Summary
Questo manoscritto descrive l'uso di topi transgenici reporter e vie di somministrazione differenti di coloranti fluorescenti in angiotensina II-ipertensione indotta mediante videomicroscopia video microscopia dei vasi sanguigni per valutare l'attivazione di cellule immunitarie e loro capacità di rotolare e aderire all'endotelio.
Abstract
Videomicroscopia video epifluorescenza (IVM) dei vasi sanguigni è un metodo consolidato per valutare l'attivazione di cellule immunitarie e la loro capacità di ruolo e rispettare lo strato endoteliale. Visualizzazione di cellule circolanti per iniezione di coloranti fluorescenti o fluorophore-accoppiati anticorpi è comunemente usato. In alternativa, possono essere utilizzati topi reporter fluorescente. Interazioni dei leucociti, in particolare lisozima M+ (LysM+) monociti, con la parete del vaso giocano un ruolo fondamentale nella promozione della disfunzione vascolare e ipertensione arteriosa. Qui presentiamo la tecnica per visualizzare e quantificare leucocita rotolamento e adesione nelle arterie carotiche in angiotensina II (AngII)-ha indotto l'ipertensione nei topi di IVM.
L'impianto di un catetere danneggia la parete vascolare e porta a risposte alterata delle cellule del sangue. Abbiamo confrontato le tecniche di iniezione differenti e vie di somministrazione per visualizzare i leucociti in un LysMCre++ di IRG mouse con diffusa espressione della proteina fluorescente rossa e condizionale espressione della proteina fluorescente verde in LysM + cellule. Per studiare l'attivazione delle cellule di LysM+ , abbiamo usato AngII infuso topi in cui rotolamento e adesione dei leucociti all'endotelio è aumentato. Abbiamo iniettato o catetere acridina arancione utilizzando una giugulare o direttamente se la coda della vena e rispetto la quantità di rotolamento e l'aderenza delle cellule. Abbiamo trovato che l'impianto di catetere giugulare per sé aumentato il numero di rotolamento e aderente LysM+ cellule in sham-infuso LysMCre+topi IRG+ rispetto ai controlli. Questa attivazione è stata aumentata in topi AngII-infuso. Interessante, l'iniezione di adesione delle cellule acridina arancio direttamente attraverso la coda della vena non ha aumentato LysM+ o rotolamento in topi falsità-infuso. Abbiamo quindi dimostrato l'importanza di topi transgenici reporter che esprimono le proteine fluorescenti per non interferire con i processi in vivo durante la sperimentazione. Inoltre, iniezione della vena della coda di traccianti fluorescenti potrebbe essere una possibile alternativa a iniezioni catetere giugulare.
Introduction
Ipertensione arteriosa aumenta il rischio di malattia cardiovascolare e di morte e promuove lo sviluppo di aterosclerosi, malattia coronarica e tromboembolie arteriose o venose1. Lo sviluppo di ipertensione dipende dall'interazione di fattori ambientali, genetici, endocrini ed emodinamici. Attualmente, l'immunità e infiammazione correlato sono apprezzate per svolgere un ruolo importante in eziologia di ipertensione2.
Tra le cellule del sistema immunitario, i macrofagi così come monociti e linfociti T sono stati trovati per essere causalmente coinvolti nell'infiammazione vascolare indotta da AngII e ipertensione, in parte legate alla loro capacità di innescare di specie reattive dell'ossigeno3. Topi deficienti di fattore del macrofago distimolazione ha mostrato ridotta risposta di AngII per quanto riguarda l'aumento della pressione sanguigna e l'infiammazione vascolare4. In un precedente lavoro, abbiamo potuto mostrare che i monociti LysM + guidano disfunzione vascolare e l'infiammazione in ipertensione indotta da AngII5. Più recentemente, abbiamo descritto una via novella nella quale coagulazione fattore XI coopera con le piastrine e la parete del vaso per indurre l'infiammazione vascolare trombina-dipendente6. Le attuali conoscenze sul ruolo del sistema immunitario nell'ipertensione recentemente sintetizzata e recensita da Rodriguez-Iturbe et al. 7
Dal momento che il coinvolgimento delle cellule immuni nello sviluppo di ipertensione è diventato evidente, modelli e tecniche per lo studio dell'interazione tra la nave e le cellule immuni è diventato necessari. Epifluorescence IVM dei vasi sanguigni è un utile strumento per osservare in vivo interazioni fra le cellule del sangue e l'endotelio8,9,10di circolazione. Con questa tecnica, iniezione di coloranti intercalanti con DNA (ad esempio di arancio di acridina) possa visualizzare cellule nucleate (circolazione nonché dall'endotelio). Piastrine isolate tinto ex vivo con rhodamin - 6G o della diclorofluorescina (DCF) può essere iniettata per visualizzare embolo ricco di piastrina in modelli di lesione arteriosa o venosa.
In genere, un catetere giugulare è usato per iniettare traccianti o contrassegnato le piastrine. Alterazione dell'endotelio e la successiva attivazione della cascata della coagulazione sono entrambi noti per avere effetti sull'attivazione del monocito. Lesione endoteliale porta immediatamente all'attivazione delle piastrine tramite molecole subendothelial matrice per sigillare il tessuto, con conseguente monocito attrazione e attivazione11. Al contrario, un endotelio intatto è noto per avere proprietà anticoagulanti (ad es., via inibitore di via di fattore del tessuto o thrombomodulin)12 ed effetti inibitori diretti su monocito, ad esempio, attraverso la secrezione di vescicole extracellulari contenenti microRNA13. I monociti sono noti per produrre un fattore del tessuto, l'attivatore estrinseco della cascata della coagulazione ed esprimere recettori attivati da proteasi (PARs) che possono essere attivati dalla trombina e partecipare a monocito attivazione14,15 . Pertanto, qualsiasi attivazione delle piastrine o della cascata della coagulazione, a causa di lesioni vascolari può avere effetti inattesi sulla attivazione del monocito e interferire con il fenomeno osservato. Con l'aiuto di topi transgenici di LysM Cre transgenici IRG, un mouse di reporter di doppio-fluorescente Cre (LysMCre+IRG+), ci proponiamo di studiare in dettaglio l'effetto delle iniezioni con un catetere e metodi alternativi su LysM+ cellule myelomonocytic in un modello murino di ipertensione arteriosa16.
Protocol
Gli esperimenti sono stati condotti sull'età di topo maschio 8-12 settimane vecchie sotto l'approvazione del comitato etico sulla sperimentazione animale da Renania-Palatinato (numero di autorizzazione 23 177-07/G12-1-002 e 23 177-07/G15-1-051).
1. mouse l'anestesia e la preparazione all'intervento
- Prima dell'intervento, verificare la buona salute e la condizione degli animali. Prima dell'intervento chirurgico, è necessario monitorare gli animali una volta al giorno per 2-3 giorni per la loro condizione generale (aspetto, postura, comportamento spontaneo), peso corporeo, cibo e consumo di acqua.
- Preparare il mix master per anestesia con midazolam (5 mg/kg di peso corporeo), medetomidina (0,5 mg/kg di peso corporeo) e fentanil (0,05 mg/kg di peso corporeo) per via intraperitoneale (i.p.) iniettare 200 µ l/30 g topo in siringa da 1 mL con ago 26 G.
- L'impianto pompa osmotica e preparazione degli animali per esperimenti di IVM vengono eseguite su un campo di funzionamento con un 39 ° C riscaldamento piattaforma. Tutti gli strumenti in un bagno di disinfezione di sterilizzare e disinfettare la piattaforma.
- Durante le procedure, proteggere gli occhi degli animali con unguento oculare. Rimuovere la pelliccia con rasoi prima dell'impianto pompa osmotica. Utilizzare una crema depilatoria e tamponi di cotone per l'isolamento delle carotidi e l'impianto di catetere giugulare in esperimenti di IVM. Disinfettare la pelle dell'animale utilizzando due disinfettanti della pelle: un antisettico e disinfettante contenente iodio povidone e una pelle antisettico octenidine contenenti in soluzione a base di alcool.
- Preparare il mix master per antagonizzare l'anestesia ("mix antisedan") con atipamezol (0,05 mg/kg di peso corporeo) e di flumazenil (0,01 mg/kgbody peso) e 200 µ l/mouse nella siringa da 1 mL con un ago da 26 G sia per via sottocutanea (s.c.) iniettato.
2. l'impianto e la pompa osmotica preparazione
Nota: L'infusione sottocutanea di AngII mediante pompe osmotiche è stata descritta in dettaglio da Lu et al. 17
- Preparare il AngII mediante ricostituzione della polvere liofilizzata con soluzione salina sterile e regolare la concentrazione con il peso dell'animale e della portata della pompa. Mantenere l'AngII ricostituito in tubi di plastica (non utilizzare tubi di vetro).
- Riempire la pompa con la soluzione di AngII a consegnare 1 mg/(kg·d) per 7 giorni. Dopo la preparazione, mantenere le pompe in soluzione salina sterile per 4-6 h minimo a 37 ° C.
- Testare l'anestesia completa del mouse dopo l'iniezione di anestesia mix con posteriore riflessi del piede e posizionarlo sul campo di operazione a caldo. Induzione di anestesia dura 10-15 min e funziona meglio se gli animali sono collocati in un ambiente buio.
- Radere la parte bassa della schiena il mouse e disinfettarlo con una pelle alcolica antisettica.
- Praticare un'incisione di 1 cm perpendicolarmente alla colonna vertebrale con le forbici. Creare una tasca per la pompa usando un laccio emostatico stretto e inserire la pompa (portata moderatore prima). La tasca deve consentire la libera circolazione della pompa con nessuna pressione sulla ferita.
- Chiudere la ferita con punti di sutura e non clip, al fine di limitare l'infiammazione; quindi disinfettare con antisettico della pelle.
- Antagonizzare l'anestesia tramite iniezione s.c. di 200 µ l della miscela antisedan e tornare il mouse alla sua gabbia.
- Svolgere l'analgesia postoperatoria con buprenorfina (0,075 mg/kg s.c.) una volta dopo l'intervento chirurgico e su richiesta in base al comportamento animale.
3. l'impianto di catetere giugulare e carotidi preparazione
- Testare l'anestesia completa del mouse dopo l'iniezione dell'anestesia mescolare con riflessi posteriore cibo e metti l'animale anestetizzato in dorsale recumbence sulla piastra chirurgica di 39 ° C con una sonda rettale al fine di mantenere la temperatura e mettere l'unguento sopra gli occhi per proteggerli durante la procedura.
- Eliminare i peli del collo usando la crema depilatoria. Utilizzare un cotton fioc per diffondere e strofinare la crema per 2 min, fino a quando i capelli iniziano a cadere. Dopo altri 2 minuti, togliere la panna e i capelli con una spatola e disinfettare la cute con un antisettico di pelle alcoliche.
- Effettuare l'intervento in un microscopio stereoscopico. Fare un'incisione lungo 1-1,5 cm nella pelle longitudinalmente nel collo, 1 cm accanto alla trachea. Poi fare due altre incisioni perpendicolarmente alla due estremità delle incisioni prime.
- Rimuovere tessuti vicino la pelle delicatamente e rimuovere il pezzo di pelle che copre la vena giugulare di sinistra e la trachea.
- Isolare accuratamente la ghiandola parotidea; ghiandole sublinguali e sottomascellari dalla zona di interesse con il forcipe curvo 2. Non tagliare o danneggiare le ghiandole, metterli per consentire il migliore accesso alla vena giugulare e per le carotidi.
- Per isolare la vena giugulare, utilizzare pinze sottili e lentamente aprire e chiudere per liberare delicatamente il vaso dal tessuto circostante. Una volta che la vena è completamente pulita, posizionare la pinza sotto la nave e posizionare due suture 7-0 di 10 cm ogni sotto esso.
- Chiudere la sutura prossimale alla testa con due nodi. La sutura di altri, preparare un nodo ma non chiuderlo.
- Mantenere il catetere (0,28 mm diametro interno, diametro esterno mm 0,61) riempito con soluzione fisiologica sterile di 37 ° C con una pinza con una mano; mentre con l'altra mano, praticare una piccola incisione nel recipiente con un paio di forbici sottile o un ago curvo 26 G. Quindi inserire il catetere nella vena giugulare e chiudere il nodo due volte. Chiudere la sutura prossimale alla testa sopra il catetere al fine di garantire l'immobilizzazione completa.
- Per isolare e preparare le arterie carotiche, sezionare l'area che copre la trachea usando il forcipe curvo sottile.
- Una volta che le carotidi sono liberi dai tessuti circostanti, rimuovere il nervo vago (si presenta come una linea bianca adiacente la carotide) dalla nave (ma non lo taglio). Il forcipe sottile può essere chiuso e aperto lentamente per mobilitare delicatamente il nervo.
- Una volta che entrambe le arterie sono completamente pulite, collocare la pinza sotto la prima arteria carotica e posizionare un pezzo di plastica piccolo nero 3 mm larghezza x 2,5 cm lunghezza sotto la nave. È molto importante non tirare troppo il vaso e controllare che il flusso di sangue è presente una volta il nave titolare è collocato. Posizionare la seconda arteria sopra il nave titolare. Se il mouse non è posizionato direttamente sotto il microscopio, rimettere le ghiandole sopra la trachea e applicare la soluzione salina sterile a 37 ° C per evitare l'essiccazione della zona.
4. valutazione di rotolamento e l'aderenza dei leucociti / LysM + celle con IVM
- Preparare acridina arancia da una soluzione madre di 2 mg/mL conservata a-20 ° C e diluirla 1:4 in soluzione fisiologica sterile (concentrazione finale di 0,5 mg/mL) in una siringa da 1 mL.
- Diverse condizioni di prova: (1) iniezione di acridina arancia con il catetere giugulare; (2) iniezione di arancio di acridina direttamente nella vena caudale laterale (con questa circostanza che è stato impiantato senza catetere giugulare); (3) misurazione senza topi acridina arancione usando la fluorescenza LysMCre++ di IRG (in questo caso nessun catetere giugulare è stato impiantato).
Representative Results
Carotidi di LysMCre++ di IRG infusi con AngII topi sono stati osservati utilizzando IVM. Arancio di acridina è stato iniettato usando un catetere giugulare. Abbiamo mirato a guardare la proporzione di cellule LysM+ a contatto con la parete vascolare rispetto a tutte le cellule nucleate circolanti (che potrebbero anche interagire con la nave, poiché la discriminazione del tipo cellulare interagendo con la nave è rimasto un open domanda dal nostro lavoro precedente). Al basale, la presenza di un catetere giugulare provoca adesione delle cellule LysM+ (Figura 2A, D). Dopo l'iniezione di arancio di acridina, le stesse cellule erano fluorescente, ma anche le cellule endothelial erano fluorescenti (Figura 2B, E). Dopo la riduzione dello sfondo per limitare endoteliali correlate a fluorescenza, i dati indicano che tutte le cellule nucleate aderenti sono LysM+ (Figura 2, F); Questi risultati valgono dopo infusione di AngII confermando i nostri risultati precedenti e dimostrando che il LysMCre++ di IRG è un buon modello per osservare l'effetto di AngII sull'attivazione delle cellule LysM+ .
Abbiamo valutato il ruolo delle vie di somministrazione dell'acridina arancia sull'attivazione delle cellule LysM+ dopo infusione di AngII in LysMCre++di IRG. Dopo una settimana di AngII infusione, interazioni leucocitarie endotelio nelle arterie carotiche di LysMCre++ di IRG topi erano imaged e visualizzati da IVM con o senza iniezione di arancio di acridina tramite un catetere giugulare o attraverso la vena caudale. Senza catetere o iniezione, rotolamento delle cellule LysM+ è stato aumentato significativamente dopo infusione di AngII rispetto ai topi non trattati e l'adesione ha mostrato un aumento (Figura 3). Iniezione di acridina arancia con una catetere giugulare aumentata adesione e rotolamento in AngII topi trattati in misura maggiore rispetto ai topi senza catetere (Figura 3). Iniezione di acridina arancia nella vena caudale conduce ad adesione simili e rotolamento rispetto ai topi che non hanno ricevuto l'iniezione di arancio di acridina (Figura 3).
Figura 1. Schema di infusione di angiotensina II e di valutazione di LysM+ cellule di rotolamento e adesione in topi. LysMCre++ di IRG topi sono stati infusi 7 giorni con AngII e aderendo così come rotolamento LysM+ cellule sopra le carotidi sono state quantificate con o senza iniezione di acridina arancia tramite un catetere giugulare o vena caudale iniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Valutazione dell'adesione cellulare LysM+ e rotolamento nelle arterie carotiche di LysMCre+topi IRG+ . Cellule di adesione di LysM+ in LysMCre+topi IRG+ prima (A, D) e dopo l'iniezione di acridina (B, E) tramite un catetere giugulare. Fluorescenza rossa e verde sono state registrate, erano visibili cellule LysM+ (in verde) e cellule di muscolo liscio (in rosso). Dopo iniezione di arancio di acridina, le cellule endoteliali sono anche visibili in verde ma rimozione di fluorescenza di fondo permette solo circolanti nucleate visualizzazione delle cellule (C, F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Valutazione delle vie di somministrazione di coloranti fluorescenti in angiotensina II infuso LysMCre+topi IRG+ . Quantificazione di rotolamento (A) e di aderire LysM (B)+ cellule in animali AngII-infuso o sham operati e con o senza iniezione di arancio di acridina utilizzando un catetere giugulare o di iniezione della vena della coda. Immagini rappresentative delle diverse condizioni (C). I risultati sono media ± errore standard della media. 2-way ANOVA è stato effettuato e post hoc test di Bonferroni, n = 3-12/gruppi; p < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
I monociti LysM+ precedentemente sono stati indicati per essere implicati nello sviluppo di ipertensione5. Qui indichiamo che le cellule immunitarie LysM+ rotolo e rispettano lo strato endoteliale in risposta all'infusione di AngII. Questo risultato è stato ottenuto utilizzando LysMCre++ di IRG topi da nostri studi precedenti, esplorando il ruolo delle cellule immuni in ipertensione in vivo visualizzando leucociti con iniezione di arancio di acridina6,10. Così, la discriminazione di tipi delle cellule aderiscono all'endotelio non era possibile.
L'IVM è uno strumento molto utile per studi vascolari e osservazioni in vivo delle cellule direttamente nel sistema vascolare, ma l'impatto di iniettare coloranti con l'aiuto di un catetere inserito chirurgicamente nel contesto infiammatorio di ipertensione rimane sconosciuto. Per valutare l'effetto potenziale del catetere e arancio di acridina iniezione abbiamo approfittato del LysMCre+topi IRG+ . Infusione di AngII ha aumentato il numero di rotolamento LysM+ cellule all'endotelio. Inserimento di un catetere nella vena giugulare amplificato l'effetto e leucociti più rotolamento e aderenti sono stati rilevati nei topi AngII-infuso strumentati con un catetere rispetto ai topi senza catetere protesi. Questo indica che l'impianto di un cause carotica catetere una reazione infiammatoria sistemica nel contesto della cicatrizzazione che si sovrappone con la reazione immune vista in ipertensione18. Inoltre, a causa della vicinanza della vena giugulare all'arteria carotica un'ulteriore attivazione immunitaria potrebbe essersi verificato che interessano la vena giugulare. Poiché questo effetto non era presente quando le iniezioni sono state fatte direttamente nella vena caudale, possiamo supporre che l'effetto era dovuta non alla tintura, ma per la procedura di inserimento del catetere. Abbiamo dimostrato qui l'importanza di topi transgenici reporter che esprimono le proteine fluorescenti per non interferire con i processi in vivo durante la sperimentazione. Inoltre, iniezione della vena della coda di traccianti fluorescenti potrebbe essere una possibile alternativa a iniezioni catetere giugulare.
Un passaggio fondamentale della procedura è l'infusione di AngII. Valutazione del polsino della coda della pressione sanguigna può essere fatta al fine di controllare l'efficacia di AngII consegna la pompa. Pressione sanguigna dovrebbero aumentare dopo 2−3 giorni di infusione. Per limitare l'infiammazione che poteva influenzare l'attivazione di cellule LysM+ , chiusura dell'incisione dove viene impiantata la pompa dovrebbe essere effettuata con suture invece di clip. Una limitazione deve essere notata sull'iniezione della vena della coda: per rendere l'acquisizione di dati possibili migliore, 4 video è di solito prese per ogni carotico. Se il segnale fluorescente diminuisce, 50 µ l di arancio di acridina vengono iniettati ma con iniezione coda è più difficile di fare diverse iniezioni e di mantenere le carotidi stabile nell'ambito dell'obiettivo del microscopio. La durata della presenza di un catetere nella vena giugulare potrebbe inoltre modulano l'attivazione di cellule immunitarie poiché si sta interessando l'attivazione di coagulazione in plasma ricco di piastrine preparato 4 h dopo l' impianto di catetere19. Questo aspetto dell'impianto di catetere necessita di ulteriori indagini.
Infine, anche se apprezziamo l'impatto dell'impianto di catetere giugulare sull'attivazione delle cellule LysM+ dopo infusione di AngII, completamente abbiamo non possiamo stimare il ruolo della preparazione, la rimozione della pelle e carotica isolamento su una potenziale cellula LysM+ attivazione. Concludiamo che l'uso di topi reporter fluorescenza come il LysMCre++ di IRG mouse è consigliato per evitare interruzioni di integrità del vaso durante la preparazione degli animali per l'imaging in vivo .
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Acknowledgments
Quest'opera è stata sostenuta dal Ministero tedesco dell'istruzione e ricerca (BMBF 01EO1003 e 01EO1503 BMBF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH | Anesthesia mix | |
| Medetomidine | Pfizer Deutschland GmbH | Anesthesia mix | |
| Fentanyl | Janssen-Cilag GmbH | Anesthesia mix | |
| Alzane | Zoetis | Antisedan mix | |
| Flumazenil | Hikma pharma | Antisedan mix | |
| Braunol | B Braun | ||
| Octeniderm | Schülke | ||
| Osmotic pumps | Alzet | 1007D | Osmotic pump implantation |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | Osmotic pump implantation | |
| 7-0 prolene suture | Ethicon | Osmotic pump implantation | |
| Acridine orange | Sigma-Aldrich | ||
| Catheter | Smiths Medical Deutschland GmbH | Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm | |
| Microscope | Olympus | BX51WI fluorescence microscope | |
| Beam Splitter | Photometrics | CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager | |
| Objective | Olympus | UMPLFLN10X | Water immersion objective with a monochromator |
| Camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
| Image acquisition and analysis software | Olympus | Realtime Imaging System eXcellence RT | |
| Mice | The Jackson Laboratory | Jax 008705 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J |
| Mice | The Jackson Laboratory | Jax 004781 | LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J ) |
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