Summary
Detta manuskript beskriver användningen av transgena reporter möss och olika administreringsvägar av fluorescerande färger i angiotensin II-inducerad hypertoni med intravital video mikroskopi av blodkärl för att utvärdera aktivering av immunceller och deras förmåga att rulla och följa endotelet.
Abstract
Epifluorescence intravital video mikroskopi (IVM) av blodkärl är en etablerad metod att utvärdera aktivering av immunceller och deras förmåga att roll och följa det endothelial lagret. Visualisering av cirkulerande celler genom injektion av fluorescerande färgämnen eller fluorophore-kopplade antikroppar används ofta. Alternativt, fluorescerande reporter möss kan användas. Interaktioner av leukocyter, i synnerhet lysozym M+ (LysM+) monocyter, med kärlväggen spelar avgörande roller i främjandet av vaskulär dysfunktion och arteriell hypertension. Här presenterar vi tekniken för att visualisera och kvantifiera leukocyt rullande och vidhäftning i halspulsåder i angiotensin II (AngII)-inducerad hypertoni hos möss av IVM.
Implantation av en kateter skadar kärlväggen och leder till förändrad blodkroppar svaren. Vi jämförde olika injektionsteknik och administreringsvägar att visualisera leukocyter i ett LysMCre+IRG+ mus med utbredd uttryck av röd fluorescerande protein och villkorsuttryck av grönt fluorescerande protein i LysM + celler. För att studera LysM+ cellaktivering, vi använde AngII infunderas möss där rullande och vidhäftning av leukocyter till endotelet ökas. Vi injiceras antingen akridin orange med en jugular kateter eller direkt om svansen ven och jämförde mängden rullande och följa celler. Vi fann att jugular katetern implantation i sig ökade antalet rullande och vidhängande LysM+ celler i sham-infunderas LysMCre+IRG+ möss jämfört med kontroller. Denna aktivering utökades i AngII-infunderas möss. Intressant, injicera akridin orange direkt genom svansen ven inte ökade LysM+ celladhesion eller rullande i sham-infunderas möss. Vi har därmed visat vikten av transgena reporter möss uttrycker fluorescerande proteiner för att inte störa i vivo processer under experiment. Dessutom kan svans ven injektion av fluorescerande spårämnen vara ett möjligt alternativ till jugular katetern injektioner.
Introduction
Högt blodtryck ökar risken för kardiovaskulär sjukdom och död och främjar utvecklingen av ateroskleros, kranskärlssjukdom och arteriell eller venös thromboembolisms1. Utvecklingen av hypertoni är beroende av samspelet mellan miljö, genetiska, endokrina och hemodynamiska faktorer. För närvarande uppskattas immunitet och relaterade inflammation för att spela en viktig roll i etiologi av hypertoni2.
Bland immuna celler befanns T-lymfocyter och monocyter samt makrofager vara kausalt inblandade i AngII-inducerad vaskulär inflammation och hypertoni, delvis relaterade till deras förmåga att utlösa reaktivt syre arter3. Makrofag granulocytkolonistimulerande faktor bristfällig möss uppvisade nedsatt svar på AngII angående blodtryck ökar och vaskulär inflammation4. I ett tidigare arbete, kunde vi visa att LysM + monocyter driva vaskulär dysfunktion och inflammation i AngII-inducerad hypertoni5. Mer nyligen, beskrev vi en ny väg i vilken koagulering faktor XI samarbetar med trombocyter och kärlväggen att inducera trombin-beroende vaskulär inflammation6. Den nuvarande kunskapen om rollen av immunförsvaret vid hypertoni var nyligen sammanfattas och granskats av Rodriguez-Iturbe et al. 7
Eftersom medverkan av immunceller i utvecklingen av hypertoni blev uppenbart, blev modeller och tekniker för att studera interaktionen mellan fartyget och immunceller nödvändigt. Epifluorescence IVM av blodkärl är ett användbart verktyg att iaktta i vivo interaktioner mellan cirkulerande blodkroppar och endotel8,9,10. Med denna teknik, kan injektion av färgämnen infoga med DNA (som akridin orange) visualisera kärnförsedda celler (cirkulerande liksom från endotelet). Isolerade blodplättar färgas ex vivo med rhodamin - 6 G eller dichlorofluorescein (DCF) kan injiceras för att visualisera trombocyt-rika trombos i arteriell eller venös skada modeller.
Vanligtvis en halsvenen kateter används att injicera spårämnen eller markerade trombocyter. Ändring av endotel och efterföljande aktivering av koagulationskaskaden är båda kända för att ha effekter på monocyt aktivering. Endoteliala skador leder omedelbart till trombocytaktivering via subendothelial matrix molekyler att täta vävnad, med efterföljande monocyt attraktion och aktivering11. Tvärtom, är en intakt endotel kända för att ha blodförtunnande egenskaper (t.ex. via vävnad factor pathway inhibitor eller thrombomodulin)12 och direkt hämmande effekter på monocyt, t.ex., genom utsöndring av extracellulära blåsor som innehåller mikroRNA13. Monocyter är kända för att producera en vävnadsfaktor, extrinsic aktivator av koagulationskaskaden och express proteas-aktiverat (PARs) receptorer som kan aktiveras av trombin och delta i monocyt aktiveringen14,15 . Därför, någon aktiveringen av trombocyter eller koagulationskaskaden på grund av vaskulär skada kan ha oväntade effekter på monocyt aktivering och störa det observerade fenomenet. Med hjälp av IRG transgena LysM Cre transgena möss, en dubbel-fluorescerande Cre reporter mus (LysMCre+IRG+) föreslår vi att i detalj studera effekten av injektioner med en kateter och alternativa metoder på LysM+ myelomonocytär celler i en musmodell av arteriell hypertension16.
Protocol
Experiment utfördes på hanmöss ålder 8 till 12 veckor gammal enligt godkännandet av den etiska kommittén på djurförsök från Rheinland-Pfalz (tillståndsnummer 23 177-07/G12-1-002 och 23 177-07/G15-1-051).
1. mus anestesi och kirurgi förberedelse
- Före operation, kontrollera god hälsa och tillstånd av djuren. Före operation, övervaka djur en gång per dag i 2-3 dagar för allmäntillståndet (utseende, kroppshållning, spontana beteende) samt kroppsvikt, mat och vattenförbrukning.
- Förbereda huvudmixen för anestesi med midazolam (5 mg/kg kroppsvikt), Medetomidin (0,5 mg/kg kroppsvikt) och fentanyl (0,05 mg/kg kroppsvikt) till intraperitonealt (i.p.) injicerar 200 µL/30 g mus i 1 mL spruta med en 26 G nål.
- Osmotisk pump implantation och djur inför IVM experiment utförs på fältet en operation med en 39 ° C uppvärmningen plattform. Sterilisera alla verktygen i badkar desinfektion och desinficera den värmande plattformen.
- Under förfarandena, skydda djurs ögon med ögonsalva. Ta bort pälsen med rakhyvlar innan osmotisk pump implantation. Använda en hårborttagningskräm och bomullspinnar för isolering av halspulsådern och jugular katetern implantation i IVM experiment. Desinficera djur huden med hjälp av två huden desinfektionsmedel: en antiseptisk och desinfektionsmedel som innehåller povidon jod och en hud antiseptiska innehållande octenidine i alkohol-baserad lösning.
- Förbereda den master mix för att motverka dexmedetomidininducerade anestesi (”antisedan mix”) med atipamezol (0,05 mg/kg kroppsvikt) och flumazenil (0,01 mg/kg vikt), och förbereda 200 µL/mus i 1 mL spruta med en 26 G nål vara subkutant (s.c.) injiceras.
2. osmotisk Pump förberedelse och Implantation
Obs: Subkutan AngII infusionen med osmotisk pumpar beskrevs i detalj av Lu et al. 17
- Förbereda AngII genom beredning av det frystorkade pulvret med steril koksaltlösning och justera koncentration med djurens vikt och andelen leveransen av pumpen. Hålla den rekonstituerade AngII i plaströr (inte Använd glasrör).
- Fyll pumparna med AngII lösningen att leverera 1 mg/(kg·d) i 7 dagar. Efter beredning, hålla pumparna i steril koksaltlösning för 4-6 h minimum vid 37 ° C.
- Testa den komplett anestesi av musen efter injektion av anestesi mixen med bakre fot reflexer och placera den på fältet varm operation. Anestesi induktion tar 10-15 min och fungerar bättre om djuren placerats i en mörk miljö.
- Raka nedre baksidan av musen och desinfektera den med en alkoholhaltiga hud antiseptiska.
- Gör en 1 cm snitt vinkelrätt mot ryggraden med sax. Skapa en ficka för pumpen använder en sundet hemostat och infoga pumpen (flow moderator först). Fickan måste tillåta fri rörlighet för pump med ingen press på såret.
- Nära såret med suturer och inte klipp, för att begränsa inflammation; sedan desinficera med huden antiseptiska.
- Reta anestesi av s.c. injektion av 200 µL antisedan mixen och återgå musen till sin bur.
- Utföra postoperativ smärtlindring med buprenorfin (0.075 mg/kg s.c.) en tid efter operationen och på begäran beroende på djurens beteende.
3. jugular katetern Implantation och halspulsådern förberedelse
- Testa den komplett anestesi av musen efter injektion av anestesi blanda med bakre mat reflexer och placera den sövda djuren i dorsala recumbence på 39 ° C kirurgiska plattan med en rektal sond för att bibehålla temperaturen och sätta salva över ögonen för att skydda dem under förfarandet.
- Ta bort hals hårstrån med hjälp av hårborttagningskräm. Använd en bomullstopp att sprida och massera in krämen i 2 min tills håren börjar falla ut. Efter en ytterligare 2 min, ta bort grädde och hårstrån med en spatel och desinficera huden med en alkoholhaltiga hud antiseptiska.
- Utföra operationen under ett stereomikroskop. Gör en 1-1,5 cm långa snitt i huden längdriktningen i nacken, 1 cm intill luftstrupen. Gör sedan två andra snitt vinkelrätt till båda extremiteter av de första snitt.
- Försiktigt bort vävnader närmast huden och ta bort bit av huden som täcker den vänstra halsvenen och luftstrupen.
- Noggrant isolera öronspottkörteln; sublinguala och mandibular körtlar av intresse med 2 böjd pincett från området. Skär inte eller skada körtlar, placera dem så att de bästa tillgången till halsvenen och halspulsådern.
- För att isolera halsvenen, använda tunna pincett och långsamt öppna och stänga den för att försiktigt gratis fartyget från den omgivande vävnaden. När venen är helt ren, placera pincetten under fartyget och placera två 7-0 suturer 10 cm varje under den.
- Stäng suturen proximalt i huvudet med två knutar. På andra suturen, förbereda en Knut men inte stänga den.
- Håll katetern (0.28 mm innerdiameter, 0,61 mm ytterdiameter) fylld med 37 ° C steril koksaltlösning med pincett med ena handen; samtidigt med den andra handen, göra ett litet snitt in i kärlet med en tunn sax eller en böjd 26 G nål. Sedan in katetern i halsvenen och Stäng Knut två gånger. Nära suturen proximalt huvudet över katetern för att säkerställa fullständig immobilisering.
- För att isolera och förbereda halspulsåder, dissekera området täcker luftstrupen med tunna böjda pincetten.
- När halspulsådern är fria från omgivande vävnader, ta bort vagusnerven (det ser ut som en vit linje intill halspulsådern) från fartyget (men skär inte det). Tunn tången kan stängas och öppnas långsamt för att försiktigt mobilisera nerven.
- När båda artärer är helt ren, placera pincetten under den första halspulsådern och placera en liten svart 3 mm brett x 2,5 cm längd plast bit under fartyget. Det är mycket viktigt att inte överanstränga fartyget och för att kontrollera att blodflödet är närvarande när fartyget innehavaren är placerat. Placera den andra artären över fartyget innehavaren. Om musen inte placeras direkt under mikroskopet, sätta tillbaka körtlar över luftstrupen och applicera 37 ° C steril koksaltlösning för att undvika uttorkning av zonen.
4. bedömning av rullande och följa leukocyter / LysM + celler med IVM
- Förbereda akridin orange från 2 mg/mL stamlösning förvaras vid-20 ° C och späd 1:4 i steril koksaltlösning (0,5 mg/mL koncentration) i en 1 mL spruta.
- Testa olika villkor: (1) injektion av akridin orange med jugular katetern; (2) injektion av akridin orange direkt i svansen laterala ven (med detta villkor inga jugular kateter var implanteras); (3) mätning utan akridin orange med fluorescensen LysMCre+IRG+ möss (här igen ingen jugular kateter var implanteras).
Representative Results
Halspulsådern av LysMCre+IRG+ möss infunderas med AngII observerades med IVM. Akridin orange injicerades med en jugular kateter. Vi syftar till att titta på andelen LysM+ celler i kontakt med kärlväggen jämfört alla kärnförsedda cirkulerande celler (som också skulle kunna samverka med fartyget eftersom diskriminering av den celltyp som interagerar med fartyget förblev en öppen fråga från vårt tidigare arbete). Vid baslinjen orsakar förekomsten av en jugular kateter vidhäftning av LysM+ celler (figur 2A, D). Efter akridin orange injektion, samma celler var fluorescerande, men även endotelceller var fluorescerande (figur 2B, E). Efter minskning av bakgrunden till begränsa endothelial relaterade fluorescens, visar data att alla celler med kärnor vidhängande är LysM+ (figur 2 c, F); dessa resultat hålla sant efter AngII infusion bekräftar våra tidigare resultat och visar att LysMCre+IRG+ är en bra modell att observera effekten av AngII på LysM+ cellaktivering.
Vi utvärderade roll administreringsvägar för akridin orange på LysM+ cellaktivering efter AngII infusion i LysMCre+IRG+. Efter en vecka av AngII infusion, leukocyt endotel interaktioner i halspulsåder av LysMCre+IRG+ möss var avbildade och visualiseras av IVM med eller utan akridin orange injektion via en jugular kateter eller genom svansen. Utan kateter eller injektion ökades betydligt rullande LysM+ celler efter AngII infusion jämfört med obehandlade möss och vidhäftning visade en ökning (figur 3). Injektion av akridin orange med en jugular katetern ökat vidhäftning och rullande i AngII behandlade möss i större utsträckning jämfört med möss utan en kateter (figur 3). Injektion av akridin orange i svansen venen leder till liknande vidhäftning och rullande jämfört med de möss som inte fått injektion av akridin orange (figur 3).
Figur 1. Systemet för angiotensin II-infusion och bedömning av LysM+ celler rullande och vidhäftning i möss. LysMCre+IRG+ möss var infunderas 7 dagar med AngII och följa samt rullande LysM+ celler över halspulsådern kvantifierades med eller utan injektion av akridin orange genom en jugular kateter eller svans ven injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Bedömning av LysM+ celladhesion och rullande i halspulsåder av LysMCre+IRG+ möss. Vidhäftning av LysM+ celler i LysMCre+IRG+ möss innan (A, D) och efter (B, E) akridin injektion via en jugular kateter. Röd och grön fluorescens spelades, LysM+ celler (i grönt) och glatta muskelceller (i rött) var synliga. Efter injektion av akridin orange, endotelceller är också synliga i grönt men att ta bort bakgrunden fluorescens tillåter bara cirkulerande nucleated cell visualisering (C, F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Utvärdering av administreringsvägar av fluorescerande färger i angiotensin II infunderas LysMCre+IRG+ möss. Kvantifiering av rullande (A) och följa (B) LysM+ celler i sham drivs eller AngII-infunderas djur och med eller utan injektion av akridin orange med en jugular kateter eller genom svansen ven injektion. Representativa bilder av olika villkor (C). Resultaten är medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet. 2-vägs ANOVA utfördes och Bonferroni's post hoc test, n = 3-12/grupper; p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
LysM+ monocyter har tidigare visat sig vara inblandade i utvecklingen av hypertoni5. Här visar vi att LysM+ immunceller rulla och följer det endothelial lagret svar på AngII infusion. Detta konstaterande erhölls med LysMCre+IRG+ möss från våra tidigare studier för att undersöka rollen av immunceller i hypertoni i vivo genom att visualisera leukocyter med injektion av akridin orange6,10. Diskriminering av celltyper som ansluter sig till endotelet var alltså inte möjligt.
IVM är ett mycket användbart verktyg för vaskulär studier och i vivo observationer av celler direkt i kärlsystemet, men effekterna av injicera färgämnen med hjälp av en kirurgiskt insatt kateter i inflammatoriska samband med hypertoni förblir okänd. Att utvärdera den potentiella effekten av katetern och akridin orange injektion tog vi fördel av LysMCre+IRG+ möss. AngII infusion ökade numrera av rullande LysM+ celler till endotelet. Införande av en kateter i halsvenen förstärks effekten och mer rullande och vidhängande leukocyter upptäcktes i AngII-infunderas möss instrumenterad med en kateter som jämfört med möss utan kateter implantat. Detta indikerar att implantation av en halspulsådern katetern orsakar en systemisk inflammatorisk reaktion i samband med sårläkning som läggs med en immunreaktion som sett i hypertoni18. Dessutom, på grund av närheten av halsvenen till halspulsådern kan en ytterligare immunsystemets aktivering ha inträffat genom att påverka halsvenen. Eftersom denna effekt inte var närvarande när injektioner direkt i svansen ven, vi kan anta att effekten berodde inte färgen utan att förfarandet för att föra in katetern. Vi visade här vikten av transgena reporter möss uttrycker fluorescerande proteiner för att inte störa i vivo processer under experiment. Dessutom kan svans ven injektion av fluorescerande spårämnen vara ett möjligt alternativ till jugular katetern injektioner.
Ett kritiskt steg av förfarandet är AngII infusionen. Svans manschetten bedömning av blodtryck kan göras för att kontrollera effektiviteten av AngII leveransen av pumpen. Blodtrycket bör öka efter 2−3 dagar efter infusion. För att begränsa inflammation som skulle kunna påverka LysM+ celler aktivering, bör stängning av snittet där pumpen implanteras göras med suturer istället för klipp. En begränsning måste noteras om svansen ven injektion: för att göra bästa möjliga dataförvärv, 4 videoklipp tas normalt för varje halspulsådern. Om fluorescerande signalen minskar, 50 µL akridin orange injiceras men med svans injektion är det svårare att göra flera injektioner och hålla halspulsådern stabil under målet mikroskopet. Varaktigheten av närvaron av en kateter i halsvenen kan dessutom differentiera dessa immunceller aktiveringen eftersom den påverkar koagulering aktiveringen i trombocyt-rich plasma förberett 4 h efter katetern implantation19. Denna aspekt av katetern implantation behöver ytterligare utredning.
Slutligen, även om vi uppskattar effekterna av jugular katetern implantation på LysM+ cellaktivering efter AngII infusion, inte kan vi fullt uppskatta rollen av förberedelse, hud borttagning och halspulsådern isolering på en potentiell LysM+ -cell aktivering. Vi konstatera att användningen av fluorescens reporter möss gillar LysMCre+IRG+ mus rekommenderas att undvika störningar av fartygets integritet under djurens förberedelserna för i vivo imaging.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Detta arbete stöds av det tyska ministeriet för utbildning och forskning (BMBF 01EO1003 och BMBF 01EO1503).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH | Anesthesia mix | |
| Medetomidine | Pfizer Deutschland GmbH | Anesthesia mix | |
| Fentanyl | Janssen-Cilag GmbH | Anesthesia mix | |
| Alzane | Zoetis | Antisedan mix | |
| Flumazenil | Hikma pharma | Antisedan mix | |
| Braunol | B Braun | ||
| Octeniderm | Schülke | ||
| Osmotic pumps | Alzet | 1007D | Osmotic pump implantation |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | Osmotic pump implantation | |
| 7-0 prolene suture | Ethicon | Osmotic pump implantation | |
| Acridine orange | Sigma-Aldrich | ||
| Catheter | Smiths Medical Deutschland GmbH | Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm | |
| Microscope | Olympus | BX51WI fluorescence microscope | |
| Beam Splitter | Photometrics | CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager | |
| Objective | Olympus | UMPLFLN10X | Water immersion objective with a monochromator |
| Camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-R2 | |
| Image acquisition and analysis software | Olympus | Realtime Imaging System eXcellence RT | |
| Mice | The Jackson Laboratory | Jax 008705 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J |
| Mice | The Jackson Laboratory | Jax 004781 | LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J ) |
References
- Lewington, S., et al. Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies. Lancet. 360, 1903-1913 (2002).
- Harrison, D. G. The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension. J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).
- Guzik, T. J., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).
- De Ciuceis, C., et al. Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).
- Wenzel, P., et al. Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction. Circulation. 124, 1370-1381 (2011).
- Kossmann, S., et al. Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension. Sci Transl Med. 9, (2017).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J. Role of the Immune System in Hypertension. Physiol Rev. 97, 1127-1164 (2017).
- Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Wenzel, P., et al. Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans. Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).
- Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. Interactions of monocytes and platelets: implication for life. Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).
- Hinsbergh, V. W. Endothelium--role in regulation of coagulation and inflammation. Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).
- Njock, M. S., et al. Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs. Blood. 125, 3202-3212 (2015).
- Colognato, R., et al. Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells. Blood. 102, 2645-2652 (2003).
- Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes--role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway. J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice. J Vis Exp. , (2015).
- Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: the role of the macrophage. Expert Rev Mol Med. 13, e23 (2011).
- Dargaud, Y., et al. Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. , (2017).
