Summary
우리는 빠른 시내 현장 샘플링의 높은 정밀도와 최소한의 침공에 신진 대사 활동의 스냅샷의 화학 특성을 촉진 하기 위하여 모 세관 기반 마이크로-샘플링를 사용 하 여 개별 셀의 작은 부분을 사용할 수 있는 단계를 설명 배아를 사용자 단일 셀 모 세관 전기 이동 법 질량 분석 플랫폼을 사용 하 여 라이브.
Abstract
단일 셀에 작은 분자의 정량화 더 나은 이해 배아 개발의 기반이 되는 기본 프로세스에 대 한 새로운 전위를 발생 시킵니다. 사용 단일 셀 조사에 직접 라이브 배아, 새로운 분석 접근 필요, 특히 그 민감한, 선택적, 양적, 강력 하며 확장 가능한 다른 셀 크기를. 여기, 선물이 자유롭게 개발 남쪽 아프리카 발톱된 개구리 (Xenopus laevis), 세포 및 개발 생물학에서 강력한 모델의 배아에 단일 셀에 대사의 분석 제자리에 있도록 하는 프로토콜. 이 방법은 모 세관 현미경을 사용 하 여 후속 분석을 위해 인접 셀 그대로 태아에 단일 식별 된 셀에서 정의 된 부분을 발음. 수집 된 셀 내용은 고해상도 탠덤 질량 분석기를 결합 하는 미 모 세관 전기 이동 법 분무 이온화 (CE-ESI) 인터페이스에 의해 분석 된다. 이 방식은 다양 한 셀 크기를 확장 하 고 발전 태아의 복잡 한 3 차원 구조와 호환 합니다. 예를 들어, 단일 셀 CE-ESI-MS 조상 세포 생겨나게 자손에 게 태아의 개발로 펼쳐져 대사 셀이 해명 수는 있지만을 설명 합니다. 세포 및 발생 생물학, 게다가 여기에 설명 된 단일 세포 분석 프로토콜은 의무가 다른 세포 크기, 세포 유형, 또는 동물 모델입니다.
Introduction
배아 발달에 대 한 포괄적인 이해 특성화를 발전 유 기체의 모든 세포에 전개 된 모든 분자 변경 필요 합니다. 수 분자 확대와 차세대 시퀀싱 하는 동안 깊은 측정 개발 시스템2,3, 상당히 적은 단일 셀 transcriptomes1 의 작은 분자의 집합에 대 한 알려져 있다 단백질 및, 특히, 대사 산물을 포함 하 여 단일 배아 세포에서 생산 (분자 질량 < ~ 1500 다). 내부 및 외부 이벤트에 신속 하 고 동적 응답,는 대사체 셀의 분자 상태의 강력한 설명자 역할을 합니다. 단일 셀 대사체 따라서 셀이 초기 배아에서의 공간 및 시간 개발을 추적 하 고 기능 연구에 대 한 새로운 분자 식별 가능성이 발생 합니다. 그러나,이 분자에 사용할 수 있는 분자 증폭, 없이 대사체의 뛰어난 감도 사용 하 여 질량 분석 (MS), 대사 산물 분석에 대 한 선택의 기술 요구.
단일 셀 MS (참조 리뷰 4,,56,7,8,9 단 세포 대사 산물을 측정 하기 위해 충분 한 감도와 기술의 모음입니다. ,10,11,12,13,,1415). 셀의 재현 샘플링 및 대사 산물의 효율적 추출 단일 세포에서 대사 산물의 성공적인 탐지에 필수적입니다. Xenopus 배아에서 식별 된 셀의 전체 셀 해 부는 작은 분자의 펩 티 드16특성을 활성화 하 고 있다. 다른 접근 탐지 분무 이온화 (ESI) MS 사용 하 여 다음 개별 라이브 셀 샘플을 micropipettes를 사용 합니다. 예를 들어 대사 산물 단일 셀 비디오 MS17, 압력 프로브18, 단일 프로브19, 및 유체 힘 현미경20, 다른 기술21, 중 식물이 나 포유류 세포에서 측정 했다 22,,2324. 또한, 단일 셀 MS 워크플로에 이온화 전에 화학 분리의 효율적으로 대사체, 따라서 검색 하기 전에 이온 생성 하는 동안 잠재적인 간섭 경감을 단순화 합니다. 중요 한 것은, 분리는 또한 분자 식별을 지원 하기 위해 화합물 관련 정보를 제공 합니다. 모 세관 전기 이동 법 (세 륨) 단일 해 부25,26 또는 microsampled27뉴런, 신경 고기 작은 분자 차이 캡처 metabolites를 감지에 사용 되었습니다. 우리는 최근 ESI 탠덤 Xenopus laevis16,28의 초기 배아에서 해 부 했다 개별 셀에 대사 산물의 수백의 추적 수준 검색 사용 하려면 MS에 CE를 적응. 이러한 연구 개발의 초기 단계에서 배아 세포 간의 놀라운 변화 차이 공개 하 고 알 수 없는 발달에 미치는 영향16와 대사 산물의 발견에 지도 했다.
여기 우리는 살아있는 척추 동물 배아 있지만 단일 셀 CE-ESI-MS29,30을 사용 하 여 직접 단일 셀에 대사 산물의 탐지를 사용 하는 프로토콜을 제공 합니다. 선택한 모델 유기 체는 8-하-32-셀 X. laevis 배아 접근 개발 및 모델 생물의 다른 종류의 나중의 단계에 적용 됩니다. 이 프로토콜 ~ 10 nL 부분 확인 된 셀에 제자리에 형태학 상으로 복잡 한 발전 태아에서의 발음을 고해상도 이미징 시스템으로 지도 다축 변환 제어 날카롭게 모세를 사용 합니다. 이 있지만 작은 셀에 확장 하 고는 태아에서 세포 계보를 추적 하기 위해 충분히 빨리 초 이내에, 작동 한다. 극 지 추출 또는 apolar 작은 분자 대사 산물 등 4 ~ 5에서 수집 된 샘플에서 펩 티 드 후 µ L 추출 솔루션, ~ 10 결과 추출의 nL ESI 질량 분석기에 하이픈이 맞춤식 CE 플랫폼에서 분석 된다. 건설 및 CE-ESI-MS 플랫폼의 다른 곳에서 설명 하는 프로토콜에 작성 합니다. 31 , 32 동축 CE ESI 인터페이스 설명 되어 있는 대로 구성 되어 있습니다. 31 이 플랫폼은 4-5 로그 순서 동적 범위 (상대28,29,30 추적 수준 감도 정량화에 대 한 기능을 달성 하기 위해 콘 제트 분사 정권 유지 또는 절대16). CE-ESI-MS 플랫폼 정량에 10의 테스트 범위는 60-박 한 8% 상대 표준 편차 (RSD)와 탐지의 제공 nM 1 µ m 작은 분자16, X에에서 내 인 성 대사 산물의 특성을 충분 한입니다. laevis 셀. Microprobed 셀 분할 개발30, 세포질 물질 대사의 해결된 일시적으로 그리고 공간 분석에 대 한 허용을 통해 배아 진행으로 계속. 실제로, 단일 셀 CE-ESI-MS 대사 차이 복 부 등16,29, 동물 식물16, 그리고 왼쪽 오른쪽28 개발 축으로 셀을 차지 하는 셀을 찾는 데 사용할 수 있습니다. 그 X. laevis30에서 일반적인 조상 세포에서 신경 조직 운명 등 계보를 형성 한다. 우리는 여기에 설명 된 프로토콜 생체의 광범위 한 배열에 적용 되는 예상 쿼리 X. laevis 배아30의 다른 발달 단계에서 개별 배아 세포의 대사 차이, 외 고 단일 셀 셀 및 모델 생물의 배아 발달의 다른 단계에서 microsampled. 또한, 다른 플랫폼 호환-조금만 샘플 분리 및 생체의 특성에 사용할 수 있습니다.는 있지만 microsampling에 사용 될 수 있습니다.
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Protocol
유지 보수에 관련 된 모든 프로토콜 및 Xenopus laevis 의 취급 기관 동물 관리 및 사용 위원회 조지 워싱턴 대학에 의해 승인 되었다 (IACUC 없습니다. A311)입니다.
1. 악기, 미디어, 용 매, 샘플링 하 고 샘플링 요리 준비
- 다음 순서로 초순 (25 ° C에서 ~18.2 MΩ.cm)에 다음과 같은 염을 용 해 하 여 스타의 솔루션 (SS) x 1을 준비 하 고 표준에 따라 지정 된 농도에서33프로토콜: 염화 나트륨 (58.2 m m), 염화 칼륨 ( 0.67 m m), 칼슘 질산염 (0.34 m m), 황산 마그네슘 (0.83 m m), 트리 스-염 산 염 (4.19 m m), 그리고 트리 스 베이스 (0.66 m m). 두 배에 의해 SS x 0.5와 0.1 x 1의 ten-fold 희석에 의해 SS SS 초순 수를 사용 하 여 x.
- 해산을 20 분 동안 120 ° C에서 SS. 압력솥 x 1에서 처음 만드는 2 %agarose 여 샘플링 요리 준비. 그러나 여전히 액체 솔루션 60 mm 페 트리 접시의 하단 코트. Agarose 젤은 냉각 하 고 고형화, 일단 불꽃 6 인치 파스퇴르 피 펫의 끝 그것 공을, 형성 될 때까지 가볍게 터치는 agarose로 5-10 웰 스, ~ 1 m m 깊은, 인쇄물을 열된 끝.
참고:이 웰 스 샘플링 동안 배아를 무력화 하는 데 사용 됩니다. - 대사 산물 추출 용 매를 준비 합니다. 용 매 (예:극성, pH)의 물리 화학적 특성 연구에 관심 있는 분자의 클래스에 맞게.
참고: 예를 들어 우리가 사용 하 여 40% 메탄올과 LC-MS-등급 물에 40% 이기 발견 접근 방식으로 주로 극 지 대사 산물, 및 몇 가지 apolar 대사 산물 및 펩 티 드28. - 깨끗 한 머리와33 부드럽게 이동 하는 배아 최소한의 섭 동으로는 접시에 설명 되어 있는 대로 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 머리 루프를 확인 합니다.
- 그림 1a와 같이 테이퍼 팁 micropipettes를 조작.
- 먼저, 다음과 같은 설정으로 불타는-브라운-타입 모 세관 끌어당기는 사람에 붕 모세 혈관 (1000/500 µ m 외부/내부 직경)를 당겨: 열 = 355; 풀 = 65, 속도 = 80; 시간 = 150.
- 다음, 휴식-오프 ~ 20 µ m.의 외부 직경 정밀도 재현성을 원조 하는 stereomicroscope 아래이 단계를 수행 하는 모 세관 팁을 얻기 위해 좋은 날카로운 집게의 쌍을 사용 하 여 가져온된 micropipette의 팁.
참고: 작은 팁과 모 세관 점성 세포질의 열망 하는 동안 막는 경향이 있다. 큰 팁 모세 혈관 막힘을 방지 하 고 세포 콘텐츠의 더 많은 발음에 확실히 도움이, 큰 구멍 모세 혈관 작은 셀의 샘플링 동안 도전을 제기 하 고 아마도 후속 샘플링에 대 한 셀을 손상 수 있습니다. 압력의 조정 및 포부의 시간 부분적으로 이러한 문제를 완화 수 있습니다 않도록 주의 하십시오. 우리 ~ 20 µ m 외부 직경을 가진 micropipettes를 여기에 제시 된 작품에 대 한 이상적인 찾으십시오.
2. Microsampling 단일 세포 및 대사 산물 추출
- 배아 (수정 란된 계란) 성인 Xenopus laevis 의 자연 짝짓기 생식 샘 자극 호르몬 유도 통해 얻거나 다른 프로토콜 에서 체 외 수정에 설명 된 대로 통해33,34.
참고: 배아 발달 단계 배아 체 외에서 수정 여는 공급에 더 신뢰할 수 있는 정열은 하면 자연 짝짓기. 그러나, 체 외에서 수정 성인 남성 개구리를 희생 해야 합니다. - 갓 시스테인의 4 g 초순 물 200 mL에 용 해 하 여 2% 시스테인 dejellying 솔루션을 준비 하 고 dropwise pH 8 10 N 수산화 나트륨 용액을 사용 하 여 솔루션을 조정 합니다.
- 그들은 다음과 같이 2 셀 단계에 다니엘을 시작으로 태아를 둘러싼 젤리 코트를 제거: 하자 태아 2 분, dejellying 솔루션에 다음 부드럽게 배아 컬렉션의 표면에 고착에서 방지 하기 위해 추가 2 분 동안 그들을 소용돌이 요리입니다.
- 부드럽게 요리 내용 깨끗 한 비 커에 부 어 하 고 신속 하 게 비 커에서 dejellying 솔루션을 가만히 따르다. 0.1 x 계란 즉시 커버 SS 나머지 씻어 부드럽게 소용돌이, 솔루션, dejellying 및 다음 솔루션을 가만히 따르다. 4 번 배아를 철저 하 게 세척이 단계를 반복 합니다.
참고: 배아의 생존 능력을 보장 하기 위해 4 분 dejellying 솔루션에 노출을 제한 합니다. 포괄적인 프로토콜 젤리 코트를 제거 하는 다른 곳에서 사용할 수 있습니다33. - 1 dejellied 배아를 전송 페 트리 접시에 SS x. 판 내에서 크롤 링을 최소화, 100 mm 접시33당 ~ 100 배아를 배치 합니다.
참고: 요리 배아 개발을 감속 하 고 같은 부모에서 비틀 거리 며 발달 단계에서 배아를 얻을을 14-18 ° C 사이 저장할 수 있습니다. 성장과 개발의 온도 의존성에 대 한 추가 지침 및 다른 Xenbase에 게시33,35,,3637. - 고착 배아 2 세포 단계에서 어떤 틀에 박힌 염색에 별도 그릇에 자신 있게 정렬 표시 설립된 셀 운명 지도38,,3940대 등 복 부 축 합니다.
- Demarks midsagittal 비행기, 첫 번째 분열 명씩 양분 하 여 올바르게 cleaving 배아 식별는 음울 (복 부)와 가볍게 되도록 두 반쪽 미러 이미지41(등 쪽) 착 동물 극.
- 다축 micromanipulator (수동 또는 원격 제어)에 조작된 micropipette를 탑재 합니다. microinjector에는 micropipette를 연결 합니다.
- 5 ~ 8 세포 배아의 발음을 포함 된 0.5 샘플링 접시에 그들을 전송 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여 SS x.
참고: 착 색 및 세포 운명 지도38,,3940에 관하여 태아의 위치에 따라 셀을 식별 합니다.
참고: 예를 들어 우리가 일상적으로 발음 ~ 10-15-30 psi의 ~ 3 펄스는 모 세관을 적용 하 여 셀에서 nL 볼륨. 이 모든 단계 지속 ~ 5 포부30s.
- 단단히 유리병을 증발 방지 유리병 4 ° C 얼음 양동이로 다시 샘플링 완료 될 때까지 닫습니다. 사용된 micropipette needlestick 위험을 방지 하기 위해 sharps 용기에 폐기.
참고: aspirated 셀 콘텐츠의 볼륨을 확인 하려면 미네랄 오일, 어디 그것은 얻는다 구형에는 aspirate를 삽입할. 현미경을 사용 하 여이 구의 직경을 측정할 수 있습니다. 발음된 볼륨 계산: V = 4/3 π r3, V 는 볼륨, 그리고 r 은 구의 반지름.
3. CE-ESI-MS 측정
- CE-ESI-MS에 대 한 표준 및 솔루션의 준비
- LC MS 학년 물에 1% 포 름 산으로 구성 된 배경 전해질 (BGE)를 준비 합니다.
- LC MS 학년 물과 0.1% 개미 산에 50% 메탄올을 포함 하도록 칼 집 솔루션을 준비 합니다.
- 매일 CE-ESI-MS 시스템의 성능 평가 대 한 칼 집 솔루션에 50 nM 아 세 틸 콜린 솔루션을 준비 합니다.
- 긍정적인 이온 모드에서 낮은 m/z 범위에 대 한 질량 교정 표준으로 150 m m 나트륨 염화 물 솔루션을 준비 합니다. 질량 (m/z) 정확도 < 10 ppm는 것이 좋습니다. 이 단계를 수행 하는 질량 분석기 공급 업체의 지침을 따릅니다.
참고: 또는, 알려진된 m/z 값을 가진 다른 표준은 사용할 수 있습니다 질량-질량 분석기를 보정 하.
- CE-ESI 플랫폼의 건설
- BGE 유리병 및 microvial를 로딩 하는 샘플을 들고 무대의 급속 한 수직 번역 수 있는 CE 주입 플랫폼을 구성 합니다. 건설 및 플랫폼의 운영에 대 한 참조31에 세부 정보를 참조 하십시오.
- CE-ESI 인터페이스 (그림 1c)를 다음과 같이 조립 한다. 3-포트 T-연방으로 분무 금속 미터 (130/260 µ m 내부/외부 직경 및 ~ 35 m m 길이)를 탑재 합니다. ~ 40-100을 내 다 수 있도록 분무 미터 통해 분리 CE 모 세관 (40/105 µ m 내부/외부 직경 및 ~ 100 cm 길이) 피드 미터의 끝 넘어 µ m. 정확도 원조 하는 stereomicroscope에서 작동 합니다.
- 분무 솔루션 공급 나머지 포트 칼 집 솔루션 모 세관 (75/360 µ m 내부/외부 직경 및 ~ 100 cm 길이)를 연결 합니다. 적절 한 슬리브를 사용 하 고 손가락 강화 CE ESI 인터페이스의 누출 운영 연결. 어셈블리 및이 인터페이스의 문제에 대 한 내용은 이전 프로토콜31,32 를 참조 하십시오.
참고: 모 세관 크기는 신호 대 잡음 비율 (S/N) 및 별거의 기간에 영향을. 예를 들어 좁은 구멍 및 짧은 모 세관 더 높은 분리 전압42,43를 사용 하 여 빠른 분판 촉진 한다. 또한, 연구에 관심 있는 분자의 종류에 따라 분리 모세는 피하려고 최소화/원치 않는 분자 모 세관 벽 상호 작용44코팅 수 있습니다.
- 분무 솔루션 공급 나머지 포트 칼 집 솔루션 모 세관 (75/360 µ m 내부/외부 직경 및 ~ 100 cm 길이)를 연결 합니다. 적절 한 슬리브를 사용 하 고 손가락 강화 CE ESI 인터페이스의 누출 운영 연결. 어셈블리 및이 인터페이스의 문제에 대 한 내용은 이전 프로토콜31,32 를 참조 하십시오.
- 플레이트 홀더를 사용 하 여, 3-축 번역 단계에 CE ESI 인터페이스를 탑재 하 고 분무 미터 팁 질량 분 서 계 오리 피스 (그림 1c)에서 ~ 2 mm의 위치.
- 인터페이스의 깨끗 한 구성 요소, 1 µ L/min에서 분무 미터를 통해 분무 칼 집 해결책 및 모 세관 CE 분리 통해 BGE 제공 하 여 린스 합니다. 주사기 펌프를 사용 하 여 일정 한 속도로 용 피드.
- 모 세관 입구 끝에 주사기를 연결 하 여 각 측정 전에 CE 분리 모 세관을 플러시. 큰 주사기를 사용 하 여 충 진 및 용 매 공급 라인의 프라이 밍을 최소화 하기 위해.
참고: 실험 일반적으로 분무 칼 집 용 매 및 500 µ L 주사기를 분리 모 세관을 1 mL 가스 꽉 주사기 사용 합니다.
- CE-ESI-MS 플랫폼 및 대사 산물의 측정의 유효성 검사
참고:이 단계의 목표는 단일 셀 추출 물 분석 하기 전에 매일 CE-ESI-MS 악기의 분석 감도 확인 하는.
- Rinsing 후 분리 ~ 5 분, 모 세관의 입구 스테인리스 유리병에 위치한 BGE 솔루션에 전송 합니다.
- 분무 미터 팁 ~ 2 m m 질량 분 서 계 오리 피스에서의 위치와 스프레이 stereomicroscope를 사용 하 여 모니터링 하는 동안 안정적인 콘 제트 정권에서 분무를 생성 하는 번역 단계를 사용 하 여이 거리 미세 조정 (참조 31,45). ~ 30-45에 대 한 총 이온 전류 (TIC)의 안정성을 모니터 분 안정적인 동작을 보장.
- 적용 ~ 20 kV ~ 15 잠재력 점차적으로 증가 하 여 BGE 유리병에 일반적으로 BGE로 1% 개미 산을 사용 하 여 분리 모 세관에 걸쳐 ~7.5 µ A 전류를 생성 하는 s. 각 측정 하기 전에 5 ~ 10 분, TIC 프로필을 모니터링 하 여 시스템 안정성을 보장 및 다음 현명한 분리 (CE) 가능성이 0 V (접지).
참고: 반 자동화를이 과정, 우리는 사용자 작성 소프트웨어를 사용 CE 고전압 전원 공급 장치31를 원격으로 제어. 경우 CE-ESI-MS 플랫폼, ESI 전용 모드로 처음 CE-ESI-MS 플랫폼을 테스트 하 여 불안정의 소스를 평가 하 고으로 CE ESI 작동 모드에서 다른 권장31신중 하 게. 간단히, ESI 전용 모드에서 플랫폼 테스트, CE 높은 전압을 해제 하 고 콘-제트 분사 정권에서 ~ 30 분 TIC를 모니터링 키를 누릅니다. 필요한 경우 주소 오류를 다음과 같이 하십시오: (i) 누수;에 대 한 연결 검사 (ii) 청소와 물, 소 프로 파 놀, 물, 메탄올; 분무 미터 (iii) 탈 가스 용 매; (4) 다시 테스트 하기 전에 25 분 미터를 플러시. 경우 CE ESI 플랫폼 ESI 전용 모드에서 안정 되어 있으면 불안정 CE 분리 하는 동안, 줄 난방 및 전기 시스템 검사: (i) 25 분 BGE와 분리 모 세관을 플러시하고 반복 실험; (ii) 낮은 분리 잠재력 유지 하기 위해 사용 선형 저항 응답 (즉, 선형 CE 분리 전압 곡선 대 현재); (iii) 균열, 같은 잠재적인 손해에 대 한 CE 모 세관 검사 하 고 필요한 경우 모 세관을 바꿉니다. - 분석 ~ 6 nL 다음과 같이 샘플의:
- 아 세 틸 콜린 표준 솔루션의 1 µ L 주입 작은 유리병에 플라스틱.
- 주입 작은 유리병으로 BGE 유리병에서 분리 모 세관을 전송.
- 1s에 CE 주입 단계를 15 cm를 들어올립니다.
- 60에 대 한 높은 무대를 잡고 s hydrodynamically ~ 6 주사를 분리 모 세관으로 샘플의 nL.
- 그 후, 무대 (모 세관 콘센트)에 맞춰 레벨을 시작에 다시 번역 합니다.
- 부드럽게는 BGE로 모 세관 입구 끝을 이동합니다.
- 직후, CE 전압 전기 이동 별거를 시작을 최대 진입로.
- 시작 MS 데이터 취득입니다.
참고: 시스템 성능은 수 수 특징 어떤 화학 표준을 사용 하 여. 단일 셀 CE-ESI-MS 제공 ~ 10에서 검출 한계 낮은 아 세 틸 콜린, 메티오닌, 히스티딘16nM (~ 60 박). 볼륨을 주입 (Vinj), nL에 모 세관에 따라 달라 집니다 (H, cm) 높이 차이에 주입, 밀도 (ρ, g c m-3) 고 점도 (η, k g m-1의-1) 동안 BGE, 길이 (L, m)와 CE의 반경 (r, µ m)의 모 세관, 그리고 주입 기간 (injt, s). 이 관계는 g (m s-2)가 중력 가속도 다음과 같은 수식으로 표현 됩니다.
- 일단 표준 검색 데이터 수집을 중지, 분리 전압을 0 V stepwise (접지), 낮은 다음 구멍에서 2 cm이 미터를 검색 합니다. 셀 추출 분석 하기 전에 5 분 동안 분리 모 세관을 플러시.
- 단일 셀의 측정 10 nL 3.3.1-3.3.5 단계를 반복 하 여 추출 90를 사용 하 여 hydrodynamically 샘플을 주입 하는 s.
참고: 데이터 처리의 목표를 식별 하 여 단일 셀 사이의 화합물 계량입니다. 단일 셀 CE-ESI-MS 프로토콜 몇 초의 전형적인 기본 폭 좁은 electropherographic 봉우리를 생성합니다. 반 수동으로 데이터 분석을 수행 하 여 그것은 분자 기능 (고유한 마이그레이션 시간 고유 m/z 값)을 찾을 수 다음 단계를 사용 하 여. 대표 분리 선택 확인 된 metabolites 그림 2a에 표시 됩니다.
- 원시 데이터 파일 질량 보정 데이터 수집 게시.
참고: 우리는 나트륨 편대 클러스터 샘플에서 풍부한 나트륨 이온의 분리 하는 동안 생성 되는 기본적으로 셀에 현재 또는 배아 배양에서 추출 된 신호를 사용 합니다. 이 단계의 목표는 높은 질량 (m/z) 정확도 선호 함으로써 나중 단계에서 대사 산물 식별을 강화 하는 <, 5 mDa 또는 < 10 ppm, m/z 50-1, 000 사이. 여기, 포스트 데이터 수집 교정은 정기적으로 대량 정밀도 얻을 수 < 1 mDa 또는 < m/z 50-500에 대 한 2 ppm. - 검색 된 대량 범위에 걸쳐 분자 기능에 대 한 검색 처리 스크립트를 사용 하 여. 각 피크 정확한 질량을 결정 하 고 해당 마이그레이션 시간을 메모를 통해 질량 스펙트럼을 평균 한다. M/z 50-500 범위에 낮은 질량 metabolites의 식별에는 500 mDa 단계 창을 사용 하 여 S/n 분자 기능 모니터링 > 3.
- 수동으로 또는 자동으로 피크 영역-에서-는-곡선 각 분자 기능을 통합 합니다. 결과 영역 값 대사 산물 풍부의 측정으로 사용 된다.
- (그림을 참조 하는 다음과 같이 높은 신뢰와 관심의 분자 기능 식별
- 첫째, 대사 산물 데이터베이스 (예:Metlin46 , HMDB47)에 대 한 분자 특징의 정확한 질량을 비교 하 여 10 ppm 정확도 putative 대량 성 냥의 목록을 가져올 수 있습니다.
- 다음,이 대량 성 냥을 평가 하는 셀에서 얻은 그들의 탠덤 질량 스펙트럼을 비교 하 여 대사 산물 데이터베이스 또는 탠덤 질량 스펙트럼에서 사용할 수 있는 데이터로 추출 해당 화학 표준에 대 한 측정.
- 마지막으로, 분자 기능 같은 CE-ESI-MS 악기에 의해 분석 관련 화학 표준 셀 추출 물에 기록의 마이그레이션 시간을 비교 하 여 이러한 과제를 확인.
참고: 실험 처리량을 향상 시키기 위해, 우리가 일반적으로 식별 실험 조건 또는 세포 유형 사이 통계적으로 크게 다른 분자 기능. 대표 신원 그림 2에 표시 됩니다. 높은 대량 정확도와 대사 산물을 식별, 좋습니다 외부 보정 질량 분석기는 매일, 내부 표준을 사용 하 여 또는 외부 질량 보정 각 측정 각 측정 하는 동안 실시간 재 수행 파일 후 데이터 수집 (예를 들면, 나트륨 편대 클러스터 여기)는 것이 좋습니다.
참고: 우리의 실험에 온라인 소프트웨어 플랫폼47 를 사용한 다음 단계를 포함 하 여 이후의 데이터 분석의 모든 단계를 수행: 나) 각 샘플 세트 (예를 들어, 셀의 50% 이상에서에서 발생 된 분자 기능의 필터링 유형); ii) 정규화 데이터; iii) 통계 (예:, t-테스트)와 다변량 데이터 분석, 주성분 분석 (PCA) 등 계층적 클러스터 분석 (HCA). 우리 p 를 사용 하 여 < 0.05 (학생의 t-테스트) 통계적 의미를 표시 및 배 변경 ≥ 1.5 생물학 중요성을 주의 하는.
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Representative Results
우리는 최근 있지만 단일 셀 고용 CE-ESI-MS 자유롭게 Xenopus laevis 배아29,30개발에 개별 확인 된 셀에 대사 산물의 특성. 있지만 빨리 가능 (~ 5 초/셀), 제자리에 ~ 10의 포부 nL 개별 셀, 같은 셀의 여러 포부 또는 라이브 배아 (그림 1b)의 개발의 동일한 이상 단계 내의 여러 다른 셀에서. Aspirated 셀룰러 콘텐츠를 적당 한 용 매를 사용 하 여 추출 되 고 대사 산물 다음 구분 및 맞춤식 CE ESI 인터페이스를 사용 하 여 이온화와 양 Typically 접근 수익률 (제거 후 ~ 300 비중복 대사 산물 신호 감지 동위 원소 봉우리 클러스터) 각 셀에서. 분리는 그림 2a에서선택 분자에 대 한 궁 행. 우리 작은 극 지 대사 산물, 마이그레이션 시간을 기준으로 높은 자신감과 70 다른 신호를 식별 하 고 셀의 MS/MS 조각화 패턴 추출 신호를 비교 하는 표준 또는 탠덤 질량 스펙트럼 라이브러리에서. 예를 들어 그림 2b 히스티딘이 직교 조각의 정보 조합에 따라 자신감 식별을 표시 합니다.
현미경 CE-ESI-MS의 대사 차이 단일 셀의 정량화 할 수 있습니다. CE-ESI-MS는 8 %RSD 선택 이온 electropherograms16,30에 곡선에서 피크 넓이의 양적 반복성. 현미경 샘플링,이 기술 재현성은 14% RSD30, 쿼리 신진 대사 활동 차이 통계 및 생물 학적 의미 하는 셀 사이 충분 한입니다. 예를 들어, 그림 3 그 미생물 CE-ESI-MS 제자리에서 마이크로-샘플링 3 등 세포 유형 (그림 3a)의 사용을 보여준다. 또한, PCA 양적 메타 데이터의 8 세포 배아의 확인 된 조상 세포 신진 대사 변화를 발견 (참조 D1R 셀) 16 셀에 셀 클론을 형성 하기 위하여 분할 (참조 D11R 셀)와 32 셀 (D111R 셀) 배아 (그림 3b). 대표 동향은 그림 3 c에서 선택 대사 산물에 대 한 표시 됩니다. 반면 trolamine 동향과 Ser-Arg 보여 반대에 셀 유형 같은 아 세 틸 콜린 대사 산물 세포 분열와 풍부 하 게에서 감소 합니다. Trolamine에서 8-16 셀 배아에 풍부 하 게에서 감소 하 고 Ser Arg 32 셀 배아에 감소 하기 전에 16 셀 배아를 늘려 반대 추세를 묘사 하는 동안 다음 32 셀 배아에 농축 되었다. 아르기닌이 셀 단계 사이 크게 변화 하지 않았다. 이러한 트렌드는 X. laevis의 초기 발달 단계를 기초 하는 기본 프로세스에 더 많은 빛을 발산 하는으로 예상 된다.
그림 1: 제자리에 있지만 단일 셀 모 세관 전기 이동 법 (세 륨) 질량 분석 (MS)에 대 한 실험적인 워크플로. (A) 후 microsampling에서 사용 하기 위해 20 µ m 외부 직경에 팁을 고착 하기 전에 micropipettes (맨 위)와 (아래)를 조작. (B) Microsampled 8 세포 배아로 분할 하기 위하여 계속 세포 vivo에서 학문을 위한 무대를 열어 16 셀 단계에 개발. (C) 확인 단일 셀 8 셀 Xenopus laevis 배아 (D1R 셀 및 참조 V1R) 현미경 (µ P)를 사용 하 여 샘플링 된, 세포 대사 산물 추출 및 CE 양 규모 막대를 사용 하 여 분석 = 250 µ m (어두운/회색); 10 m m (흰색)입니다. 키: SP, 주사기 펌프 (숫자 참조29,30허가 적응.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 현미경 단일 셀 CE-MS metabolites의 자신감 식별 수 있습니다. 선택 확인 된 대사 산물에 대 한 (A) 대표 electropherogram. 히스티딘의 (B) 식별 표준 대사 산물에 대 한 데이터 (충돌 유도 된 분리)의 정확한 질량, 이동 시간, 및 조각화 비교에 기반. 키: 1, 메 틸 히스티딘; 2, homolysine; 샘, S-adenosylmethionine; 온, ornithine; 차, triethylamine; 자동차, carnitine; AcCho, 아 세 틸 콜린; AcCar, acetylcarnitine; HPX, hypoxanthine; GSH, 티 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 양적 변화 차이 X. laevis에서 등 쪽 계보를 형성 하는 단일 셀. (A) 8 세포 배아와 해당 하위 항목, 16 셀 배아에서 D11R 셀 및 32 셀 배아에서 D111R 셀의 조상 D1R 셀의 광학 이미지. (B) 교장이 세 세포 유형 잠복 다른 신진 대사 프로필에에서 계량 하는 대사 산물의 구성 요소 분석 (PCA). 각 데이터 요소는 다른 셀 (참조 번호)는 기술 복제 (연결된 점)에 측정 되었다. 타원은 95% 신뢰를 표시합니다. 차이 (ANOVA)의 (C) 분석 및 게시물-특별 피셔의 최하위 줄이기 위해서는 판별식 분석 셀 단계에 걸쳐 복잡 한 변화 추세를 보여준다. 상자 플롯에 대 한 사각 평균 상자는 1 × 표준 오차 (SEM), 의미 이며, 수염은 1.5 × SEM. 키: *p < 0.05; ns, 큰 차이 스케일 바 = 250 µ m. (숫자 참조30허가 적응.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
현미경 CE-ESI-MS 라이브, 자유롭게 개발 배아에 단일 세포에서 대사 산물의 직접 특성을 수 있습니다. 접근 방법의 핵심은 두 가지 기술 하위 구성 요소, 즉 제자리에서 모 세관 microsampling 및 높은 감도 CE-ESI-양 전체 셀 절 개에 비해, 모 세관 microsampling는 빠른 작업 (몇 초 5 분 대의 이점이 있다 / 해 부에 의해 셀), 배아, 그리고 개발의 나중 단계에서 형성 하는 작은 세포를 확장성의 복잡 한 3 차원 형태와의 호환성. 해 부, 달리 현미경 샘플링 그대로 유지 다른 세포는 배아에서 후속 분석을 위한 됩니다. 글, microsampled 셀 수 계속 분열, 세포 분화. 의 장기 연구에 대 한 가능성을 제기 현미경의 팁 크기를 제어 하는 능력은 또한 현미경을 CE-ESI-MS 셀 및 다른 모형 유기 체, 제 브라 등 마우스를 사용 하 여 개발 프로세스에서 신진 대사의 역할을 공부 하 고 다재 다능 한 툴으로 서 역할을 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위해서 중요 한 관심사의 세포는 정확 하 게, 정확 하 게, 그리고 일관 되 게 식별을 샘플링입니다. 포부 (예를 들어, 모 세관 크기, 압력 및 시간)의 실험적인 매개 변수 셀의 원하는 부분을 맞출 수 있습니다. 또한, 그것은 차례로 태아에 손상을 최소화 하는 관심의 셀을 대상으로 정밀도 향상 시키기 위해 배아를 무력화 하는 중요 한. 이 프로토콜에서 agarose 코팅 접시 샘플링 동안 배아를 무력화 하 내 우물을 만들었습니다. 우리의 경험에서는, 경사진 팁 모 세관 무딘 팁에 비해 셀에 최소한의 손상을 확인 합니다. 추가 샘플링 및 화학 분석의 개선 처리량에 따라서 중요 한 대사 산물 기본 셀 및 개발 프로세스를 식별 하기 위해 통계 분석 능력, 세포의 큰 인구 특성 수 있게 된다.
CE-ESI-MS의 목적은 추적 수준 감도 대사체의 특성을 사용 하입니다. CE 나노 흐름 액체 크로마토그래피 또는 가스 크로마토그래피와 같은 다른 인기 있는 분리 기술을 통해 단일 셀 연구에 대 한 상호 보완적인 장점을 제공합니다. CE는 복잡 한 대사체를 해결 하기 위해 절묘 한 분리 효율을 제공 합니다. CE의 물리적 크기 단일 세포에서 발생 하는 볼륨 제한 예제와 호환 됩니다. 또한, 다양 한 농축 기술 열, 따라서 탐지 감도 증폭에 샘플을 preconcentrate를 (예를 들어, 필드 증폭 샘플 스태킹 또는 동적 pH 접합) CE에 존재 한다. 성공적인 연구에 대 한 CE-ESI-MS 악기 특징와 있어야 매일 확인 합니다. 예를 들어 우리 60 박 아 세 틸 콜린 표준의 적어도 3의 S/N 필요 (6 50 nM 표준 주입의 nL)의 재현성 및 < 5% 분리 (마이그레이션) 시간에 RSD와 < 25% 정량화에 RSD 기준 피크 영역-아래--곡선에 표준에 대 한 선택 이온 electropherograms입니다. 대사 산물 (펩 티 드)의 CE-ESI-MS6,,1625 를 사용 하 여 단일 셀에 농도의 광범위 한 범위에 걸친 다양 한 종류의 측정을 용이 하 게 추적-민감한 감지 및 동적 정량화 , 31. 동안 우리는 일상적으로 300 ~ 다른 긍정적으로 위탁 대사 산물 신호 감지, CE-MS는 또한 부정적인 이온화 모드48, 호환 따라서 감지 부분의 단일 셀 대사체의 깊이 향상.
X. laevis 개발 공부에 대 한이 기술의 창조에 여러 장점을 제공, 현미경 CE-ESI-MS 수도 있습니다 다른 유형의 모형 유기 체에. Xenopus, 착 색 및 크기 차이 재현할 수 세포 운명 지도49 함께 셀 가능 하 게 알려진된 조직 운명을 가진 특정 셀을 식별 하. 이, 차례로, 발견 문을 엽니다 또는 셀 공고히 차별화를 향해 다른 발달 프로그램으로 전체 세포 계보의 대사 실험 대상. 다양 한 세포 주기 때문에 발생 하는 차이 제거 하려면 같이 다른50완전히 샘플링, 전에 다음 단계로 분할 배아를 허용 한다. 현미경 CE-ESI-MS 선택 세포 또는 세포 유형 사이 중요 한 dysregulation와 작은 분자의 개발 의미 테스트 하 고전 embryological 조작 또는 분자 도구 (예를 들어, 유전자 노크 아웃/아래)에 . 예를 들어 단일 셀 대사체학 녹색 형광 단백질의 표현을 통해 세포 운명 추적의 조합을 알 수 없는 발달에 미치는 영향16와 대사 산물의 발견에 지도.
단일 셀 대사체학 연구 분석 세부 사항, 특히 정량화;의 경우에 주의 깊은 관심에 대 한 전화 우리의 기술도 예외가 아니다. 이상적으로, 샘플 준비 작업의 각 단계 잠재적 저하 및 내 인 성 대사 산물 또는 샘플에 오염을 최소화 하기 위해 신중 하 게 평가 되어야 한다. 효소의 활동을 냉각 하 여 신진 대사 변화 경 음악 분석6 이전 샘플을 완화/방지 순도 변성 용 매 (예를 들어, LC/MS 등급), 산 또는 기초, 및 낮은 온도 (~ 4 ° C)의 사용 권장 , 51. 간단한 유기 솔루션 메탄올과 이기 수 작은 극 metabolites28의 효율적 추출. 물론, 대사 산물 (예를 들어, apolar 화합물, 지질)의 특정 클래스를 대상으로 하는 실험에서 미리 추출 용 매에의 구성에 맞게 혜택. 예를 들어 우리는 최근 여러 종류의 추출 용 매를 사용 하 여 단일 셀 대사체28의 범위를 향상 시연. 이러한 대사 산물의 정량화 대사 산물 추출 하는 동안 추출에 아군 수 있습니다 isotopically 레이블된 대사 산물 등 내부 기준에 의해 촉진 수 있습니다. 내부 표준 품질 보증에 대 한 추출 및 측정 단계, 따라서 기술 및 시스템 재현성 평가 및 샘플 analytes의 복구를 촉진에 도움이 있습니다. 마지막으로, 우리가 옹호 기술 복제 (여러 번 측정 하는 동일한 추출)에서 분석 하는 각 셀 (다른 세포 다른 배아에서 발음 하는)를 복제 하는 생물에 대 한 통계적 인 힘 및 결과의 해석에 도움을.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 연구소의 건강 보조금 GM114854 (P.N.)에 의해 지원 되었다 및 (P.N.)에 CA211635, 아놀드와 벨 베크만 재단 베크만 영 탐정 부여 (P.N.)는 듀 폰 영 교수 수상 (P.N.), 질량에 대 한 미국 사회 분석 연구 수상 (P.N.), 그리고 (R.M.O. E.P.P.)를 우주 클럽 재단 장학. 의견 및이 책에서 표현 하는 결론은 전적으로 그 저자 고 반드시 자금 출처의 공식 의견을 대표 하지는 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for Embryo Culture Media | |||
| Potasium chloride | Fisher Scientific | BP 366-1 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M 65-3 | |
| Calcium nitrate | Sigma Aldrich | C1396 | |
| Cysteine | MP Biomedicals | 101444 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma Aldrich | T3253 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolite Extraction Solvents | |||
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solvents and Standards for CE-ESI-MS | |||
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A11710X1-AMP | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Acetylcholine chloride | Acros Organics | 159170050 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Fabrication Setup | |||
| Micropippette puller | Sutter Instrument Co. | P-1000 | |
| Borosilicate capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel | Fine Science Tools (USA) Inc | 11252-30 | Corrosion resitant and autoclavable. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Sampling Setup | |||
| Micromanipulator | Eppendorf, Hauppauge, NY | TransferMan 4r | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | Should be vibrationally isolated. |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CE-ESI-MS Setup | |||
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure. |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Stereomicroscope | Amscope | SM-3BZZ | Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface. |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-built | This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary | |
| Stainless steel sample vials | Custom-built | ||
| Stainless steel BGE vial | Custom-built | ||
| Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP040105 | |
| Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP075375 | |
| Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) | Hamilton Co. | 21031A | For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip. |
| Syringes (gas-tight): 500 - 1000 µL | Hamilton Co. | 1750TTL | |
| Digital multimeter | Fluke | Fluke 117 | |
| High-resolution Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | Maxis Impact HD | High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI |
| Tunning mixture for mass spectrometer calibration | Agilent technologies | ESI-L G1969-85000 | |
| Data Analysis ver. 4.3 software | Bruker Daltonics | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ancillary Equipment | |||
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C | Labconco | 7310022 | |
| Analytical microbalance (XSE105DU) | Fisher Scientific | 01911005 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Fisher Scientific | 88300ASP | |
| Refrigerated Incubator | Fisher Scientific | 11475126 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 |
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