Summary
אנו מתארים צעדים המאפשרים דיגום מהיר בתוך באתרו של חלק קטן של תא יחיד עם דיוק גבוהה, הפלישה מינימלי באמצעות נימי מיקרו-דגימה, כדי להקל על אפיון כימי של תמונת מצב של פעילות מטבולית חיים העוברים באמצעות אלקטרופורזה נימי תא בודד לפי הזמנה ספקטרומטר מסה פלטפורמה.
Abstract
כימות של מולקולות קטנות של תאים בודדים מעלה סיכויי החדשה טובה יותר להבנת התהליכים basic העומדים בבסיס התפתחות. אפשר תא בודד לחקירות העוברים ישירות ב בשידור חי, גישות אנליטיות חדשות נדרשים, במיוחד אלה הן רגישות סלקטיבית, כמותיים, חזקים, מדרגי הגדלים תא שונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר הניתוח ב באתרו של חילוף החומרים בתאים בודדים בפיתוח בחופשיות העוברים על הצפרדע שנחטף ייזרק דרום אפריקאי (זריזה צפרדע רפואית), במודל רב עוצמה התא וביולוגיה התפתחותית. גישה זו משתמשת microprobe נימי לרוקן חלק מוגדר מתאי מזוהה יחיד בתוך העובר, עוזב את התאים הסמוכים שלם לניתוח עוקבות. תוכן שנאספו ניתוח מאת microscale אלקטרופורזה נימי ספקטרומטריית electrospray יינון (CE-ESI) ממשק מצמידים בספקטרומטר טנדם ברזולוציה גבוהה. גישה זו היא להרחבה כדי במגוון גדלים תא ותואמת מבנה תלת-ממדי מורכב של העובר המתפתח. לדוגמה, נדגים את microprobe שתא בודד CE-ESI-MS מאפשרת הבהרה של הטרוגניות תא מטבולית זה מתגלה תאים ובתאים מעורר צאצאים במהלך התפתחות העובר. מלבד התא, ביולוגיה התפתחותית, הפרוטוקולים ניתוח מתא בודד המתוארים כאן נתונות אחרים הגדלים תא, סוגי תאים או בבעלי חיים.
Introduction
הבנה מקיפה של התפתחות דורש אפיון של כל השינויים המולקולריים להתגלות בכל תא של האורגניזם המתפתח. בעוד הדור הבא רצף עם הגברה מולקולרית מאפשרת מדידה עמוק של תא בודד transcriptomes1 פיתוח מערכות2,3, הרבה פחות ידוע על הסוויטה של מולקולות קטנות מיוצר ע י תאים עובריים בודדים, כולל חלבונים, במיוחד, מטבוליטים (מסה מולקולרית < Da ~ 1500). עם תגובה מהירה ודינמית לאירועים פנימי, חיצוני, משמש metabolome מתאר רבי עוצמה של המדינה מולקולרית של התא. Metabolome תא בודד, ולכן מעלה את הפוטנציאל כדי לעקוב אחר התפתחות יכולות תא הטרוגניות של העובר מוקדם וכדי לזהות מולקולות חדשות ללימודי פונקציונלי. עם זאת, ללא זמין עבור מולקולות אלה מולקולרית הגברה, זיהוי של metabolome דורשת רגישות יוצאת דופן באמצעות ספקטרומטר מסה (MS), אשר היא הטכנולוגיה של בחירה עבור ניתוח מטבוליט.
תא בודד MS הוא אוסף של טכנולוגיות עם רגישות מספיק למדוד מטבוליטים של תאים בודדים (ראה הדעת 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). לשחזור דגימה של תאים, חילוץ יעיל מטבוליטים חיוניים גילוי מוצלחת של מטבוליטים של תאים בודדים. כל תא דיסקציה של מזוהה תאים מעוברים צפרדע רפואית איפשר האפיון של מולקולות קטנות, פפטידים16. גישות אחרות להעסיק micropipettes לטעום תאים חיים בודדים ואחריו זיהוי באמצעות ספקטרומטריית electrospray יינון (ESI) MS. לדוגמה, מטבוליטים נמדדו צמח או תאים בתרבית של תא בודד וידאו MS17, הלחץ בדיקה18, בדיקה אחת19ועל כוח fluidic מיקרוסקופ20, בין שאר טכניקות21, 22,23,24. בנוסף, התאגדות של הפרדה כימית לפני יינון לתוך תא בודד MS זרימת העבודה ביעילות מפשט את metabolome, וכך להפחית הפרעות אפשריות במהלך יון דור לפני זיהוי. חשוב, ההפרדה מספק גם מידע ספציפי המתחם כדי לסייע בהמשך המולקולרי ופיזיקליים. צינור קפילר אלקטרופורזה (CE) שימש לזהות מטבוליטים ביתור בודד25,microsampled וא26 27הנוירונים, לכידת מולקולה קטנה הבדלים בין תא עצב פנוטיפים. אנחנו לאחרונה המותאמים CE ESI טנדם MS כדי לאפשר זיהוי עקבות ברמת מאות מטבוליטים בתאים בודדים היו גזור מן העוברים מוקדם של צפרדע רפואית זריזה16,28. מחקרים אלה חשפו הבדלים מטבוליים מפתיע בין תאים עובריים בשלב מוקדם של התפתחות והוביל לגילוי של מטבוליטים בעבר לא ידוע השפעות התפתחותיות16.
כאן אנו מספקים פרוטוקול איפשרה הגילוי של מטבוליטים של תאים בודדים ישירות ב- העובר חוליות בשידור חי באמצעות microprobe תא בודד CE-ESI-MS29,30. האורגניזם דגם שבחרת הוא 8-ל-32-התא עובר X. laevis , למרות הגישה חל גם בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות וסוגים אחרים של אורגניזמים מודל. פרוטוקול זה משתמש נימים מחודדים עם שליטה translational ורב ציר תחת הדרכתו על-ידי מערכת הדמיה ברזולוציה גבוהה מחוק לגמרי ~ 10 nL חלק מזוהה תאים ב באתרו של העובר המתפתח מורפולוגית מורכבים. Microprobe זו היא מדרגית לתאים קטנים יותר ופועל תוך שניות, וזה מספיק מהר כדי לעקוב אחר שושלות תאים של העובר. לאחר חילוץ קוטבי או מולקולות קטנות apolar, כגון מטבוליטים, פפטידים, מדגם שנאספו ב ~ 4-5 µL חילוץ הפתרון, 10 ~ nL של התמצית המתקבלת ניתוח ב פלטפורמה CE לפי הזמנה במקף כדי ספקטרומטר מסה ESI. הקמה ותפעול של פלטפורמת CE-ESI-MS בונה על פרוטוקולים אחרים. 31 , 32 הממשק CE-ESI co-צירית נבנה כמתואר. 31 פלטפורמה זו נשמרת המשטר הריסוס קונוס-jet להשיג מעקב ברמת רגישות עם יכולת על כימות מעל 4-5 יומן-הזמנה טווח דינמי (יחסית28,29,30 או מוחלטת16). פלטפורמת CE-ESI-MS מציע מגבלה נמוכה יותר 60-ניסים מונטקיו של זיהוי עם סטיית תקן יחסית (RSD) 8% בכימות על מגוון שנבדקו 10 nM 1 מיקרומטר עבור מולקולות קטנות16, אשר מספיקים לאפיין אנדוגני מטבוליטים ב X. זריזה תאים. Microprobed התאים ממשיכים לחלק ככל מתקדם העובר דרך פיתוח30, מתן אפשרות לניתוח נפתרה חנותם והמרגשים של חילוף החומרים הסלולר. אכן, תא בודד CE-ESI-MS יכול לשמש כדי למצוא הבדלים מטבוליים בין התאים לכבוש את הגבי הגחוני /16,29, בעלי חיים-צמחי16, צירים התפתחותית משמאל28 וכן תאים זה טופס השושלת נגזר רקמה עצבית הגבי מתא קדמון משותף X. laevis30. מלבד הפעלת שאילתות מטבולית ההבדלים בין תאים עובריים בודדים בשלבים התפתחותיים שונים של העובר X. laevis 30, אנו צופים כי הפרוטוקולים המתוארים כאן הם חלים על מגוון רחב של מולקולות, microsampled תאים בודדים של שלבים שונים של התפתחות, כמו גם סוגים אחרים של תאים ואורגניזמים מודל. בנוסף, microprobe יכול לשמש microsampling בזמן פלטפורמה שונה תואם עם דגימות זעיר יכול לשמש עבור הפרדה ו/או אפיון של מולקולות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים הקשורים התחזוקה, טיפול של צפרדע רפואית זריזה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה באוניברסיטה. ג'ורג ' וושינגטון (IACUC אין. A311).
1. הכנת דגימה מכשירים, מדיה, ממיסים, המנות
- להכין 1 x הפתרון של שטיינברג (הה) על ידי המסת המלחים הבאים במים הנדסה גנטית (~18.2 MΩ.cm ב- 25 ° C) לפי הסדר הבא, בריכוזים המצוין בעקבות תקן פרוטוקול33: נתרן כלורי (58.2 מ מ), אשלגן כלורי ( 0.67 מ מ), סידן חנקתי (0.34 ממ), מגנזיום גופרתי (0.83 מ מ), טריס-הידרוכלוריד (4.19 מ מ), טריס בסיס (0.66 מ מ). 0.5 x SS מאת כפולה, ואם הוא 0.1 x SS על ידי דילול ten-fold, 1 x SS באמצעות הנדסה גנטית מים.
- להכין מאכלים הדגימה על ידי הראשון-מכינה 2% agarose 1 x השליחים הקדושים אוטוקלב ב 120 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי להמיס. אמנם עדיין נוזלי, מעיל התחתון של 60 מ מ צלחות פטרי עם הפתרון. ברגע הג'ל agarose מקורר, פני השטח למוצק, להבה סוף פיפטה פסטר שישה אינץ ' עד שהיא יוצרת כדור, נוגעים בעדינות הסוף מחוממת להטביע בה 5-10 וולס, ~ 1 מ מ עמוק, אל תוך agarose.
הערה: הבארות הללו משמשים כדי לשתק את העוברים במהלך הדגימה. - להכין מטבוליט החילוץ הממס. להתאים את המאפיינים physicochemical של הממס (למשל, קוטביות ו pH) בשיעורי של מולקולות המעניינים במחקר.
הערה: לדוגמה, אנו משתמשים מתנול 40% ו- 40% acetonitrile במים LC-MS-ציונים כמו בגישה גילוי כדי להתמקד בעיקר קוטבי מטבוליטים, ו כמה apolar מטבוליטים של פפטידים28. - להפוך שיער לולאות באמצעות השיער הנקי של פיפטה פסטר כמתואר33 להעברת העוברים בעדינות, צלחות פטרי עם ההפרעות מינימלי.
- לפברק צמצום-טיפ micropipettes כפי שמוצג באיור 1a.
- ראשית, להכניס בורוסיליקט נימים (1000/500 מיקרומטר קוטר חיצוני/פנימי) פולר נימי בוער-בראון-type עם ההגדרות הבאות: חום = 355; משיכה = 65, מהירות = 80; זמן = 150.
- בשלב הבא, מעבר-מקצה micropipette משך באמצעות זוג מלקחיים חדה בסדר כדי להשיג טיפ נימי הקוטר החיצוני של ~ 20 מיקרומטר. לבצע שלב זה תחת stereomicroscope כדי לסייע דיוק ואת הפארמצבטית.
הערה: נימים עם טיפ קטן נוטים סתימת במהלך השאיפה של הציטופלסמה צמיגה. בעוד נימים עם טיפ גדול בהחלט לעזור למנוע סתימת ואת האחות יותר של תוכן סלולרי, גדול נשא נימים עשויים להוות אתגרים במהלך הדגימה של תאים קטנים יותר, יכול לגרום נזק התא עבור הדגימה הבאים. זהירות על ההתאמה של הלחץ והזמן של השאיפה עשויה חלקית להקל על האתגרים הללו. אנו מוצאים micropipettes עם ~ 20 מיקרומטר הקוטר החיצוני אידיאלי עבור העבודה המוצגת כאן.
2. Microsampling חד תאים, מטבוליט חילוץ
- להשיג את העוברים (הביצים) דרך גונדוטרופין-induced לטבעי להזדווגות של מבוגרים זריזה צפרדע רפואית או דרך במבחנה הפריה כפי שמתואר פרוטוקולים במקום33,34.
הערה: לטבעי להזדווגות מבטיחה כי העובריים התפתחותית הם התנודדה בזמן עוברי מתקבל על ידי הפריה במבחנה אמינים יותר באספקת. עם זאת, הפריה במבחנה מחייבת להקריב את הצפרדע זכרים בוגרים. - טרי להכין 2% ציסטאין dejellying פתרון על ידי המסת 4 g של ציסטאין לתוך 200 מיליליטר מים הנדסה גנטית, dropwise להתאים את פתרון ה-pH 8 באמצעות תמיסת נתרן הידרוקסידי N 10.
- הסר את המעילים ג'לי המקיפים את העוברים כשהם מתחילים לדבוק לשלב 2-תא כדלקמן: תן עוברי לנוח על הפתרון dejellying למשך 2 דקות, ואז בעדינות מערבולת אותם למשך 2 דקות נוספות למנוע עוברי הקפדה על פני השטח של האוסף תבשיל.
- בעדינות שופכים תוכן המנה לתוך גביע נקי, במהירות decant הפתרון dejellying מ הספל. מיד לכסות את הביצים עם 0.1 x SS כדי לשטוף הנותרים dejellying פתרון, בעדינות מערבולת ולאחר מכן decant את הפתרון. חזור על שלב זה ארבע פעמים לשטוף ביסודיות את העוברים.
הערה: להגביל את החשיפה של העוברים פתרון dejellying 4 דקות כדי להבטיח יכולת הקיום. פרוטוקולים מקיפה כדי להסיר את המעילים ג'לי זמינים במקום33. - העברת העוברים dejellied 1 x SS בצלחת פטרי. כדי למזער את הצפיפות בתוך הלוחות, במקום ~ 100 עוברי לכל מנה 100 מ מ33.
הערה: ניתן לאחסן הכלים המכיל העוברים בין 14-18 ° C כדי להאט את התפתחות ולקבל עוברי-מעד שלבים התפתחותיים אותם ההורים. הנחיות נוספות על התלות בטמפרטורה של צמיחה והתפתחות מתפרסמים על Xenbase ובמקומות33,35,36,37. - מיון ביקוע העוברים בשלב 2 תאים לתוך תבשיל נפרדים באילו פיגמנטציה סטריאוטיפי בביטחון מסמן את הציר הגבי הגחוני /, התייחסות תא הוקמה גורל מפות38,39,40.
- לזהות כראוי שהפריד העוברים על-ידי הבטחת שחוצה פארו המחשוף הראשון, אשר demarks את המטוס midsagittal, האפלה (הגחון) בקלילות (הגבי) פיגמנט מוט חיה כך שני החצאים הם תמונות מראה41.
- הר של micropipette מפוברק על micromanipulator ורב ציר (ידני או מבוקר מרחוק). לחבר את micropipette microinjector.
- השתמש פיפטה העברה פלסטיק תשאף ~ 5 של העוברים שמונה תאים ולהעביר אותם לתוך המנה דגימה המכילה 0.5 x SS.
הערה: לזהות את התאים המבוסס על פיגמנטציה, מיקום העובר, התייחסות תא גורל מפות38,39,40.
הערה: לדוגמה, אנחנו באופן שגרתי תשאף ~ 10-15 nL נפח מהתא על-ידי החלת ~ 3 פולסים של-30 psi נימי. זה כל שלב נמשך ~ 5 s השאיפה30.
- סגור בחוזקה את הצנצנת כדי למנוע אידוי ומניחים את המבחנה בחזרה לתוך דלי קרח 4 ° C עד דגימה תושלם. למחוק את micropipette בשימוש לתוך מיכל שרפ כדי למנוע סיכון needlestick.
הערה: כדי לקבוע את עוצמת הקול של תוכן התא aspirated, להזריק את וביופסיה לתוך שמן מינרלי, שבו הוא מקבל צורה כדורית. ניתן למדוד את קוטר בנחישות באמצעות מיקרוסקופ. לחשב את עוצמת הקול aspirated: V = 4/3 π r3, כאשר V הוא אמצעי האחסון ו- r הוא הרדיוס של הספרה.
3. CE-ESI-MS מדידה
- הכנה של סטנדרטים ופתרונות CE-ESI-MS
- להכין האלקטרוליט רקע (BGE) בהיקף של 1% חומצה פורמית במים כיתה LC-MS.
- להכין את הפתרון נדן להכיל 50% מתנול ב LC-MS כיתה מים ו- 0.1% חומצה פורמית.
- היכונו 50 ננומטר אצטילכולין פתרון בפתרון נדן יומי הערכת הביצועים של המערכת CE-ESI-MS.
- להכין פתרון נתרן כלוריד 150 מ מ כיול מסה סטנדרטי עבור הטווח נמוך מ/z במצב יון חיובי. הדיוק מסה (מ/z) של < מומלץ 10 עמודים לדקה. ההוראות של הספק ספקטרומטר מסה לבצע שלב זה.
הערה: לחלופין, תקנים נוספים עם ערכים ידועים מ/z ניתן לכייל מסה ספקטרומטר מסה.
- בנייה של פלטפורמת CE-ESI
- לבנות פלטפורמה הזרקת CE מסוגל תרגום אנכי מהיר של שלב מחזיק את המבחנה BGE ולדגום את טעינת microvial. עבור הקמה ותפעול של הפלטפורמה, מתייחסים לפרטים ב הפניה31.
- להרכיב את הממשק CE-ESI (איור 1 c) כדלקמן. בעיא ספקטרומטריית electrospray מתכת פולט (130/260 µm פנימי/חיצוני בקוטר ו ~ 35 מ מ אורך) T-איחוד 3 יציאות. להאכיל את נימי ההפרדה לסה נ (40/105 µm פנימי/חיצוני בקוטר ו ~ 100 ס מ אורך) דרך פולט ספקטרומטריית electrospray השירי לבלוט ~ 40-100 מיקרומטר מעבר לקצה פולט. עבודה תחת stereomicroscope כדי לסייע לדיוק.
- חבר את נימי פתרון נדן (75/360 µm פנימי/חיצוני בקוטר ו ~ 100 ס מ אורך) ליציאת הנותרים כדי לספק את הפתרון ספקטרומטריית electrospray. השתמש שרוולים המתאים והדק אצבע-חיבורים לפעולה ללא דליפה של הממשק CE-ESI. עיין הקודם31,פרוטוקולים32 לפרטים על מכלול, וגישה לפתרון בעיות של ממשק זה.
הערה: מידות נימי משפיע על יחס אות לרעש (S/N) וכן את משך הזמן של הפרדה. לדוגמה, נימים נשא צר וקצר להקל הפרדות מהיר באמצעות הפרדה גבוהה יותר מתחים42,43. בנוסף, בהתאם לסוג מולקולות המעניינים במחקר, ייתכן מצופה ההפרדה נימים למזער/למנוע קיר מולקולה-נים לא רצויים אינטראקציות44.
- חבר את נימי פתרון נדן (75/360 µm פנימי/חיצוני בקוטר ו ~ 100 ס מ אורך) ליציאת הנותרים כדי לספק את הפתרון ספקטרומטריית electrospray. השתמש שרוולים המתאים והדק אצבע-חיבורים לפעולה ללא דליפה של הממשק CE-ESI. עיין הקודם31,פרוטוקולים32 לפרטים על מכלול, וגישה לפתרון בעיות של ממשק זה.
- משתמש בעל לוחית, הר הממשק CE-ESI אל שלב התרגום שלושה צירים ומקם את הטיפ פולט ספקטרומטריית electrospray ~ 2 מ מ כגדולים ספקטרומטר מסה (איור 1 c).
- מרכיבי הממשק נקי, לשטוף הרציונאלית, הפתרון נדן ספקטרומטריית electrospray דרך פולט ספקטרומטריית electrospray ב µL 1/דקה את BGE דרך נימי ההפרדה לסה נ. השתמש משאבות מזרק להאכיל את ממיסים בקצב קבוע.
- לרוקן את נימי ההפרדה לסה נ לפני כל מדידה על-ידי חיבור מזרק סופו הנימים מפרץ צר. השתמש מזרקים גדול מספיק כדי למזער את מילוי ואת הטרמה של קווי האספקה הממס.
הערה: ניסויים בדרך כלל להשתמש 1 מ"ל גז חזק מזרקים לספק הממס נדן ספקטרומטריית electrospray ומזרק 500 µL לרוקן את נימי ההפרדה.
- אימות של CE-ESI-MS פלטפורמה ומדידה של מטבוליטים
הערה: המטרה של שלב זה היא כדי לאשר את הרגישות אנליטית של המכשיר CE-ESI-MS מדי יום לפני ניתוח תמציות תא בודד.
- לאחר שטיפה ההפרדה נימי עבור ~ 5 דקות, להעביר את כניסת שלה לתוך הפתרון BGE ממוקם בקבוקון מפלדת.
- מקם את הטיפ פולט ספקטרומטריית electrospray ~ 2 מ מ כגדולים ספקטרומטר מסה ו פיין-להתאים את המרחק באמצעות שלב התרגום לייצר ספקטרומטריית electrospray המשטר קונוס-סילון יציב בעודו מנטר את הספריי באמצעות stereomicroscope (ראו הפניות 31,45). תנטר את היציבות הכולל יונים הנוכחי (טיק) ~ 30-45 דקות כדי להבטיח פעולה יציבה.
- החלת ~ 20 kV למבחנה BGE באמצעות הגדלת בהדרגה הפוטנציאל מעל 15 ~ s, בדרך כלל יוצר ~7.5 µA הנוכחי על פני נים ההפרדה באמצעות חומצה פורמית 1% כמו BGE. לפני כל מדידה, להבטיח את יציבות המערכת על-ידי ניטור לפרופיל טיק ~ 5-10 דקות ולאחר מכן step-wise להוריד את הפוטנציאל ההפרדה (CE) ל- 0 V (הקרקע).
הערה: להפיכת חצי תהליך זה, אנו משתמשים תוכנה מותאמת אישית-נכתב כדי לשלוט מרחוק אספקת31חשמל מתח גבוה לסה נ. אם הפלטפורמה CE-ESI-MS לא יציב, בזהירות להעריך את המקור של אי יציבות על ידי בדיקות פלטפורמת CE-ESI-MS הראשונה במצב ESI בלבד, במצב תפעולי CE-ESI כמו מומלץ אז במקום31. בקצרה, כדי לבדוק את הפלטפורמה במצב ESI בלבד, כבה את מתח גבוה לסה נ ונטר את הטיק ~ 30 דקות המשטר הריסוס קונוס-סילון. במידת הצורך, כדלקמן להמשיך עם שגיאות כתובת: (i) בדוק חיבורי דליפות; (ii) לנקות את פולט ספקטרומטריית electrospray עם מים, אלכוהול איזופרופיל, מים, מתנול; (iii) דה-גז ממיסים; (iv) לרוקן פולט ~ 25 דקות לפני בדיקה שוב. אם הפלטפורמה CE-ESI נמצא יציב במצב ESI בלבד, אך הופך לבלתי יציב במהלך ההפרדה לסה נ, לבחון את המערכת ג'אול חימום ו/או אלקטרוליזה: (i) לשטוף את נימי ההפרדה עם BGE ~ 25 דקות וחזור על הניסוי; (ii) להשתמש את פוטנציאל ההפרדה נמוכה כדי לשמור על תגובה Ohmic ליניארית (קרי, הנוכחי לעומת ההפרדה מתח עקומה ליניארית לסה נ); (iii) לבחון את נימי לסה נ בגין נזקים פוטנציאליים, כגון סדקים, ולהחליף את נימי במידת הצורך. - לנתח ~ 6 nL המדגם כדלקמן:
- פיפטה µL 1 של הפתרון הסטנדרטי אצטילכולין לתוך המבחנה הזרקה.
- להעביר את נימי ההפרדה מ המבחנה BGE לתוך המבחנה הזרקה.
- הרם את הבמה הזרקת לסה נ 15 ס מ ב- 1s.
- להחזיק את הבמה עם הרשאות מלאות עבור 60 s hydrodynamically להזריק ~ 6 nL המדגם לתוך נימי ההפרדה.
- לאחר מכן, לתרגם את השלב לחזור החל רמות (בקו אחד עם השקע נימי).
- בעדינות להעביר סופו הנימים כניסת BGE.
- מיד לאחר מכן, הגדלת המתח CE להתחיל ההפרדה electrophoretic.
- התחל MS קירור והקפאה.
הערה: ביצועי המערכת עשוי להיות מאופיין באמצעות הליך כימי. מספק CE-ESI-MS החד-תאיים להוריד את הגבולות של זיהוי ~ 10 ננומטר (ניסים מונטקיו ~ 60) עבור אצטילכולין, מתיונין, היסטידין16. אמצעי האחסון מוזרק (Vהפצוע למרכז הר), לתוך נימי ב nL, תלוי ההבדל הגובה (H, ס מ) במהלך זריקה, צפיפות (ρ, g ס מ-3), צמיגות (η, s ז-1ק ג-1) של BGE, אורך (L, m), רדיוס (r, מיקרומטר) לסה נ נימי, ומשך ההזרקה (tהפצוע למרכז הר, s). קשר זה מבוטא על ידי הנוסחה הבאה, איפה תאוצת הכובד g (m s-2):
- ברגע התקן זוהה, תעצור קירור והקפאה, להפחית מתח ההפרדה stepwise ל- 0 V (הקרקע) ולאחר מכן לאחזר פולט אל 2 ס מ כגדולים. מיושרות לחלץ ההפרדה נימי עבור 5 דקות לפני ניתוח התא.
- מידה 10 nL יחיד-התא לחלץ באמצעות חזרה צעדים 3.3.1-3.3.5 באמצעות 90 s hydrodynamically להחדיר את הדגימה.
הערה: המטרה של עיבוד נתונים היא כדי לזהות ולכמת תרכובות בין תאים בודדים. פרוטוקול CE-ESI-MS תא בודד יוצר פסגות electropherographic צר עם רוחב בסיס טיפוסי של כמה שניות. על ידי ביצוע ניתוח נתונים באופן ידני למחצה, זה אפשרי למצוא תכונות מולקולרית (ערכים ייחודיים מ/z עם ההעברה ייחודיים פעמים) באמצעות השלבים הבאים. ההפרדה נציג מוצג עבור בחירה מטבוליטים המזוהים באיור2 א.
- כיול מסה קבצי נתונים גולמיים פוסט קירור והקפאה.
הערה: אנו משתמשים אותות נתרן formate אשכולות שנוצרו במהלך ההפרדה של נתרן בשפע מן המדגם, אשר קיים בתאים באופן מקורי או שחולצו מן התקשורת תרבות העובר. המטרה של שלב זה היא כדי לשפר זיהוי מטבוליט בשלבים מאוחר יותר על-ידי הקפדה על דיוק גבוהה בנפח גדול (מ/z), רצוי < מד א 5, או < 10 עמודים לדקה, בין מ/z 50-1, 000. כאן, פוסט נתוני הרכישה כיול מאפשר להשיג באופן שגרתי המוני accuracies < מד א 1, או < 2 ppm עבור מ/z 50-500. - שימוש בקובץ script, עיבוד, חיפוש עבור תכונות מולקולרית על-פני הטווח ההמוני שזוהו. ממוצע ספקטרה המונית על פני כל הפסגה, כדי לקבוע את המסה מדויק, ושים לב למטה זמני ההעברה המתאימים שלהם. לצורך זיהוי נמוך-המונית מטבוליטים בטווח מ/z 50-500, להשתמש חלון שלב מד א 500 כדי לפקח תכונות מולקולרית עם S/N > 3.
- לשלב את שיא באזור-תחת--עקומת עבור כל תכונה מולקולרית באופן ידני או אוטומטי. הערכים האזור וכתוצאה מכך משמשים כאמצעי של המטבוליט שפע.
- לזהות תכונות מולקולרית של עניין עם ביטחון עצמי גבוה כדלקמן (ראה איור
- ראשית, להשוות בין המסה מדויק של התכונות מולקולרית נגד מטבוליט מסד נתונים (למשל, Metlin46 ולא HMDB47) עם דיוק 10 עמודים לדקה כדי לקבל רשימה של התאמות המוני בשם.
- הבא, להעריך הלוחיות מסה על ידי השוואת ספקטרום המונית שלהם טנדם המתקבל התא תמציות עם נתונים זמינים מטבוליט מסדי הנתונים או הקשת המוני טנדם יימדדו סטנדרט כימי המתאים.
- בפעם האחרונה, אמת הקצאות אלה על-ידי השוואת את זמן ההעברה של תכונות מולקולרית טלקוה תמציות תא עם סטנדרטים כימיים קשורים נותחו על ידי אותו כלי CE-ESI-MS.
הערה: כדי לשפר תפוקה ניסיוני, אנו בדרך כלל לזהות רק תכונות מולקולריים שונים באופן משמעותי סטטיסטית בין תנאים ניסויית או סוגי תאים. נציג ההזדהויות מוצגים באיור2. כדי לזהות מטבוליטים עם דיוק מסה גבוהה, אנו ממליצים מבחוץ כיול של ספקטרומטר מסה מדי יום, ביצוע למשובטים בזמן אמת במהלך כל מדידה באמצעות תקן פנימי או חיצוני בנפח גדול-כיול כל אחת מהמידות קובץ נתונים שלאחר הרכישה (למשל, עבור נתרן formate אשכולות כאן) מומלצים.
הערה: בניסויים שלנו, פלטפורמות תוכנה באינטרנט47 שימשו כדי לבצע את כל השלבים של ניתוח נתונים עוקבות, כולל את השלבים הבאים: אני) סינון של תכונות מולקולרית עם מופע לפחות 50% של כל דגימה-ערכה (למשל, תא סוג); ii) נורמליזציה של הנתונים; iii) סטטיסטי (לדוגמה, t-מבחן), ניתוח נתונים רב משתנית, כגון ניתוח גורמים ראשיים (PCA) וניתוח אשכול היררכי (HCA). אנו משתמשים p < 0.05 (הסטודנט t-מבחן) לסמן מובהקות סטטיסטית, קיפול-שינוי ≥ 1.5 לציין משמעות ביולוגית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו לאחרונה המועסקים תא בודד microprobe CE-ESI-MS כדי לאפיין מטבוליטים בתאים מזוהה בודדים בפיתוח בחופשיות צפרדע רפואית זריזה עוברי29,30. Microprobe מאפשר מהר (שניה ~ 5/נייד), השאיפה בחיי עיר של ~ 10 nL של תא בודד, השאיפות מרובים באותו התא, או מספר תאים שונים בתוך אותו ואילך שלבי התפתחות העובר חי (איור 1b). תוכן סלולרי aspirated מופק באמצעות ממיס מתאים ואת מטבוליטים ואז מופרדים, מיונן באמצעות ממשק CE-ESI לפי הזמנה, זוהה על ידי גב' Typically, הגישה התשואות ~ 300 אותות המטבוליט nonredundant (לאחר הסרת איזוטרופי, אשכול פסגות) של כל תא. ההפרדה היא דוגמה עבור מולקולות בחר ב איור 2a. זיהינו 70 אותות שונים עם ביטחון עצמי גבוה כמו מטבוליטים קוטב קטנים, בהתבסס על זמן ההעברה ולחלץ דפוסי MS/MS-פיצול תא אותות, בהשוואה לאלו תקן או מספריות המוני ספקטרלי טנדם. לדוגמה, באיור 2b מראה הזיהוי בטוח של היסטידין מבוסס על השילוב של אלה פיסות מידע אורתוגונלית.
Microprobe CE-ESI-MS מאפשר כימות של חילוף החומרים ההבדלים בין תאים בודדים. CE-ESI-MS יש הדיר כמותית של 8% RSD בהתבסס על שיא תחת--עקומת באזורים נבחרים-יון electropherograms16,30. עם דגימה microprobe, הזה הפארמצבטית טכני הוא 14% RSD30, שהוא מספיק כדי שאילתה פעילות חילוף החומרים ההבדלים בין התאים משמעות סטטיסטית וביולוגי. לדוגמה, איור 3 מראה שאת חיידק CE-ESI-MS פעילה בחיי עיר מיקרו-דגימה של שלושה הגבי-סוגי תאים (איור 3 א). יתר על כן, PCA של המטה-נתונים כמותיים העומדות בפני שינויים מטבוליים כמו תאים ובתאים מזוהה של העובר שמונה תאים (ראה D1R תא) מחולק כדי ליצור שיבוט תא בתא-16 (ראה D11R תא) ו- 32-תא (תא D111R) העובר (איור 3b). נציג מגמות מוצגים עבור מטבוליטים בחירה ג' באיור 3. מטבוליטים כגון אצטילכולין ירד בשפע עם חלוקת התא, בעוד trolamine, הראה Arg-Ser מגמות מנוגדות אלה תא סוגים. Trolamine ירד בשפע מ 8 - אל העובר 16 תאים, ואז הפך המועשר העובר 32 תאים, בעוד Ser-Arg מצטיירת מגמה הפוכה על ידי הגדלת כדי שהעובר 16 תאים להקטין בהעובר 32-תא. ארגינין לא השתנו באופן משמעותי בשפע בין השלבים האלה התא. מגמות אלה צפויים לשפוך אור נוסף על התהליכים הבסיסיים העומדים בבסיס בשלבים התפתחותיים המוקדמים של X. laevis.
איור 1: ניסיוני זרימת עבודה עבור בחיי עיר microprobe תא בודד נימי אלקטרופורזה (CE) ספקטרומטר מסה (MS). (א) המציא micropipettes (למעלה) לפני ו (למטה) לאחר בבועיות את הטיפ עם 20 מיקרומטר הקוטר החיצוני לשימוש ב- microsampling. Microsampled (B) התאים המשיך לחלק כמו העובר שמונה תאים פיתח לבמה 16 תאים, פתיחת השלב ללימודי אין ויוו . (ג) תאים בודדים המזוהים היו שנדגמו שימוש של microprobe (µP) ב- 8-התא עובר צפרדע רפואית זריזה (ראה V1R, D1R תאים), מטבוליטים תא חילוץ, נותחה באמצעות סולם CE-גב' ברים = 250 מיקרומטר (כהה/אפור); 10 מ מ (לבן). מפתח: SP, משאבת מזרק. (דמויות הותאם באישור הפניות29,30). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: Microprobe תא בודד CE-MS מאפשר זיהוי בטוח של מטבוליטים. (א) electropherogram נציג של המטבוליטים מזוהה בחר. (B) זיהוי של היסטידין מבוסס על השוואה של מסה מדויק זמן ההעברה, פיצול נתונים (התנגשות-induced דיסוציאציה) כנגד המטבוליט סטנדרטי. מפתח: 1, מתיל היסטידין; 2, homolysine; . סאם, S-adenosylmethionine; ולהתמכר, ornithine; תה, triethylamine; המכונית, קרניטין; AcCho, אצטילכולין; AcCar, acetylcarnitine; HPX, hypoxanthine; GSH, גלוטתיון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הבדלים מטבוליים כמותית בין תאים בודדים שאת בצורה הגבי שושלת X. laevis. (א) אופטי תמונות של התא-קדמון D1R העובר שמונה תאים, ואת הצאצאים שלו, בתא העובר 16-תא D11R התא D111R העובר 32-cell. (B) המנהל ניתוח גורמים (PCA) של מטבוליטים לכמת אלה סוגי תאים שלושה לחשוף פרופילים מטבוליים שונים. כל נקודת נתונים מציין תא אחר (ראה מספרים) זה נמדד בטכני משכפל (מחובר נקודות). אליפסות לסמן ביטחון של 95%. (ג) ניתוח שונות (ANOVA) וניתוח של פוסט-הוק פישר הפחות משמעותי דיסקרימיננטה מגלה מגמות חילוף החומרים מורכבים ברחבי השלבים התא. עבור החלקות תיבת, סקוור הינו, תיבת 1 × שגיאת התקן של הממוצע (SEM), שפם 1.5 × ב- SEM. מפתח: *p < 0.05; . אן. אס, אין הבדל משמעותי. גודל ברים = 250 מיקרומטר. (דמויות הותאם באישור הפניה30). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microprobe CE-ESI-MS מאפשרת אפיון ישיר מטבוליטים של תאים בודדים בפיתוח חי, בחופשיות עוברי. בלב ליבה של הגישה הם שני רכיבי משנה טכני, כלומר בחיי עיר נימי microsampling ו רגישות גבוהה CE-ESI-גב' לעומת תאים כל ניתוח, נימי microsampling יש את היתרון של פעולה מהירה (כמה שניות לעומת 5 דקות / תא על-ידי ניתוח), תאימות עם המורפולוגיה תלת מימדי מורכב של עוברי ומדרגיות לתאים קטנים בצורת בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות. בניגוד לנתיחה, הדגימה microprobe עלים אחרים בתאי העובר שלם לניתוח עוקבות. מסקרן, microsampled תאים באפשרותך להמשיך לחלק, מעלים את האפשרות עבור מחקרים ארוכי טווח של תאית התמיינות. היכולת לשלוט שגודל הטיפ microprobe מאפשר גם microprobe CE-ESI-MS כדי לשמש כלי רב-תכליתי עבור לומד את התפקיד של חילוף החומרים בתאים ותהליכים התפתחותיים באמצעות מודל אורגניזמים אחרים, כולל דג זברה ועכבר. על מנת להבטיח תוצאות אמינות, זה קריטי כי התאים עניין הם בדיוק, מדויק ועקבי מזוהה, שנדגמו. הפרמטרים ניסיוני של השאיפה (למשל, מידות נימי, לחץ, וזמן) ניתן להתאימו לדגום חלק בתא הרצוי. בנוסף, הכרחי על מנת לשתק את העוברים כדי לשפר את דיוק המיקוד התא של עניין, אשר בתורו ממזער נזקים העובר. ב פרוטוקול זה, יצרנו בארות בתוך מצופים agarose פטרי. כדי לשתק את העוברים במהלך הדגימה. מניסיוננו, נימים עם טיפים משופע להבטיח נזק מינימלי התא בהשוואה טיפים בוטה. עוד שיפור התפוקה מדגם וניתוח כימי יאפשר אפיון אוכלוסיות גדולות של תאים, ובכך מעצים ניתוח סטטיסטי כדי לזהות מטבוליטים חשובים המשמשים כבסיס תא ותהליכים התפתחותיים.
המטרה של CE-ESI-MS היא לאפשר אפיון metabolome ב מעקב ברמת רגישות. CE מציע יתרונות משלים ללימודי תא בודד על פני שיטות ההפרדה פופולריים אחרים, כגון ננו-flow כרומטוגרפיה נוזלית או גז כרומטוגרפיה. CE מספק יעילות ההפרדה מעולה לפנות את metabolome מורכבים. הממדים הפיזיים של לסה נ תואמים הדגימות נפח מוגבל הנובעים תאים בודדים. בנוסף, טכניקות העשרה שונות קיימות ב- CE (למשל, דוגמת מוגבר-שדה הערמה או דינאמי pH צומת) כדי preconcentrate את הדגימה על הטור, ובכך לחיזוק איתור רגישות. להצלחה בלימודים, CE-ESI-MS הכלי צריך להיות מאופיין ואומת מדי יום. לדוגמה, אנחנו דורשים S/N לפחות 3 עבור 60 (קרית אתא) של אצטילכולין רגיל (6 nL ברמה 50 ננומטר, מוזרק) ו הפארמצבטית של < 5% RSD בזמן ההפרדה (העברה) ו- < 25% RSD, כימות בהתבסס על הפסגה אזור-תחת--עקומת electropherograms יון נבחר בזכות הסטנדרטים. מעקב רגישים זיהוי, כימות דינמי להקל על המידה של מגוון סוגים של מטבוליטים (פפטידים) המתפרסות על-פני מגוון רחב של ריכוז תאים בודדים באמצעות CE-ESI-MS6,16,25 , 31. בעוד אנו מזהים באופן שגרתי ~ 300 שונים טעונה באופן חיובי מטבוליט אותות, CE-MS הוא גם תואם יינון שלילי במצב48, ובכך שיפור העומק של החלק לזיהוי של metabolome תא בודד.
למרות X. laevis מציעים מספר יתרונות ביצירת טכנולוגיה זו ללמוד פיתוח, microprobe CE-ESI-MS יכול להיות גם יכולת הסתגלות לסוגים אחרים של אורגניזמים מודל. צפרדע רפואית, פיגמנטציה, גודל ההבדלים בין התאים יחד עם מפות הגורל תא לשחזור49 מאפשרים לזהות תאים ספציפיים עם רקמה ידוע גורלם. זה, בתורו, פותח את הדלת בפני גילוי או ממוקד ניסויים חילוף החומרים של התא כולו שושלות כמו תאים לחזק תוכניות התפתחותיות שונות כלפי בידול. כדי למנוע הבדלים הנובעים עקב התא משתנה-מחזורים, העוברים אסור לחלק באופן מלא לשלב הבא לפני דגימה, כפי שמתואר במקום50. Microprobe CE-ESI-MS לסגלה מניפולציות embryological קלאסית או כלים (למשל, ג'ין לדפוק out/למטה) כדי לבחון את משמעות התפתחותית של מולקולות קטנות עם dysregulation משמעותי בין תאים בחר או סוגי תאים . לדוגמה, השילוב של תא בודד גליקומיקס עם מעקב גורל התא דרך הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק הובילה לגילוי של מטבוליטים בעבר לא ידוע השפעות התפתחותיות16.
תא בודד גליקומיקס במחקרים תשומת-לב רבה פרטים אנליטית, במיוחד במקרה של כימות; הטכנולוגיה שלנו הוא לא יוצא מן הכלל. באופן אידיאלי, כל שלב של זרימת העבודה הכנת המדגם צריך להעריך בזהירות כדי למזער את פוטנציאל השפלה ו/או אובדן של מטבוליטים אנדוגני או הדבקות הדגימות. השימוש טוהר גבוהה ממיסים denaturing (למשל, LC/MS כיתה), חומצות או בסיסים, טמפרטורות נמוכות (~ 4 ° C) מומלץ כדי להרוות את הפעילות של אנזימים להקל/למנוע שינויים מטבוליים דגימות לפני ניתוח פלייבק6 , 51. פתרונות אורגניים פשוטים מבוסס על מתנול acetonitrile לאפשר חילוץ יעיל של מטבוליטים קוטב קטנים28. כמובן, ניסויים ממוקד שיעורים ספציפיים של מטבוליטים (למשל, תרכובות apolar, ליפידים) תועלת לתפור את ההרכב של הממס מיצוי מראש. לדוגמה, לאחרונה להדגים השימוש מספר סוגים של מיצוי ממיסים משפר את הכיסוי של תא בודד metabolome28. כימות של מטבוליטים אלה ניתן להקל על ידי סטנדרטים פנימיים, כגון isotopically שכותרתו מטבוליטים, אשר עשוי להיות קפץ לתוך תמציות במהלך החילוץ מטבוליט. הסטנדרטים פנימי מועילים גם לאבטחת איכות עבור הצעדים החילוץ ומדידה, ובכך להקל על הערכת הפארמצבטית טכני ומערכת ושחזור מדגם analytes. האחרון אנחנו עו ד עבור ביולוגית משכפל (תאים שונים aspirated מעוברים שונים) עם כל תא ניתח ב טכני משכפל (תמצית זהה למדוד מספר פעמים) כדי לסייע עוצמה סטטיסטית ואת הפרשנות של תוצאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות מענקים GM114854 (כדי P.N.) ו CA211635 (כדי P.N.), ארנולד, מייבל בקמן קרן בקמן יאנג החוקר להעניק (P.N.), בפרס פרופסור צעיר דופונט (כדי P.N.), האגודה האמריקנית למיסה ספקטרומטר מחקר פרס (P.N.), מלגות קרן המועדון קוסמוס (כדי R.M.O. ו- E.P.P.). הדעות והמסקנות לידי ביטוי בפרסום זה הן אך ורק לאלה של המחברים, אינם מייצגים בהכרח התצוגות הרשמי של מקורות מימון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for Embryo Culture Media | |||
| Potasium chloride | Fisher Scientific | BP 366-1 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M 65-3 | |
| Calcium nitrate | Sigma Aldrich | C1396 | |
| Cysteine | MP Biomedicals | 101444 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma Aldrich | T3253 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolite Extraction Solvents | |||
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solvents and Standards for CE-ESI-MS | |||
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A11710X1-AMP | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Acetylcholine chloride | Acros Organics | 159170050 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Fabrication Setup | |||
| Micropippette puller | Sutter Instrument Co. | P-1000 | |
| Borosilicate capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel | Fine Science Tools (USA) Inc | 11252-30 | Corrosion resitant and autoclavable. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Sampling Setup | |||
| Micromanipulator | Eppendorf, Hauppauge, NY | TransferMan 4r | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | Should be vibrationally isolated. |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CE-ESI-MS Setup | |||
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure. |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Stereomicroscope | Amscope | SM-3BZZ | Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface. |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-built | This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary | |
| Stainless steel sample vials | Custom-built | ||
| Stainless steel BGE vial | Custom-built | ||
| Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP040105 | |
| Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP075375 | |
| Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) | Hamilton Co. | 21031A | For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip. |
| Syringes (gas-tight): 500 - 1000 µL | Hamilton Co. | 1750TTL | |
| Digital multimeter | Fluke | Fluke 117 | |
| High-resolution Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | Maxis Impact HD | High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI |
| Tunning mixture for mass spectrometer calibration | Agilent technologies | ESI-L G1969-85000 | |
| Data Analysis ver. 4.3 software | Bruker Daltonics | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ancillary Equipment | |||
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C | Labconco | 7310022 | |
| Analytical microbalance (XSE105DU) | Fisher Scientific | 01911005 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Fisher Scientific | 88300ASP | |
| Refrigerated Incubator | Fisher Scientific | 11475126 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 |
References
- Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
- Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape. Genome Biol. 16 (209), (2015).
- Tran, D. A., Bai, A. Y., Singh, P., Wu, X. W., Szabo, P. E. Characterization of the imprinting signature of mouse embryo fibroblasts by RNA deep sequencing. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1772-1783 (2014).
- Wang, D. J., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics'. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Svatos, A. Single-cell metabolomics comes of age: new developments in mass spectrometry profiling and imaging. Anal. Chem. 83 (13), 5037-5044 (2011).
- Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat. Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
- Bodenmiller, B., et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat. Biotechnol. 30 (9), 858-889 (2012).
- Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
- Kleparnik, K., Foret, F. Recent advances in the development of single cell analysis: A review. Anal. Chim. Acta. 800, 12-21 (2013).
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: Analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Gholipour, Y., Erra-Balsells, R., Nonami, H. In situ pressure probe sampling and UV-MALDI MS for profiling metabolites in living single cells. Mass Spectrom (Tokyo). 1 (1), A0003 (2012).
- Comi, T. J., Do, T. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Categorizing cells on the basis of their chemical profiles: progress in single-cell mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 139 (11), 3920-3929 (2017).
- Lombard-Banek, C., Portero, E. P., Onjiko, R. M., Nemes, P. New-generation mass spectrometry expands the toolbox of cell and developmental biology. Genesis. 55, e23012 (2017).
- Yang, Y. Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. Trac-Trends Anal. Chem. 90, 14-26 (2017).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (21), 6545-6550 (2015).
- Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
- Nakashima, T., et al. Single-cell metabolite profiling of stalk and glandular cells of intact trichomes with internal electrode capillary pressure probe electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 88 (6), 3049-3057 (2016).
- Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
- Guillaume-Gentil, O., et al. Single-cell mass spectrometry of metabolites extracted from live cells by fluidic force microscopy. Anal. Chem. 89 (9), 5017-5023 (2017).
- Saha-Shah, A., Green, C. M., Abraham, D. H., Baker, L. A. Segmented flow sampling with push-pull theta pipettes. Analyst. 141 (6), 1958-1965 (2016).
- Hu, J., et al. Synchronized polarization induced electrospray: Comprehensively profiling biomolecules in single cells by combining both positive-ion and negative-ion mass spectra. Anal. Chem. 88 (14), 7245-7251 (2016).
- Zhang, L. W., Vertes, A. Energy charge, redox state, and metabolite turnover in single human hepatocytes revealed by capillary microsampling mass spectrometry. Anal. Chem. 87 (20), 10397-10405 (2015).
- Zhang, L. W., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
- Lapainis, T., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Capillary electrophoresis with electrospray ionization mass spectrometric detection for single-cell metabolomics. Anal. Chem. 81 (14), 5858-5864 (2009).
- Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 83 (17), 6810-6817 (2011).
- Aerts, J. T., et al. Patch clamp electrophysiology and capillary electrophoresis mass spectrometry metabolomics for single cell characterization. Anal. Chem. 86 (6), 3203-3208 (2014).
- Onjiko, R. M., Morris, S. E., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry with multi-solvent extraction identifies metabolic differences between left and right blastomeres in the 8-cell frog (Xenopus) embryo. Analyst. 141 (12), 3648-3656 (2016).
- Onjiko, R. M., Plotnick, D. O., Moody, S. A., Nemes, P. Metabolic comparison of dorsal versus ventral cells directly in the live 8-cell frog embryo by microprobe single-cell CE-ESI-MS. Anal. Methods. , (2017).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: Metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Anal. Chem. 89, 7069-7076 (2017).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 8 (4), 783-799 (2013).
- Knolhoff, A. M., Nemes, P., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R., Lutz, N., Sweedler, J. V. , 119-139 (2013).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods Mol Biol. 135, 331-347 (2000).
- Bowes, J. B., et al. Xenbase: a Xenopus biology and genomics resource. Nucleic Acids Res. 36, D761-D767 (2008).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43 (D1), D756-D763 (2015).
- James-Zorn, C., et al. Xenbase: expansion and updates of the Xenopus model organism database. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D865-D870 (2013).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120 (1), 299-304 (1987).
- Rollman, C. M., Moini, M. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry of controlled substances with optical isomer separation in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 30 (18), 2070-2076 (2016).
- Moini, M., Martinez, B. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry with adjustable porous tip for a rapid analysis of protein digest in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (3), 305-310 (2014).
- Huhn, C., Ramautar, R., Wuhrer, M., Somsen, G. W. Relevance and use of capillary coatings in capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 297-314 (2010).
- Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal. Chem. 79 (8), 3105-3116 (2007).
- Zhu, Z. J., et al. Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry characterization of metabolites guided by the METLIN database. Nat. Protoc. 8 (3), 451-460 (2013).
- Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0 The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D801-D807 (2013).
- Liu, J. X., Aerts, J. T., Rubakhin, S. S., Zhang, X. X., Sweedler, J. V. Analysis of endogenous nucleotides by single cell capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analyst. 139 (22), 5835-5842 (2014).
- Hubrecht, L., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Pub. Co. (1967).
- Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development. J. Vis. Exp. (71), (2013).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nat. Protoc. 6 (8), 1241-1249 (2011).
