Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Автоматизированное измерение криптококковой видов полисахаридной капсулы и клетки тела

doi: 10.3791/56957 Published: January 11, 2018

Summary

Этот метод описывает процессор обработки изображений автоматизированный пакет предназначен для измерения полисахаридной капсулы и тело радиусов. Хотя первоначально предназначен для Cryptococcus neoformans капсула измерений процессор автоматизированных изображения также могут применяться для обнаружения других контраста на основе круговой объектов.

Abstract

Этот метод призван обеспечить последовательную, точной и управляемым процесс для большого числа полисахаридной капсулы измерений.

Во-первых порог изображение формируется на основании значений интенсивности, однозначно рассчитывается для каждого изображения. Затем круги обнаруживаются, основанные на контраст между объектом и фоном, с использованием алгоритма устоявшихся преобразование Хафа круг (CHT). Наконец капсулы обнаруженных клетки и органы подобраны согласно Координаты центра и размер радиуса и экспортируются данные для пользователя в таблицу управляемым.

Простой, но значительные преимущества этой методики. Во-первых, потому, что эти расчеты выполняются на алгоритм, вместо того, чтобы человека увеличивается точность и надежность. Существует не снижение точности или надежности независимо от того, сколько пробы анализируются. Во-вторых этот подход устанавливает потенциальных Стандартная операционная процедура для поля Cryptococcus вместо нынешней ситуации, когда капсула измерения зависит от лаборатории. В-третьих учитывая, что ручной капсула измерения медленно и однообразной, Автоматизация позволяет быстрого измерения на большое количество дрожжевых клеток, которые в свою очередь облегчает анализ данных высокой пропускной способности и все более мощные статистики.

Основные ограничения этой методики берутся как функции алгоритма. Во-первых алгоритм будет создавать только круги. В то время как Cryptococcus клетки и их капсулы взять на круговой морфологии, было бы трудно применять этот метод для обнаружения объектов не круглое. Во-вторых благодаря как круги обнаруживаются CHT алгоритм может обнаружить огромные псевдо-круги, основанный на внешних краях нескольких кластерных кругов. Однако любой исказил клеток тела, поймали в псевдо-круг можно легко обнаружены и удалены из результирующих наборов данных.

Этот метод предназначен для измерения круговой полисахаридной капсулы Cryptococcus видов на основе чернил Индии светлые области микроскопии; Хотя он может быть применен к другим контраста на основе круговой объект измерения.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cryptococcus neoformans является патогенных дрожжей, найдены повсеместно в мире, который связан с человеческие заболевания преимущественно в популяциях подавленным иммунитетом. C. neoformans прежде всего приходится существенной причиной общее ежегодное количество смертей в субсахарской Африке вследствие инфекционных болезней1. Основным клиническим проявлением криптококковой инфекции является менингоэнцефалит, который следует вторжения центральной нервной системы на транспорте в зараженные макрофаги (троянский конь образом) или прямые пересечения blood - brain барьер. C. neoformans выражает некоторые факторы вирулентности, включая возможность реплицировать на температуре человеческого тела, активность уреазы, melanization и формирование полисахаридной капсулы2. Полисахаридной капсулы состоит из повторяющихся glucuronoxylomannan и glucoronoxylomannangalactan полимеров и функции как защитный барьер против факторы экологического стресса и иммунной реакции2.

Хотя размер криптококковой полисахаридной капсулы размер последовательно не связывается с вирулентности, есть свидетельства того, что это фактор в патогенезе2,3,,4,5, 6,7. Капсула размер связан с менингитом патологии6, может повлиять на способность макрофагов контролировать Cryptococcus инфекции5и может привести к потере вирулентности если отсутствует8. Таким образом измерения размера капсулы являются общими в криптококковой исследований, но там не fieldwide стандарт для метода капсула измерения.

В настоящее время C. neoformans полисахаридной капсулы измерение основано на ручных измерений микроскопии изображений, и точные методы приобретения изображений и измерение варьируются от лаборатории9,10, 11. Главная задача этого метода является, что некоторые исследования требуют приобретения тысяч отдельных измерений, что затрудняет поддержание точность и надежность. Кроме того даже когда публикуются результаты, есть часто недостаточное описание метода измерения. Многие публикации не объяснить, каким образом были получены их измерения, что фокальной плоскости был использован, как они определены порог для капсула идентификации, ли они использовали радиус или диаметр, ли они использовать одно измерение, или в среднем несколько, или другие детали. Некоторые публикации только состояние их метод как какая программа была использована, например, «Adobe Photoshop CS3 был использован для измерения клетки»11. Такое отсутствие стандартизации и отчетности подробно может сделать воспроизводимость трудно, если не невозможно. Различия в человеческое зрение, компьютер яркости, Микроскоп настройки, слайд освещения, и других факторов может изменяться не только между отдельными лицами, но и между образцы, в то время как расчеты на основе соотношения значений интенсивности пикселей будет оставаться постоянным и применимые между выборками. Эта техника была создана в контексте обеспечения стандартизированной, точной, быстрый и простой способ измерить размеры капсул для поля, в котором не было ни до.

Как упоминалось ранее CHT алгоритм, давно, и сценарии для автоматического обнаружения круги были написаны раньше. Этот метод улучшает в двух областях, где бы не отвечают другие скрипты. Во-первых просто обнаружения круги не достаточно, потому что с криптококковой клетки должны быть обнаружены два различных кругов по отношению друг к другу. Этот метод специально обнаруживает клетки органов внутри капсулы, провести различие между двумя и выполняет вычисления только на соответствующие пары тела капсула. Во-вторых даже когда следующие же протокол, разные исследователи будут в конечном итоге с различными приобретенные изображения. Позволяя контролировать каждый параметр алгоритма следователь, этот инструмент может быть скорректированы в соответствии широкий спектр методов приобретения. Нет необходимости для стандартизированных охвата, цели, фильтра и так далее.

Этот метод легко может применяться к любой ситуации, в которой следователь должен обнаружить круги в изображении что контраст с их фоне. Как круги светлее и темнее, чем их фона могут быть обнаружены, подсчет и измерить, используя эту технику.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Подготовка чернил Индии слайд

  1. Пипетка 10 мкл криптококковой образца на слайд. Любые циклические дрожжей будет работать, но для этого эксперимента H99 был единственным штаммом используется.
    Примечание: Если образец непосредственно с носителя культуры, разбавления 1:2 с водой или PBS может помочь предотвратить тушь от слипания.
  2. Пипетка 2 мкл Индии чернильное пятно на образце и смешивать, физически толкает наконечник пипетки для образца и переезд круговыми движениями до тех пор, пока чернила Индии появляется равномерно.
  3. Поместите coverslip образца, удерживая левый край coverslip против поверхности слайда, затем аккуратно и равномерно снижение противоположной стороне coverslip над образца.
  4. Разрешить на слайд, чтобы воздух сухой за 5 мин.
  5. Осторожно примените легкий слой лака до coverslip границы сформировать печать и сохранить Индии чернильное пятно.

2. изображений слайд

  1. Место слайды в светлых местах микроскоп с камеры вложения и известных пиксель в микронный преобразования. Настройте фильтры, цели и контрастность, так что клетки капсулы являются ясными и клеток тела являются целенаправленной, темные полосы.
    Примечание: Различные фильтры, цели и параметры контрастности будет работать, но рекомендуется 20 x цель, Ph1 фильтр и биннинга 2 x 2.
  2. Убедитесь, что поле зрения плотным, но не перенаселенный с криптококковой клетки, с четкой контраст между капсулу клетки и фон и правильно сфокусированные с телом клетки визуализированы как темная полоса.
    Примечание: Точное количество клеток для оптимального изображения будет варьироваться в зависимости от образца и цели используется. Важные аспекты, чтобы убедиться, что клетки не кластерных или перекрытия, что плоскости фокуса ячейки существенно не изменяются, и что существует значительное чернил Индии пятна видны на заднем плане (по крайней мере 25% от поля).
  3. Сохранение изображений в один каталог с четких титулов, как алгоритм измерения будет выполняться на изображениях в одном каталоге и выходных данных будут организованы согласно имена файлов изображений.

3. алгоритм настройки

  1. Установить Python версии 2.7
  2. Установить дополнительные python библиотек, выполнив команды «ПУМ установить подушку» и «ПУМ установить openpyxl».
  3. Установка MATLAB, следуя инструкциям на
  4. Построить библиотеку python MATLAB, следуя инструкциям на https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
  5. Скачайте три необходимые файлы, включенные в этой рукописи дополнительных материалов («QCA.py», «Analysis2.m» и «TestRun.m»).
    Примечание: Эти файлы могут быть извлечены в любом месте, но все три должны быть в той же директории.

4. Использование алгоритма

  1. Запустите приложение, дважды щелкнув на QCA.py.
    Примечание: Приложение может занять несколько минут, чтобы начать. «QCA.py» файл содержит структуру программы, которая вызывает «.m» файлы для запуска алгоритма фактической.
  2. Выполните шаги, описанные в программе.
    1. Входной тип расширения файлов изображений предшествует период и разделенных точкой с запятой (вкл.». TIF;. JPEG») затем нажмите кнопку Enter .
    2. Выберите каталог, в котором расположены файлы изображений, нажав кнопку Выбор каталога и выбрать папку, которая содержит изображения.
    3. Создание списка файлов изображений в каталоге, нажав кнопку Создать список изображений . Изображения будут перечислены в текстовом поле справа. Проверьте и убедитесь, что список является точным и полным.
    4. Выберите случайное изображение из списка, чтобы использовать в качестве предварительного просмотра, нажав кнопку Выбрать случайное изображение .
      Примечание: Если изображение не удается открыть из-за «неправильное изображение режиме ошибка», алгоритм будет по-прежнему функционировать должным образом несмотря на не отображаются изображения. После шага 4.2.7 тестовое изображение будет по-прежнему отображаться.
    5. Цель ввода микроскопа и биннинга параметры. Если параметры по умолчанию не соответствуют Микроскоп используется, выберите «Custom пиксель преобразования» и ввод пиксель в ум преобразования для файлов изображений. После выбора, нажмите кнопку Вычислить преобразования и убедитесь, что преобразование является правильным согласно текстовое поле справа.
      Примечание: Представитель изображения, показанный на рисунке 1 были рассчитаны с 40 x увеличение и 2 x 2 биннинга выбран.
    6. Входные параметры алгоритма для обнаружения круг.
      1. Ввод минимального и максимального радиуса, обнаруживаемая наружная капсула обнаружения как Min и Max капсула радиуса записи. Меньший диапазон позволит более точные результаты.
      2. Ввод минимального и максимального радиуса, обнаруживаемыми для обнаружения тела клетки как Min и Max клетки тела радиуса записи.
        Примечание: Все четыре из этих записей должны быть цифры, представляющие их соответствующие значения в пикселях, согласно исходного изображения.
      3. Переместите капсулу и чувствительность клеток тела ползунков, чтобы отрегулировать порог чувствительности алгоритма. Низкая чувствительность будет строгим и уменьшить обнаружение ложных положительных круг, но может также обнаружить меньше реальных кругах. И наоборот высокая чувствительность будет увеличить скорость обнаружения, но может также привести к ложных положительных кругах.
        Примечание: Представитель результаты были получены с минимальный радиус капсула 7, максимальный радиус капсула 45, минимум тела радиус 4, максимальная тела радиус 30, капсула чувствительность 87 и тело чувствительность 87.
    7. Проверьте параметры на случайно выбранных изображений, нажав на кнопку Run Test . Результаты будут отображаться в центре верхней программы, заменив исходное изображение. Если результаты выглядят точной, рекомендуется выбрать дополнительные случайные изображения также попытаться убедиться, что выбранные параметры будут соответствовать все выбранные изображения.
      1. Максимально количество органов и капсулы обнаружен и визуально проверить ли круги, как представляется, подходят правильно. Количество органов внутри капсулы обнаружены будет отображаться в текстовом поле справа. В противном случае манипулировать параметры алгоритма, до тех пор, пока результаты точны.
        Примечание: Толстые цветные круги, только для того, чтобы помочь с визуализацией. Фактической круги, созданных для измерения, это математическая кривая рассчитывается алгоритмом HCT.
    8. Запустите алгоритм обнаружения на весь каталог файлов изображений, нажав на кнопку Начать анализ . Каждое изображение будет анализироваться и программа будет отображать «завершена» в текстовом поле справа когда были проанализированы все изображения.
    9. Нажмите кнопку матч и очистки . Это будет соответствовать обнаруженных клеток органов для обнаруженных капсулы, когда они находятся в и вычислить истинное капсула радиус путем вычитания тела от капсулы.
      Примечание: Если алгоритм используется для обнаружения флуоресценции или другая ситуация, в которой находится только один круг обнаружен этот шаг не требуется. Вместо этого нажмите Только тянуть органы или Только тянуть капсулы для сбора данных для только синий или только зеленые круги, соответственно. Важно отметить, что если только капсула данные извлекаются радиус направит всего радиус ячейки как не быть вычитанным радиус тела клетки.
    10. Найдите данные, завершенного в файле «CleanedOuput.csv» в каталоге изображений. Если только один кусок данных был выбран, этот файл будет называться «CleanedBodies.csv» или «CleanedCapsules.csv».

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Изображения получаются сначала микроскопии чернил Индии слайдов с помощью микроскопа яркие поля в сочетании с камерой (рис. 1А). Важно иметь клетки разлученных и достаточно низкой плотности, чтобы не подавить поля зрения, а также о том, как использовать достаточно пятно для создания контраста между клетками и фон. Как указано в протоколе, точное количество клеток для оптимального изображения будет варьироваться в зависимости от образца, микроскоп и цели используется. Важные аспекты, чтобы убедиться, что клетки не кластерных или перекрытия, что плоскости фокуса ячейки существенно не изменяются, и что существует значительное чернил Индии пятна видны на заднем плане (по крайней мере 25% от поля). Эти направления позволяют алгоритм для определения порога, уникальные для каждого изображения, принимая средний интенсивности пикселов и добавив стандартное отклонение. Любые пикселей превышает указанное пороговое значение интенсивности считается белый и любой интенсивности значение ниже считается черный. Полученное изображение позволяет ясно и четкие различия капсулы, где заканчивается (рис. 1Б). Алгоритм затем имеет надежный белый на черный контраст на основе круг для обнаружения для капсулы и исходное изображение обеспечивает надежный черного на белый круг для клеток тела. Представитель визуализация обнаруженного кругов создается как часть программы (рис. 1C). Это позволяет пользователю быстро разобрать через обработанные изображения и убедитесь, что отображаются точные результаты.

Важно следовать точный протокол для получения оптимального изображения. Югу оптимального изображения обычно являются результатом отсутствия контраста между капсулой и чернила (рисA). Оптимальные параметры контрастности и приобретение будет меняться в зависимости от образца, эксперимент, камеры и Микроскоп модели и т.д. Оптимальное изображение является одним где дрожжи клетки разделены, если возможно, где внешнего края капсулы имеет четкий контраст в Индии чернильное пятно, и где тело клетки ориентирована как темный группа, которая резко контрастирует с его фоне. Если слишком много клетки находятся в поле зрения или слишком светлое пятно, кластер значения интенсивности пикселей и программа не сможет установить порог, способный выяснения размера капсулы (рис. 2B). Когда используются югу оптимального изображения программа может обнаружить круги неправильные размеры, не сможет обнаружить каких-либо кругов или обнаружить несколько псевдо-круги, основанный на артефакты в изображении порог (рис. 2C).

Обнаружение клеток органов создает аналогичные проблемы в том, что тело клетки должны быть визуализированы как надежный черный кружок на белом фоне капсулы. Эта проблема решается в протоколе при описании желаемого фокальной плоскости для захвата изображений. Лучшие фокальной плоскости для использования-один в котором клетки тела появляется как темные, концентрированные группа (рисA). Этот фокальной плоскости является приемлемым как стандарт потому, что он должным образом сосредоточен ячейки. Это было подтверждено визуализации клеточной стенки с Uvitex, хитин пятно (рис. 3B). Uvitex пятно показывает явно хрустящей корочкой, сосредоточены клеточной стенки с слабый сигнал в центре (где верхней и нижней части тела клетки будет быть запятнано, не в фокусе).

В разработке этого метода, важно также подтвердить, что этот алгоритм может точно определить измерения капсулу и клеток тела. В то время как представитель круги на предыдущих рисунках являются многообещающими, фактические измерения были сопоставлены между компьютером и человеческого измерения. Когда протокол следует точно и оптимального изображения получаются, алгоритм является точной и надежной (рис. 4A). Однако если протокол применяется неправильно и субоптимальные изображения получаются из-за плохой окрашивание, переполненности или других ранее указанных параметров, алгоритм теряет точность и нельзя охарактеризовать человеческого измерения (рис. 4B ). Поскольку этот метод был первоначально разработан для конкретного лица (первый автор), другой человек было предложено использовать его, чтобы определить, если различия между стилями окрашивание и измерения повлияет на точность несмотря на следующий протокол. Результаты показали, что эта техника была широко применимым, поскольку протокол был затем как указание (рис. 4C). Кроме того этот метод может использоваться с любой Микроскоп способен приобретения фазы контрастность изображения подготовленные слайды чернил Индии. Чтобы убедиться, что алгоритм остается точным с другой Микроскоп установок, что этот эксперимент был повторен на треть следователь, с помощью микроскопа различные яркие поля в сочетании с камерой и сравнении обнаруженных капсула диаметров с вручную измеренных капсула диаметры. Между компьютером и человеческого измерений (рис. 4D) было отмечено никакого существенного различия.

Наконец будущие применения этого алгоритма были изучены в контексте окрашивания флуоресценции. Так как флуоресценции изображений до сих пор базируется на сигнал/шум соотношения значений интенсивности пикселей алгоритм должно быть легко применимы к флуоресцирования изображения до тех пор, пока пятно, имеет циклический характер. Это приложение было подтверждено, когда алгоритм смог успешно обнаружить Uvitex окрашенных клеток тела из ранее описанных изображения (рис. 5A, 5B). Пользователи должны быть осторожны, чтобы оптимизировать параметры алгоритма для своего эксперимента, и стандартизированные протоколы должны разрабатываться в будущем для любых новых приложений.

Figure 1
Рисунок 1 : Представитель результаты оптимально полученные изображения. A. исходное изображение, приобретена светлые области микроскопии чернил Индии слайда. B. двоичный образ, созданный с помощью порогового значения рассчитывается средняя пиксель интенсивности добавленной стоимости в стандартное отклонение. Все значения выше этого порога считаются белый и все ниже черный. C. визуализация капсулы (зеленый) и клеток органов (синий), обнаруженных алгоритмом. Все изображения были получены в 40 кратном с биннинга 2 x 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Представитель результаты югу оптимально полученного изображения. A. первоначальный слайд чернил Индии, приобрели через светлые области микроскопии. Неравномерное и неадекватные результаты в особенно яркий фон с градиентом интенсивности окрашивания. B. результирующий двоичный образ, в котором четко нельзя отличить капсулы из-за высокой фонового сигнала. C. несколько капсул обнаружить. Все изображения были получены в 40 кратном с биннинга 2 x 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: обнаружение клеток тела. А. светлые области изображения капсулы центрирована на предпочтительный фокальной плоскости. B. Uvitex изображение флуоресценции клеток тела на предпочтительный фокальной плоскости. Изображения были получены в 100 крат с 2 x 2 биннинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: анализ сравнения результатов для алгоритма (черный) и человека (серый). A. когда слайды готовятся согласно протоколу и оптимального изображения получаются нет никакого ощутимого разница между измерениями. B. если протокол не применяется алгоритм нельзя точно определить и измерить капсулы. Здесь специально фон не был последовательным и там было не ясно, контраст между капсулы и фон. Значительные колебания вычисляется через t теста отмечен как * для P значений < 0,05. C. независимый следователь было предложено следовать протоколу и сравнить их анализ с алгоритмом. Надежность поддерживается через наблюдателей до тех пор, как изображения правильно приобрела. D. Второй независимый следователь с микроскопом второй был использован для подтверждения, что алгоритм сохраняет точность через людей и оборудования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Потенциальных альтернативных применение алгоритма: выявление и измерение микроскопии флуоресцирования. Клетки тела были окрашенных и образы с Uvitex, а затем выявленные алгоритмом. Обнаруженных круг простирается прошлом что бы быть помечены как клеточной стенки, потому что определение основано на сигнал флуоресценции. Алгоритм обнаружения может быть адаптирована для выявления особо ярких накопление сигнала (клеточной стенки), изменяя порог, используемый для создания начального двоичного изображения представлены в цифры 1B и 2B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Supplemental Figure 1
Дополнительные рисунок 1: представитель Скриншот приложения, работающего в среде Windows. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Supplemental Figure 2
Дополнительные рисунок 2: клеток дрожжей представлений обнаруженных бутонизации. Линейки шкалы представляет 10 мкм. а. Родительской ячейки и бутон учитываются как отдельные клетки в пределах их собственных капсулы. Б. A родительской ячейки и бутон учтен дважды, обнаружении для их собственных капсулу и один раз для других капсулу клетки, приводит в четырех ячейках всего из одного родителя и один бутон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Supplemental Figure 3
Дополнительная цифра 3: представление окончательных данных, предоставленных после ячейки обнаружения и измерения. Файл изображения ссылается на имя исходного изображения. Общая радиус относится к радиус представитель зеленые круги, капсулы и тела клетки объединены. Капсула x и y капсула относятся к значениям координат капсуле, для которого эти данные касаются. Радиус тела относится к радиусу представитель синие круги. Капсула радиус относится к общей радиус минус тела радиуса, что привело в радиусе всего капсулы. Эти значения будут в мкм до тех пор, пока пользователь включен коэффициент конверсии пиксель в микрон в шаге 3.2.5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Критические шаги этой методики подготовки слайд чернил Индии и приобретение микроскопа изображений. Хотя алгоритм успешно протестирована с различных методов слайд и изображения рекомендуемый Протокол описан в этой рукописи. Полисахаридной капсулы обнаруживается, основанные на исключение чернил Индии частиц из домена капсулы, как эти частицы являются слишком большими, проникнуть в сеть фибриллярных полисахарид. Чернила Индия исключение приводит в светлый круг на темном фоне. Алгоритм определяет круги, основанные на насколько хорошо они контрастируют с их фоне. Таким образом тяжелые пятна чернил Индии приведет к более высокий контраст между полисахаридной капсулы и фон, увеличивая соотношение сигнал-шум и улучшение качества результата. И наоборот тело клетки обнаружены как темный круг на вершине яркий фон. Тело клетки будет изменить внешний вид, на основе которых фокальной плоскости, Микроскоп имеет значение, появляясь как диффузные серый круг в верхней или нижней ячейки и как сгущенное темная полоса в центре. По тем же причинам, которые уже обсуждались фокальной плоскости, где клетки тела появляется как сгущенное, темные полосы должны использоваться для захвата изображений как это приведет к наиболее точного обнаружения круг.

Метод, сообщили здесь шло через несколько модификаций и раундов устранения неполадок. Алгоритм был изначально кодированные, ожидая, что клетки не может быть меньше 4 или больше, чем 60 пикселей, основанный на Микроскоп, который был использован. Для расширения применения этого алгоритма различных увеличениях и размеры ячеек, которые эти ограничения, вместо этого были заменены поля ввода пользователя, указанных в протоколе. Пользователи теперь могут входные параметры, специфичные для каждого эксперимента для максимальной точности. Если этот алгоритм применяется к ситуации за пределами Cryptococcus капсула измерения рекомендуется настроить первой серии диапазона поиска условий определить как образцы должны быть генерируется и образы.

Наиболее значительным ограничением этой методики является, что он был разработан с определенным приложением, в виду, а именно измерения криптококковой капсулы. Хотя он могут быть легко изменены с учетом дополнительных приложений, этот сценарий применяется только непосредственно к протоколу капсула измерения, изложенных выше. Однако это ограничение также описывает значение этого метода в отношении его поле и существующих методов. Кроме того, начинающим дрожжевых клеток может представлять собой проблему для следователей, которые хотят только измерить размеры родительской ячейки. Этот алгоритм способен обнаруживать бутоны как уникальный клетки (Рисунок S2A). Во-первых это может быть проблемой, если следователь в этом случае, они хотели бы удалить бутон измерений, или удалить обе ячейки, если он не может быть определено, которого обнаружено, что круг бутон и который является родителем. Во-вторых это может вызвать еще одну проблему, если почки обнаружен как клетки тела все еще в пределах родительского капсулы (Рисунок S2B), в котором случае алгоритм будет измерять бутон со ссылкой на родительский капсулы. В этом примере каждая ячейка будет учитываться дважды, поскольку каждой клетки тела находится в пределах двух капсул. Любой из этих проблем могут быть решены легко, после завершения протокола. Окончательный набор данных появится в виде таблицы, где каждый человек обнаружил, ячейка помечается файл изображения, он пришел от, и x и y координаты тела клетки (Рисунок S3). Следователи могут просто найти и исключить данные, который соответствует бутон. Несмотря на капсулы размер, что является важным и тяжело изучал фактор вирулентности, поле Cryptococcus еще предстоит установить стандартные протоколы для капсула измерения или изображения приобретения. Этот метод был разработан для заполнения этих ролей в точной и удобной манере, свободно доступны для лабораторий с минимальной предпосылки.

Будущего применения этой техники в основном, чтобы применить его к другим экспериментов. Любое изображение на основе обнаружения или измерения круговой объектов должно быть анализируемые через этот алгоритм. Люминесцентная микроскопия изображения могут быть проанализированы, применяя алгоритм для отдельных лазерных каналов. Подсчет бактериальные колонии может быть достигнуто и с дополнительной модификации могут различать галактозы репортеров. Дрожжи анализов роста колонии также может быть вычислено с помощью этого алгоритма для оценки размера области колонии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Acknowledgments

Мы хотели бы признать Энтони Боуэн, чьи слайды были использованы в качестве второго человека бок о бок сравнения, а также Sabrina Нолан, чьи слайды были использованы в качестве третьего человека бок о бок и второй Микроскоп сравнения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
India Ink Becton, Dickinson and Co. 261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-143 25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher Scientific 12-548-B 22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish Sally Hansen N/A 109 invisible
SAB Media Sigma S3306
Cryptotoccus neoformans ATCC 208821 H99 strain
Olympus AX70 Microscope Olympus AX70TRF Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300 Qimaging N/A Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB MathWorks N/A Most recent version recommended
Python Programming Language Python N/A Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel Microsoft N/A Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P3813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23, (4), 525-530 (2009).
  2. Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4, (7), 019760 (2014).
  3. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76, (2), 508 (1985).
  4. Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80, (7), Supplement (P04.007) 007 (2013).
  5. Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
  6. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209, (1), 74-82 (2014).
  7. Araujo, G. deS., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7, (1), 29561 (2012).
  8. García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3, (2), 385-392 (2004).
  9. Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12, (6), 740-753 (2010).
  10. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71, (11), 6155-6164 (2003).
  11. Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).
Автоматизированное измерение <em>криптококковой</em> видов полисахаридной капсулы и клетки тела
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).More

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter