Summary
Denne teknik beskriver en automatiseret batch image processor designet til at måle polysaccharid kapsel og krop radier. Mens oprindeligt designet til Cryptococcus neoformans kapsel målinger automatiseret Billedbehandler kan også anvendes på andre kontrast baseret detektion af cirkulære objekter.
Abstract
Formålet med denne teknik er at give en ensartet, præcis og håndterbare proces for et stort antal polysaccharid kapsel målinger.
Først, en tærskel billede genereres baseret på intensitetsværdierne entydigt beregnes for hvert billede. Derefter, cirkler opdages, baseret på kontrast mellem objekt og baggrund ved hjælp af den veletablerede cirkel Hough Transformation (CHT) algoritme. Endelig opdaget celle kapsler og organer er matchet efter center koordinater og radius størrelse, og dataene er eksporteret til brugeren i et overskueligt regneark.
Fordelene ved denne teknik er enkle, men signifikant. Første, fordi disse beregninger er udført af en algoritme snarere end et menneske både nøjagtighed og pålidelighed er steget. Der er ingen forringelse af nøjagtigheden eller pålideligheden uanset hvor mange prøver analyseres. For det andet etablerer denne tilgang en potentiel standardprocedure for feltet Cryptococcus i stedet for den nuværende situation, hvor kapsel måling varierer efter lab. For det tredje manuelle kapsel målinger er langsomme og monotone, tillader automation hurtige målinger på mange gærceller, der til gengæld letter høj overførselshastighed dataanalyse og stadig mere magtfulde statistik.
De store begrænsninger i denne teknik kommer fra, hvordan funktionerne algoritme. Først, algoritmen vil kun generere cirkler. Mens Cryptococcus celler og deres kapsler tage på en cirkulær morfologi, ville det være vanskeligt at anvende denne teknik med ikke-cirkulært objekt detektion. For det andet på grund af hvordan cirkler er opdaget kan CHT algoritme registrere enorme pseudo cirkler baseret på de ydre kanter af flere klynger cirkler. Dog kan eventuelle forvansket celle organer fanget i pseudo-cirklen nemt opdaget og fjernet fra de resulterende datasæt.
Denne teknik er beregnet til at måle de cirkulære polysaccharid kapsler af Cryptococcus arter baseret på tusch lysfelt mikroskopi; selv om det kunne anvendes på baseret andre kontrast cirkulære objekt målinger.
Introduction
Cryptococcus neoformans er en patogene gær fundet allestedsnærværende rundt om i verden, der er forbundet med human sygdom primært i immunosuppressed populationer. C. neoformans især tegner sig for en væsentlig årsag til samlede årlige dødsfald i Sub-Sahara Afrika på grund af smitsom sygdom1. Den store kliniske manifestation af cryptococcal infektion er meningoencephalitis, som følger invasion af centralnervesystemet ved transport i inficerede makrofager (trojansk hest måde) eller direkte passage af blod - hjerne barrieren. C. neoformans udtrykker flere virulens faktorer herunder evnen til at replikere på menneskets kropstemperatur, urease aktivitet, melanization og dannelsen af et polysaccharid kapsel2. Polysaccharid kapslen består af gentagne glucuronoxylomannan og glucoronoxylomannangalactan polymerer og funktioner som en beskyttende barriere mod faktorer såsom miljømæssige stress og vært immunrespons2.
Selv om størrelsen af den cryptococcal polysaccharid kapsel størrelse ikke har konsekvent været forbundet med virulens, er der beviser for, at det er en faktor i patogenesen2,3,4,5, 6,7. Kapsel størrelse er forbundet med meningitis patologi6, kan påvirke makrofag evne til at kontrollere Cryptococcus infektion5, og kan resultere i tab af virulens hvis fraværende8. Derfor kapsel størrelse målinger er almindelige i cryptococcal forskning, men der er ingen fieldwide standard for en metode til kapsel måling.
I øjeblikket, C. neoformans polysaccharid kapsel målingen er baseret på manuelle målinger af mikroskopi billeder, og de nøjagtige metoder til både billede og måling erhvervelser varierer mellem laboratorier9,10, 11. En umiddelbar bekymring for denne metode er, at nogle undersøgelser kræver erhvervelse af tusindvis af individuelle målinger, som vanskeliggør opretholdelse nøjagtighed og pålidelighed. Desuden, selv når resultaterne er offentliggjort, der er ofte utilstrækkelige beskrivelse af målemetoden. Mange publikationer ikke forklare, hvordan deres målinger blev opnået, hvad brændplanet blev brugt, hvordan de fastlægges tærsklen for kapsel identifikation, uanset om de anvendes radius eller diameter, uanset om de anvendes én måling eller i gennemsnit flere eller andre detaljer. Nogle publikationer eneste stat deres metode som hvilket program blev brugt, f.eks "Adobe Photoshop CS3 blev brugt til at måle cellerne"11. Denne mangel på standardisering og rapportering detaljer kan gøre reproducerbarhed svært hvis ikke umuligt. Forskelle i menneskelige syn, computer lysstyrke, mikroskop indstillinger, slide, belysning, og andre faktorer kan variere ikke bare mellem individer men mellem prøver, mens beregninger baseret på nøgletal af pixelværdier intensitet vil forblive konstante og gældende mellem prøver. Denne teknik blev genereret i forbindelse med at levere en standardiseret, præcis, hurtig og enkel teknik til at måle kapsler størrelser for et felt, hvor der var ingen før.
Som tidligere nævnt, CHT algoritme er veletablerede, og scripts til automatisk at registrere kredse har været skrevet før. Denne metode forbedrer i to områder, hvor andre scripts vil falde kort. Først, blot registrere cirkler er ikke nok, fordi med cryptococcal celler to særskilte kredse skal være registreret i forhold til hinanden. Denne metode specielt registrerer celle organer inden for kapsler, diskriminerer mellem to, og udfører beregninger kun på de relevante organ-kapsel par. For det andet, selv Hvornår følger den samme protokol, forskellige efterforskere vil ende op med forskellige erhvervet billeder. Ved at tillade investigator kontrol over hver algoritme parameter, kan dette værktøj justeres til at matche en bred vifte af anskaffelsesmetoder. Der er ikke behov for en standardiseret anvendelsesområde, målsætning, filter og så videre.
Denne teknik kan umiddelbart anvendes til enhver situation, hvor investigator skal registrere cirkler i et billede at kontrast med deres baggrund. Både cirkler lysere og mørkere end deres baggrund kan registreres, tælles og måles ved hjælp af denne teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af tusch dias
- Tilsæt 10 µL af cryptococcal prøve på et dias. Enhver cirkulære gærstamme vil arbejde men for dette eksperiment H99 var de eneste stamme anvendes.
Bemærk: Hvis prøven er direkte fra dyrkningsmedier, fortynding 1:2 med PBS eller vand kan hjælpe med at forhindre tusch fra sammenklumpning. - Der afpipetteres 2 µL af tusch plet på prøven og bland ved fysisk at skubbe pipette tip til prøven og bevæger sig i en cirkulær bevægelse, indtil tusch vises jævnt fordelt.
- Placer en coverslip over prøven ved at holde den venstre kant af coverslip mod overfladen af det dias, derefter forsigtigt og jævnt sænke den modsatte side af coverslip over prøven.
- Tillad dias til luft tørre i 5 min.
- Forsigtigt anvende en lys lag af neglelak til coverslip grænse til at danne en forsegling og bevare tusch plet.
2. imaging dias
- Placer dias i en lysfelt mikroskop med et kamera udlæg og kendte pixel til micron konvertering. Justere filtre, mål og kontrast, således at celle kapsler er klare og celle organer er fokuseret, mørke bånd.
Bemærk: Forskellige filtre, mål og kontrastindstillinger vil arbejde, men en 20 x mål, Ph1 filter og 2 x 2 binning anbefales. - Sikre synsfelt er tæt men ikke overbefolket med cryptococcal celler, med klar kontrast mellem celle kapsel og baggrund, og korrekt fokuseret med cellen kroppen visualiseret som et mørkt bånd.
Bemærk: Det nøjagtige antal celler for en optimal billede vil variere afhængigt af prøven og mål bliver brugt. De vigtige aspekter er at sikre celler ikke er klyngemiljø eller overlappende, at celle fokale planer ikke variere betydeligt, og at der er betydelige tusch plet klart synlige i baggrunden (mindst 25% i feltet). - Gemme billeder til en enkelt mappe med klare titler, som måling algoritme vil blive kørt på billeder i en enkelt mappe og outputdata vil blive tilrettelagt efter navnene på billedfilerne.
3. algoritme Setup
- Installere Python version 2.7 fra
- Installere ekstra python biblioteker ved at køre kommandoer "pip installere pude" og "pip installere openpyxl".
- Installere MATLAB ved at følge instruktionerne på
- Opbygge MATLAB python library ved at følge instruktionerne på https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
- Download de tre nødvendige filer inkluderet i dette manuskript supplerende materialer ("QCA.py", "Analysis2.m" og "TestRun.m").
Bemærk: Disse filer kan udvindes til ethvert sted, men alle tre skal være i samme mappe.
4. brug af algoritme
- Køre programmet ved at dobbeltklikke på QCA.py.
Bemærk: Programmet kan tage flere minutter at starte. Filen "QCA.py" indeholder den programstruktur, der kalder ".m" filer for at køre den faktiske algoritme. - Følg trinene i programmet.
- Input typen udvidelse af billedfiler efterfulgt af et punktum og adskilt af semikolon (tidl. ". TIF;. JPEG") derefter Klik Enter -knappen.
- Vælg den mappe, hvor billedfiler er placeret ved at klikke på knappen Vælg mappe og vælge den mappe, som indeholder billederne.
- Opret liste over billedfiler i mappen ved at klikke på knappen Generer billedet . Billederne vises i boksen til højre. Anmeld og sikre, at listen er nøjagtige og fuldstændige.
- Vælg et tilfældigt billede på listen til at bruge som et eksempel ved at klikke på knappen Vælg tilfældigt billede .
Bemærk: Hvis billedet er i stand til at åbne på grund af en "forkert billede tilstand fejl", algoritmen vil stadig fungere korrekt trods ikke vise billedet. Efter trin 4.2.7, vil test billede stadig vise. - Input mikroskop mål og udsmidningen indstillinger. Hvis standardindstillingerne ikke passer mikroskop bruges, skal du vælge "Custom Pixel konvertering" og input pixel-til-um konvertering til billedfilerne. Når det er valgt, skal du klikke på knappen Beregn konvertering og sikre konverteringen er korrekt efter tekstboksen til højre.
Bemærk: Repræsentative billeder vist i figur 1 blev beregnet med 40 x forstørrelse og 2 x 2 binning valgt. - Inddata algoritmen parametre til circle påvisning.
- Input minimale og maksimale radius kan spores til den ydre kapsel registrering som posterne Min og Max kapsel Radius. Et mindre område giver mulighed for mere præcise resultater.
- Input minimale og maksimale radius kan påvises for cellen kroppen opdagelse som posterne Min og Max cellen kroppen Radius.
Bemærk: Alle fire af disse poster skal være tal, der repræsenterer deres respektive værdier i pixels, ifølge kildebillederne. - Flyt kapsel og cellen kroppen følsomhed skyderne for at justere tærsklen af algoritme. En lav følsomhed vil være strenge og reducere falsk positive circle påvisning, men kan også påvise færre virkelige cirkler. Omvendt, en høj følsomhed vil øge den opdagelse sats men kan også resultere i falske positive cirkler.
Bemærk: Repræsentative resultater blev opnået med kapsel minimumsradius i 7, maksimale kapsel radius af 45, minimum krop radius af 4, maksimale krop radius 30, kapsel følsomhed 87, og kroppen følsomhed af 87.
- Teste parametre på det tilfældigt valgte billede ved at klikke på knappen Kør Test . Resultaterne vises i den øverste midten af programmet, erstatter det oprindelige billede. Hvis resultaterne ser nøjagtig, anbefales det at vælge en yderligere tilfældigt billede at prøve samt at sikre, at de valgte parametre vil passe alle valgte billeder.
- Maksimere antallet af organer og kapsler opdages og visuelt inspicere om cirkler synes at passe korrekt. Antallet af organer inden for kapsler opdaget vises i boksen til højre. Ellers manipulere algoritme parametre, indtil resultaterne er korrekte.
Bemærk: De tykke farvede cirkler er kun for at hjælpe med visualisering. De faktiske cirkler genereret for måling er en matematisk kurve beregnet af HCT algoritme.
- Maksimere antallet af organer og kapsler opdages og visuelt inspicere om cirkler synes at passe korrekt. Antallet af organer inden for kapsler opdaget vises i boksen til højre. Ellers manipulere algoritme parametre, indtil resultaterne er korrekte.
- Køre opdagelse algoritme på hele mappen billedfiler ved at klikke på knappen Begynde analysen . Hvert billede vil blive analyseret og programmet vil vise "færdig" i tekstboksen til højre når alle billeder er blevet analyseret.
- Klik på knappen Match og oprydning . Dette matcher detekterede celle organer til de fundne kapsler, de bor i, og beregne den sande kapsel radius ved at fratrække kroppen fra kapsel.
Bemærk: Hvis algoritmen, der bruges til at påvise fluorescens eller en anden situation, hvor kun en cirkel er opdaget dette trin er unødvendige. Klik i stedet på Kun trække organer eller knappen Kun trække kapsler for at indsamle data for kun blå eller kun de grønne cirkler, henholdsvis. Det er vigtigt at bemærke, at hvis bare den kapsel data hentes radius vil henvise til den samlede radius af cellen som radius af cellen kroppen ikke kan trækkes. - Find de færdige data i filen "CleanedOuput.csv" i mappen billede. Hvis det kun er ét enkelt dataelement blev valgt, vil fil være mærket "CleanedBodies.csv" eller "CleanedCapsules.csv".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Billeder er først fremstillet ved mikroskopi af tusch dias ved hjælp af en lysfelt mikroskop kombineret med et kamera (fig. 1A). Det er vigtigt at have cellerne adskilt og i tilstrækkeligt lav befolkningstæthed ikke at overvælde synsfelt, samt at bruge nok plet for at skabe kontrast mellem celler og baggrund. Som det fremgår af protokollen, vil det nøjagtige antal celler for en optimal billede variere afhængigt af prøven, mikroskop og mål bliver brugt. De vigtige aspekter er at sikre celler ikke er klyngemiljø eller overlappende, at celle fokale planer ikke variere betydeligt, og at der er betydelige tusch plet klart synlige i baggrunden (mindst 25% i feltet). Disse retninger tillade algoritme til at bestemme en tærskel, der er unikke for hvert billede ved at tage værdien gennemsnitlige pixel intensitet og tilføje standardafvigelsen. Alle pixel med en intensitet værdi højere end nævnte tærskel betragtes hvid og med en lavere intensitetsværdien betragtes som sort. Den resulterende billede giver en klar og skarp skelnen af hvor kapslen slutter (figur 1B). Algoritmen så har en robust hvidt på sort kontrast baseret cirkel til at opdage for kapslen og det originale billede giver en robust sort på hvid cirkel for celle organer. En repræsentativ visualisering af de fundne cirkler genereres som en del af programmet (figur 1C). Dette giver brugeren mulighed for hurtigt analysere igennem behandlede billeder og sikre resultaterne vises korrekt.
Det er vigtigt at følge den nøjagtige protokollen for at få optimale billeder. Sub-optimale billeder resultat som regel af en manglende kontrast mellem kapsel og blæk (fig. 2A). Optimale kontrast og erhvervelse parametre vil variere baseret på prøve, eksperiment, kamera og mikroskop modeller, osv. Et optimalt billede er en, hvor gærceller er adskilt, hvis det er muligt, hvor den ydre kant af kapslen har klar kontrast til tusch plet, og hvor cellen kroppen er fokuseret til at fremstå som et mørkt bånd, som står i skarp kontrast med sin baggrund. Hvis for mange celler er i synsfeltet, eller hvis pletten er for lys, intensitet pixelværdier vil klynge og programmet vil ikke være i stand til at fastsætte en tærskel i stand til at belyse kapsel størrelse (figur 2B). Når sub-optimale billeder bruges kan programmet registrere cirkler af forkerte størrelser, ikke være i stand til at opdage enhver cirkler eller opdage flere pseudo cirkler med artefakter i tærskel billede (fig. 2C).
Påvisning af celle organer udgør et lignende problem, idet cellen kroppen skal visualiseres som en robust sort cirkel på den hvide baggrund af kapslen. Dette problem er rettet i protokollen når der beskriver det ønskede brændplanet for image erhvervelse. Bedste brændplanet at bruge er en, hvor cellen kroppen optræder som en mørk, koncentreret band (fig. 3A). Denne brændplanet er acceptabel som en standard, fordi det fokuserer korrekt cellen. Dette blev bekræftet ved at visualisere cellevæg med Uvitex, en kitin plet (figur 3B). Uvitex plet viser tydeligt en sprød, fokuseret cellevæg med svagt signal i midten (hvor top og bund af cellen kroppen ville være plettet, ude af fokus).
I udviklingen af denne metode, det var også vigtigt at bekræfte, at kunne denne algoritme præcist bestemme kapsel og cellen kroppen målinger. Mens de repræsentative kredse i de tidligere tal er lovende, blev faktiske målinger sammenlignet mellem computer og menneskelige målinger. Når protokollen er fulgt nøjagtigt og optimale billeder er opnået, algoritmen er præcis og pålidelig (figur 4A). Men hvis protokollen efterfølges forkert og suboptimal billeder er opnået på grund af dårlig farvning, overbelægning, eller andre parametre, som tidligere nævnt, algoritmen mister nøjagtighed og sammenfatte ikke menneskelige målinger (figur 4B ). Da denne teknik blev oprindeligt udviklet til en bestemt person (første forfatter), en anden person blev bedt om at bruge det til at bestemme, hvis forskellene mellem farvning og måling stilarter vil det påvirke nøjagtigheden trods følgende protokol. Resultaterne viste, at denne teknik var almindeligt gældende så længe protokollen blev efterfulgt som instruerede (fig. 4C). På samme måde, denne teknik kan bruges med nogen i stand til at erhverve fase kontrast billeder parat tusch dias mikroskop. For at sikre algoritmen, der fortsat er korrekt med andre mikroskop opsætninger dette eksperiment blev gentaget af en tredje investigator bruger forskellige lysfelt mikroskop kombineret med et kamera og sammenlignet detekterede kapsel diametre med manuelt målte kapsel diametre. Ingen signifikant forskel blev observeret mellem computer og menneskelige målinger (figur 4D).
Endelig, fremtidige anvendelser af denne algoritme blev undersøgt i forbindelse med fluorescens farvning. Da fluorescens imaging er stadig baseret på signal til støj forhold mellem pixel intensitetsværdierne bør algoritmen gælde umiddelbart for fluorescens billeder så længe pletten er cirkulær i naturen. Dette program blev bekræftet, da algoritmen var købedygtig med held opdager Uvitex farves celle organer fra de tidligere beskrevne billeder (figur 5A, 5B). Brugere bør være omhyggelig med at optimere algoritme parametre for deres eksperiment, og standardiserede protokoller bør udvikles for alle nye ansøgninger i fremtiden.
Figur 1 : Repræsentative resultater af et optimalt opnåede billede. A. den oprindelige billede erhvervet af lysfelt mikroskopi af en tusch dias. B. den binært billede oprettet ved hjælp af en grænse beregnes ud fra gennemsnitlige pixel intensitet merværdi til standardafvigelsen. Alle værdier over denne tærskel betragtes hvid og alle under betragtes som sort. C. en visualisering af kapsler (grøn) og celle organer (blå) blev fundet af algoritmen. Alle billeder blev opnået på 40 x forstørrelse med 2 x 2 binning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentative resultater af en suboptimalt opnåede billede. A. den oprindelige tusch dias erhvervet via lysfelt mikroskopi. Skæv og utilstrækkelig, farvning resultaterne i et særligt lys baggrund med gradienter af intensitet. B. de resulterende binært billede, hvor kapsler ikke kan klart adskilles på grund af høje baggrund signal. C. flere kapsler er målbart. Alle billeder blev opnået på 40 x forstørrelse med 2 x 2 binning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: afsløring celle organer. A. lysfelt billede af kapsel centreret på den foretrukne fokalplan. B. Uvitex fluorescens billede af cellen kroppen på den foretrukne fokalplan. Billeder blev opnået på 100 x forstørrelse med 2 x 2 binning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: sammenligninger af resultater for algoritme (sort) og menneskelige (grå) analyser. A. når dias er tilberedt efter protokollen og optimale billeder fremstilles der er ingen mærkbar forskel mellem målinger. B. hvis protokollen ikke følges algoritmen kan ikke præcist identificere og måle kapsler. Specifikt baggrunden var her ikke konsekvent, og der var ikke klart kontrast mellem kapsler og baggrund. Betydelige variationer beregnes via t-test er noteret som * for P værdier < 0,05. C. en uafhængig efterforsker blev bedt om at følge protokollen og sammenligne deres analyser med algoritme. Pålidelighed bevares på tværs af observatører, så længe billederne er korrekt erhvervet. D. En anden uafhængig investigator med en anden mikroskop blev brugt til at bekræfte algoritmen, der bevarer nøjagtighed på tværs af individer og hardware. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : En potentiel alternativ anvendelse af algoritmen: identifikation og måling af Fluorescens mikroskopi. Celle organer var plettet og afbildet med Uvitex, så identificeret af algoritme. Den fundne cirkel streamens hvad ville mærkes som cellens væg, fordi opdagelse er baseret på fluorescens signal. Afsløring algoritme kan skræddersyes til at identificere specifikt den lyseste ophobning af signal (cellevæg) ved at ændre den tærskel, der bruges til at generere den indledende binært billede repræsenteret i tal 1B og 2B. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: en repræsentativ screenshot af programmet kører i et Windows-miljø. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 2: repræsentationer af detekterede spirende gær celler. Skalalinjen repræsenterer 10 µm. A. En forælder celle og bud hver regnes som separate celler inden for deres egen kapsel. B. A moder-cellen og bud hver talt to gange, når deres egen kapsel og en gang for den anden celle kapsel, resulterer i fire samlede celler opdaget fra ét moderselskab og ét bud. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 3: en repræsentation af de endelige efter celle påvisning og måling. Billedfil refererer til navnet på det oprindelige billede. Samlede radius refererer til radius af repræsentative grønne cirkler, kapsel og cellen kroppen kombineret. Kapsel x og kapsel y refererer til koordinater af kapsel som disse data vedrører. Kroppen radius refererer til radius af de repræsentative blå cirkler. Kapsel radius refererer til den samlede radius minus krop radius, hvilket resulterer i radius af bare kapslen. Disse værdier bliver i mikron, så længe brugeren inkluderet en pixel til micron konvertering ratio i trin 3.2.5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trin af denne teknik forbereder tusch dias og erhverve mikroskop billeder. Mens algoritmen, der er testet med succes med en række dias og billede teknikker er anbefalede protokollen beskrevet i dette håndskrift. Polysaccharid kapsel er opdaget, baseret på udelukkelse af tusch partikler fra domænet af kapslen, da disse partikler er for store til at trænge polysaccharid fibril netværk. Tusch udstødelse resulterer i en lys cirkel på toppen af en mørk baggrund. Algoritmen registrerer cirkler baseret på hvor godt de kontrast med deres baggrund. Således, en tung tusch plet vil resultere i højere kontrast mellem polysaccharid kapsel og baggrund, øge signal / støjforhold, og forbedre resultatet kvalitet. Omvendt, cellen kroppen er opdaget som en mørk cirkel på toppen af en lys baggrund. Cellen kroppen ændrer udseende baseret på hvilke brændplanet mikroskop er angivet til, vises som en diffus grå cirkel på toppen eller bunden af cellen og som en kondenseret mørkt bånd på center. Af samme årsager allerede diskuteret, bør brændplanet hvor cellen kroppen fremstår som en kondenseret, mørke band bruges til billede erhvervelse, da dette vil resultere i de mest præcise circle påvisning.
Metoden rapporteret her er vokset gennem flere ændringer og runder af fejlfinding. Algoritmen var oprindeligt kodet forventer at celler ikke ville være mindre end 4 eller større end 60 pixels baseret på mikroskopet, der blev brugt. At udvide anvendelsen af denne algoritme til forskellige forstørrelser og cellestørrelser disse grænser blev i stedet afløst af bruger input felter beskrevet i protokollen. Brugerne kan nu input parametre specifikt for hvert eksperiment for maksimal nøjagtighed. Hvis denne algoritme anvendes til en situation uden for Cryptococcus kapsel måling anbefales det at første sæt op en række udvalg at finde betingelser skal bestemme hvordan prøver bør genereres og afbildet.
Den væsentligste begrænsning af denne teknik er, at det var designet med et bestemt program i tankerne, nemlig målingen af cryptococcal kapsel. Mens det kan let modificeret til at passe ekstra applikationer, er dette script kun gælder direkte for kapsel måling protokollen skitseret ovenfor. Men denne begrænsning også beskriver betydningen af denne metode med hensyn til sit område og de eksisterende metoder. Derudover spirende gærceller kan udgøre et problem for efterforskere, der ønsker at kun måle forælder cellestørrelser. Denne algoritme er i stand til at opdage knopper som unikke celler (Figur S2A). Først, kan dette være et problem hvis investigator i hvilket tilfælde de ønsker at fjerne bud målinger, eller fjerne begge celler, hvis det ikke kan bestemmes som registreret cirkel er opløbet, og som er moderselskab. For det andet kan det medføre et andet problem hvis opløbet er opdaget som en cellen kroppen stadig inden for rammerne af forældrenes kapslen (Figur S2B) hvor sagen algoritmen vil måle bud i forhold til den parentale kapsel. I dette eksempel vil hver celle blive medregnet to gange, fordi hver celle organ er bosat inden for to kapsler. Nogen af disse problemer kan løses nemt, når protokollen er færdig. Det endelige datasæt vises som et regneark, hvor hver enkelt påvist celle er mærket ifølge den billedfil det kom fra, og x og y koordinaterne for cellen kroppen (Figur S3). Efterforskere kan simpelthen finde og udelukke de data, som svarer på opløbet. Trods kapsel størrelse er et vigtigt og stærkt studerede virulens faktor feltet Cryptococcus har endnu at etablere standard protokoller for kapsel måling eller et billede erhvervelse. Denne teknik var designet til at udfylde disse roller i en nøjagtig og praktisk måde frit til rådighed for laboratorier med minimal forudsætninger.
Fremtidige ansøgninger af denne teknik er i vid udstrækning at anvende det på andre eksperimenter. Ethvert billede baseret påvisning eller måling af cirkulære objekter bør analyzable gennem denne algoritme. Fluorescerende mikroskopi billeder kan analyseres ved at anvende algoritmen for individuelle laser kanaler. Bakteriel koloni optælling kan opnås, og med yderligere ændring kunne skelne mellem galactose journalister. Gær koloni vækst assays kunne også evalueres ved hjælp af denne algoritme til at anslå koloni området størrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende Anthony Bowen hvis dias blev brugt som en anden menneskelig side-by-side sammenligning samt Sabrina Nolan hvis dias blev brugt som en tredje menneskelige side-by-side og anden mikroskop sammenligning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| India Ink | Becton, Dickinson and Co. | 261194 | |
| Fisherbrand Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | 25x75x1 |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-B | 22x22-1 |
| Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish | Sally Hansen | N/A | 109 invisible |
| SAB Media | Sigma | S3306 | |
| Cryptotoccus neoformans | ATCC | 208821 | H99 strain |
| Olympus AX70 Microscope | Olympus | AX70TRF | Discontinued ; Bright Field Microscope |
| Qimaging Retiga 1300 | Qimaging | N/A | Discontinued ; Camera Microscope Attachment |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Most recent version recommended |
| Python Programming Language | Python | N/A | Version 2 necessary ; 2.7 recommended |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | Most recent version recommended |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P3813 |
References
- Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).
- Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007 (2013).
- Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Araujo, G. deS., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).
- García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
- Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
- Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).
