Deze techniek wordt beschreven van een geautomatiseerde batch-beeldprocessor, bedoeld voor het meten van de polysacharide capsule en lichaam stralen. Hoewel oorspronkelijk ontworpen voor Cryptococcus neoformans capsule metingen die de geautomatiseerde image processor kan ook worden toegepast op andere gebaseerd contrastdetectie van cirkelvormige objecten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geautomatiseerde meting van Cryptococcal soorten Polysaccharide Capsule en cel lichaam
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het doel van deze techniek is om te zorgen voor een consistente, nauwkeurige en beheersbaar proces voor grote aantallen polysaccharide capsule metingen.
Ten eerste, een drempel afbeelding is gegenereerd op basis van intensiteitswaarden uniek berekend voor elke afbeelding. Vervolgens worden cirkels gedetecteerd op basis van contrast tussen het object en de achtergrond met behulp van de gevestigde cirkel Hough transformatie (CHT) algoritme. Tot slot de gedetecteerde cel capsules en organen worden vergeleken volgens center coördinaten en RADIUS-grootte en gegevens worden geëxporteerd naar de gebruiker in een beheersbare werkblad.
De voordelen van deze techniek zijn eenvoudige maar belangrijke. Eerste, omdat deze berekeningen worden uitgevoerd door een algoritme in plaats van een mens zowel de nauwkeurigheid en de betrouwbaarheid zijn verhoogd. Er is geen achteruitgang in de nauwkeurigheid of betrouwbaarheid ongeacht hoeveel monsters worden geanalyseerd. Ten tweede, deze aanpak stelt een potentiële standaard gebruiksprocedure voor het Cryptococcus veld in plaats van de huidige situatie waar capsule meting per lab verschilt. Ten derde, gezien het feit dat handmatige metingen van de capsule zacht en monotoon, automatisering kunt snelle metingen op grote aantallen van gistcellen die op zijn beurt vergemakkelijkt hoge doorvoer data-analyse en steeds krachtiger statistieken.
De belangrijkste beperkingen van deze techniek vandaan hoe het algoritme-functies. Ten eerste zal het algoritme alleen genereren cirkels. Hoewel Cryptococcus cellen en hun capsules over een circulaire morfologie nemen, zou het moeilijk om deze techniek van toepassing op niet-cirkelvormige object detectie. Ten tweede, als gevolg van hoe cirkels worden gedetecteerd de CHT-algoritme kan detecteren enorme pseudo-cirkels op basis van de buitenste randen van verschillende geclusterde cirkels. Echter kan een verdraaid cel organen gevangen binnen de pseudo-cirkel gemakkelijk worden gedetecteerd en verwijderd uit het resulterende gegevenssets.
Deze techniek is bedoeld voor het meten van de circulaire polysaccharide capsules van Cryptococcus soorten op basis van de Oost-Indische inkt helder veld microscopie; Hoewel het kan worden toegepast op andere contrast gebaseerd circulaire object metingen.
Inleiding
Cryptococcus neoformans is een pathogene gist overal gevonden over de hele wereld dat is gekoppeld aan ziekten bij de mens vooral in immunosuppressie populaties. C. neoformans is vooral goed voor een beduidende oorzaak is van de totale jaarlijkse sterfgevallen in sub-Saharisch Afrika als gevolg van besmettelijke ziekte1. De belangrijke klinische manifestatie van cryptococcal infectie is meningo, die invasie van het centrale zenuwstelsel door vervoer in besmette macrophages (Trojaans paard wijze volgt) of directe overschrijding van de bloed - hersenbarrière. C. neoformans spreekt verschillende virulentiefactoren waaron....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. voorbereiding van de Oost-Indische inkt dia
- Pipetteer 10 µL van cryptococcal monster in een dia verschijnt. Een circulaire giststam zal werken maar voor dit experiment H99 was de enige spanning gebruikt.
Opmerking: Als het monster rechtstreeks van de voedingsbodems is, verdunnen 1:2 met PBS of water kan helpen voorkomen dat de Oost-Indische inkt uit clumping. - Pipetteer 2 µL van de Oost-Indische inktvlek op het monster en meng door fysiek duwen van het uiteinde van de pipet om het monster en in een cirkelmotie te verplaatsen totdat de Oost-Indische inkt gelijkmatig verdeelde verschijnt.
- Breng een dekglaasje aan over het monster door ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Beelden worden eerst verkregen door microscopie van Oost-Indische inkt dia's met behulp van een heldere veld Microscoop in combinatie met een camera(Figuur 1). Het is belangrijk dat cellen gescheiden en in voldoende lage dichtheid niet te overweldigen de gezichtsveld, alsmede over voldoende vlek kunt maken van contrast tussen cellen en achtergrond. Zoals in het protocol, zal het exacte aantal cellen voor een optimale afbeelding variëren afhan.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De kritische fasen van deze techniek zijn voorbereiding van de Oost-Indische inkt dia en de Microscoop afbeeldingen ophalen. Terwijl het algoritme met succes met een verscheidenheid van dia en beeld technieken getest is wordt het aanbevolen protocol beschreven in dit manuscript. De polysaccharide capsule wordt gedetecteerd op basis van de uitsluiting van de Oost-Indische inkt deeltjes uit het domein van de capsule zoals deze deeltjes zijn te groot om door te dringen de polysacharide fibril netwerk. Oost-Indische inkt uit.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Dankbetuigingen
Wij willen erkennen Anthony Bowen waarvan dia's werden gebruikt als een tweede menselijke side-by-side vergelijking evenals Sabrina Nolan waarvan dia's werden gebruikt als een derde menselijke side-by-side en de tweede vergelijking van de Microscoop.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| India Ink | Becton, Dickinson and Co. | 261194 | |
| Fisherbrand Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | 25x75x1 |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-B | 22x22-1 |
| Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nagellak | Sally Hansen | N/A | 109 onzichtbaar |
| SAB Media | Sigma | S3306 | |
| Cryptotoccus neoformans | ATCC | 208821 | H99 stam |
| Olympus AX70 Microscoop | Olympus | AX70TRF | Niet meer verkrijgbaar; Helderveld Microscoop |
| Qimaging Retiga 1300 | Qimaging | N/A | Niet meer verkrijgbaar; Camera Microscoop-aansluiting |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Meest recente versie aanbevolen |
| Python programmeertaal | Python | N/A | Versie 2 noodzakelijk; 2.7 aanbevolen |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | Meest recente versie aanbevolen |
| Fosfaatbufferoplossing (PBS) | Sigma | P3813 |
Referenties
- Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Kwon-Chung, K. J., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
