Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Geautomatiseerde meting van Cryptococcal soorten Polysaccharide Capsule en cel lichaam

doi: 10.3791/56957 Published: January 11, 2018

Summary

Deze techniek wordt beschreven van een geautomatiseerde batch-beeldprocessor, bedoeld voor het meten van de polysacharide capsule en lichaam stralen. Hoewel oorspronkelijk ontworpen voor Cryptococcus neoformans capsule metingen die de geautomatiseerde image processor kan ook worden toegepast op andere gebaseerd contrastdetectie van cirkelvormige objecten.

Abstract

Het doel van deze techniek is om te zorgen voor een consistente, nauwkeurige en beheersbaar proces voor grote aantallen polysaccharide capsule metingen.

Ten eerste, een drempel afbeelding is gegenereerd op basis van intensiteitswaarden uniek berekend voor elke afbeelding. Vervolgens worden cirkels gedetecteerd op basis van contrast tussen het object en de achtergrond met behulp van de gevestigde cirkel Hough transformatie (CHT) algoritme. Tot slot de gedetecteerde cel capsules en organen worden vergeleken volgens center coördinaten en RADIUS-grootte en gegevens worden geëxporteerd naar de gebruiker in een beheersbare werkblad.

De voordelen van deze techniek zijn eenvoudige maar belangrijke. Eerste, omdat deze berekeningen worden uitgevoerd door een algoritme in plaats van een mens zowel de nauwkeurigheid en de betrouwbaarheid zijn verhoogd. Er is geen achteruitgang in de nauwkeurigheid of betrouwbaarheid ongeacht hoeveel monsters worden geanalyseerd. Ten tweede, deze aanpak stelt een potentiële standaard gebruiksprocedure voor het Cryptococcus veld in plaats van de huidige situatie waar capsule meting per lab verschilt. Ten derde, gezien het feit dat handmatige metingen van de capsule zacht en monotoon, automatisering kunt snelle metingen op grote aantallen van gistcellen die op zijn beurt vergemakkelijkt hoge doorvoer data-analyse en steeds krachtiger statistieken.

De belangrijkste beperkingen van deze techniek vandaan hoe het algoritme-functies. Ten eerste zal het algoritme alleen genereren cirkels. Hoewel Cryptococcus cellen en hun capsules over een circulaire morfologie nemen, zou het moeilijk om deze techniek van toepassing op niet-cirkelvormige object detectie. Ten tweede, als gevolg van hoe cirkels worden gedetecteerd de CHT-algoritme kan detecteren enorme pseudo-cirkels op basis van de buitenste randen van verschillende geclusterde cirkels. Echter kan een verdraaid cel organen gevangen binnen de pseudo-cirkel gemakkelijk worden gedetecteerd en verwijderd uit het resulterende gegevenssets.

Deze techniek is bedoeld voor het meten van de circulaire polysaccharide capsules van Cryptococcus soorten op basis van de Oost-Indische inkt helder veld microscopie; Hoewel het kan worden toegepast op andere contrast gebaseerd circulaire object metingen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cryptococcus neoformans is een pathogene gist overal gevonden over de hele wereld dat is gekoppeld aan ziekten bij de mens vooral in immunosuppressie populaties. C. neoformans is vooral goed voor een beduidende oorzaak is van de totale jaarlijkse sterfgevallen in sub-Saharisch Afrika als gevolg van besmettelijke ziekte1. De belangrijke klinische manifestatie van cryptococcal infectie is meningo, die invasie van het centrale zenuwstelsel door vervoer in besmette macrophages (Trojaans paard wijze volgt) of directe overschrijding van de bloed - hersenbarrière. C. neoformans spreekt verschillende virulentiefactoren waaronder de mogelijkheid om te repliceren op menselijke lichaamstemperatuur, ureaseactiviteit, melanization en vorming van een polysaccharide capsule2. De polysaccharide capsule bestaat uit herhalende glucuronoxylomannan en glucoronoxylomannangalactan polymeren en functies als een beschermende barrière tegen factoren, zoals milieudruk en host immuunrespons op2.

Hoewel de grootte van de cryptococcal polysaccharide capsule grootte niet consequent gekoppeld aan de virulentie heeft, is er bewijs dat er een factor in de pathogenese2,3,4,5, 6,7. Capsule grootte is gekoppeld aan meningitis pathologie6, kan invloed uitoefenen op macrophage Cryptococcus infectie5controle, en kan resulteren in verlies van virulentie als afwezig8. Vandaar, capsule grootte metingen zijn gebruikelijk in cryptococcal onderzoek, maar er bestaat geen fieldwide standaard voor een methode voor de meting van de capsule.

Momenteel, C. neoformans polysaccharide capsule waardering is gebaseerd op handmatige metingen van microscopie beelden, en de exacte methoden van zowel de afbeelding als de meting acquisities variëren tussen laboratoria9,10, 11. Een directe zorg aan deze methode is dat sommige studies vereisen de verwerving van duizenden afzonderlijke metingen, waardoor handhaving nauwkeurigheid en betrouwbaarheid moeilijk. Bovendien, zelfs wanneer de resultaten worden gepubliceerd, er is vaak onvoldoende beschrijving van de meetmethode. Vele publicaties niet uitleggen hoe hun metingen werden verkregen, wat brandvlak werd gebruikt, hoe zij vastbesloten de drempel voor de identificatie van de capsule, of ze gebruikt RADIUS- of diameter, of ze een meting gebruikt of gemiddeld aantal, of andere Details. Sommige publicaties alleen staat hun methode als welk programma is gebruikt, bijvoorbeeld "Adobe Photoshop CS3 werd gebruikt voor het meten van de cellen"11. Dit gebrek aan standaardisatie en rapportage van detail kan maken reproduceerbaarheid moeilijk zo niet onmogelijk. Verschillen in menselijk gezichtsvermogen, computer helderheid, Microscoop instellingen, schuif de verlichting, en andere factoren kunnen variëren niet alleen tussen individuen, maar ook tussen de monsters, overwegende dat de berekeningen op basis van ratio's van pixelwaarden intensiteit constant zal blijven en toepassing tussen de monsters. Deze techniek werd gemaakt in het kader van het verstrekken van een gestandaardiseerde, nauwkeurige, snelle en eenvoudige techniek voor het meten van capsules maten voor een veld waarin er geen vóór was.

Zoals eerder vermeld, de CHT-algoritme is reeds lang gevestigde, en scripts automatisch detecteert cirkels zijn geschreven vóór. Deze methode verbetert in twee gebieden waar andere scripts zou tekortkomen. Eerst, simpelweg het opsporen van cirkels is niet genoeg, omdat met cryptococcal cellen twee verschillende cirkels ten opzichte van elkaar moeten worden gedetecteerd. Deze methode specifiek detecteert cel organen binnen capsules, discrimineert tussen de twee, en berekeningen alleen op de relevante instantie-capsule paren. Ten tweede, zelfs wanneer na de hetzelfde protocol, de verschillende onderzoekers zullen eindigen met verschillende verworven beelden. Doordat de onderzoeker controle over elk algoritme-parameter, kan deze tool worden aangepast aan een breed scala van overname methoden. Er is geen behoefte aan een gestandaardiseerde toepassingsgebied, doelstelling, filter, enzovoort.

Deze techniek kan gemakkelijk worden toegepast op elke situatie waarin de onderzoeker moet detecteren cirkels binnen een afbeelding die contrast met hun achtergrond. Beide cirkels lichter en donkerder dan hun achtergrond kan worden opgespoord, geteld en gemeten met behulp van deze techniek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. voorbereiding van de Oost-Indische inkt dia

  1. Pipetteer 10 µL van cryptococcal monster in een dia verschijnt. Een circulaire giststam zal werken maar voor dit experiment H99 was de enige spanning gebruikt.
    Opmerking: Als het monster rechtstreeks van de voedingsbodems is, verdunnen 1:2 met PBS of water kan helpen voorkomen dat de Oost-Indische inkt uit clumping.
  2. Pipetteer 2 µL van de Oost-Indische inktvlek op het monster en meng door fysiek duwen van het uiteinde van de pipet om het monster en in een cirkelmotie te verplaatsen totdat de Oost-Indische inkt gelijkmatig verdeelde verschijnt.
  3. Breng een dekglaasje aan over het monster door ingedrukt te houden de linker rand van het dekglaasje aan tegen het oppervlak van de dia, vervolgens voorzichtig en gelijkmatig verlagen de overkant van het dekglaasje aan over het monster.
  4. Laat de dia in de lucht droog voor 5 min.
  5. Zachtjes toepassen een licht laagje nagellak op dekglaasje aan rand om een zegel vormen en de Oost-Indische inktvlek te behouden.

2. imaging dia

  1. Dia's in een heldere veld microscoop met een camera gehechtheid en bekende pixel-naar-micron conversie plaats. Filters, doelstellingen, en het contrast aanpassen zodat de cel capsules zijn duidelijk en cel organen zijn gericht, donkere banden.
    Opmerking: Diverse filters, doelstellingen en contrast instellingen werkt maar een 20 x doelstelling, Ph1 filter en 2 x 2 weggooien wordt aanbevolen.
  2. Zorg ervoor dat het gezichtsveld is dicht maar niet overbevolkte met cryptococcal cellen, met duidelijk contrast tussen cel capsule en achtergrond, en goed gericht met het lichaam van de cel als een donkere band gevisualiseerd.
    Opmerking: Het exacte aantal cellen voor een optimale afbeelding zal variëren afhankelijk van het monster en de doelstelling wordt gebruikt. De belangrijke aspecten zijn om cellen zijn geen gegroepeerde of overlappende, dat de cel focal vliegtuigen niet aanzienlijk variëren, en dat er belangrijke Oost-Indische inkt vlek duidelijk zichtbaar op de achtergrond (ten minste 25% van het veld).
  3. Afbeeldingen opslaan naar een enkele directory met duidelijke titels, zoals het algoritme van de meting zal worden uitgevoerd op afbeeldingen in één map en de outputgegevens zal worden georganiseerd volgens de namen van de afbeeldingsbestanden opslaat.

3. algoritme Setup

  1. Installeren van Python versie 2.7 van
  2. Extra python bibliotheken installeren door het uitvoeren van de commando's "pip install kussen" en "pip install openpyxl".
  3. MATLAB installeren door het volgen van de instructies op
  4. Bouw de MATLAB python bibliotheek door het volgen van de instructies op https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
  5. Downloaden van de drie vereiste bestanden opgenomen in dit manuscript aanvullende materialen ("QCA.py", "Analysis2.m" en "TestRun.m").
    Opmerking: Deze bestanden kunnen worden uitgepakt naar een willekeurige locatie, maar alle drie moeten in dezelfde map.

4. gebruik van het algoritme

  1. De toepassing laten uitvoeren door dubbel te klikken op QCA.py.
    Opmerking: De toepassing kan enige tijd duren om te beginnen. Het "QCA.py"-bestand bevat de programmastructuur die de ".m"-bestanden roept voor het uitvoeren van de werkelijke algoritme.
  2. Volg de stappen in het programma.
    1. Het uitbreidingstype van de afbeeldingsbestanden opslaat voorafgegaan door een punt en gescheiden door puntkomma's (ex. ". TIF;. JPEG") dan klik op de Enter -knop.
    2. Kies de map waarin de afbeeldingsbestanden bevinden zich door op de knop Map selecteren te klikken en te selecteren de map die de afbeeldingen bevat.
    3. Genereer de lijst met afbeeldingsbestanden in de map door te klikken op de knop Genereren Image List . De beelden worden weergegeven in het tekstvak naar rechts. Herziening en zorgen voor dat de lijst is nauwkeurig en volledig.
    4. Selecteer een willekeurige afbeelding in de lijst om te gebruiken als een voorbeeld door te klikken op de knop Willekeurige afbeelding selecteren .
      Opmerking: Als de afbeelding niet kunt openen vanwege een "onjuist beeld modus fout", het algoritme functioneert nog steeds goed ondanks de afbeelding niet weergegeven. Na stap 4.2.7, zal nog steeds de testafbeelding weergeven.
    5. Invoer-Microscoop objectieve en weggooien van instellingen. Als de standaardinstellingen niet overeenkomen met de Microscoop gebruikt, selecteert u "Custom Pixel Conversion" en input van de pixel-naar-um-conversie voor de afbeeldingsbestanden. Zodra geselecteerd, klik op de knop Berekenen conversie en zorgen dat de conversie klopt volgens het tekstvak aan de rechterkant.
      Opmerking: Representatieve beelden getoond in Figuur 1 zijn berekend met 40 x vergroting en 2 x 2 weggooien geselecteerd.
    6. Input parameters van de algoritme voor de detectie van de cirkel.
      1. Ingang van de minimale en maximale straal aantoonbaar voor de buitenste capsule detectie als de Min en Max Capsule RADIUS-posten. Een kleiner bereik zal toestaan meer nauwkeurige resultaten.
      2. Ingang van de minimale en maximale straal aantoonbaar voor de detectie van de cel lichaam als de Min en Max cel lichaam RADIUS-posten.
        Opmerking: Alle vier van deze vermeldingen moet getallen vertegenwoordigen hun respectieve waarden in pixels, volgens de bronafbeeldingen.
      3. Verplaats de schuifregelaars van de Capsule en de gevoeligheid van de cel lichaam aan te passen van de drempel van de gevoeligheid van het algoritme. Een lage gevoeligheid zullen strikte en valse positieve cirkel detectie verminderen, maar ook minder echte kringen kan detecteren. Omgekeerd, een hoge gevoeligheid de opsporingstarief zal toenemen maar kan ook leiden tot valse positieve cirkels.
        Opmerking: Representatieve resultaten werden bekomen met een capsule minimumboogstraal van 7, de capsule maximumstraal van 45, de minimale lichaam straal van 4, de maximale lichaam straal van 30, de capsule gevoeligheid van 87 en lichaam gevoeligheid van 87.
    7. Test de parameters op de willekeurig geselecteerde afbeelding door te klikken op de knop Test starten . De resultaten worden weergegeven in het bovenste midden van het programma, ter vervanging van de oorspronkelijke afbeelding. Als de resultaten nauwkeurig kijken, is het raadzaam om een extra willekeurige afbeelding om eveneens te proberen om dat de geselecteerde parameters past alle geselecteerde afbeeldingen te selecteren.
      1. Maximaliseren van het aantal organen en capsules gedetecteerd en of de cirkels lijken te passen correct visueel te inspecteren. Het aantal organen binnen capsules gedetecteerd zal worden weergegeven in het tekstvak naar rechts. Anders, het manipuleren van de algoritme parameters totdat de resultaten kloppen.
        Opmerking: De dikke gekleurde cirkels zijn slechts om te helpen met visualisatie. De werkelijke cirkels gegenereerd voor meting is een wiskundige curve berekend door de HCT-algoritme.
    8. De detectie algoritme op de gehele Active directory van beeld-bestanden door te klikken op de knop Beginnen analyse uitvoeren Elk beeld zal worden geanalyseerd en het programma verschijnt "klaar" in het tekstvak naar rechts als alle beelden hebben geanalyseerd.
    9. Klik op de knop Match en opruimen . Dit zal overeenkomen met gedetecteerde cel organen aan de gedetecteerde capsules, die zij wonen in en de ware capsule straal berekenen door lichaam van capsule af te trekken.
      Opmerking: Als het algoritme wordt gebruikt voor het detecteren van fluorescentie of een andere situatie waarin slechts één cirkel is ontdekt deze stap niet nodig. In plaats daarvan klikt u op de Alleen trekken organen of de knop Alleen trekken Capsules voor het verzamelen van de gegevens voor alleen de blauwe of alleen de groene cirkels, respectievelijk. Het is belangrijk op te merken dat als alleen de capsule gegevens opgehaald de straal naar de totale straal van de cel verwijzen zal als de straal van de cel lichaam kon niet worden afgetrokken.
    10. Zoek de ingevulde gegevens in het bestand "CleanedOuput.csv" in de image map. Als slechts één gegevenseenheid werd geselecteerd, zal het bestand "CleanedBodies.csv" of "CleanedCapsules.csv" worden aangeduid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Beelden worden eerst verkregen door microscopie van Oost-Indische inkt dia's met behulp van een heldere veld Microscoop in combinatie met een camera(Figuur 1). Het is belangrijk dat cellen gescheiden en in voldoende lage dichtheid niet te overweldigen de gezichtsveld, alsmede over voldoende vlek kunt maken van contrast tussen cellen en achtergrond. Zoals in het protocol, zal het exacte aantal cellen voor een optimale afbeelding variëren afhankelijk van het monster, de Microscoop, en de doelstelling wordt gebruikt. De belangrijke aspecten zijn om cellen zijn geen gegroepeerde of overlappende, dat de cel focal vliegtuigen niet aanzienlijk variëren, en dat er belangrijke Oost-Indische inkt vlek duidelijk zichtbaar op de achtergrond (ten minste 25% van het veld). Deze richtingen toestaan het algoritme om te bepalen van een drempel die uniek zijn voor elke afbeelding door de gemiddelde pixelwaarde van de intensiteit en de standaarddeviatie toe te voegen. Elke pixel met een hoger dan de genoemde drempel intensiteitswaarde wordt beschouwd als wit en met een lagere intensiteitswaarde wordt beschouwd als zwarte. De resulterende afbeelding laat een duidelijke en kernachtige onderscheid van waar de capsule (Figuur 1B eindigt). Het algoritme heeft een robuuste wit-op-zwart contrast gebaseerd cirkel om te detecteren de capsule en de oorspronkelijke afbeelding biedt een robuuste zwart-op-wit cirkel voor cel organen. Een representatieve visualisatie van de gedetecteerde cirkels wordt gegenereerd als onderdeel van het programma (Figuur 1C). Hierdoor kan de gebruiker snel ontleden door verwerkte afbeeldingen en ervoor te zorgen dat nauwkeurige worden de resultaten weergegeven.

Het is essentieel te volgen het exacte protocol om optimale beelden te verkrijgen. Sub-optimale beelden meestal het gevolg van een gebrek aan contrast tussen capsule en inkt(Figuur 2). Optimaal contrast en overname parameters zullen variëren, afhankelijk van de steekproef, experiment, camera en Microscoop modellen, enz. Een optimale afbeelding is een waar gistcellen worden gescheiden, indien mogelijk, waar de buitenste rand van de capsule heeft duidelijk contrast op de Oost-Indische inktvlek, en waar de cel lichaam is gericht om te verschijnen als een donkere band die met de achtergrond contrasteert. Als te veel cellen in het gezichtsveld of als de vlek te licht is, de intensiteit van de pixelwaarden zal cluster en het programma niet zal kunnen een drempel kunnen ophelderen capsule grootte (Figuur 2B) vast te stellen. Wanneer sub-optimale beelden worden gebruikt kan het programma detecteren cirkels van onjuiste grootte, niet kundig voor speurder ieder cirkels worden of detecteren van meerdere pseudo-cirkels op basis van artefacten in het beeld van de drempel (Figuur 2C).

Opsporen van cel organen vormt een soortgelijk probleem in die zin dat de cel lichaam moet worden gevisualiseerd als een robuuste zwarte cirkel op de witte achtergrond van de capsule. Dit probleem wordt behandeld in het protocol bij het beschrijven van de gewenste brandvlak voor Beeldacquisitie. De beste brandvlak te gebruiken is een waarin de cel lichaam wordt weergegeven als een donkere, geconcentreerde band (Figuur 3A). Deze brandvlak is aanvaardbaar als norm, omdat het zich goed de cel concentreert. Dit werd bevestigd door het visualiseren van de celwand met Uvitex, een vlek van chitine (Figuur 3B). De Uvitex vlek blijkt een scherpe, celwand met zwak signaal in het centrum (waar de boven- en onderkant van de cel lichaam zou worden gekleurd, onscherp) gericht.

Bij de ontwikkeling van deze methode het was ook belangrijk om te bevestigen dat kon dit algoritme nauwkeurig bepalen capsule en cel lichaam metingen. Terwijl de representatieve cirkels in de vorige cijfers veelbelovend zijn, werden feitelijke metingen vergeleken tussen computer en menselijke metingen. Wanneer het protocol wordt nauwkeurig gevolgd en optimale beelden worden verkregen, het algoritme is nauwkeurig en betrouwbaar (Figuur 4A). Echter als het protocol niet correct wordt gevolgd en suboptimaal beelden worden verkregen als gevolg van slechte kleuring, overbevolking, of andere eerder genoemde parameters, het algoritme verliest van nauwkeurigheid en kan niet recapituleren menselijke metingen (Figuur 4B ). Omdat deze techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld voor een specifiek individu (eerste auteur), een andere persoon werd gevraagd om het te gebruiken om te bepalen als de verschillen tussen kleuring en meting stijlen nauwkeurigheid ondanks onderstaande voorschriften zou beïnvloeden. De resultaten bleek dat deze techniek breed toepasbaar is, zolang het protocol werd gevolgd als geïnstrueerd (Figuur 4C). Deze techniek kan ook worden gebruikt met een microscoop kan verwerven fase contrast beelden van de voorbereide dia's van de Oost-Indische inkt. Om ervoor te zorgen dat het algoritme blijft nauwkeurig met andere opstellingen van de Microscoop die dit experiment werd herhaald door een derde onderzoeker met behulp van een ander helder veld Microscoop in combinatie met een camera en ten opzichte van gedetecteerde capsule diameters met handmatig gemeten capsule diameters. Geen significant verschil waargenomen tussen computer en menselijke metingen (Figuur 4D).

Ten slotte, toekomstige toepassingen van dit algoritme werden onderzocht in het kader van de fluorescentie kleuring. Aangezien fluorescentie imaging is nog steeds gebaseerd op signaal ruisverhoudingen van pixelwaarden intensiteit het algoritme gelden gemakkelijk fluorescentie beelden zo lang als de vlek circulaire in de natuur is. Deze toepassing werd bevestigd toen het algoritme was kundig voor speurder met succes dat uvitex gekleurd cel organen van de eerder beschreven beelden (Figuur 5A, 5B). Gebruikers moeten voorzichtig zijn voor het optimaliseren van de parameters van de algoritme voor hun experiment en gestandaardiseerde protocollen moeten in de toekomst voor elke nieuwe toepassingen worden ontwikkeld.

Figure 1
Figuur 1 : Representatieve resultaten van een optimaal verkregen beeld. A. het eerste beeld verkregen door heldere veld microscopie van een dia Oost-Indische inkt. B. de binaire image gemaakt met behulp van een drempel berekend op basis van de gemiddelde pixel intensiteit toegevoegde waarde voor de standaarddeviatie. Alle waarden boven deze drempel worden beschouwd als wit en alle hieronder worden beschouwd als zwarte. C. een visualisatie van de capsules (groen) en cel organen (blauw) gedetecteerd door het algoritme. Alle beelden werden verkregen op 40 x vergroting met 2 x 2 weggooien. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Representatieve resultaten van een sub-optimaal verkregen beeld. A. de eerste dia van de Oost-Indische inkt verworven via heldere veld microscopie. Oneffen en onvoldoende resultaten op een bijzonder heldere achtergrond met hellingen van intensiteit kleuring. B. het resulterende binaire beeld, waarin de capsules duidelijk te wijten aan de hoge achtergrond signaal niet worden onderscheiden. C. verschillende capsules zijn niet detecteerbaar. Alle beelden werden verkregen op 40 x vergroting met 2 x 2 weggooien. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: opsporen cel organen. A. helder veld afbeelding van capsule gecentreerd op het gewenste brandvlak. B. de afbeelding van de fluorescentie van het Uvitex van het lichaam van de cel op de gewenste brandvlak. Beelden werden verkregen op 100 x vergroting met 2 x 2 weggooien. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: analyses van de vergelijkingen van de resultaten van het algoritme (zwart) en menselijke (grijs). A. als dia's worden bereid volgens protocol en optimale beelden zijn verkregen is er geen merkbaar verschil tussen de metingen. B. als het protocol wordt niet gevolgd het algoritme kan niet nauwkeurig identificeren en meten van de capsules. Hier specifiek de achtergrond was niet consistent en er was niet duidelijk contrast tussen capsules en achtergrond. Aanzienlijke variaties berekend via t-test wordt genoteerd als * voor P < 0.05 waarden. C. een onafhankelijke onderzoeker werd gevraagd om het protocol te volgen en vergelijken hun analyses met het algoritme. Betrouwbaarheid wordt bijgehouden over waarnemers, zolang de opnamen goed worden verworven. D. Een tweede onafhankelijke onderzoeker met een tweede Microscoop werd gebruikt om te bevestigen dat het algoritme behoudt nauwkeurigheid over individuen en hardware. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Een mogelijke alternatieve toepassing van het algoritme: identificatie en meting van fluorescentie microscopie. Cel organen werden gekleurd en beeld met Uvitex en vervolgens geïdentificeerd door algoritme. De gedetecteerde cirkel strekt zich uit langs wat zou worden aangeduid als de celwand omdat de detectie is gebaseerd op het signaal van de fluorescentie. De detectie algoritme kan worden aangepast om specifiek de helderste accumulatie van signaal (de celwand) vast te stellen door aanpassing van de drempel die is gebruikt voor het genereren van de oorspronkelijke binaire image vertegenwoordigd in cijfers 1B en 2B. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Supplemental Figure 1
Aanvullende figuur 1: een representatieve screenshot van de toepassing die wordt uitgevoerd in een Windows omgeving. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Supplemental Figure 2
Aanvullende figuur 2: representaties van gedetecteerde ontluikende gist cellen. Schaal staaf vertegenwoordigt 10 µm. A. Een oudercel en bud elke geteld als afzonderlijke cellen binnen hun eigen capsule. B. A bovenliggende-cel en bud elke geteld tweemaal, eenmaal voor hun eigen capsule en eenmaal voor de andere cel capsule, resulterend in vier totaal aantal cellen van één ouder en één bud ontdekt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Supplemental Figure 3
Aanvullende figuur 3: een vertegenwoordiging van de definitieve gegevens verstrekt na cel detectie en meting. Image-bestand verwijst naar de naam van de oorspronkelijke afbeelding. Totale straal verwijst naar de straal van de representatieve groene cirkels, de capsule en de cel lichaam gecombineerd. Capsule x en y van de Capsule verwijzen naar de coördinaten van de capsule waarvoor deze gegevens geldt voor. Lichaam straal verwijst naar de straal van de representatieve blauwe cirkels. Capsule straal verwijst naar de totale straal minus de straal van het lichaam, resulterend in de straal van alleen de capsule. Deze waarden zullen in micron, zo lang als de gebruiker een pixel-naar-micron conversie ratio in stap 3.2.5 opgenomen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De kritische fasen van deze techniek zijn voorbereiding van de Oost-Indische inkt dia en de Microscoop afbeeldingen ophalen. Terwijl het algoritme met succes met een verscheidenheid van dia en beeld technieken getest is wordt het aanbevolen protocol beschreven in dit manuscript. De polysaccharide capsule wordt gedetecteerd op basis van de uitsluiting van de Oost-Indische inkt deeltjes uit het domein van de capsule zoals deze deeltjes zijn te groot om door te dringen de polysacharide fibril netwerk. Oost-Indische inkt uitsluiting resulteert in een heldere cirkel op de top van een donkere achtergrond. Het algoritme detecteert cirkels op basis van hoe goed ze met hun achtergrond contrast. Dus, een zware Oost-Indische inktvlek zal resulteren in hogere contrast tussen polysaccharide capsule en achtergrond, verhoging van de signaal / ruisverhouding en verbetering van de Resultaatskwaliteit. Omgekeerd, wordt de cel lichaam ontdekt als een donkere cirkel op de top van een lichte achtergrond. De cel lichaam verandert uiterlijk op basis van welke brandvlak de Microscoop is ingesteld op, wordt weergegeven als een diffuse grijze cirkel aan de bovenkant of onderkant van de cel en als een verkorte donkere band in het midden. Om dezelfde redenen reeds besproken, het brandvlak waar het lichaam van de cel wordt weergegeven als een verkorte, donkere band moet worden gebruikt voor Beeldacquisitie, aangezien dit in de meest nauwkeurige detectie van de cirkel resulteren zal.

De methode gemeld hier geboekt via verschillende wijzigingen en rondes van het oplossen van problemen. Het algoritme werd aanvankelijk gecodeerde verwacht dat cellen niet kleiner zijn dan 4 zou zijn of groter is dan 60 pixels op basis van de Microscoop waarmee. Uit te breiden de toepassing van dit algoritme naar verschillende vergrotingen en cel maten die deze limieten in plaats daarvan werden vervangen door de gebruiker invoervelden beschreven in het protocol. Gebruikers kunnen nu het invoeren van parameters die specifiek zijn voor elk experiment voor maximale nauwkeurigheid. Dit algoritme wordt toegepast op een situatie buiten Cryptococcus capsule meting wordt het aanbevolen om als eerste set een reeks verkennende voorwaarden om te bepalen hoe de monsters moeten worden gegenereerd en beeld.

De belangrijkste beperking van deze techniek is dat het werd ontworpen met een specifieke toepassing in het achterhoofd, namelijk de meting van cryptococcal capsule. Terwijl het kan gemakkelijk worden aangepast voor extra toepassingen passen, is dit script alleen rechtstreeks toepasselijk zijn bij het protocol van de capsule meting hierboven beschreven. Deze beperking wordt echter ook de betekenis van deze methode ten aanzien van het veld en aan de bestaande methodes beschreven. Bovendien, ontluikende gistcellen kunnen presenteren een probleem voor onderzoekers die willen alleen bovenliggende cellen maten te meten. Dit algoritme is geschikt voor het opsporen van toppen als unieke cellen (Figuur S2A). Eerst, kan dit een probleem zijn als de onderzoeker in welk geval zij zou willen verwijderen van bud metingen of beide cellen verwijderen als het niet kan worden bepaald welke gedetecteerde cirkel is de kiem en die de ouder is. Ten tweede, kan hierdoor een ander probleem als de kiem wordt herkend als een cel lichaam nog steeds binnen de grenzen van de ouderlijke capsule (Figuur S2B) in die geval de algoritme de kiem met betrekking tot de ouderlijke capsule meten zal. In dit voorbeeld wordt elke cel tweemaal omdat elke cel lichaam zich binnen twee capsules bevindt gerekend. Een van deze problemen kunnen gemakkelijk worden aangepakt wanneer het protocol voltooid is. De definitieve gegevensset wordt weergegeven als een werkblad waar elk individu gevonden cel heet volgens het afbeeldingsbestand het vandaan kwam, en de x en y-coördinaten van de cel lichaam (Figuur S3). Onderzoekers kunnen eenvoudig zoeken en uitsluiten van de gegevens die overeenkomt met de kiem. Ondanks de grootte van de capsule wordt een belangrijk en zwaar studeerde virulentiefactor die het Cryptococcus -veld nog heeft om standaardprotocollen voor capsule meting of afbeelding verwerving. Deze techniek werd ontworpen om te vullen deze rollen in een accurate en handige wijze vrij beschikbaar voor laboratoria met minimale vereisten.

Toekomstige toepassingen van deze techniek zijn grotendeels toe te passen op andere experimenten. Elk beeld gebaseerde detectie of meting van cirkelvormige objecten moet analyseren door middel van dit algoritme. Fluorescent microscopie beelden kunnen worden geanalyseerd door toepassing van het algoritme op individuele laser kanalen. Bacteriële kolonie tellen kan worden bereikt, en met extra wijziging kan onderscheid maken tussen galactose verslaggevers. Gist kolonie groei testen kon ook worden geëvalueerd met behulp van dit algoritme te schatten van de oppervlakte van de kolonie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Acknowledgments

Wij willen erkennen Anthony Bowen waarvan dia's werden gebruikt als een tweede menselijke side-by-side vergelijking evenals Sabrina Nolan waarvan dia's werden gebruikt als een derde menselijke side-by-side en de tweede vergelijking van de Microscoop.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
India Ink Becton, Dickinson and Co. 261194
Fisherbrand Superfrost Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-143 25x75x1
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher Scientific 12-548-B 22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish Sally Hansen N/A 109 invisible
SAB Media Sigma S3306
Cryptotoccus neoformans ATCC 208821 H99 strain
Olympus AX70 Microscope Olympus AX70TRF Discontinued ; Bright Field Microscope
Qimaging Retiga 1300 Qimaging N/A Discontinued ; Camera Microscope Attachment
MATLAB MathWorks N/A Most recent version recommended
Python Programming Language Python N/A Version 2 necessary ; 2.7 recommended
Microsoft Excel Microsoft N/A Most recent version recommended
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P3813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23, (4), 525-530 (2009).
  2. Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4, (7), 019760 (2014).
  3. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76, (2), 508 (1985).
  4. Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80, (7), Supplement (P04.007) 007 (2013).
  5. Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
  6. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209, (1), 74-82 (2014).
  7. Araujo, G. deS., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7, (1), 29561 (2012).
  8. García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3, (2), 385-392 (2004).
  9. Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12, (6), 740-753 (2010).
  10. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71, (11), 6155-6164 (2003).
  11. Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).
Geautomatiseerde meting van <em>Cryptococcal</em> soorten Polysaccharide Capsule en cel lichaam
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).More

Dragotakes, Q., Casadevall, A. Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body. J. Vis. Exp. (131), e56957, doi:10.3791/56957 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter