Summary
Denna teknik beskriver en automatiserad batch bildprocessor avsedd att mäta polysackarid kapsel och kroppen radier. Samtidigt som ursprungligen har utformats för Cryptococcus neoformans kapsel mätningar automatiserade bildprocessorn kan också tillämpas på andra baserat kontrastmätning av cirkulära objekt.
Abstract
Syftet med denna teknik är att ge en konsekvent, korrekt och hanterbar process för ett stort antal polysackarid kapsel mätningar.
Först, en tröskel bilden genereras baserat på intensitetsvärden unikt beräknas för varje bild. Sedan, cirklar upptäcks baserat på kontrasten mellan objekt och bakgrund med väletablerade cirkel Hough Transformation (CHT) algoritm. Slutligen de upptäckta cell kapslar och organ matchas enligt center koordinater och RADIUS-storlek och data exporteras till användaren i ett lätthanterligt kalkylblad.
Fördelarna med denna teknik är enkel men betydande. Första, eftersom dessa beräkningar utförs av en algoritm i stället för en människa både noggrannhet och tillförlitlighet ökar. Det finns ingen nedgång i riktigheten eller tillförlitligheten oavsett hur många prover analyseras. För det andra, denna strategi fastställs en potentiell normalförfarande för fältet Cryptococcus i stället för den nuvarande situationen där kapsel mätning varierar av lab. Tredje, med tanke på att manuell kapsel mätningar är långsam och monotona, automation tillåter snabba mätningar på stora mängder jästceller som i sin tur underlättar hög genomströmning dataanalys och allt mäktigare statistik.
Stora begränsningar i denna teknik kommer från hur funktionerna algoritm. Algoritmen kommer först, bara generera cirklar. Medan Cryptococcus celler och deras kapslar tar på en cirkulär morfologi, skulle det vara svårt att tillämpa denna teknik till icke-cirkulära objekt upptäckt. För det andra, på grund av hur cirklar upptäcks CHT algoritmen kan upptäcka enorma pseudo cirklar baserat på ytterkanterna på flera klustrade cirklar. Dock kan någon felaktig bild cell organ som fångas inom pseudo cirkeln enkelt upptäckas och tas bort från de resulterande datauppsättningarna.
Denna teknik är avsedd för mätning av cirkulär polysackarid kapslarna av Cryptococcus arter baserat på India färgpulver ljusa fält mikroskopi; Trots det skulle kunna tillämpas på bygger andra kontrast cirkulär objektet mätningar.
Introduction
Cryptococcus neoformans är en patogen jäst hittade ubiquitously i världen som är associerad med mänskliga sjukdomen primärt hos immunsupprimerade populationer. C. neoformans framför står för en betydande orsak till totala årliga dödsfall i subsahariska Afrika på grund av smittsam sjukdom1. Den stora kliniska manifestationen av cryptococcal infektion är meningoencefalit, som följer invasion av centrala nervsystemet av transport i infekterade makrofagerna (trojansk häst sätt) eller direkt korsning av den blod - hjärnbarriären. C. neoformans uttrycker flera virulensfaktorer inklusive möjligheten att replikera på människans kroppstemperatur, ureasaktivitet, melanization och bildandet av en polysackarid kapsel2. Polysackarid kapseln består av upprepade glucuronoxylomannan och glucoronoxylomannangalactan polymerer och funktioner som en skyddande barriär mot faktorer som stress och värd immunsvar2.
Även om storleken på cryptococcal polysackarid kapsel storlek inte konsekvent har associerade med virulens, finns det bevis för att det är en faktor i patogenesen2,3,4,5, 6,7. Storlek är associerad med meningit patologi6, kan påverka makrofag förmåga att styra Cryptococcus infektion5och kan resultera i förlust av virulens om frånvarande8. Därför kapsel storlek mätningar är vanliga i cryptococcal forskning, men det finns ingen fieldwide standard för en kapsel mätmetod.
För närvarande C. neoformans polysackarid kapsel mätningen baseras på manuella mätningar av mikroskopi bilder, och metoderna för både bild och mätning förvärv varierar mellan laboratorier9,10, 11. En omedelbar oro att denna metod är att vissa studier kräver förvärvet av tusentals enskilda mätningar, vilket försvårar att upprätthålla noggrannhet och tillförlitlighet. Dessutom även när resultaten publiceras, finns det ofta otillräcklig Beskrivning av mätmetoden. Många publikationer inte förklara hur deras mätningar erhölls, vilken fokalplan användes, hur de beslutsamma tröskeln för kapsel identifiering, huruvida de använt radie eller diameter, oavsett om de används en mätning eller i genomsnitt flera, eller andra Detaljer. Vissa publikationer endast staten deras metod som vilket program som använts, t.ex., ”Adobe Photoshop CS3 användes för att mäta cellerna”11. Denna brist på standardisering och rapportering detalj kan göra reproducerbarhet svårt om inte omöjligt. Skillnader i människors syn, dator ljusstyrka, Mikroskop inställningar, Skjut belysning och andra faktorer kan varierar inte bara mellan individer utan mellan prover, medan beräkningar baserade på förhållanden av pixel intensitetsvärden förblir konstant och tillämpliga mellan prover. Denna teknik har genererats i samband med att tillhandahålla en standardiserad, korrekt, snabb och enkel teknik för att mäta kapslar storlekar för ett fält där det fanns ingen innan.
Som tidigare nämnts, CHT algoritmen är väletablerad och skript för att automatiskt upptäcka cirklar har skrivits innan. Metoden förbättrar i två områden där andra skript skulle falla kort. Första helt enkelt upptäcka cirklar är inte tillräckligt, eftersom med cryptococcal celler två distinkta cirklar måste upptäckas i förhållande till varandra. Denna metod uttryckligen upptäcker cellen organ inom kapslar, diskriminerar mellan två och utför beräkningar endast på de relevanta organ-kapsel-par. För det andra, även när efter samma protokoll, olika utredare kommer att sluta med olika förvärvade bilder. Genom att låta försöksledaren kontroll över varje algoritm parametern, kan detta verktyg justeras för att passa ett brett spektrum av förvärvsmetoder. Det finns inget behov av en standardiserad omfattning, mål, filter och så vidare.
Denna teknik kan lätt tillämpas på varje situation där utredaren behöver upptäcka cirklar inom en bild som kontrast till deras bakgrund. Både cirklar ljusare och mörkare än deras bakgrund kan upptäckas, räknas och mäts med hjälp av denna teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av India färgpulver bild
- Pipettera 10 µL av cryptococcal prov på ett objektglas. Alla cirkulär jästsort fungerar men för detta experiment H99 var den enda stam som används.
Obs: Om provet är direkt från kultur media, spädning 1:2 med PBS eller vatten kan förhindra tusch klumpar. - Pipettera 2 µL av Indien bläck fläcken på provet och blanda genom fysiskt driver pipettspetsen till provet och flytta i en cirkulär rörelse tills Indien bläck visas jämnt fördelade.
- Placera ett täckglas över provet genom att hålla ned den vänstra kanten av täckglaset mot ytan av bilden, sedan jämnt och försiktigt sänka motsatt sida av täckglaset över provet.
- Låt bilden luft torka i 5 min.
- Applicera ett tunt lager nagellack till täckglas gränsen att bilda en tätning och bevara Indien bläck fläcken.
2. imaging Slide
- Placera bilder i ljusa fält Mikroskop med kamera kvarstad och kända pixel-till-micron konvertering. Justera filter, mål och kontrast så att cellen kapslar är tydliga och cellen organ är fokuserad, mörka band.
Obs: Olika filter, mål och kontrast inställningar fungerar men en 20 x mål, Ph1 filter och 2 x 2 binning rekommenderas. - Säkerställa synfältet är tät men inte överbefolkad med cryptococcal celler, med tydlig kontrast mellan cell kapsel och bakgrund, och korrekt fokuserad med cellkroppen visualiseras som ett mörkt band.
Obs: Det exakta antalet celler för en optimal bild kommer att variera beroende på prov och mål som används. De viktiga aspekterna är att se till att cellerna inte är klustrade eller överlappande, att cellen fokal planen inte varierar avsevärt och att det finns betydande Indien bläck fläcken klart synlig i bakgrunden (minst 25% av området). - Spara bilder på en enda katalog med tydliga titlar, som mätning algoritmen kommer att köras på bilder i en enda katalog och utdata kommer att organiseras enligt namnen på bildfilerna.
3. algoritm Setup
- Installera Python version 2.7 från
- Installera ytterligare python-bibliotek genom att köra kommandona ”pip installera kudde” och ”pip installera openpyxl”.
- Installera MATLAB genom att följa anvisningarna på
- Bygga det MATLAB python-biblioteket genom att följa instruktionerna på https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.
- Hämta tre krävs filerna som ingår i detta manuskript kompletterande material (”QCA.py”, ”Analysis2.m” och ”TestRun.m”).
Obs: Dessa filer kan extraheras till valfri plats, men alla tre måste vara i samma katalog.
4. användning av algoritm
- Kör programmet genom att dubbelklicka på QCA.py.
Obs: Programmet kan ta flera minuter att starta. ”QCA.py” filen innehåller den programstruktur som anropar de ”.m” filerna för att köra den faktiska algoritmen. - Följ stegen som beskrivs i programmet.
- Input filändelsen typ av bildfiler föregås av en period och avgränsade med semikolon (t.ex ”.. TIF;. JPEG ”) sedan klicka Enter -knappen.
- Välj den katalog där bildfiler finns genom att klicka på knappen Välj katalog och välja den mapp som innehåller bilderna.
- Generera listan med filer i katalogen genom att klicka på knappen Generera bildlista . Bilderna visas i textrutan till höger. Granska och säkerställa listan är korrekt och komplett.
- Välj en slumpmässig bild från listan för att använda som en förhandsgranskning genom att klicka på knappen Välj slumpmässig bild .
Obs: Om bilden går inte att öppna på grund av en ”felaktig bild läge fel”, algoritmen kommer fortfarande fungera korrekt trots inte visa bilden. Efter steg 4.2.7 visas fortfarande testbilden. - Mata in mikroskopet mål och binning inställningar. Om standardinställningarna inte matchar mikroskopet används, Välj ”Custom Pixel konvertering” och mata in pixel-till-um omvandlingen för bildfiler. När du valt klickar du på knappen Beräkna konvertering och säkerställa omvandlingen är korrekt enligt rutan till höger.
Obs: Representativa bilder visas i figur 1 beräknades med 40 x förstoring och 2 x 2 binning valt. - Ingång algoritmparametrar för cirkel upptäckt.
- Ange lägsta och högsta radien detekterbara för yttre kapsel upptäckt som Min och Max kapsel RADIUS-poster. Ett mindre utbud gör att mer exakta resultat.
- Ange lägsta och högsta radien detekterbara för cellkroppen upptäckt som Min och Max cellkroppen RADIUS-poster.
Obs: Alla fyra av dessa poster bör vara nummer som motsvarar deras respektive värden i pixlar, enligt källavbildningarna. - Flytta skjutreglagen kapsel och cellkroppen känslighet att justera känslighetströskeln av algoritmen. En låg känslighet kommer att vara strikt och minska falska positiva cirkel upptäckt, men kan också upptäcka färre riktiga cirklar. Omvänt, en hög känslighet ökar den upptäckt hastigheten men kan också resultera i falskt positiva cirklar.
Obs: Representativa resultat erhölls med minsta kapsel radie av 7, maximal kapsel radius 45, minsta kropp radie av 4, maximal kropp radie av 30, kapsel känslighet 87 och kroppen känslighet 87.
- Testa parametrarna på slumpmässigt utvalda bilden genom att klicka på Kör Test . Resultaten visas i övre mitten av programmet, som ersätter den ursprungliga bilden. Om resultaten ser korrekt, är det rekommenderat att välja en ytterligare random bild också försöka se till de valda parametrarna kommer att passa alla markerade bilder.
- Maximera antalet organ och kapslar upptäcks och inspektera visuellt om cirklar visas att passa korrekt. Antalet organ inom kapslar som upptäcks visas i textrutan till höger. Annars, manipulera algoritmparametrar tills resultaten är korrekta.
Obs: De tjocka färgade cirklarna är endast för att hjälpa till med visualisering. De faktiska cirklar som genereras för mätning är en matematisk kurva som beräknas av HCT algoritmen.
- Maximera antalet organ och kapslar upptäcks och inspektera visuellt om cirklar visas att passa korrekt. Antalet organ inom kapslar som upptäcks visas i textrutan till höger. Annars, manipulera algoritmparametrar tills resultaten är korrekta.
- Kör den upptäckt algoritmen på hela katalogen av bildfiler genom att klicka på knappen Påbörja analysen . Varje bild kommer att analyseras och programmet visar ”klar” i textrutan till höger när alla bilder har analyserats.
- Klicka på knappen Match och rensning . Detta kommer att matcha upptäckta cellen organ till de upptäckta kapslar som de bor i och beräkna sann kapsel radien genom att subtrahera kropp från kapsel.
Obs: Om algoritmen som används för att upptäcka fluorescens eller en annan situation där endast en cirkel är upptäckt detta steg är onödiga. Istället klickar du Bara dra organ eller Bara dra kapslar för att samla in data för endast blå eller bara gröna cirklar, respektive. Det är viktigt att notera att om bara kapsel data hämtas radien kommer att hänvisa till den totala radien av cellen som radien på cellkroppen inte kunde dras. - Leta upp den ifyllda data i filen ”CleanedOuput.csv” i katalogen bild. Om bara en dataenhet valdes, kommer att filen märkas ”CleanedBodies.csv” eller ”CleanedCapsules.csv”.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bilder erhålls först genom mikroskopi av India färgpulver bilder med ljusa fält Mikroskop tillsammans med en kamera (figur 1A). Det är viktigt att ha celler separerade och i tillräckligt låg densitet inte att överväldiga synfält, samt att använda tillräckligt fläcken för att skapa kontrast mellan celler och bakgrund. Som anges i protokollet, kommer att det exakta antalet celler för en optimal bild variera beroende på provet, Mikroskop, och mål som används. De viktiga aspekterna är att se till att cellerna inte är klustrade eller överlappande, att cellen fokal planen inte varierar avsevärt och att det finns betydande Indien bläck fläcken klart synlig i bakgrunden (minst 25% av området). Dessa riktningar låta algoritmen att fastställa ett tröskelvärde som är unika för varje bild genom att det genomsnittliga pixelvärdet intensitet och lägga till standardavvikelsen. Varje pixel med en intensitet högre värde än nämnda tröskelvärde anses vitt och någon med en lägre intensitetsvärdet anses svart. Den resulterande bilden tillåter en klar och tydlig åtskillnad av där kapseln slutar (figur 1B). Algoritmen då har en robust vit och svart kontrast baserade cirkel att upptäcka för kapseln och den ursprungliga bilden ger en robust svart på vitt-cirkel för cellen organ. En representativ visualisering av upptäckta cirklar genereras som en del av programmet (figur 1C). Detta tillåter användaren att snabbt analysera igenom bearbetade bilder och säkerställa resultaten visas korrekt.
Det är viktigt att följa det exakta protokollet att förvärva optimala bilder. Optimala bilder resultera brukar från en brist på kontrast mellan kapseln och bläck (figur 2A). Optimal kontrast och förvärvet parametrar varierar beroende på provet, experiment, kamera och Mikroskop modeller, etc. En optimal bild är en där jästceller är åtskilda om möjligt, där den yttre kanten av kapseln har tydlig kontrast till Indien bläck fläcken och där cellkroppen är fokuserad ska visas som ett mörkt band som kontrasterar skarpt med dess bakgrund. Om alltför många celler är i synfältet eller om fläcken är för ljus, intensitet pixelvärdena kommer kluster och programmet kommer inte att kunna upprätta en tröskel kan belysa kapsel storlek (figur 2B). När suboptimala bilder används kan programmet upptäcka cirklar av felaktiga storlekar, inte kunna upptäcka eventuella cirklar eller upptäcka flera pseudo cirklar utifrån artefakter i bilden tröskel (figur 2C).
Upptäcka cellen organ medför liknande problem i att cellkroppen måste visualiseras som en robust svart cirkel på den vita bakgrunden av kapseln. Problemet behandlas i protokollet när man beskriver önskad fokalplanet för bild förvärv. Bäst fokalplanet att använda är en där cellkroppen visas som en mörk, koncentrerad band (figur 3A). Detta fokalplanet är acceptabelt som standard eftersom det fokuserar ordentligt cellen. Detta bekräftades genom att visualisera cellväggen med Uvitex, en kitin fläck (figur 3B). Uvitex fläcken visar tydligt en skarp, fokuserade cellväggen med svag signal i mitten (där toppen och botten av cellen kroppen skulle färgas, ur fokus).
Utveckla denna metod var det också viktigt att bekräfta att kan denna algoritm exakt bestämma kapsel och cellkroppen mätningar. Medan de representativa cirklarna i tidigare figurer är lovande, jämfördes faktiska mätningar mellan dator och mänskliga mätningar. När protokollet följs korrekt och optimal bilder erhålls, algoritmen är korrekt och tillförlitlig (figur 4A). Dock om protokollet följs felaktigt och suboptimala bilder erhålls på grund av dålig färgning, trångboddhet eller andra tidigare nämnda parametrar, algoritmen förlorar noggrannhet och kan inte sammanfatta mänskliga mätningar (figur 4B ). Eftersom denna teknik utvecklades ursprungligen för en specifik individ (första författare), en annan person fick frågan och kan användas för att fastställa om skillnader mellan färgning och mätning stilar skulle påverka noggrannheten trots följande protokoll. Resultaten visade att denna teknik var allmänt tillämplig så länge protokollet följdes som instruerade (figur 4C). Likaså kan denna teknik användas med någon Mikroskop kan förvärva fas kontrast bilder beredda India färgpulver bilder. För att säkerställa algoritmen förblir korrekt med andra Mikroskop uppställningar experimentet upprepades av tredje utredare med olika ljusa fält Mikroskop tillsammans med en kamera och jämfört upptäckta kapsel diametrar med manuellt uppmätta kapsel diametrar. Ingen signifikant skillnad observerades mellan dator och mänskliga mätningar (figur 4D).
Slutligen, framtida tillämpningar av denna algoritm utforskades i samband med fluorescens färgning. Eftersom fluorescens imaging bygger fortfarande på signal-brus förhållandet mellan pixelvärdena intensitet bör algoritmen lättillämpliga fluorescens bilder så länge fläcken är cirkulär i naturen. Denna ansökan bekräftades när algoritmen kunde identifiera Uvitex färgade cellen organ från de tidigare beskrivna bilderna (figur 5A, 5B). Användare bör vara noga med att optimera parametrarna algoritm för deras experiment och standardiserade protokoll bör utvecklas i framtiden för alla nya program.
Figur 1 : Representativa resultat bildens optimalt erhållits. A. den första bilden som förvärvats av ljusa fält mikroskopi av en rutschkana i India färgpulver. B. den binär bild som skapats med hjälp av ett tröskelvärde beräknas från genomsnittliga pixel intensitet förädlingsvärdet standardavvikelsen. Alla värden över detta tröskelvärde anses vitt och alla nedan anses svart. C. en visualisering av kapslar (grön) och cellen organ (blå) upptäcks av algoritmen. Alla bilder erhölls på 40 x förstoring med 2 x 2 binning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa resultat av en sub optimalt erhållna bild. A. inledande India färgpulver bilden förvärvat via ljusa fält mikroskopi. Ojämna och otillräckliga färgning resulterar i ett särskilt ljus bakgrund med lutningar av intensitet. B. den resulterande binära bilden, som inte kapslar tydligt särskiljas på grund av hög bakgrund signal. C. flera kapslar är omätbara. Alla bilder erhölls på 40 x förstoring med 2 x 2 binning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: identifiera cellen organ. A. ljusa fältet bild av kapsel centrerad på Rekommenderad fokalplanet. B. Uvitex fluorescens bilden av cell kroppen på Rekommenderad fokalplanet. Bilder erhölls vid 100 gångers förstoring med 2 x 2 binning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: jämförelser av resultat för algoritm (svart) och mänskliga (grå) analyser. A. när bilderna är upprättad enligt protokollet och optimala bilder erhålls finns det ingen märkbar skillnad mellan mätningarna. B. om protokollet inte följs algoritmen inte korrekt identifiera och mäta kapslar. Speciellt bakgrunden inte var här konsekvent och det var inte klart kontrast mellan kapslar och bakgrund. Betydande variationer beräknas via t-test noteras som * för P värden < 0,05. C. en oberoende utredare ombads att följa protokollet och jämföra sina analyser med algoritmen. Tillförlitlighet upprätthålls över observatörer så länge bilderna förvärvas ordentligt. D. En andra oberoende utredare med andra Mikroskop användes för att bekräfta algoritmen behålls noggrannhet över individer och hårdvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : En potentiella alternativa tillämpning av algoritmen: identifiering och mätning av fluorescensmikroskopi. Cellen organ var målat och avbildas med Uvitex, då identifieras av algoritmen. Upptäckta cirkeln sträcker sig förbi vad skulle märkas som cellväggen eftersom påvisande baseras på fluorescens signalen. Den upptäckt algoritmen kan skräddarsys för att identifiera specifikt ljusaste ansamling av signal (cellväggen) genom att ändra det tröskelvärde som används för att generera den ursprungliga binär bild representerade i siffror 1B och 2B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: en representativ skärmdump av programmet körs i Windowsmiljö. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2: representationer av upptäckta spirande jästceller. Skalstapeln representerar 10 µm. A. En förälder cell och bud varje räknas som separata celler inom sin egen kapsel. B. A förälder-cellen och bud varje räknas två gånger, en gång för sin egen kapsel och en gång för den andra cellen kapseln, vilket resulterar i fyra totala celler upptäckt från en förälder och en knopp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 3: en representation av de slutliga uppgifterna efter cell detektering och mätning. Bildfilen refererar till namnet på den ursprungliga bilden. Totala radie refererar till radien av representativa gröna cirklar, kapsel och cellkroppen kombinerat. Kapsel x och kapsel y se koordinaterna för kapseln som informationen gäller. Kroppen radie refererar till radien av de representativa blå cirklarna. Kapsel radie avser den totala radien minus kropp radien, vilket resulterar i radien av bara kapseln. Dessa värden kommer att vara i mikron så länge användaren med en pixel-till-micron omräkningstal i steg 3.2.5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiska steg med denna teknik förbereder i India färgpulver bilden och förvärva Mikroskop bilderna. Medan algoritmen har framgångsrikt testats med en mängd olika bild och bild tekniker beskrivs rekommenderade protokollet i detta manuskript. Polysackarid kapseln upptäcks baserat på uteslutandet av Indien bläckpartiklar från domänen för kapseln som dessa partiklar är för stora för att tränga igenom polysackarid fibrill nätverket. India färgpulver utslagning resulterar i en ljus cirkel ovanpå en mörk bakgrund. Algoritmen upptäcker cirklar utifrån hur väl de kontrast med sin bakgrund. Således, en tung tusch-fläckar kommer att resultera i högre kontrast mellan polysackarid kapsel och bakgrund, ökande signal-brus-förhållande, och förbättra resultatet. Omvänt, cellkroppen upptäcks som en mörk cirkel ovanpå en ljus bakgrund. Cellkroppen kommer att ändra utseende baserat på som fokalplan mikroskopet är inställd på, visas som en diffus grå cirkel på toppen eller botten av cellen och som kondenserad mörka band på center. Av samma skäl som redan diskuterats, fokalplanet där cellkroppen visas som en kondenserad, mörka band bör användas för bild förvärv eftersom detta kommer att resultera i den mest exakta cirkel upptäckten.
Den metod som redovisas här har utvecklats genom flera ändringar och rundor av felsökning. Algoritmen var ursprungligen kodad förväntar sig att cellerna inte skulle vara mindre än 4 eller större än 60 pixlar baserat på mikroskopet som användes. Att utöka tillämpningen av denna algoritm till olika förstoringar och cell storlekar dessa gränser ersattes istället av inmatningsfälten användaren beskrivs i protokollet. Användare kan nu mata in parametrar som är specifika för varje experiment för maximal noggrannhet. Om denna algoritm tillämpas på en situation utanför Cryptococcus kapsel mätning är det rekommenderat att första uppsättningen upp en serie av rangefinding villkor att avgöra hur prover ska genereras och avbildas.
Den mest betydande begränsningen av denna teknik är att den var designad med ett visst program i åtanke, nämligen mätningen av cryptococcal kapsel. Medan det kan lätt ändras för att passa fler program, är detta skript endast direkt tillämpliga på kapsel measurement protocol som beskrivs ovan. Men beskrivs denna begränsning också betydelsen av denna metod med avseende på sitt område och de befintliga metoderna. Dessutom, knoppande jästceller kan presentera ett problem för utredare som vill bara mäta överordnade cell storlekar. Denna algoritm är kan upptäcka knoppar som unika celler (Figur S2A). Först, kan detta vara ett problem om prövaren i vilket fall de skulle vilja ta bort bud mätningar eller ta bort båda cellerna om det inte kan fastställas som upptäckt cirkel är knoppen och som är överordnad. För det andra, kan det orsaka ett annat problem om knoppen har identifierats som en cell kropp fortfarande inom ramarna för föräldrarnas kapseln (Figur S2B) i vilket fall algoritmen mäter knopp med hänvisning till föräldrarnas kapseln. I detta exempel kommer varje cell räknas två gånger eftersom varje cell organ är bosatt inom två kapslar. Något av dessa problem kan lösas enkelt när protokollet är klar. De slutliga uppgifter som visas som ett kalkylblad där varje individ upptäckts cell är märkt enligt den bildfil som det kom från, och x och y koordinaterna för cell kroppen (Figur S3). Utredarna kan helt enkelt hitta och utesluta de data som matchar knoppen. Trots kapsel storlek är en viktig och kraftigt studerade virulens faktor fältet Cryptococcus har ännu att upprätta standardprotokoll för kapsel mätning eller bild förvärv. Denna teknik var utformade för att fylla dessa roller på ett korrekt och bekvämt sätt som är fritt tillgänglig för laboratorier med minimal förutsättningar.
Framtida tillämpningar av denna teknik är till stor del att tillämpa den på andra experiment. Någon bild baserat identifiering eller mätning av cirkulära objekt bör analyserbart genom denna algoritm. Fluorescerande mikroskopi bilder kan analyseras genom att tillämpa algoritmen enskilda laser kanaler. Bakteriella kolonin räknar kan uppnås, och med ytterligare modifiering kunde skilja mellan galaktos reportrar. Jästen kolonin tillväxt analyser kunde också utvärderas med denna algoritm för att uppskatta koloni område storlek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Vi skulle vilja erkänna Anthony Bowen vars bilder användes som andra mänskliga sida-vid-sida jämförelse samt Sabrina Nolan vars bilder användes som en tredje mänskliga sida-vid-sida och andra Mikroskop jämförelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| India Ink | Becton, Dickinson and Co. | 261194 | |
| Fisherbrand Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | 25x75x1 |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-B | 22x22-1 |
| Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish | Sally Hansen | N/A | 109 invisible |
| SAB Media | Sigma | S3306 | |
| Cryptotoccus neoformans | ATCC | 208821 | H99 strain |
| Olympus AX70 Microscope | Olympus | AX70TRF | Discontinued ; Bright Field Microscope |
| Qimaging Retiga 1300 | Qimaging | N/A | Discontinued ; Camera Microscope Attachment |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Most recent version recommended |
| Python Programming Language | Python | N/A | Version 2 necessary ; 2.7 recommended |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | Most recent version recommended |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P3813 |
References
- Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).
- Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).
- Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007 (2013).
- Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
- Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
- Araujo, G. deS., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).
- García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
- Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
- Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
- Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).
