تسمح البروتوكولات وصف البناء والتوصيف والتحديد (مقابل الهدف المفضل) من مكتبة “دوماينومي” من أي مصدر الحمض النووي. يتحقق ذلك من خلال خط أنابيب بحث الذي يجمع بين التكنولوجيات المختلفة: عرض بالعاثية، مراسل للطي وتسلسل الجيل القادم مع أداة ويب لتحليل البيانات.
الصحفيين للطي هي بروتينات مع تعمل يمكن تحديدها بسهولة، مثل مقاومة المضادات الحيوية، الذي قابلة للطي والدالة للخطر عندما تنصهر فيها سيئة لطي البروتينات أو إطارات عشوائية القراءة المفتوحة. قمنا بتطوير استراتيجية فيها، باستخدام ال-1 β-lactamase (الإنزيم منح المقاومة الأمبيسلّين) على نطاق الجينوم، علينا تحديد مجموعات من المجالات البروتين مطوية بشكل صحيح من ترميز جزء من الحمض النووي لأي الجينوم إينترونلس. سوف تكون الشظايا البروتين التي حصل عليها هذا النهج، ما يسمى “دومينومي”، كذلك أعرب عنه وقابل للذوبان، يجعلها مناسبة للدراسات الهيكلية/الوظيفية.
عن طريق الاستنساخ، وعرض “دوماينومي” مباشرة في نظام عرض بالعاثية، لقد أظهرنا أنه من الممكن لتحديد مجالات محددة من البروتين مع خصائص الربط المطلوبة (مثلاً، إلى غيرها من البروتينات أو الأجسام المضادة)، وبالتالي توفير أساسي المعلومات التجريبية لتحديد الجينات الشرح أو مستضد.
يمكن تحديد المستنسخين المخصب الأكثر في عدد سكان [بولكلونل] محدد باستخدام تقنيات رواية الجيل التالي التسلسل (خ ع). لهذه الأسباب، فنحن نقدم تحليل تسلسل عميق المكتبة نفسها والنواتج التحديد تقديم معلومات كاملة عن التنوع والوفرة ورسم خرائط دقيقة لكل من الجزء المحدد. وتظهر البروتوكولات المقدمة هنا الخطوات الرئيسية لبناء المكتبة، وتوصيف، والتحقق من الصحة.
هنا، يمكننا وصف أسلوب الفائق للبناء واختيار المكتبات من نطاقات البروتين مطوية وقابل للذوبان من أي مصدر انطلاق الجينية/الجينوم. النهج الذي يجمع بين ثلاث تقنيات مختلفة: عرض بالعاثية، واستخدام مراسل قابلة للطي وتسلسل الجيل القادم (خ ع) مع أداة ويب محددة لتحليل البيانات. الأساليب التي يمكن استخدامها في العديد من السياقات المختلفة للبحث القائم على البروتين، لتحديد الهوية والشرح من البروتينات/البروتين من المجالات الجديدة، وتوصيف الخصائص الهيكلية والوظيفية للبروتينات المعروفة، فضلا عن تعريف شبكة التفاعل البروتين.
العديد من الأسئلة المفتوحة لا تزال موجودة في البحوث القائمة على البروتين وتطوير أساليب لإنتاج البروتين الأمثل ضرورة هامة لعدة مجالات للتحقيق. على سبيل المثال، على الرغم من توافر الآلاف من مورثات بدائية وحقيقية النواة1، خريطة مقابلة من بروتيوميس النسبية مع تعليق توضيحي مباشرة من الببتيدات والبروتينات المكوده مازال مفقوداً للغالبية العظمى من الكائنات الحية. فهرس بروتيوميس كاملة يبرز بوصفه هدفا صعبة التي تتطلب جهدا ضخما من حيث الوقت والموارد. يبقى المعيار الذهبي للشرح التجريبية استنساخ جميع “المفتوحة قراءة الإطارات” (Orf) الجينوم، بناء ما يسمى “أورفيومي”. عادة ما يتم تعيين وظيفة الجينات استناداً إلى التماثل للجينات المتصلة النشاط المعروفة ولكن هذا النهج دقيقة ضعيفة بسبب وجود العديد من الشروح غير صحيحة في مرجع قواعد البيانات2،،من34، 5. وعلاوة على ذلك، حتى بالنسبة للبروتينات التي تم تحديدها والمشروح، دراسات إضافية مطلوبة لتحقيق الوصف من حيث الوفرة، وأنماط التعبير في السياقات المختلفة، بما في ذلك الخصائص الهيكلية والوظيفية، وكذلك شبكات التفاعل.
وعلاوة على ذلك، نظراً للبروتينات تتألف من نطاقات مختلفة، كل منها عرض ميزات محددة، والإسهام بشكل مختلف وظائف البروتين، الدراسة والتعريف الدقيق لهذه المجالات يمكن أن تسمح صورة أكثر شمولاً، كلاهما في الواحد الجينات والجينوم الكامل على الصعيد. كل هذه المعلومات ضرورية يجعل البحث القائم على البروتين حقلاً واسعاً وتحديا.
من هذا المنظور، يمكن إعطاء مساهمة هامة بأساليب غير متحيزة والفائق لإنتاج البروتين. بيد أن نجاح هذا النهج، إلى جانب الاستثمارات الكبيرة المطلوبة، يعتمد على القدرة على إنتاج البروتين للذوبان/مستقرة بنيات. وهذا يشكل الحد من عامل نظراً لأنها قدرت أن فقط حوالي 30% بروتينات يمكن أن أعرب بنجاح وأنتجت على مستويات كافية لتكون مفيدة تجريبيا6،،من78. ويستند نهج للتغلب على هذا القيد استخدام الحمض النووي مجزأة عشوائياً لإنتاج البروتينية المختلفة، التي توفر معا متداخلة تمثيل جزء من الجينات الفردية. نسبة صغيرة فقط من أجزاء الحمض النووي تم إنشاؤه عشوائياً هي Orf الفنية بينما الغالبية العظمى منهم غير وظيفية (بسبب وجود stop codons داخل تسلسل بهم) أو ترميز للأمم المتحدة الطبيعية (ORF في إطار خلاف الأصلي) البروتينية مع لا معنى البيولوجية.
لمعالجة جميع هذه القضايا، وضعت مجموعتنا بروتين الفائق التعبير والتفاعل تحليل منصة التي يمكن استخدامها على نطاق الجينوم9،10،،من1112. هذا البرنامج يدمج التقنيات التالية: 1) طريقة تحديد مجموعات من المجالات البروتين مطوية بشكل صحيح من ترميز جزء من الحمض النووي من أي كائن حي؛ 2) بالعاثية عرض التكنولوجيا لتحديد شركاء تفاعلات؛ 3 خ ع) تماما تميز إينتيراكتومي كلها قيد الدراسة وتحديد المستنسخين الاهتمام؛ و 4) أداة ويب لتحليل البيانات للمستخدمين دون الحاجة إلى مهارات البرمجة أو المعلوماتية الحيوية لإجراء تحليل Seq إينتيراكتومي بطريقة سهلة وسهلة الاستعمال.
استخدام هذا البرنامج يوفر مزايا هامة أكثر استراتيجيات بديلة للتحقيق؛ قبل كل شيء الأسلوب تماما غير متحيزة والفائق، ووحدات للدراسة تتراوح بين مورثة واحدة تصل إلى جينوم كله. الخطوة الأولى من خط الأنابيب هو إنشاء مكتبة من الحمض النووي عشوائياً مجزأة تحت الدراسة، ثم تميزت خ ع عميق. يتم إنشاء هذه المكتبة باستخدام المتجهات هندسيا حيث يتم استنساخ الجينات/شظايا اهتمام بين تسلسل إشارة لإفراز البروتين في الفضاء بيريبلاسميك (أي، زعيم ثانية) والجين β-lactamase TEM1. سوف تمنح البروتين الانصهار الأمبيسلّين المقاومة والقدرة على البقاء على قيد الحياة تحت ضغط الأمبيسلّين إلا إذا كانت الشظايا المستنسخة في الإطار مع كل من هذه العناصر والبروتين الانصهار الناتج هو مطوية بشكل صحيح10،13 ،14. جميع النسخ إنقاذهم بعد اختيار المضادات الحيوية، ما يسمى “استنساخ تصفيته”، Orf، وغالبية العظمى منهم (أكثر من 80 في المائة)، مستمدة من الجينات الحقيقية9. علاوة على ذلك، تكمن قوة هذه الاستراتيجية في النتائج أن جميع الحيوانات المستنسخة ORF تصفيتها يتم ترميز للبروتينات بشكل صحيح مطوية/الذوبان/المجالات15. كما لدى الكثير من استنساخ، موجودة في المكتبة ورسم الخرائط ذات الصلة في نفس المنطقة/المجال، مختلفة في البداية والنهاية نقطة، يسمح هذا تحديد غير منحازة، وخطوة واحدة من الشظايا الدنيا التي من المحتمل أن يؤدي إلى منتجات قابلة للذوبان.
ويرد مزيد من تحسن في التكنولوجيا باستخدام خ ع تميز المكتبة. المزيج من هذه المنصة، وأداة ويب محددة لتحليل البيانات يعطي معلومات هامة غير منحازة على تسلسل النوكليوتيدات الدقيق وعلى موقع Orf المحدد على مرجع الحمض النووي قيد الدراسة دون الحاجة إلى المزيد من التحليلات الواسعة أو الجهد التجريبي.
ويمكن نقلها في سياق تحديد مكتبات دومينومي وتستخدم كأداة عالمية لإجراء الدراسات الفنية. البروتين الفائق التعبير والتفاعل تحليل المنهاج أن نحن متكاملة وأن طالبنا Seq إينتيراكتومي يستفيد من تكنولوجيا العرض بالعاثية بتحويل ORF المصفاة إلى ناقل فاجيميد وخلق بالعاثية-ORF مكتبة. إعادة استنساخ مرة واحدة في سياق عرض بالعاثية، بروتين مجالات يتم عرضها على سطح جسيمات M13؛ وبهذه الطريقة يمكن تحديد مكتبات دومينومي مباشرة للشظايا الجينات ترميز المجالات مع الأنشطة الانزيمية محددة أو ربط خصائص، يسمح للشبكات إينتيراكتومي التنميط. وقد وصف هذا النهج في البداية زاكتشي et al. 16 واستخدمت فيما بعد في عدة أخرى السياق13،،من1718.
بالمقارنة مع غيرها من التكنولوجيات المستخدمة لدراسة التفاعل البروتين-بروتين (بما في ذلك نظام هجين اثنين الخميرة والطيف الكتلي19،20)، ميزة رئيسية واحدة هي التضخيم الشريك الملزم الذي يحدث أثناء بالعاثية عرض جولات متعددة من التحديد. وهذا يزيد من حساسية الاختيار مما يسمح بتحديد المجالات ملزم وفيرة منخفضة البروتينات الموجودة في المكتبة. هو زيادة كفاءة اختيار المنفذ مع ارف تصفية مكتبة بسبب غياب استنساخ غير وظيفية. أخيرا، تسمح هذه التقنية التحديد التي يتعين القيام بها ضد كل من البروتين والبروتين غير الطعم21،،من2223،24،25.
بالعاثية التحديدات باستخدام مكتبة دومينومي-بالعاثية يمكن أن يؤديها باستخدام الأجسام المضادة قادمة من الأمصال للمرضى الذين يعانون من الحالات المرضية المختلفة، مثل أمراض المناعة الذاتية13أو السرطان أو العدوى من الأمراض كطعم. يتم استخدام هذا النهج للحصول على ما يسمى “جسم التوقيع” هذا المرض قيد الدراسة مما يسمح على نطاق واسع في تحديد وتوصيف المستضدات/[ابيتوبس] تعترف على وجه التحديد بأجسام المرضى في نفس الوقت. مقارنة بالأساليب الأخرى الاستخدام بالعاثية يسمح العرض تحديد [ابيتوبس] مستضدي الخطي وكونفورماشونال على حد سواء. تحديد توقيع محدد يمكن أن يكون لها تأثير هام لفهم الآلية المرضية، وتصميم لقاح جديد، تحديد أهداف علاجية جديدة واستحداث أدوات تشخيصية وتشخيصية جديدة ومحددة. وعلاوة على ذلك، عند الدراسة تركز على الأمراض المعدية، ميزة كبيرة أن اكتشاف البروتينات مكسبه ومستقلة عن زراعة الممرض.
نهجنا ويؤكد أن الصحفيين قابلة للطي يمكن استخدامها على نطاق الجينوم لتحديد “دومينومي”: عبارة عن مجموعة من المجالات البروتين مطوية بشكل صحيح، وكذلك أعرب، القابلة للذوبان من ترميز جزء من الحمض النووي و/أو كدنا من أي كائن حي. مرة معزولة شظايا البروتين مفيدة لأغراض كثيرة، توفير معلومات تجريبية أساسية للشرح الجينات، وكذلك فيما يتعلق بالدراسات الهيكلية، جسم حانمه رسم الخرائط، مستضد تحديد الهوية، إلخ. اكتمال البيانات الفائق المقدمة من خ ع يتيح تحليل العينات معقدة للغاية، مثل بالعاثية عرض المكتبات، ويحمل إمكانات للتحايل على الانتقاء شاقة التقليدية واختبار فردية بالعاثية إنقاذ الحيوانات المستنسخة.
في الوقت نفسه بفضل ميزات المكتبة التي تمت تصفيتها والحساسية المفرطة والقوة لتحليل خ ع، فمن الممكن لتحديد المجال البروتين مسؤولة كل التفاعل مباشرة شاشة أولى، دون الحاجة إلى إنشاء مكتبات إضافية لكل ملزمة البروتين. خ ع يتيح الحصول على تعريف شامل دومينومي كله من أي مصدر انطلاق الجينية/الجينوم وأداة ويب تحليل البيانات يمكن الحصول على توصيف محددة للغاية كلا من نوعية وكمية من وجهة نظر المجالات للبروتينات إينتيراكتومي.
إنشاء مكتبة عالية الجودة التي تمت تصفيتها Orf درجة عالية من التنوع هو الخطوة الأولى الحاسمة في الإجراء برمته نظراً لأنه سوف يؤثر على جميع الخطوات اللاحقة من خط الأنابيب.
سمة هامة مفيدة لأسلوبنا أن أي مصدر للحمض النووي (إينترونلس) (كدنا، الحمض النووي، وبكر مشتقة أو الحمض النوو…
The authors have nothing to disclose.
كان يؤيد هذا العمل بمنحه من وزارة التربية والتعليم الإيطالية وجامعة (2010P3S8BR_002 لحزب المحافظين).
Sonopuls ultrasonic homogenizer | Bandelin | HD2070 | or equivalent |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | or equivalent |
GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0311 | or equivalent |
Molecular Biology Agarose | BioRad | 161-3102 | or equivalent |
Green Gel Plus | Fisher Molecular Biology | FS-GEL01 | or equivalent |
6x DNA Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | or equivalent |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | or equivalent |
Quick Blunting Kit | New England Biolabs | E1201S | |
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368813 | |
Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | or equivalent |
QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | or equivalent |
EcoRV | New England Biolabs | R0195L | |
Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202T | |
Sodium Acetate 3M pH5.2 | general lab supplier | ||
Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
DH5aF' bacteria cells | Thermo Fisher Scientific | ||
0,2 ml tubes | general lab supplier | ||
1,5 ml tubes | general lab supplier | ||
0,1 cm electroporation cuvettes | Biosigma | 4905020 | |
Electroporator 2510 | Eppendorf | ||
2x YT medium | Sigma-Aldrich | Y1003 | |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
DreamTaq DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | EP0702 | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
150 mm plates | general lab supplier | ||
100 mm plates | general lab supplier | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
BssHII | New England Biolabs | R0199L | |
NheI | New England Biolabs | R0131L | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | or equivalent |
M13KO7 Helper Phage | GE Healthcare Life Sciences | 27-1524-01 | |
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K1377 | |
Polyethylene glycol (PEG) | Sigma-Aldrich | P5413 | |
Sodium Cloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
PBS | general lab supplier | ||
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10003D | or equivalent |
MagnaRack Magnetic Separation Rack | Thermo Fisher Scientific | CS15000 | or equivalent |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Nonfat dried milk powder | EuroClone | EMR180500 | |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems, Fisher Scientific | 7958935001 | |
AMPure XP beads | Agencourt, Beckman Coulter | A63881 | |
Nextera XT dual Index Primers | Illumina | FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004 | |
MiSeq or Hiseq2500 | Illumina | ||
Spectrophotomer | Nanodrop | ||
Agilent Bioanalyzer or TapeStation | Agilent | ||
Forward PCR primer | general lab supplier | 5’ TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’ | |
Reverse PCR primer | general lab supplier | 5’ TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’ | |
Forward primer for NGS | general lab supplier | 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAGCAAGCGGCGCGCATGC 3’; | |
Reverse primer for NGS | general lab supplier | 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTGGTTTGCCGCTAGC 3’; |