Summary
Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor het verkrijgen van afgevlakte tangentiële secties van zoogdieren afkomstig cortices en visualiseren van corticale modules met behulp van histochemische en immunohistochemische methoden.
Abstract
De cortex van de hersenen van zoogdieren is parcellated in verschillende substructuren of modules. Corticale modules meestal parallel aan de corticale blad liggen, en kunnen worden afgebakend door bepaalde histochemische en immunohistochemische methoden. In deze studie markeren we een methode om te isoleren van de cortex van de hersenen van zoogdieren en hen om te verkrijgen van secties parallel aan de corticale blad plat. We verder hoogtepunt geselecteerd histochemische en immunohistochemische methoden voor het verwerken van deze afgeplatte tangentiële secties om te visualiseren corticale modules. Wij voeren in de Somatosensorische cortex van verschillende zoogdieren, cytochrome oxidase histochemie te onthullen lichaam kaarten of corticale modules vertegenwoordigen verschillende delen van het kadaver van het dier. In de mediale Entorinale cortex, een gebied waar raster cellen worden gegenereerd, maken we gebruik van immunohistochemical methoden om te markeren van modules van genetisch bepaalde neuronen die zijn gerangschikt in een rasterpatroon in de corticale blad over verschillende soorten. Wij bieden over het algemeen een kader te isoleren en te bereiden layer-wise afgevlakt corticale secties, en visualiseren van corticale modules met behulp van histochemische en immunohistochemische methoden in een breed scala van zoogdieren hersenen.
Introduction
Enkele van de belangrijkste veranderingen in de hersenstructuur over fylogenie kunnen worden waargenomen in de hersenschors. Ondanks aanzienlijke verschillen, de cortex van de dieren volgt een gemeenschappelijk patroon en kan grofweg worden verdeeld in twee verschillende manieren, door lagen en gebieden1. Corticale lagen liggen evenwijdig aan het oppervlak van de hersenen en variëren in getal van 3 lagen in reptiel cortices2 tot 6 lagen in zoogdieren cortices1. Corticale gebieden aan de andere kant zijn verschillende regio's van de cortex, die grotendeels overeenkomen met verschillende functies, bijvoorbeeld, de Somatosensorische cortex is betrokken bij het gevoel van aanraking of de visuele cortex bij de verwerking van visuele ingangen. Deze corticale gebieden kunnen vaak worden onderverdeeld in patches of modules3, die regelmatig anatomische structuren herhalen, in wezen gevonden parallel aan het pial oppervlak van de hersenen. Corticale modules kunnen worden beperkt tot een bepaalde laag4of uitbreiden over meerdere lagen5.
Standaard vectorafbeeldingsbestanden methodes van de hersenen omvatten secties loodrecht op het glasoppervlak van de hersenen, zoals coronale of Sagittaal. Terwijl deze methoden kunnen worden gebruikt om te visualiseren corticale modules, kan een veelheid van interessante eigenschappen worden onthuld wanneer de corticale modules worden gevisualiseerd tangentieel, in een vlak evenwijdig aan het oppervlak van de hersenen. Bijvoorbeeld, somatosensorische modules in de knaagdier hersenen vertegenwoordigen snorharen, worden weergegeven als vaten wanneer gevisualiseerd loodrecht op het glasoppervlak van de hersenen, en dus de regio's de naam vat cortex ontlenen. Echter, op het visualiseren van de vaten in de stand van een tangentiële, onthullen ze een Bakkebaard-kaart, met de vaten wordt vastgelegd in een topografische oriëntatie spiegeling van de exacte indeling van de snorharen op het oppervlak van de externe instantie. In bepaalde gevallen, modulaire regeling is zelfs ontsnapt aan de detectie voor een aanzienlijke periode, wanneer gevisualiseerd op een niet-tangentiële wijze. De mediale Entorinale cortex, staat bekend om de aanwezigheid van cellen van de grid, neuronen die brand in een regelmatige zeshoekig patroon wanneer een dier is het doorlopen van een omgeving. Hoewel het is een zwaar onderzochte gebied, tot onlangs, de aanwezigheid van patches of modules van cellen in de mediale Entorinale cortex, die fysiek zijn neergelegd in een zeshoekig patroon6, was ontsnapt aan detectie. De aanwezigheid en de opstelling van deze modules, in de rat hersenen, werd vergemakkelijkt door het maken van tangentiële secties van de mediale Entorinale cortex en de cytoarchitecture op een layer-wise wijze te onderzoeken.
Na het segmenteren, kan het specifieke aspect van visualisatie van corticale modules ook worden gerealiseerd op meerdere manieren. Klassiek, hebben studies afgebakend modules gebaseerd op cel dichtheid of glasvezel lay-out1. Een andere populaire benadering is het gebruik van cytochroom oxidase histochemie, die gebieden van hogere activiteit8 onthult. Nieuwere benaderingen omvatten kijken naar genetisch bepaalde celtypen, onderscheiden op grond van hun eiwit expressie profielen6,8.
In deze studie markeren we methoden voor het isoleren van de cortex van de hersenen van zoogdieren, verkrijgen van afgevlakte tangentiële secties, en visualiseren van corticale modules op basis van cytochroom oxidase histochemie en immunohistochemistry van celtype specifieke proteïnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de Duitse richtlijnen inzake dierenwelzijn onder toezicht van plaatselijke ethische commissies (LaGeSo). Menselijke en vleermuis hersenen gegevens werden ontleend aan Naumann et al. 5 de volgende procedure wordt uitgevoerd op een mannelijke volwassen Wistar ratten (stam: RJHan:WI).
1. perfusie en extractie van de hersenen
Opmerking: Het verkrijgen van een homogeen vaste en bloed-vrije hersenen, transcardial perfusie van het dier is zeer aangemoedigd, zoals residuele bloed aspecifieke achtergrond signaal tijdens de kleuring toeneemt. Het is echter ook mogelijk verkrijgen van afgevlakte secties uit un-perfused monster en vlekken hen. Het gemak van de behandeling van het model is afhankelijk van de concentratie van fixeerspray gebruikt. Te weinig fixatie verhoogt het risico voor de behandeling van schade aan de hersenen tijdens afvlakken en snijden, terwijl ook hoge concentraties lager de flexibiliteit voor het afvlakken en de kwaliteit van de kleuring signaal.
- Transcardially perfuse het dier, met behulp van een naald 23G. Zie voor een meer gedetailleerde gids, Gage et al. 9
- Gebruik van fosfaat buffer zoute10 (PBS 0,02 M; pH 7.4) te spoelen van bloed uit de hersenen en het lichaam van het dier. Totdat infusie vloeistof blijkt duidelijk, met ten minste 150 mL PBS wordt toegediend via het vasculaire systeem.
Opmerking: De beste resultaten worden bereikt bij een druk die vergelijkbaar is met het bereik van de fysiologische druk van het bloed van het dier wordt geperfundeerd (bijvoorbeeld, rat: 120-130 mmHg). Desgewenst voegt u heparine (10 U/mL) toe aan de oplossing om te voorkomen dat bloed coagulatie11. - Om dit te corrigeren de hersenen transcardially infusie van een minimum van 100 mL paraformaldehyde12 (PFA, 4%; in 0,1 M fosfaat buffer (PB)13) totdat de hals van het dier stijf is.
Let op: PFA is een potentieel kankerverwekkend.
Opmerking: Beste resultaten voor histochemische activiteit kleuring, zoals cytochroom oxidase, zijn behaald, bij het gebruik van 2% PFA. Voor andere kleuring, zoals immunohistochemistry, 4% PFA heeft de voorkeur.
- Gebruik van fosfaat buffer zoute10 (PBS 0,02 M; pH 7.4) te spoelen van bloed uit de hersenen en het lichaam van het dier. Totdat infusie vloeistof blijkt duidelijk, met ten minste 150 mL PBS wordt toegediend via het vasculaire systeem.
- Het uittreksel van de hersenen van de schedel.
Opmerking: Zie Gage et al. 9 voor meer informatie.- Isoleren van het hoofd met behulp van grote schaar of bot schaar.
- Met behulp van fijn schaar, sneed de huid langs de middellijn van de nek naar de neus. Trek uit elkaar de huid om de schedel bloot te stellen. Verwijder de nek en temporele spieren met behulp van fijn schaar.
- Maak een middellijn die dwars door het interparietal bot vanaf het foramen magnum tot het pariëtale bot.
- Gebruik Rongeurs schil af de interparietal bot. Schuif fijn schaar langs de Sagittaal hechtdraad en verlaagd het achterste einde van de pariëtale tot het anterior einde van de frontale botten.
- Gebruik Rongeurs schil af de pariëtale en frontale botten. Als alternatief, heffen de botten weg met pincet. Gebruik een lepel om te knippen ventrale zenuw koorden en verwijderen van de hersenen. De hersenen overbrengen in PB (0,1 M; pH 7.4).
- VN-perfused hersenen oplossen door onderdompeling in 4% PFA gedurende 1-3 uur bij 4 ° C (afhankelijk van de grootte van de hersenen en de sonde: Shrew: ~ 1 h, mens: ~ 3 h).
Opmerking: Voor grote en gyrencephalic hersenen als mens, isoleren en knip uit het gebied van belang zijn voor het verkorten van de fixatie. - Met het oog op een grotere corticale gebieden in een sectie, het afvlakken van de hersenen vóór verdere na fixatie; Ga verder met stap 2. Echter voor het verkrijgen van secties van moeilijker te bereiken plekken zoals de mediale Entorinale cortex, post bevestigen de hersenen in 4% PFA gedurende 24 uur voordat u verdergaat met stap 2.
2. brain dissectie en afvlakken
- Het scheiden van de hemisferen van de hersenen met behulp van een scheermesje (lissencephalic hersenen) of scalpel (gyrencephalic hersenen).
Opmerking: Als de hersenen heeft geen post zijn vastgesteld, is het gevoelig voor schade door behandeling. - Optionele stap voor medeplichtigheid aan latere sectie registratie en krimp schatting:
- Het doorprikken van de cortex in een gebied van niet-belang, met een 35G naald loodrecht op het glasoppervlak corticale. Herhaal de stap twee keer op gedefinieerde afstanden langs de corticale blad. Om te bepalen van de afstand langs de corticale blad, gebruik een voorgesneden draad op een vaste lengte (bijv., 5 mm) en leg het langs de corticale oppervlak om punten van lekke band.
- Lissencephalic hersenen: verwijderen van subcorticale structuren met behulp van een spatel ontleden. Kritische: Houd de hersenen vochtig met PB (0,1 M; pH 7.4) gedurende de hele procedure.
- Houd de hersenen door het cerebellum en zachtjes invoegen de spatel om te openen van een vliegtuig van de dissectie in het corpus callosum. De ronde tip van spatel erop uit de buurt van de cortex.
- Schuif de spatel verder en trek voorzichtig totdat de spatel tussen de thalamus en cortex is. Aparte subcorticale structuren met het krassen van bewegingen.
- Inspecteer het halfrond voor zelfs dikte.
Opmerking: Eventuele ongelijke regio's tijdens kunnen ontstaan in een trans-laag verloop segmenteren. Gebruik voor tangentiële afdelen, een scalpel om een schoon gesneden door de hersenen, parallel aan het pial oppervlak van de regio waaruit tangentiële secties zijn gewenst. - Optionele stappen afvlakken kwaliteit te verbeteren:
- Maak een schoon gesneden door het striatum, nucleus accumbens en orbitofrontale cortex, aangezien ze de dikte van de cortex in de laterale regio te verhogen. Ook het toevoegen van een verlichten gesneden aan de basis van de binnenste regio van de prefrontale cortex, waarmee de ontplooiing van de mediale delen van de cortex.
- Plaats het halfrond (cortex naar beneden) op een glasplaatje. Ga verder met stap 2.6.
- Gyrencephalic hersenen: verwijderen van de witte stof te ontvouwen van gyri (Zie voor gedetailleerde protocollen,: Sincich et al. 14; Tootell en Silverman15). Kritische: Gebruik PB (0,1 M; pH 7.4) de hersenen om vochtig te houden te allen tijde.
- Zet het interessegebied op een vochtige filterpapier in een grote petrischaal, met de cortex naar boven.
- Verwijder de arachnoideavilli membraan en pia met behulp van twee pincet.
- Gebruik een vochtig wattenstaafje en voeg voorzichtig in elke Sulcus (hersenanatomie) aan het losmaken van verklevingen tussen gyri.
- De hersenen draaien met behulp van een andere vochtige filterpapier.
- Gebruik twee gebogen micro spatels te ontvouwen van één gyri. Gebruik de bolle kant van de spatels te plagen uit elkaar de witte stof tot het bereiken van dicht bij de concaaf einde van de gyrus. Gebruik een vochtig wattenstaafje en ga verder met kronkelende bewegingen te bereiken het concaaf einde van de gyrus.
- Tease uit elkaar één gyri. Zo nodig typt u kleine verlichten snijdt als de spanning te hoog is.
- De ongevouwen hersenen in de petrischaal of een soortgelijk container afvlakken.
- U kunt desgewenst plaats grotere hersenen op een filtreerpapier gedekt spons, om ervoor te zorgen dat regio's doen niet uitdrogen.
- Leg twee opgerolde stukjes klei aan beide zijden. Kritische: Als de dikte van de klei hoeveel het halfrond kan worden afgevlakt definieert, ervoor zorgen dat de klei 10-20 is % dunner dan de niet-afgevlakte cortex.
- Zachtjes druk op een tweede glas dia/kleine petrischaal op de cortex totdat het halfrond volledig plat is. Voor de beste resultaten voor een gewenste regio, plaatst u het glasplaatje eerst op het desbetreffende gebied. Voor de beste resultaten voor lissencephalic hersenen, plaatst u het glasplaatje tangentieel op het laterale gedeelte eerst en geconcentreerde druk uitoefenen op deze regio.
- Zet een gewicht (bijvoorbeeld, een keramische horlogeglas) op de dia's / petrischaal van glas en afvlakken van het halfrond gedurende 3-5 uur bij 4 ° C in PB.
- Voor fixatie van de post, laat de druk en de glas-dia's te verwijderen. Zet de afgevlakte halfrond in PFA (vrij zwevend) gedurende 24 uur in een roteerapparaat bij 4 ° C.
Opmerking: De beste resultaten voor activiteit histochemische technieken zijn behaald bij het gebruik van 1% PFA. Voor andere technieken, zoals immunohistochemistry, voor un-perfused hersenen, 2% PFA kan worden gebruikt.
Figuur 1: schematische weergave van de werkstroom voor het afvlakken van een rat corticale halfrond en visualisatie van modules in Somatosensorische cortex. Na de transcardial perfusie, het brein van een muis werd ontleed (A). Subcorticale structuren werden verwijderd en cortex was afgeplat tussen twee glazen dia's in de fosfaatbuffer (B). Afgevlakte halfrond (C) was na vaste tangentieel gesegmenteerd en gekleurd voor cytochroom oxidase activiteit (D). Schaal bars = 1 cm. R: Rostral, C: Caudal, L: laterale, M: mediale. Figuur overgenomen van Lauer et al. 23 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
3. Snij tangentiële secties
Opmerking: Afhankelijk van de vereisten van de kleuring protocollen, de snijden procedure en dikte kunnen worden aangepast. Een vibratome werd gebruikt voor het knippen van de hemisferen voor verdere histochemische verwerking (stap 3.2) bij 80-150 µm. Echter voor de immunohistochemische verwerking, dunner secties zijn gewenst en een bevriezing microtoom werd gebruikt voor vectorafbeeldingsbestanden (stap 3.3) op 10-60 µm. Zie Video 1.
- Wassen van de afgevlakte halfrond in PB (0.1M; pH 7.4) gedurende 15 minuten.
- Snijd het halfrond op een vibratome.
- Plaats het halfrond tangentieel op de segmenteringshulplijnen houder. Optioneel, druk nogmaals op zachtjes met een glasplaatje vóór de vaststelling van het in positie (bvmet lijm).
Opmerking: Minimaliseren de hoeveelheid lijm gebruikt, omdat het snijden artefacten kunnen ertoe leiden dat als gevolg van de kleine dikte van afgevlakte hemisferen. - Snijd het halfrond vanaf het einde van het dikker en stabieler dunner eind (posterieure aan anterior, hier) op de gewenste dikte. Ga verder met stap 3.4.
Opmerking: Als lage fixatie concentraties werden gebruikt, snijd het op een langzame snelheid en een hoge amplitude.
- Plaats het halfrond tangentieel op de segmenteringshulplijnen houder. Optioneel, druk nogmaals op zachtjes met een glasplaatje vóór de vaststelling van het in positie (bvmet lijm).
- Snijd het halfrond op een bevriezing microtoom.
- Cryoprotect de hersenen door onder te dompelen in een 30% sacharoseoplossing (in PB) totdat hij zinkt.
Opmerking: Afhankelijk van de grootte van het weefsel wordt cryoprotected, tot zinken brengen in de oplossing kan variëren van een paar uur tot een paar dagen. Voor grotere hersenen alternatieve cryoprotection methoden kunnen worden beschouwd (Zie Rosene et al. 16). - Vormen een ijs baseren op de bevriezing microtoom te monteren de hersenen. Construeer de basis ijs door bevriezing van de PB op het gezicht van het blok van de bevriezing microtoom. Kritische: Zorg ervoor dat het oppervlak van de ijs-base parallel aan de microtoom blade. Om dit te doen, snijd het lege ijs base met behulp van de microtoom blade precies uitlijnen de ijs base parallel aan het snijvlak.
- Insluiten van de hersenen in de bevriezing van medium en dit koppelen aan het gezicht van het blok van de microtoom met het interessegebied parallel aan het gezicht van het blok. Gezicht het pial oppervlak van de hersenen naar het gezicht van het blok van de microtoom. Kritische: Aanpassen de vriestemperatuur afhankelijk van de grootte van de steekproef; hogere temperaturen betere sectie integriteit te garanderen tijdens het segmenteren, maar grotere secties vereisen lagere temperaturen om te monster gelijkmatig te bevriezen.
- Snijd de hersenen tangentieel bij de vereiste dikte (langzamer en uniforme snijsnelheden resulteren in de beste kwaliteit van de sectie).
- Cryoprotect de hersenen door onder te dompelen in een 30% sacharoseoplossing (in PB) totdat hij zinkt.
- Wassen van de secties in PB gedurende 15 minuten op een shaker.
Video 1: schematische video van tangentiële segmenteren van een rat mediale Entorinale cortex en de lay-out van de modules parasubicular en Entorinale. De mediale Entorinale cortex van de hersenen van een knaagdier is gelegen aan de achterste eind van de cortex en wordt bewogen naar de mediale en ventrale zijde. Tangentiële secties worden verkregen door een mes langs deze hoek oriënteren. Bijgevolg passende celtype specifieke kleuring onthult modulaire structuren in de mediale Entorinale cortex en de aangrenzende parasubiculum. Video van Ray en Brecht8aangepast. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
4. visualisatie van corticale Modules met behulp van cytochroom Oxidase kleuring
Opmerking: Verschillende kleuring protocollen zijn ontwikkeld voor histochemische detectie van cytochroom oxidase activiteiten, bijvoorbeeld, eerst door Wong-Riley17 en later bewerkt door Divac et al. 18 dit protocol is gebaseerd op enerzijds door Divac et al. 18, sinds het gebruik van nikkel-ammoniumsulfaat (NiAS) resulteert in een hoger contrast en beter gedefinieerde modules in gekleurde corticale gebieden.
- Voorbereiden van het cytochroom-oxidase kleurstofoplossing (Zie Divac et al. 18). voor 10 mL van oplossing toevoegen: 10 mL HEPES buffer (0,1 M, pH 7.4), 400 mg sacharose, 12,5 mg NiAS, 2 mg cytochroom C, 6 mg diaminobenzidine (DAB).
Let op: DAB en NiAS zijn kankerverwekkend.
Opmerking: Voeg DAB vlak voor de incubatie van secties. - Wassen van de secties in HEPES-buffer (0,1 M, pH 7.4) op een shaker gedurende 15 minuten.
- Incubeer de secties in de kleurstofoplossing bij kamertemperatuur op een shaker.
Opmerking: Let op de snelheid van de kleuring. Als er geen zichtbare reactie, omzetten in incubatie bij 37 ° C. Afhankelijk van de hoeveelheid fixatie, kan kleuring worden waargenomen na 10 min of in enkele uren. - Zet de reactie stop door het toevoegen van 4% PFA; Hiermee voorkomt u dat ongewenste opnieuw sterven en verhoging van de achtergrond signaal.
- Wassen in de secties drie keer gebruik van HEPES-buffer gedurende 10 minuten.
- Monteren en drogen van de secties op glas dia's.
- Uitdrogen van de secties met een toenemende rij van alcohol:
- De dia's in 60% ethanol voor 1 min. Wash de dia's in wassen 80% ethanol 1 min. wassen de dia's in 96% ethanol 2 min. wassen de dia's in 100% ethanol 3 min. wassen de dia's in isopropanol en 5 min. de dia's in xyleen gedurende 5 minuten wassen.
- Onmiddellijk een snelle verharding-montage-medium, en voeg toe een dekglaasje aan. Kritische: Gebruik geen montage waterbasis mediums, zoals NiAS zal worden uitgewassen en de kleuring degraderen.
- Houd de secties bij 4 ° C voor lange termijn opslag.
5. visualisatie van corticale Modules met behulp van immunohistochemische kleuring
Opmerking: Meerdere protocollen zijn beschikbaar voor immunohistochemistry, geoptimaliseerd voor het model en de soort sonde. Aanpassingen kunnen worden gemaakt zoals vereist, in uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar van antilichamen, permeabilizing agenten en incubatie tijden. Het volgende protocol leidt tot goede resultaten voor het opsporen van een groot scala aan antilichamen en visualisatie door fluorescerende sondes.
- Wassen van de secties in PBS (0,1 M; pH 7.4) gedurende 15 minuten.
- Optioneel: Uitvoeren antigeen ophalen om het ontmaskeren van een epitoop met behulp van een waterbad (op basis van Jiao et al. 19; Zie Pileri et al. voor alternatieve methoden, 20).
- Verwarm een waterbad tot 80 ° C. Bereiden van tri-natrium citraat buffer19 (pH 8.0) en verwarm het in het waterbad tot 80 ° C.
- De secties naar tri-natrium citraat buffer overbrengen. Incubeer de secties gedurende 30 minuten bij 80 ° C
- De secties tot kamertemperatuur afkoelen
- Wassen van de secties in PBS gedurende 15 minuten.
- Wassen van de secties twee keer in PBS-X (0,5% Triton-X, in 0,1 M PBS) gedurende 15 minuten.
- Aspecifieke epitopes blokkeren door het broeden van de secties in een oplossing van bovien serumalbumine (BSA; 2,5%) en Triton-X (0,75%) in PBS voor 2 h.
- Incubeer de secties in primair antilichaam, bijvoorbeeldCalbindin - D28k (1:5, 000, 1% BSA in PBS-X), voor 2-3 dagen in een roteerapparaat bij 4 ° C.
Opmerking: Optimale verdunning voor het primaire antilichaam afhankelijk van het specifieke antilichaam gebruikt. Raadpleeg fabrikant informatie te verkrijgen van verdunning criteria voor een specifiek antilichaam. Meerdere antilichamen kunnen samen worden gebruikt maar moeten worden verhoogd tegen verschillende soorten. - Wassen van de secties drie keer in PBS voor elke 15 min.
- Incubeer de secties overnachting in secundair antilichaam (1:200, 1% BSA in PBS) bij 4 ° C op een shaker.
Opmerking: Meerdere secundaire antilichamen kunnen worden gebruikt op verschillende spectra als meerdere primaire antilichamen werden gebruikt. - Het secundaire antilichaam afwassen door het wassen van de secties drie keer in PBS voor elke 10 min.
- Monteren en drogen van de secties op een glasplaatje voor microscopie.
Opmerking: De secties moeten nog steeds vochtig voorafgaand aan de montage van het dekglaasje aan. - Montage medium geschikt voor fluorescentie kleurstoffen op de weefselsecties toepassen en breng een dekglaasje aan.
- Droog de secties voor 1 h.
- Voor lange termijn opslag, zegel het dekglaasje aan met behulp van nagellak en houden in het donker bij 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij verkregen van afgevlakte corticale secties van de Somatosensorische cortex in een verscheidenheid van hersenen en verwerkt ze voor cytochroom oxidase histochemie te visualiseren de somatotopic modules vertegenwoordigen verschillende lichaamsdelen. Deze vergelijkende benadering biedt het bestuderen van de evolutionaire krachten die vorm cortex, bijvoorbeeldzeer geconserveerde vertegenwoordiging van mystacial snorharen in knaagdieren en haasachtigen tonen als vaten21 (Figuur 2). Daarentegen Toon andere lichaamsdelen zoals poten en geslachtsdelen variaties in hun relatieve grootte en weerspiegelen de specialisatie tot een ecologische niche of seksuele selectie22,23.
Om te begrijpen van de architectuur van de mediale Entorinale cortex, verkregen we secties parallel aan het pial oppervlak. Dit werd hoofdzakelijk bereikt door tangentiële segmenteren van de mediale Entorinale cortex in Egyptische fruit vleermuizen, muizen en ratten. Bij de mens, vanwege de aanzienlijk grotere omvang en meer rondingen in de Entorinale cortex, we voorzichtig afgevlakt de cortex na het maken van een tangentiële verlaging van de Entorinale cortex. Daarna alle hersens waren cryopreserved en gesegmenteerd op een cryostaat op 60 µm. Immunohistochemistry werd uitgevoerd op de verkregen secties met een anti-calbindin antistof, te visualiseren van de calbindin-positieve piramidale cel modules in de mediale Entorinale cortex5 (Figuur 3). De calbindin-modules in de Entorinale cortex Toon een opmerkelijke periodiciteit over alle deze hersenen, en variëren in grootte, met alleen een factor 10 over ~ 20,000-fold variatie in hersenen5maten.
Figuur 2: topografische lay-out van het vat cortex modules over zoogdieren geïdentificeerd door cytochroom oxidase histochemie. Tangentiële delen van IV van de laag van de Somatosensorische cortex van (A) muis, Mongoolse gerbil (B), (C) rat, degoe (D), (E) hamster, konijn (F), vaten als een zeer geconserveerde somatotopic zichtbaar vertegenwoordiging van de mystacial snorharen. Schaal bars = 500 µm. M: mediale, laterale L:, R: Rostral C: Caudal; Oriëntatie in A geldt ook voor de B-E. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: periodieke lay-out van de mediale Entorinale cortex modules over zoogdieren geïdentificeerd door calbindin immunoreactivity. Tangentiële secties uit laag II van de mediale Entorinale cortex van (A) muis, rat (B) de Egyptische leucotis (C) en (D) menselijk, een geconserveerde periodieke lay-out van calbindin-positieve piramidale cel modules weergegeven. Schaal bars = 250 µm. M: mediale, laterale L: D: Dorsal, V: ventrale, R: Rostral, C: Caudal; In de D stand is ook van toepassing op B, C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modulariteit in de hersenschors heeft geïdentificeerd met behulp van een verscheidenheid van technieken. De vroegste corticale modules van de studies die normaal gesproken aangeduid door beide visualiseren cel dichte regio's, of een gebrek aan vezels1. Volgende methoden hebben gebruikt de aanwezigheid van dendritische bundels24, afferents van een bepaalde regio25, of de verrijking van neurotransmitters26. Wij tonen hier twee technieken, cytochrome oxidase (i) histochemie en (ii) immunohistochemische kleuring.
Cytochroom oxidase kleuring is één van de populairste methodes om te visualiseren corticale modules, en is wijd verbeid gebruikt in de primaire sensorische cortices27,28. Het visualiseert modules door kleuring donkerder voor gebieden van hogere mitochondriale activiteit17, aldus fungeert als een proxy voor anatomische modules die aanzienlijke functionele reacties uitlokken. Deze methode is gebruikt om te visualiseren somatosensorische corticale modules (Figuur 2) en corticale modules in de visuele cortex27.
Een van de nadelen van de traditionele histochemische technieken is dat hun typische visualisatie door de lichte microscopie van helder-veld beperkt het aantal modules die tegelijkertijd kunnen worden gevisualiseerd. Immunohistochemische methoden, in conjugatie met fluorescerende visualisatie sondes kunnen echter ook worden gebruikt om bepaalde eiwitten bekijken en identificeren van corticale modules. Bijvoorbeeld, thalamus afferents aan het sensorische cortices project op somatotopic wijze. Dus, het visualiseren van deze afferents, met behulp van VGluT2 immunoreactivity kan ook worden gebruikt om te visualiseren van de kaarten van het lichaam in de primaire Somatosensorische cortex die we hebben gevisualiseerd met behulp van cytochroom oxidase activiteit (Figuur 2). Selectieve eiwitten kunnen ook worden gebruikt als cellulaire markeringen ter aanduiding van groepen van genetisch bepaalde cellen. Met behulp van immunohistochemistry, we clusters van piramidale cellen in de cortex van de mediale Entorinale uiting geven aan de calcium-bindend-proteïne, calbindin6 (Figuur 3) geïdentificeerd en bepaald dat clusters van dit bijzondere genetisch bepaald groep cellen zijn bewaard over evolutie5, waarin microcircuit beginselen ten grondslag liggen aan hun functie. Met behulp van meerdere fluorophores, wij ook afgebakend aanvullende modules in de mediale Entorinale cortex26, demonstreren parallelle micro schakelingen ten grondslag, ruimtelijke geheugen liggen.
Historisch gezien heeft de hersenen is gesegmenteerd in een vlak loodrecht op zijn standpunt in het lichaam, in Sagittaal, coronale of horizontale richtingen. De identificatie van corticale modules zijn, evenals de vat-velden in de Somatosensorische cortex4 gevraagd ook afdelen langs een tangentiële en vervolgens met afgeplatte corticale preparaten29, al geïsoleerde gevallen van dergelijke afdelen waren veel oudere30,31in acht genomen. Na de identificatie van de cortex van het vat, werden andere corticale modules ook geïdentificeerd in de primaire visuele cortex27, evenals de aanwezigheid van een volledig lichaam kaart32 met een vertegenwoordiging van de somatotopic van het lichaam in primaire Somatosensorische cortex. Afgevlakte secties van de visuele cortex van de kat bleek ook de topografische organisatie van oriëntatie kolommen zonder de behoefte aan extra reconstructies33. Corticale modulariteit is ook aangetoond in parahippocampal cortices, met inbegrip van de presubiculum en de parasubiculum26,34 en de mediale Entorinale cortex6. Meestal afvlakking een gebogen object induceert verstoringen in de topografie van het laminaire - als kunnen worden waargenomen door de veelheid van de prognoses inzake het gebogen aardoppervlak op een platte kaart35. Een vrij simplistisch methode om gedeeltelijk compenseren voor deze verstoringen is door de invoering van referentiepunten bij gedefinieerde afstanden voordat afvlakken, en dan het meten van de afstand tussen hen na het afvlakken. Deze merken dan niet alleen subserve in verstoringen geïntroduceerd door het afvlakken kwantitatief te schatten, maar ook een eenvoudig referentiepunt wilt uitlijnen van opeenvolgende secties. Verdere cruciale aspecten voor het behoud van laminaire trouw omvatten zorgen voor homogene afvlakken in de sectie, en ten slotte afdelen precies raakvlak aan de laminaire lay-out te krijgen geoptimaliseerd laminaire corticale secties.
De visualisatie van corticale modules in afgeplatte tangentiële secties heeft een belangrijke rol gespeeld bij onthullen fascinerende structuur-functie relaties in de hersenschors. De topografische vertegenwoordiging van Bakkebaard en lichaamsdelen in de primaire Somatosensorische cortex en de aanwezigheid van een anatomische raster in de micro schakelingen genereren van functionele raster cellen in afgeplatte tangentiële corticale secties onthullen ingewikkelde micro schakelingen Details die zou moeilijk te begrijpen van andere richtingen. Onze huidige technieken bieden echter slechts een twee-dimensionale segment van deze in wezen driedimensionale modules. Met immunofluorescentie technieken en weefsel clearing methoden36,37, zou het kunnen visualiseren van deze corticale modules als geheel en misschien onthullen verdere inzichten in ons begrip van de corticale kaarten en modules.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in de afwezigheid van eventuele commerciële of financiële relaties kan worden opgevat als een mogelijke belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Humboldt-Universität zu Berlin, de Bernstein-Center for Computational Neuroscience Berlijn, het Duitse centrum voor neurodegeneratieve ziekten (DZNE), het Duitse federale ministerie van onderwijs en onderzoek (goedgekeurd, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure, en de Gottfried Wilhelm Leibniz prize van de DFG. Wij danken Shimpei Ishiyama voor uitstekende grafische vormgeving en Juliane Diederichs voor uitstekende technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps - Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears - 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- Brodmann, K. Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , Barth. (1909).
- Naumann, R. K., et al. The reptilian brain. Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).
- Kaas, J. H. Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).
- Woolsey, T. A., Van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
- Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex. J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).
- Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex. Science. 343 (6173), 891-896 (2014).
- Wong-Riley, M. T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity. Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).
- Ray, S., Brecht, M. Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex. Elife. 5, e13343 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Olson, S. T., Chuang, Y. J. Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases. Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).
- Paraformaldehyde (PFA; 4%). Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- Sodium phosphate (PB). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex. Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).
- Tootell, R. B., Silverman, M. S. Two methods for flat-mounting cortical tissue. J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).
- Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact. J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol. J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
- Krubitzer, L. The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different? Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).
- Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex. J Comp Neurol. , (2017).
- Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. Vertical bundles of dendrites in the neocortex. Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).
- Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex. J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).
- Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex. Front Syst Neurosci. 11, (2017).
- Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).
- Land, P. W., Simons, D. J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex. J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).
- Welker, C., Woolsey, T. A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse. J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).
- Retzius, G. Die Cajal'schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).
- Cajal, S. R. Histologie du Systeme Nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Talleres Grafios. Montana, Madrid. (1911).
- Chapin, J. K., Lin, C. S. Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats. J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).
- Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).
- Tang, Q., et al. Functional architecture of the rat parasubiculum. J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).
- Snyder, J. P. Map projections--A working manual (Vol. 1395). , US Government Printing Office. (1987).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
