Summary
Cet article décrit une méthodologie détaillée pour obtenir aplaties sections tangentielles des cortex mammifère et visualiser les modules corticales en utilisant histochimiques et méthodes immunohistochimiques.
Abstract
Le cortex du cerveau chez les mammifères est parcellated en sous-structures distinctes ou modules. Corticales modules généralement se positionner parallèles à la fiche corticale et peuvent être délimités par certaines méthodes histochimiques et immunohistochimiques. Dans cette étude, nous mettons en évidence une méthode pour isoler le cortex du cerveau chez les mammifères et aplatir pour obtenir parallèle de sections à la fiche corticale. Nous avons en outre point culminant choisi histochimiques et méthodes immunohistochimiques pour traiter ces aplati sections tangentielles pour visualiser les modules corticales. Dans le cortex somatosensoriel de divers mammifères, nous effectuons l’histochimie cytochrome oxydase pour révéler des cartes de corps ou corticales modules représentant les différentes parties du corps de l’animal. Dans le cortex entorhinal médial, une zone où les cellules de la grille sont générés, nous utilisons des méthodes immunohistochimiques pour mettre en évidence des modules de neurones génétiquement déterminés qui sont disposées en forme de grille dans la fiche corticale chez plusieurs espèces. Dans l’ensemble, nous fournissons un cadre pour isoler et préparer schichtweisen aplati sections corticales et visualiser les modules corticales en utilisant histochimiques et méthodes immunohistochimiques dans une grande variété de mammifères cerveaux.
Introduction
Certains des changements plus importants dans la structure du cerveau dans la phylogénie peuvent être observée dans le cortex cérébral. Malgré les différences significatives, le cortex des animaux suit un modèle commun et peut être largement divisé de deux manières distinctes, par couches et domaines1. Les couches corticales se positionner parallèles à la surface du cerveau et varient en nombre de 3 couches en cortex Reptilien2 à 6 couches de mammifère cortex1. Aires corticales sont quant à eux des régions distinctes du cortex qui correspondent en grande partie aux fonctionnalités distinctes, par exemple, le cortex somatosensoriel est impliqué dans la sensation de toucher ou le cortex visuel dans le traitement des entrées visuelles. Ces aires corticales peuvent souvent être subdivisés en3modules ou correctifs, qui répètent régulièrement les structures anatomiques, trouves essentiellement parallèles à la surface pial du cerveau. Modules corticales peuvent être limités à un calque particulier4ou étendent à travers plusieurs couches5.
Méthodes standard de sectionnement du cerveau impliquent sections perpendiculaires à la surface du cerveau, comme coronale ou sagittal. Alors que ces méthodes peuvent être utilisées pour visualiser les modules corticales, une multitude de fonctionnalités intéressantes peut être révélée lorsque les modules corticales sont visualisées tangentiellement, dans un plan parallèle à la surface du cerveau. Par exemple, modules somatosensoriels dans le cerveau de rongeur qui représentent les moustaches, apparaissent comme des barils quand visualisé perpendiculairement à la surface du cerveau, et donc les régions tirent le cortex de baril de nom. Cependant, sur la visualisation des barriques dans une orientation tangentielle, ils révèlent une moustache-carte, avec les barils étant disposées dans une orientation topographique la disposition exacte des moustaches à la surface externe de la mise en miroir. Dans certains cas, arrangement modulaire a même échappé de détection pendant une longue période, lorsque visualisé de manière non-tangentielle. Le cortex entorhinal médial, est connu pour la présence de cellules de la grille, les neurones qui se déclenchent selon un arrangement hexagonal régulier lorsqu’un animal parcourt un environnement. Même si c’est une zone fortement étudiée, jusqu'à récemment, la présence de plaques ou de modules de cellules dans le cortex entorhinal médial, qui sont physiquement disposées dans un arrangement hexagonal6, avait échappé à détection. La présence et l’arrangement de ces modules, dans le cerveau de rat, a été facilitée par des sections tangentielles du cortex entorhinal médial et étudie la cytoarchitecture de manière layer-wise.
À la suite de sectionnement, l’aspect particulier de la visualisation des modules corticales aussi peut être réalisé que de multiples façons. Classiquement, des études ont délimité des modules basés sur des cellules densité ou fibre mise en page1. Une autre méthode populaire est l’utilisation de la cytochrome oxydase histochimie, qui révèle des zones d’activité supérieur8. Des approches plus récentes incluent regardant des types de cellules génétiquement déterminée, distinguées sur la base de leur protéine expression profils6,8.
Dans cette étude, nous mettons en évidence les méthodes pour isoler le cortex du cerveau chez les mammifères, obtenir des sections tangentielles aplaties et visualiser les corticales modules basés sur la cytochrome oxydase histochimie et immunohistochimie de protéines spécifiques de type cellulaire.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées selon les directives allemandes sur le bien-être animal sous la supervision des comités d’éthique locaux (LaGeSo). Humaine et bat cerveau données proviennent de Naumann et al. 5 la procédure suivante est effectuée sur un rat de Wistar adulte mâle (souche : RJHan:WI).
1. la perfusion et l’Extraction de cerveau
NOTE : Afin d’obtenir un cerveau homogène fixe et sans sang, perfusion de transcardial de l’animal est fortement encouragée, comme résidus de sang augmente le signal de fond non spécifique pendant la coloration. Néanmoins, il est également possible d’obtenir des sections aplaties du spécimen non perfusé et leur tache. La facilité de manipulation de l’échantillon varie avec la concentration de fixatif utilisé. Trop peu de fixation augmente le risque de manipulation des dommages au cerveau pendant l’aplatissement et la coupe, tandis que des concentrations trop élevées abaisser la flexibilité pour l’aplatissement et la qualité du signal coloration.
- Transcardially perfuse l’animal, à l’aide d’une aiguille de 23G. Pour un guide plus détaillé, voir Gage et al. 9
- Utiliser le phosphate tampon saline10 (PBS ; 0,02 M ; pH 7,4) afin d’éliminer le sang du cerveau et le corps de l’animal. Continuez jusqu'à ce que le liquide de perfusion apparaît clairement, au moins 150 mL de PBS est infusé dans le système vasculaire.
Remarque : Les meilleurs résultats sont obtenus à une pression semblable à la gamme de la pression sanguine physiologique de l’animal étant perfusé (p. ex., rat : 120-130 mmHg). Ajouter éventuellement l’héparine (10 U/mL) à la solution pour éviter la coagulation de sang11. - Pour corriger le cerveau, transcardially insuffler un minimum de 100 mL de paraformaldéhyde12 (PFA, 4 % ; en phosphate 0,1 M de tampon (PB)13) jusqu'à ce que le cou de l’animal est raide.
ATTENTION : PFA est un carcinogène potentiel.
NOTE : Meilleur pour activité histochimique coloration, par exemple pour des cytochrome oxydase, résultats, lors de l’utilisation de 2 % PFA. Pour d’autres, tels que l’immunohistochimie, de coloration 4 % PFA est préféré.
- Utiliser le phosphate tampon saline10 (PBS ; 0,02 M ; pH 7,4) afin d’éliminer le sang du cerveau et le corps de l’animal. Continuez jusqu'à ce que le liquide de perfusion apparaît clairement, au moins 150 mL de PBS est infusé dans le système vasculaire.
- Extraire le cerveau du crâne.
Remarque : Voir Gage et al. 9 pour plus de détails.- Isoler la tête à l’aide de grands ciseaux ou cisaille à OS.
- À l’aide des ciseaux, coupez la peau le long de la ligne médiane du cou aux nez. Écartez la peau afin d’exposer le crâne. Retirez le cou et les muscles temporelles à l’aide des ciseaux.
- Faites une ligne médiane coupe à travers l’OS interpariétal depuis le trou occipital jusqu'à l’os pariétal.
- Utiliser des pinces-Gouges à décoller l’OS interpariétal. Glissez des ciseaux le long de la suture sagittale et taillés dans l’extrémité postérieure de la pariétal à l’extrémité antérieure de l’os frontal.
- Utiliser des pinces-Gouges à décoller le pariétal et les os frontaux. Sinon, soulevez les os loin avec une pincette. Utilisez une cuillère pour couper les cordons nerveux ventral et retirer le cerveau. Transférer le cerveau à PB (0,1 M, pH 7,4).
- Difficulté des cerveaux non perfusé par immersion dans 4 % PFA pendant 1-3 h à 4 ° C (selon la taille du cerveau et de la sonde : musaraigne : ~ 1 h, l’homme : ~ 3 h).
Remarque : Pour les grandes et gyrencephalic cerveaux comme les humains, isoler et découper dans la zone d’intérêt pour réduire les temps de fixation. - Pour obtenir de plus grandes aires corticales dans une section, aplatir le cerveau avant supplémentaire après fixation ; Passez à l’étape 2. Toutefois, pour obtenir des sections de plus difficile à atteindre des zones comme le cortex entorhinal médial, fixer le cerveau chez 4 % PFA pendant 24 h avant de passer à l’étape 2.
2. Dissection et l’aplatissement du cerveau
- Séparer les hémisphères du cerveau à l’aide d’une lame de rasoir (lissencephalic cerveau) ou un scalpel (gyrencephalic cerveaux).
Remarque : Si le cerveau n’a pas été fixé après, il est sensible aux dommages causés par la manutention. - Étape facultative pour aider estimation d’inscription et le rétrécissement de section subséquente :
- Percez le cortex dans une zone de non-intérêt, avec une aiguille de 35G perpendiculairement à la surface corticale. Répétez l’étape deux fois à des distances définies le long de la feuille de la corticale. Pour déterminer la distance le long de la feuille de la corticale, utilise un thread prédécoupé à une longueur fixe (p. ex., 5 mm) et poser le long de la surface corticale pour déterminer les points de ponction.
- Lissencephalic cervelle : supprimer les structures sous-corticales en utilisant une spatule de dissection. Critique : Garder le cerveau humide avec PB (0,1 M, pH 7,4) tout au long de la procédure dans son ensemble.
- Organiser le cerveau, le cervelet et insérer doucement la spatule pour ouvrir un plan de dissection dans le corps calleux. Le bout rond de spatule doit diriger vers le cortex.
- Glisser la spatule plus loin et tirez doucement jusqu'à ce que la spatule entre le thalamus et le cortex. Structures sous-corticales séparés avec grattage des requêtes.
- Inspecter l’hémisphère pour la même épaisseur.
Remarque : Toute régions inégales peuvent entraîner un gradient trans-couche pendant la découpe. Pour la coupe tangentielle, utiliser un scalpel pour faire une coupe nette à travers le cerveau, parallèle à la surface pial de la région d'où les sections tangentielles sont souhaitées. - Étapes facultatives pour améliorer la qualité de l’aplatissement :
- Faire une coupe nette dans le striatum, le noyau accumbens et le cortex orbitofrontal, puisqu’ils augmentent l’épaisseur du cortex dans la région latérale. En outre, ajouter une coupe relève à la base de la région intérieure du cortex préfrontal, qui permet le déroulement de la partie médiale du cortex.
- Placez l’hémisphère (cortex vers le bas) sur une lame de verre. Passez à l’étape 2.6.
- Gyrencephalic cerveau : retirer la matière blanche se dérouler gyri (pour les protocoles détaillés, voir : Sincich et al. 14; Tootell et Silverman15). Critique : PB d’utilisation (0,1 M, pH 7,4) pour garder le cerveau humide en tout temps.
- Mettre la zone d’intérêt sur un papier filtre humide dans une grande boîte de Pétri, avec le cortex vers le haut.
- Retirez l’arachnoïde et pia à l’aide de deux pinces.
- Utilisez un coton-tige humide et insérez doucement dans chaque sillon pour détacher les adhérences entre les circonvolutions.
- Retourner le cerveau en utilisant un autre papier filtre humide.
- Utiliser deux spatules micro incurvées pour Déplier les gyri unique. Utilisez le côté convexe des spatules de distinguer la matière blanche jusqu'à arriver près de l’extrémité concave de la godronné. Utilisez un coton-tige humide et procéder à des mouvements tourbillonnants pour atteindre l’extrémité concave du gyrus.
- Taquiner les gyri seul dehors. Si nécessaire, ajoutez de soulager les petites coupures si la tension est trop élevée.
- Aplatir le cerveau non plié dans la boîte de Pétri ou un autre récipient.
- Éventuellement, placer des cerveaux plus gros sur une éponge de papier-filtre couvert, pour s’assurer que régions ne s’assèchent pas.
- Placez deux morceaux roulés d’argile des deux côtés. Critique : Comme l’épaisseur de l’argile définit combien l’hémisphère peut être aplati, veiller à ce que l’argile est de 10 à 20 % plus mince que le cortex non aplati.
- Appuyez doucement sur un deuxième verre diapositive/petit Petri stérile sur le cortex jusqu'à ce que l’hémisphère est entièrement plat. Pour obtenir les meilleurs résultats pour une région souhaitée, placez la lame de verre tout d’abord sur la zone respective. Pour obtenir les meilleurs résultats pour les cerveaux lissencephalic, placez la lame de verre tangentiellement à la partie latérale tout d’abord et appliquer une pression concentrée sur cette région.
- Mettre un poids (par exemple, un verre de montre en céramique) sur le lames de verre/Pétri et aplatir l’hémisphère pendant 3-5 h à 4 ° C en PB.
- Après fixation, relâcher la pression et enlever les lames de verre. Mettre l’hémisphère aplati en PFA (mobile) pendant 24 h sur un agitateur à 4 ° C.
Remarque : Les meilleurs résultats pour activité histochimiques salissures sont obtenus lorsque vous utilisez 1 % PFA. Pour les autres salissures, tels que l’immunohistochimie, pour les cerveaux non perfusés, 2 % PFA peut être utilisé.
Figure 1 : représentation schématique du workflow pour l’aplatissement d’un hémisphère cortical de rat et de visualisation des modules dans le cortex somatosensoriel. À la suite de la perfusion de transcardial, le cerveau de souris a été disséqué (A). Structures sous-corticales ont été enlevées et cortex a été aplati entre deux lames de verre dans un tampon phosphate (B). Hémisphère aplati (C) a été fixé après, tangentiellement sectionné et coloré pour l’activité cytochrome oxydase (D). Barreaux de l’échelle = 1 cm. R: Rostral, C: Caudal, L: latérale, M: médiale. Adaptation du Lauer et al. 23 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
3. coupe tangentielle Sections
Remarque : Selon les exigences des protocoles des coloration, la procédure de coupe et l’épaisseur peuvent être adaptés. Un vibratome servait à couper les hémisphères pour traitement histochimique (étape 3.2) à 80-150 µm. Toutefois, pour le traitement de l’immunohistochimie, sections plus minces sont désirées et un microtome à congélation a été utilisé pour le sectionnement (étape 3.3) à 10-60 µm. Voir la vidéo 1.
- Laver l’hémisphère aplati en PB (0,1 ; pH 7,4) pendant 15 min.
- Couper l’hémisphère sur un vibratome.
- Placez l’hémisphère tangentiellement sur le support de tranchage. En option, appuyez à nouveau sur doucement avec une lame de verre avant de fixer en position (par exemple, avec la superglue).
Remarque : Réduire la quantité de colle utilisée, car les artefacts coupe pourraient entraîner en raison de la faible épaisseur des hémisphères aplatis. - Couper l’hémisphère de l’extrémité plus épaisse et plus stable vers la fin plus mince (postérieur à la partie antérieure, en l’occurrence) à l’épaisseur requise. Passez à l’étape 3.4.
Remarque : Si la fixation faible concentrations ont été utilisées, coupez-le à une vitesse lente et une grande amplitude.
- Placez l’hémisphère tangentiellement sur le support de tranchage. En option, appuyez à nouveau sur doucement avec une lame de verre avant de fixer en position (par exemple, avec la superglue).
- Couper l’hémisphère sur un microtome à congélation.
- Cryoprotect le cerveau en l’immergeant dans une solution de sucrose à 30 % (en PB) jusqu'à ce qu’il coule.
Remarque : Selon la taille du tissu étant cryoprotected, couler dans la solution peut varier de quelques heures à quelques jours. Pour les plus grands cerveaux pourraient considérer les méthodes alternatives cryoprotection (voir rrrrrrrr et al. ( 16). - Forment une base sur le microtome de gel pour monter le cerveau des glaces. Construire la base de glace en congelant les PB sur la face du bloc du microtome à congélation. Critique : S’assurer que la surface de la base de la glace est parallèle à la lame du microtome. Pour ce faire, couper la glace vide base à l’aide de la lame microtome d’aligner exactement la base glace parallèle à la surface de coupe.
- Incorporer le cerveau au moyen de congélation et la fixer à la face du bloc du microtome avec la zone d’intérêt parallèle à la face du bloc. Face à la surface pial du cerveau vers la face du bloc du microtome. Critique : Régler la température de congélation selon la taille de l’échantillon ; des températures plus élevées assurer mieux section intégrité tout en sectionnant, mais plus grandes sections nécessitent des températures plus basses pour geler l’échantillon uniformément.
- Couper le cerveau tangentiellement à l’épaisseur requise (entraîner des vitesses de coupe plus lente et uniforme dans la meilleure qualité de section).
- Cryoprotect le cerveau en l’immergeant dans une solution de sucrose à 30 % (en PB) jusqu'à ce qu’il coule.
- Laver les sections de PB pendant 15 minutes sur un agitateur.
Vidéo 1 : vidéo schématique de sectionnement tangentielle du cortex entorhinal médial du rat et mise en page des modules parasubicular et entorhinal. L’aire entorhinale médiale d’un cerveau de rongeur est situé à l’extrémité postérieure du cortex et est incliné vers le côté médial et ventral. Les sections tangentielles sont obtenues en orientant un couteau le long de cet angle. Par conséquent, type cellulaire approprié de coloration spécifique révèle des structures modulaires dans le cortex entorhinal médial et parasubiculum attenant. Vidéo adapté de Ray et Brecht8. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
4. visualisation des Modules corticales à l’aide de coloration de la Cytochrome oxydase
Remarque : Différents protocoles de coloration ont été développés pour la détection histochimique de l’activité cytochrome oxydase, par exemple, tout d’abord par Wong-Riley17 et modifiés plus tard par Divac et al. 18 ce protocole est basé sur celui de Divac et al. 18, car l’utilisation de sulfate de nickel-d’ammonium (NiAS) se traduit par un contraste plus élevé et mieux les modules définis dans les zones corticales tachées.
- Préparer la solution de coloration de la cytochrome oxydase (voir Divac et al. 18). pour 10 mL de solution, ajouter : 10 mL de tampon HEPES (0,1 M, pH 7,4), saccharose 400 mg, 12,5 mg NiAS, cytochrome 2 mg C, mg 6 diaminobenzidine (DAB).
ATTENTION : DAB et NiAS sont cancérigènes.
NOTE : Ajouter DAB juste avant l’incubation des sections. - Laver les sections dans un tampon HEPES (0,1 M, pH 7,4) sur un agitateur pendant 15 min.
- Incuber les sections dans la solution colorante à température ambiante sur un agitateur.
Remarque : Observer la vitesse de la coloration. S’il n’y a aucune réaction visible, changer d’incubation à 37 ° C. Selon l’importance de la fixation, la coloration peut être observée après 10 min ou en quelques heures. - Arrêter la réaction en ajoutant 4 % PFA ; Cela empêche de re-mourir non désirées et l’augmentation du signal de fond.
- Laver les sections trois fois avec un tampon HEPES pendant 10 min.
- Monter et sécher les sections sur lames de verre.
- Déshydrater les sections avec une rangée d’alcool croissante :
- Laver les lames dans l’éthanol à 60 % pendant 1 min. laver les lames dans l’éthanol à 80 % pour 1 min. laver les lames dans l’éthanol à 96 % pour 2 min. laver les lames dans l’éthanol à 100 % pour 3 min. laver les lames dans l’alcool isopropylique pour 5 min. laver les lames dans le xylène pendant 5 min.
- Immédiatement ajouter un milieu de trempe-montage rapide et ajouter un lamelle couvre-objet. Critique : Ne pas utiliser les supports de montage à base d’eau, car NiAS va être rincés et dégrader la coloration.
- Conserver les sections à 4 ° C pour un stockage prolongé.
5. visualisation des Modules corticales à l’aide de coloration immunohistochimique
Remarque : Plusieurs protocoles sont disponibles pour l’immunohistochimie, optimisé pour le spécimen et le type de sonde. Des adaptations sont possibles selon les besoins, de diverses concentrations d’anticorps, agents perméabilisant et temps d’incubation. Le protocole suivant mène à de bons résultats pour détecter une large gamme d’anticorps et de visualisation de sondes fluorescentes.
- Laver les sections dans du PBS (0,1 M, pH 7,4) pendant 15 min.
- Facultatif : Effectuer la recherche d’antigène pour démasquer un épitope à l’aide d’un bain-marie (basé sur Jiao et al. 19; pour des méthodes alternatives, voir Pileri et al. ( 20).
- Préchauffer un bain d’eau à 80 ° C. Préparer de tampon citrate trisodique19 (pH 8,0) et préchauffer dans le bain d’eau à 80 ° C.
- Transférer les sections à tampon citrate trisodique. Incuber les sections pendant 30 min à 80 ° C
- Cool les sections à température ambiante
- Laver les sections en PBS pendant 15 min.
- Laver les sections deux fois au PBS-X (0,5 % Triton-X, dans du PBS de 0,1 M) pendant 15 min.
- Bloquer les épitopes imprécises en incubant les sections dans une solution d’albumine de sérum bovin (BSA ; 2,5 %) et le Triton-X (0,75 %) dans du PBS pendant 2 h.
- Incuber les sections de l’anticorps primaire, par exemple, Calbindin - D28k (1:5, 000, 1 % de BSA dans PBS-X), pour 2 ou 3 jours sur un agitateur à 4 ° C.
Remarque : Une dilution optimale pour l’anticorps primaire dépend de l’anticorps spécifique utilisé. Reportez-vous aux informations du fabricant pour obtenir les critères de la dilution d’un anticorps spécifique. Anticorps multiples peuvent être utilisés ensemble, mais doivent être soulevées contre différentes espèces. - Laver les sections trois fois dans du PBS pendant 15 minutes chaque.
- Incuber les sections du jour au lendemain dans l’anticorps secondaire (1 : 200, 1 % de BSA dans du PBS) à 4 ° C dans un agitateur.
Remarque : Plusieurs Anticorps secondaires peuvent être utilisés à différents spectres si plusieurs anticorps primaires ont été utilisés. - Laver l’anticorps secondaire en lavant les sections trois fois dans du PBS pendant 10 min chaque.
- Monter et sécher les sections sur une lame de verre pour la microscopie.
Remarque : Les sections doivent être toujours humides avant de monter la lamelle. - Appliquez le milieu de montage adapté pour les teintures de fluorescence sur les sections de tissu ainsi un lamelle couvre-objet.
- Sécher les sections pendant 1 h.
- Pour le stockage à long terme, sceller la lamelle à l’aide de vernis à ongles et conserver à l’obscurité à 4 ° C.
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Representative Results
Nous avons obtenu aplaties sections corticales du cortex somatosensoriel dans une variété de cerveaux et eux pour histochimie cytochrome oxydase de visualiser les modules somatotopique représentant les différentes parties du corps traitées. Cette approche comparative permet d’étudier les forces évolutives que cortex de la forme, par exemple, indiquer la répartition hautement conservée des vibrissae mystacial chez les rongeurs et lagomorpha barils21 (Figure 2). En revanche, les autres parties du corps telles que les pattes et les organes génitaux montrent des variations dans leurs parentes, taille et reflètent la spécialisation d’une niche écologique ou de la sélection sexuelle22,23.
Pour comprendre l’architecture du cortex entorhinal médial, nous avons obtenu parallèlement de sections à la surface pial. Ceci a été principalement réalisé par découpe tangentielle du cortex entorhinal médiale dans les souris, des rats et des chauves-souris frugivores égyptiennes. Chez l’homme, en raison de la taille beaucoup plus grande et plus les ondulations dans le cortex entorhinal, nous aplatis doucement le cortex à la suite de faire une coupe tangentielle du cortex entorhinal. Par la suite, tous les cerveaux ont été cryoconservés et sectionné sur un cryostat à 60 µm. immunohistochimie a été réalisée sur les sections obtenues avec un anticorps anti-calbindin, de visualiser les modules calbindin séropositifs cellule pyramidale dans l’entorhinal médial cortex5 (Figure 3). Les modules de calbindin dans le cortex entorhinal illustrent une périodicité remarquable dans l’ensemble de tous ces cerveaux et varient en taille de seulement un facteur de 10 dans l’ensemble ~ 20,000-fold variation dans le cerveau des tailles5.
Figure 2 : emplacement topographique des baril cortex modules travers mammifères identifiés par cytochrome oxydase histochimie. Sections tangentielles de IV de la couche du cortex somatosensoriel (A) souris, gerbille de Mongolie (B), (C) rat, Octodon degus (D), hamster (E), lapin (F), montrant des barils comme un somatotopique hautement conservée représentation des vibrisses mystacial. Barreaux de l’échelle = 500 µm. M: médiale, L: latérale, R: Rostral Caudal C: ; Orientation a s’applique également aux B-E. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : disposition périodique des modules cortex entorhinal médial dans mammifères identifiés par l’immunoréactivité calbindin. Sections tangentielles de couche II du cortex entorhinal médial de souris (A), (B) rat, chauve-souris égyptien (C) et (D) humaine, montrant une disposition périodique conservée des modules de cellules pyramidales de calbindin séropositifs. Barreaux de l’échelle = 250 µm. M: L: latérale, D: dorsale, ventrale V:, R: Rostral, Medial, C: Caudal ; Orientation en ré s’applique également aux B, C. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Modularité dans le cortex cérébral a été identifiée à l’aide d’une variété de techniques. Les premiers modules corticale études généralement identifiés en soit visualisant cellulaires denses régions, ou l’absence de fibres1. Les méthodes suivantes ont utilisé la présence de faisceaux dendritiques24, afférences d’une région donnée25ou enrichissement des neurotransmetteurs26. Nous démontrons ici deux techniques, cytochrome oxydase i histochimie et marquage immunohistochimique (ii).
Coloration de la cytochrome oxydase a été une des méthodes plus populaires de visualiser les modules corticales et a été largement utilisée dans le cortex sensoriel primaire27,28. Il visualise les modules par coloration plus sombre pour les zones plus élevées l’activité mitochondriale17, agissant ainsi comme un proxy pour modules anatomiques qui suscitent des réponses fonctionnelles importantes. Cette méthode a été utilisée pour visualiser les modules cortex somatosensoriels (Figure 2) et des modules corticales dans le cortex visuel27.
Un des inconvénients des techniques histochimiques traditionnelles est que leur visualisation typique par microscopie optique lumineux-zone limite le nombre de modules qui peuvent être visualisées simultanément. Cependant, méthodes immunohistochimiques, en conjugaison avec des sondes fluorescentes visualisation peuvent également servir pour afficher des protéines particulières et identifier les modules corticales. Par exemple, thalamique afférents au projet cortex sensoriel de façon somatotopique. Ainsi, visualiser ces afférences, à l’aide de l’immunoréactivité VGluT2 permet également de visualiser les cartes du corps dans le cortex somatosensoriel primaire qui nous avons visualisé à l’aide de l’activité cytochrome oxydase (Figure 2). Protéines sélectives peuvent également servir de marqueurs cellulaires pour identifier les groupes de cellules génétiquement définies. Par immunohistochimie, nous avons identifié des amas de cellules pyramidales du cortex entorhinal médial exprimant la protéine de liaison du calcium, calbindin6 (Figure 3) et a déterminé que les grappes de ce particulier déterminé génétiquement Groupe de cellules sont conservées à travers évolution5, indiquant les principes communs de microcircuit qui sous-tendent leur fonction. À l’aide de plusieurs fluorophores, nous aussi délimité des modules complémentaires dans le cortex entorhinal médial26, démontrant des microcircuits parallèles qui sous-tendent la mémoire spatiale.
Historiquement, le cerveau a été sectionné dans un plan perpendiculaire à sa position dans le corps, dans les orientations sagittales, coronales soit horizontales. L’identification des modules corticales, tels que les champs de Canon dans le cortex somatosensoriel4 a également incité sectionnant le long d’une tangentielle et ensuite aplati préparations corticale29, bien que des cas isolés de ces coupes ont été observé beaucoup plus tôt de30,31. À la suite de l’identification du cortex baril, autres modules corticaux ont également été identifiés dans le cortex visuel primaire27, ainsi que la présence d’un corps complet carte32 avec une représentation somatotopique du corps dans l’enseignement primaire cortex somatosensoriel. Les sections aplaties du cortex visuel du chat a également révèlent l’organisation topographique des colonnes d’orientation sans la nécessité pour les reconstructions supplémentaires33. Modularité corticale a aussi démontrée dans le cortex parahippocampique, notamment presubiculum et parasubiculum26,34 et de cortex entorhinal médial6. Aplatissement généralement un objet courbe induit des distorsions dans la topographie laminaire - comme peut être observé par la multitude des projections de la surface de la terre courbée sur une carte plate35. Une méthode relativement simpliste pour compenser partiellement ces distorsions est en introduisant des points de référence à des distances déterminées avant d’aplatir et ensuite mesurer la distance entre eux après aplatissement. Non seulement ces marques puis servent à estimer quantitativement distorsions introduites par aplatissement, mais également fournissent un point de repère facile pour aligner les sections consécutives. Davantage des aspects essentiels pour préserver la fidélité laminaire comprennent assurant un aplatissement homogène dans l’ensemble de la section et enfin la section exactement tangent à la disposition laminaire pour obtenir optimisée laminaires sections corticales.
La visualisation des modules corticales dans les sections tangentielles aplaties a joué un rôle important pour révéler des relations structure-fonction fascinante dans le cortex cérébral. La représentation topographique des moustaches et du corps des pièces dans le cortex somatosensoriel primaire et la présence d’une grille anatomique dans les microcircuits générant des cellules de la grille fonctionnelle dans les sections corticales tangentielles aplaties révèlent des microstructures complexes détails qui seraient difficiles à comprendre d’autres orientations. Cependant, nos techniques actuelles ne fournissent qu’une tranche bidimensionnelle de ces modules essentiellement en trois dimensions. À l’aide de techniques d’immunofluorescence et tissus compensation méthodes36,37, il serait possible de visualiser ces modules corticales dans son ensemble et peut-être révéler davantage des aperçus de notre compréhension des cartes corticales et modules.
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Disclosures
Les auteurs déclarent que la recherche a été effectuée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprété comme un conflit d’intérêts potentiel.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par Humboldt Universität zu Berlin, Bernstein Center for Computational Neuroscience Berlin, le Centre allemand pour les maladies neurodégénératives (DZNE), le ministère fédéral allemand de l’éducation et la recherche (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure et la Gottfried Wilhelm Leibniz prize de la DFG. Nous remercions Shimpei Ishiyama d’excellent graphisme et Juliane Diederichs excellente assistance technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps - Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears - 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
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