Summary
I denne artikel beskrives en detaljeret metode til at opnå fladtrykte tangential sektioner fra pattedyr cortex og visualisere kortikale moduler bruger histokemiske og immunhistokemiske metoder.
Abstract
Cortex af pattedyr hjerner er parcellated i særskilte delstrukturer eller moduler. Kortikale moduler typisk ligge parallelt med det kortikale ark, og kan være afgrænset af visse histokemiske og immunhistokemiske metoder. I denne undersøgelse fremhæve vi en metode til at isolere cortex fra pattedyr hjerner og tromle dem for at få sektioner parallelt med det kortikale ark. Vi yderligere fremhæve valgt histokemiske og immunhistokemiske metoder til at behandle disse fladtrykt tangential sektioner for at visualisere kortikale moduler. I den somatosensoriske cortex af forskellige pattedyr udføre vi cytokrom oxidase histokemi for at afsløre krop kort eller kortikale moduler som repræsenterer forskellige dele af kroppen af dyret. I den mediale entorhinal cortex, et område, hvor gitterceller genereres, udnytter vi immunhistokemiske metoder for at fremhæve moduler af genetisk bestemt neuroner, der er arrangeret i et gitter-mønster i det kortikale ark på tværs af flere arter. Samlet set, vi leverer en ramme til at isolere og forberede layer-wise fladtrykt kortikale sektioner og visualisere kortikale moduler bruger histokemiske og immunhistokemiske metoder i en bred vifte af pattedyr hjerner.
Introduction
Nogle af de mest markante ændringer i hjernens struktur på tværs af fylogeni kan observeres i hjernebarken. Trods betydelige forskelle, cortex af dyr følger et fælles mønster og kan groft inddeles i to særskilte måder, af lag og områder1. Kortikale lag ligger parallelt med overfladen af hjernen og variere i antal fra 3 lag i krybdyrs cortex2 til 6 lag i pattedyr cortex1. Kortikale områder på den anden side er forskellige regioner af cortex, som stort set svarer til forskellige funktioner, f.eks., den somatosensoriske cortex er involveret i følelsen af touch eller den visuelle cortex ved behandling af visuelle input. Disse kortikale områder kan ofte opdeles i patches eller moduler3, som regelmæssigt gentaget anatomiske strukturer, hovedsagelig fundet parallelt med pial overfladen af hjernen. Kortikale moduler kan begrænses til et bestemt lag4eller strækker sig over flere lag5.
Skæring standardmetoder af hjernen inddrage afsnit vinkelret på overfladen af hjernen, som koronal og sagittal. Mens disse metoder kan bruges til at visualisere kortikale moduler, kan et væld af interessante funktioner blive afsløret når de kortikale moduler er visualiseret tangentielt, i et plan parallelt med overfladen af hjernen. For eksempel, somatosensoriske moduler i gnavere hjernen repræsenterer whiskers, vises som Tønder når visualiseret normal hjerne overflade, og dermed Regionsudvalget udlede navnet tønde cortex. Dog på visualisere tønder i en tangential orientering, afslører de en bakkenbart-kort, med tønder er lagt ud i en topografisk orientering spejling den nøjagtige layout af knurhår på eksterne kroppens overflade. I visse tilfælde, modulære arrangement har endnu undsluppet påvisning i store perioder, når visualiseret i en ikke-tangential måde. Den mediale entorhinal cortex, er kendt for tilstedeværelsen af gitterceller, neuroner, som brand i en regelmæssig sekskantede mønster, når et dyr gennemkører en miljø. Selv om det er et stærkt undersøgte område, indtil for nylig, tilstedeværelsen af patches eller moduler af celler i den mediale entorhinal cortex, var som fysisk er lagt ud i en sekskantet mønster6, undsluppet påvisning. Tilstedeværelsen og placeringen af disse moduler, i hjernen, rotte, blev fremmet ved at gøre tangential dele af mediale entorhinal cortex og undersøge cytoarchitecture på en layer-wise måde.
Efter skæring, indså det særlige aspekt af visualisering af kortikale moduler kan også på flere måder. Klassisk, har undersøgelser afgrænset moduler baseret på celle tæthed eller fiber layout1. En anden populær metode er brugen af cytokrom oxidase histokemi, som afslører områder af højere aktivitet8. Nyere tilgange omfatte kigger på genetisk bestemt celletyper, udmærker sig på grundlag af deres protein udtryk profiler6,8.
I denne undersøgelse fremhæve vi metoder for at isolere cortex fra pattedyr hjerner, få fladtrykte tangential sektioner og visualisere kortikale moduler baseret på cytokrom oxidase histokemi og Immunhistokemi celletype specifikke proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev udført efter tyske retningslinjer vedrørende dyrs velfærd under tilsyn af lokale etiske komitéer (LaGeSo). Menneskelige og bat brain data blev afledt fra Naumann et al. 5 følgende procedure er udført på en mandlig voksen Wistar rotter (stamme: RJHan:WI).
1. perfusion og hjernen udvinding
Bemærk: For at opnå en homogen måde fast og blod-gratis hjerne, transcardial perfusion af dyret er stærkt opmuntret, som resterende blod øger uspecifik baggrund signal under farvning. Det er dog også muligt at opnå fladtrykte sektioner fra un-perfused prøvemateriale og bejdse dem. Let håndtering af prøven varierer med koncentrationen af fiksativ anvendes. For lidt fiksering øger risikoen for håndtering hjerneskader under udfladning og skæring, mens alt for høje koncentrationer lavere fleksibilitet til udfladning og kvaliteten af det farvning signal.
- Transcardially perfuse dyr, ved hjælp af en 23G nål. For en mere detaljeret guide, se Gage et al. 9
- Bruge fosfat buffer saltvand10 (PBS; 0,02 M, pH 7,4) til at skylle ud blod fra hjernen og kroppen af dyr. Fortsætte indtil infusion væske vises tydeligt, med mindst 150 mL PBS bliver infunderes gennem det vaskulære system.
Bemærk: Bedste resultater er opnået ved et tryk svarende til rækken af de fysiologiske blodtryk af dyret er perfunderet (fx, rotte: 120-130 mmHg). Du kan eventuelt tilføje heparin (10 U/mL) til løsning til at undgå blod koagulation11. - Du kan løse hjernen, transcardially indgyde mindst 100 mL PARAFORMALDEHYD12 (PFA, 4%; i 0,1 M fosfat buffer (PB)13) indtil nakken af dyret er stiv.
Forsigtig: PFA er en potentiel kræftfremkaldende.
Bemærk: Bedste resultater for histokemiske aktivitet farvning, såsom cytokrom oxidase, der opnås, når du bruger 2% PFA. For andre farvning, såsom immunhistokemi, 4% PFA foretrækkes.
- Bruge fosfat buffer saltvand10 (PBS; 0,02 M, pH 7,4) til at skylle ud blod fra hjernen og kroppen af dyr. Fortsætte indtil infusion væske vises tydeligt, med mindst 150 mL PBS bliver infunderes gennem det vaskulære system.
- Uddrag hjernen fra kraniet.
Bemærk: Se Gage et al. 9 for detaljer.- Isolere hovedet ved hjælp af store saks eller knogle sakse.
- Brug fine saks, skåret huden langs midterlinjen fra hals til næse. Trække fra hinanden huden til at udsætte kraniet. Fjerne hals og tidsmæssige muskler ved hjælp af fine sakse.
- Gøre en midterlinjen skære igennem den interparietal knogle fra foramen magnum til parietal knogle.
- Brug Rongeurs til at skrælle den interparietal knogle. Skub fine saks langs den sagittal sutur og skåret fra den bageste ende af parietale til den forreste ende af de frontale knogler.
- Brug Rongeurs til at skrælle den parietale og frontale knogler. Alternativt, løft knogler væk med pincet. Brug en ske til at skære ventrale nerve snore og fjerne hjernen. Overføre hjernen til PB (0,1 M, pH 7,4).
- Fix un-perfused hjerner ved nedsænkning i 4% PFA i 1-3 timer ved 4 ° C (afhængigt af hjernens størrelse og sonde: spidsmus: ~ 1 h, menneskelige: ~ 3 h).
Bemærk: For store og gyrencephalic hjerner som mennesker, isolere og skære området af interesse at reducere fiksering tid. - For at opnå større kortikale områder i en sektion, flade hjernen før yderligere efter fiksering; Fortsæt til trin 2. Men for at få dele af sværere at nå områder som mediale entorhinal cortex, post løse hjerne i 4% PFA i 24 timer, før du fortsætter til trin 2.
2. brain dissektion og samkopiering
- Adskille hjernen halvkugle ved hjælp af et barberblad (lissencephalic hjerner) eller skalpel (gyrencephalic hjerner).
Bemærk: Hvis hjernen ikke har fastsat efter, det er modtagelige for skade ved håndtering. - Valgfrit trin til medvirken efterfølgende afsnit registrering og svind Estimering:
- Punktere cortex i et område af ikke-interesse, med en 35G nål normale kortikale overflade. Gentag trin to gange på definerede afstande langs den kortikale ark. For at bestemme afstanden langs den kortikale ark, bruge en forskårne tråd på en fast længde (fx, 5 mm) og lægge den langs den kortikale overflade til at beregne point for punktering.
- Lissencephalic hjerner: fjerne subkortikale strukturer ved hjælp af en dissekere spatel. Kritisk: Hold hjernen fugtig med PB (0,1 M, pH 7,4) under hele proceduren.
- Hold hjernen i lillehjernen og forsigtigt indsætte spatel for at åbne en dissektion fly i corpus callosum. Spatel rund spids skal pege væk fra cortex.
- Skubbe spatel yderligere og træk forsigtigt indtil spatel ligger mellem thalamus og cortex. Separat subkortikale strukturer med skrabe bevægelser.
- Inspicere halvkugle for ensartet tykkelse.
Bemærk: Enhver ujævne områder kan medføre en trans-lag gradient ved skæring. Tangential skæring, bruge en skalpel til at gøre et rent snit gennem hjernen, parallelt med pial overfladen af regionen som tangerer sektioner er ønsket. - Valgfri skridt til at forbedre udfladning kvalitet:
- Gør et rent snit gennem striatum, nucleus accumbens og orbitofrontal cortex, da de øger tykkelsen af cortex i den laterale region. Også, tilføje en lindre cut i bunden af den indre region af præfrontal cortex, som giver mulighed for udfoldelse af mediale dele af cortex.
- Placer halvkugle (cortex vender nedad) på et glas dias. Fortsæt til trin 2.6.
- Gyrencephalic hjerner: fjerne hvide substans at udfolde gyri (detaljerede protokoller, se: Sincich et al. 14; Tootell og Silverman15). Kritisk: Brug PB (0,1 M, pH 7,4) at holde hjernen fugtig til enhver tid.
- Stille område af interesse på en fugtig filterpapir i en stor petriskål med cortex opad.
- Fjerne den arachnoid membran og pia ved hjælp af to pincet.
- Brug en fugtig vatpind og Indsæt forsigtigt i hver sulcus løsrive sammenvoksninger mellem gyri.
- Slå hjernen ved hjælp af en anden fugtigt filtrerpapir.
- Bruge to buede mikro spatler for at udfolde enkelt gyri. Bruge den konvekse side af spatler for at drille hinanden den hvide substans indtil nå tæt på konkave slutningen af gyrus. Brug en fugtig vatpind og fortsætte med hvirvlende bevægelser at nå konkave slutningen af gyrus.
- Drille apart enkelt gyri. Om nødvendigt tilsættes små lindre skærer hvis spændingen er for høj.
- Flade udfoldet hjernen i petriskålen eller en lignende beholder.
- Valgfrit, placere større hjerner på et filtrerpapir dækket svamp, at sikre, at regioner ikke tørre ud.
- Placer to rullede stykker af ler på begge sider. Kritisk: Som tykkelsen af leret definerer, hvor meget halvkugle kan være flad, sikre at leret er 10-20% tyndere end den un-fladtrykte cortex.
- Tryk forsigtigt et andet glas dias/lille petriskål på cortex, indtil halvkugle er helt flad. For at opnå de bedste resultater for en ønskede region, placere glas dias først på det respektive område. At opnå de bedste resultater for lissencephalic hjerner, placere glas dias tangentielt på den laterale del først og anvende koncentreret pres på denne region.
- Sætte en vægt (fx, en keramisk urglas) på glas dias/petriskål og tromle halvkugle for 3-5 h ved 4 ° C i PB.
- Efter fiksering, frigive trykket og fjerne glas lysbilleder. Sætte den fladtrykte halvkugle i PFA (frit flydende) i 24 timer på en shaker ved 4 ° C.
Bemærk: Bedste resultater for histokemiske aktivitet stainings, der er opnået ved brug af 1% PFA. For andre stainings, såsom immunhistokemi, for un-perfused hjerner, 2% PFA kan bruges.
Figur 1: skematisk fremstilling af arbejdsgangen til udfladning af en rotte kortikale halvkugle og visualisering af moduler i somatosensoriske cortex. Efter transcardial perfusion, hjernen af en mus var dissekeret (A). Subkortikale strukturer blev fjernet og cortex var fladtrykt mellem to glas dias i fosfat buffer (B). Fladtrykt halvkugle (C) var efter faste, tangentielt sectioned og farvet for cytokrom oxidase aktivitet (D). Skalere barer = 1 cm. R: Rostral, C: Caudal, L: laterale, M: mediale. Figur tilpasset fra Lauer et al. 23 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
3. skære Tangential sektioner
Bemærk: Afhængig af de farvningsprotokoller krav skæring procedure og tykkelse kan tilpasses. En vibratome blev brugt til at skære hjernehalvdele til yderligere histokemiske forarbejdning (trin 3.2) på 80-150 µm. Dog til immunhistokemiske forarbejdning, tyndere sektioner er ønsket og en indefrysning mikrotom blev brugt til skæring (trin 3.3) på 10-60 µm. Se Video 1.
- Vaske den fladtrykte halvkugle i PB (0.1M, pH 7,4) i 15 min.
- Skær halvkugle på en vibratome.
- Sted halvkugle tangentielt på indehaveren af udskæring. Hvis det ønskes, tryk igen forsigtigt med et glas dias før fastsættelse det i position (f.eks.med superglue).
Bemærk: Minimere mængden af lim brugt, fordi skære artefakter kan medføre på grund af små tykkelsen af fladtrykt halvkugle. - Skær halvkugle fra den tykkere og mere stabil end tyndere slutningen (posteriort for forreste, her) i den krævede tykkelse. Fortsæt til trin 3.4.
Bemærk: Hvis lav fiksering koncentrationer blev brugt, skære det på en langsom hastighed og en høj amplitude.
- Sted halvkugle tangentielt på indehaveren af udskæring. Hvis det ønskes, tryk igen forsigtigt med et glas dias før fastsættelse det i position (f.eks.med superglue).
- Skær halvkugle på en indefrysning mikrotomen.
- Cryoprotect hjernen ved at nedsænke det i en 30% rørsukkeropløsning (PB) indtil det synker.
Bemærk: Afhængigt af størrelsen af det væv, der cryoprotected, synker ned i opløsningen kan variere fra et par timer til et par dage. For større hjerner kan anses for alternative cryoprotection metoder (Se Rosene et al. 16). - Danne en base på indefrysning mikrotomen at montere hjernen is. Konstruere is base ved nedfrysning PB i blok ansigtet indefrysning mikrotomen. Kritisk: Sikre, at overfladen af is base parallelt med mikrotomen blade. For at gøre dette, skæres den tomme is base ved hjælp af mikrotomen klinge præcis justere is base parallel med overfladen, skæring.
- Integrere hjernen i frysning medium og montere det til blok ansigt af mikrotom med området af interesse parallelt med blok ansigt. Ansigt pial overfladen af hjernen mod blok ansigt af mikrotomen. Kritisk: Justere indefrysning temperatur afhængigt af prøvestørrelse; højere temperaturer sikre bedre afsnit integritet samtidig skæring, men større dele kræver lavere temperaturer til at fryse prøve ensartet.
- Skære hjernen tangentielt i den krævede tykkelse (langsommere og ensartet skærehastigheder resultere i bedste afsnit kvalitet).
- Cryoprotect hjernen ved at nedsænke det i en 30% rørsukkeropløsning (PB) indtil det synker.
- Vask sektioner i PB til 15 min på en shaker.
Video 1: skematisk video af tangential skæring fra en rotte mediale entorhinal cortex og layout af moduler, parasubicular og entorhinal. Den mediale entorhinal cortex af en gnaver hjerne er beliggende i den bageste ende af cortex og vippes mod mediale og ventrale side. Tangential sektioner fås ved at orientere en kniv langs denne vinkel. Derfor, passende celletype specifik farvning afslører modulære strukturer i den mediale entorhinal cortex og tilstødende parasubiculum. Video tilpasset fra Ray og Brecht8. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
4. visualisering af kortikale moduler ved hjælp af cytokrom Oxidase farvning
Bemærk: Forskellige farvningsprotokoller har været udviklet til histokemiske påvisning af cytokrom oxidase aktivitet, f.eks., først af Wong-Riley17 og senere ændret ved Divac et al. 18 denne protokol er baseret på ene af Divac et al. 18, da anvendelsen af nikkel-ammonium sulfat (NiAS) resulterer i en højere kontrast og bedre definerede moduler i bejdset kortikale områder.
- Forberede cytokrom oxidase farvning løsning (Se Divac et al. 18). til 10 mL af opløsning, tilføje: 10 mL HEPES buffer (0,1 M, pH 7,4), 400 mg saccharose, 12,5 mg NiAS, 2 mg cytokrom C, 6 mg diaminobenzidine (DAB).
Forsigtig: DAB og NiAS er kræftfremkaldende.
Bemærk: Tilføje DAB lige før inkubation af sektioner. - Vask sektioner i HEPES buffer (0,1 M, pH 7,4) på en shaker i 15 min.
- Inkuber sektioner i Farvningsopløsningen ved stuetemperatur på en shaker.
Bemærk: Observere hastigheden af farvning. Hvis der er ingen synlige reaktion, ændre til inkubation ved 37 ° C. Afhængigt af mængden af fiksering, kan farvning observeres, efter 10 min eller i flere timer. - Reaktionen standses ved tilsætning af 4% PFA; Dette forhindrer uønskede re døende og forøgelse af baggrunden signal.
- Vask afsnittene, tre gange benytter HEPES buffer i 10 min.
- Montere og tørre sektioner på glas dias.
- Dehydrere sektioner med en stigende alkohol-række:
- Vask dias i 60% ethanol i 1 min. Skyl dias i 80% ethanol for 1 min. vask dias i 96% ethanol for 2 min. vask dias i 100% ethanol til 3 min. vask dias i isopropanol for 5 min. vask dias i xylen i 5 min.
- Straks tilføje et hurtig hærdning-montering medium, og tilføje en coverslip. Kritisk: Brug ikke vand-baserede montering medier, som NiAS vil blive vasket ud og forringe farvning.
- Holde sektionerne på 4 ° C for langtidsopbevaring.
5. visualisering af kortikale moduler bruger immunhistokemisk farvning
Bemærk: Flere protokoller er tilgængelige for immunhistokemi, optimeret til modellen og typen af sonden. Tilpasninger kan foretages efter behov, af varierende koncentrationer af antistoffer, permeabilizing agenter og inkuberingstider. Følgende protokol fører til gode resultater til påvisning af en bred vifte af antistoffer og visualisering af fluorescerende sonder.
- Vask sektioner i PBS (0,1 M, pH 7,4) i 15 min.
- Valgfrit: Udføre antigen hentning for at afsløre en epitop, ved hjælp af et vandbad (baseret på Jiao et al. 19; for alternative metoder, se Pileri et al. 20).
- Forvarm et vandbad til 80 ° C. Forberede tri-natrium citrat buffer19 (pH 8,0) og Forvarm det i vandbad til 80 ° C.
- Overføre sektionerne til tri-natrium citratbuffer. Inkuber sektioner i 30 min. ved 80 ° C
- Cool sektioner ned til stuetemperatur
- Vask sektioner i PBS for 15 min.
- Vaske i afsnit to gange i PBS-X (0,5% Triton-X, i 0,1 M PBS) i 15 min.
- Blokere uspecifik epitoper af inkubere sektioner i en opløsning af bovint serumalbumin (BSA, 2,5%) og Triton-X (0,75%) i PBS for 2 h.
- Inkuber sektioner i primære antistof, fxCalbindin - D28k (1:5, 000, 1% BSA i PBS-X), 2-3 dage på en shaker ved 4 ° C.
Bemærk: Optimale fortynding til det primære antistof afhænger af det specifikke antistof anvendes. Se producentens oplysninger at hente fortynding kriterier for et specifikt antistof. Flere antistoffer kan bruges sammen men skal rejses mod forskellige arter. - Vaske i afsnit tre gange i PBS for 15 min.
- Inkuber sektioner overnatning i sekundær antistof (1:200, 1% BSA i PBS) ved 4 ° C på en shaker.
Bemærk: Flere sekundære antistoffer kan anvendes på forskellige spektre, hvis flere primære antistoffer blev brugt. - Vaske den sekundær antistof ved at vaske i afsnit tre gange i PBS i 10 min.
- Montere og tørre sektioner på glas dias til mikroskopi.
Bemærk: Sektionerne skal stadig være fugtig før montering af coverslip. - Anvende montering medium velegnet til fluorescens farvestoffer på afsnittene væv og dækglas.
- Tørre sektioner for 1 h.
- For lang sigt opbevaring, forsegle coverslip bruge neglelak og holde i mørke ved 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi opnåede fladtrykte kortikale sektioner af somatosensoriske cortex i en række forskellige hjerner, og behandlet dem for cytokrom oxidase histokemi at visualisere de somatotopic moduler repræsenterer forskellige kropsdele. Denne komparative fremgangsmåde giver mulighed for at studere de evolutionære styrker denne figur cortex, f.eks., viser meget bevaret repræsentation af mystacial vibrissae i gnavere og hareagtige som Tønder21 (figur 2). I modsætning hertil er Vis andre kropsdele såsom poter og kønsorganer variationer i deres relative størrelse og afspejler specialisering til en økologisk niche eller seksuel selektion22,23.
For at forstå arkitekturen i den mediale entorhinal cortex, opnåede vi sektioner parallel til pial overfladen. Dette blev primært opnået ved tangential skæring af den mediale entorhinal cortex hos mus, rotter og egyptiske flyvende hunde. Hos mennesker fladtrykt på grund af de betydeligt større og mere bølger i entorhinal cortex, vi os forsigtigt cortex efter at gøre en tangential nedskæring af entorhinal cortex. Senere, alle hjerner blev befrugtede og snit på en kryostaten på 60 µm. Immunhistokemi blev udført på de opnåede sektioner med en anti-calbindin antistof, at visualisere calbindin-positive pyramideformet celler moduler i den mediale entorhinal Cortex5 (figur 3). Calbindin-moduler i entorhinal cortex viser en bemærkelsesværdig hyppighed på tværs af alle disse hjerner, og varierer i størrelse med kun en faktor 10 over ~ 20.000 variation i hjernen størrelser5.
Figur 2: topografiske layout af tønde cortex moduler på tværs af pattedyr identificeret af cytokrom oxidase histokemi. Tangential sektioner af lag IV fra somatosensoriske cortex af (A) mus, (B) mongolske ørkenrotte, (C) rotte, (D) degu, (E) hamster, (F) kanin, viser Tønder som en yderst velbevarede somatotopic repræsentation af mystacial vibrissae. Skalere barer = 500 µm. M: mediale, L: Lateral, R: Rostral, C: Caudal; Orientering i A gælder også for B-E. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: periodiske layout af mediale entorhinal cortex moduler på tværs af pattedyr identificeret af calbindin immunoreactivity. Tangential sektioner fra lag II af den mediale entorhinal cortex (A) mus, (B) rotte, (C) egyptiske frugt bat, og (D) menneskelige, viser en bevaret periodiske layout af calbindin-positive pyramideformet celler moduler. Skalere barer = 250 µm. M: mediale, L: Lateral, D: dorsale, V: ventrale, R: Rostral, C: Caudal; Orientering i D gælder også for B, C. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modularitet i hjernebarken er blevet identificeret ved hjælp af en række teknikker. De tidligste studier der typisk kortikale moduler af enten visualisere celle tætte områder, eller fravær af fibre1. Efterfølgende metoder har udnyttet tilstedeværelsen af dendritiske bundter24, afferenter fra en bestemt region25eller berigelse af neurotransmittere26. Her viser vi to teknikker, (i) cytokrom oxidase histokemi og (ii) immunhistokemisk farvning.
Cytokrom oxidase farvning har været en af de mest populære metoder til at visualisere kortikale moduler, og har været meget anvendt i den primære sensoriske cortex27,28. Det visualiserer moduler af farvning mørkere områder af højere mitokondrie-aktivitet17, dermed fungere som en proxy for anatomiske moduler, der fremkalde betydelige funktionelt svar. Denne metode har været brugt til at visualisere somatosensoriske kortikale moduler (figur 2) og cortical moduler i den visuelle cortex27.
En af ulemperne ved traditionelle histokemiske metoder er, at deres typiske visualisering af lysfelt lysmikroskopi begrænser antallet af moduler, som kan visualiseres samtidigt. Immunhistokemiske metoder, i konjugation med fluorescerende visualisering sonder kan dog også udnyttes for at se bestemte proteiner og identificere kortikale moduler. For eksempel, thalamic afferenter til sensoriske cortex projektet i et somatotopic måde. Således, visualisere disse afferenter, ved hjælp af VGluT2 immunoreactivity kan også bruges til at visualisere krop kortene i den primære somatosensoriske cortex, som vi har visualiseret ved hjælp af cytokrom oxidase aktivitet (figur 2). Selektiv proteiner kan også bruges som cellulære markører til at identificere grupper af genetisk definerede celler. Ved hjælp af immunhistokemi, vi identificeret klynger af pyramideformet celler i den mediale entorhinal cortex udtrykker calcium bindende protein, calbindin6 (figur 3) og fast besluttet på at klynger af dette særlige genetisk betinget Gruppen af celler er bevaret på tværs af evolution5, der angiver fælles dataloger grundprincipperne deres funktion. Brug af flere fluorophores, afgrænset vi også supplerende moduler i de mediale entorhinal cortex26, demonstrerer parallelle mikrokredsløb, som ligger til grund for rumlig hukommelse.
Historisk set har hjernen blevet sectioned i et plan vinkelret på sin position i kroppen, i sagittal, koronale eller horisontale retningslinjer. Identifikation af kortikale moduler, som felterne tønde i den somatosensoriske cortex4 bedt også skære langs en tangent og efterfølgende i fladtrykte kortikale præparater29, var isolerede tilfælde af sådanne skæring observeret meget tidligere30,31. Efter identifikation af tønde cortex, var andre kortikale moduler også identificeret i de primære visuelle cortex27, samt tilstedeværelsen af en komplet kroppen kort32 med et somatotopic repræsentation af kroppen i primære somatosensoriske cortex. Fladtrykt sektioner af kat visuelle cortex afslørede også den topografiske organisation af orientering kolonner uden behov for yderligere rekonstruktioner33. Kortikale modularitet er også blevet påvist i parahippocampal cortex, herunder presubiculum og parasubiculum26,34 og mediale entorhinal cortex6. Typisk udfladning en buet objekt inducerer forvridninger i laminar topografi - som kan observeres ved væld af fremskrivninger af den buede jordens overflade på et fladt kort35. Et relativt simpelt metode til delvis kompensation for disse forvridninger er ved at indføre referencepunkter på definerede afstande før samkopiering, og derefter måle afstanden mellem dem efter udfladning. Disse mærker så ikke kun subserve i kvantitativt estimering forvridninger indført af samkopiering, men også give en nem referencepunkt for at justere på hinanden følgende sektioner. Yderligere afgørende aspekter for at bevare laminar troskab omfatter sikring af homogen udfladning på tværs af afsnittet, og endelig skæring præcis tangerer laminar layoutet for at få optimeret laminar kortikale sektioner.
Visualisering af kortikale moduler i fladtrykte tangential sektioner har spillet en vigtig rolle i afslørende fascinerende struktur-funktion relationer i hjernebarken. Knurhår og kroppen dele i den primære somatosensoriske cortex topografisk repræsentation og tilstedeværelsen af en anatomisk gitter i mikrokredsløb generere funktionelle netkvadrater i fladtrykte tangential kortikale sektioner afsløre indviklede mikrokredsløb detaljer, som ville være svært at forstå fra andre retningslinjer. Men vores nuværende teknikker give kun en to-dimensional skive af disse væsentlige tredimensionale moduler. Brug immunofluorescens teknikker og væv clearing metoder36,37, ville det være muligt at visualisere disse kortikale moduler som helhed og måske afsløre yderligere indsigt i vores forståelse af kortikale kort og moduler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at forskningen blev gennemført i mangel af nogen kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Humboldt Universität zu Berlin, Bernstein Center for Computational Neuroscience Berlin, det tyske Center for Neurodegenerative sygdomme (DZNE), den tyske føderale ministerium for uddannelse og forskning (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure og Gottfried Wilhelm Leibniz-prisen af DFG. Vi takker Shimpei Ishiyama for fremragende grafisk design og Juliane Diederichs for fremragende teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps - Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears - 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- Brodmann, K. Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , Barth. (1909).
- Naumann, R. K., et al. The reptilian brain. Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).
- Kaas, J. H. Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).
- Woolsey, T. A., Van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
- Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex. J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).
- Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex. Science. 343 (6173), 891-896 (2014).
- Wong-Riley, M. T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity. Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).
- Ray, S., Brecht, M. Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex. Elife. 5, e13343 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Olson, S. T., Chuang, Y. J. Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases. Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).
- Paraformaldehyde (PFA; 4%). Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- Sodium phosphate (PB). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex. Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).
- Tootell, R. B., Silverman, M. S. Two methods for flat-mounting cortical tissue. J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).
- Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact. J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol. J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
- Krubitzer, L. The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different? Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).
- Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex. J Comp Neurol. , (2017).
- Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W.
- Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex. J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).
- Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex. Front Syst Neurosci. 11, (2017).
- Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).
- Land, P. W., Simons, D. J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex. J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).
- Welker, C., Woolsey, T. A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse. J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).
- Retzius, G. Die Cajal'schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).
- Cajal, S. R. Histologie du Systeme Nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Talleres Grafios. Montana, Madrid. (1911).
- Chapin, J. K., Lin, C. S. Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats. J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).
- Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).
- Tang, Q., et al.
- Snyder, J. P. Map projections--A working manual (Vol. 1395). , US Government Printing Office. (1987).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
