Summary
Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode abgeflachten tangential Abschnitte von Säugetieren Cortex und kortikalen Module mit histochemische und immunhistochemischen Methoden zu visualisieren.
Abstract
Der Kortex Säugetier-Gehirne ist Parcellated in verschiedene Unterkonstruktionen oder Module. Kortikale Module in der Regel liegen parallel zu den kortikalen Blatt und können durch bestimmte histochemische und immunhistochemischen Methoden abgegrenzt werden. In dieser Studie stellen wir eine Methode zu den Kortex von Säugetier-Gehirne zu isolieren und zu glätten, um Abschnitte Parallel zu den kortikalen Blatt zu erhalten. Wir weitere Highlight ausgewählt histochemische und immunhistochemischen Methoden, diese zu verarbeiten abgeflacht tangential Abschnitte um kortikalen Module zu visualisieren. Wir führen im somatosensorischen Cortex von verschiedenen Säugetieren Cytochrom-Oxidase Histochemie um Körper Karten oder kortikale Module aus verschiedenen Teilen des Körpers des Tieres zu offenbaren. In der medialen entorhinalen Kortex, ein Gebiet, wo Rasterzellen generiert werden, nutzen wir immunhistochemischen Methoden um Module von genetisch bedingten Neuronen zu markieren, die auf mehrere Arten in einem Raster in der kortikalen Blatt angeordnet sind. Insgesamt bieten wir ein Rahmen zu isolieren und bereiten Ligawechsel kortikale Abschnitte abgeflacht und kortikalen Module mit histochemische und immunhistochemischen Methoden in einer Vielzahl von Säugetier-Gehirne zu visualisieren.
Introduction
Einige der wichtigsten Änderungen in der Gehirnstruktur über Phylogenie kann in der Großhirnrinde beobachtet werden. Trotz der erheblichen Unterschiede der Hirnrinde von Tieren folgt ein gemeinsames Muster und kann breit geteilt werden auf zwei verschiedene Arten von Schichten und Bereichen1. Kortikale Schichten liegen parallel zur Oberfläche des Gehirns und variieren in der Zahl von 3 Schichten in Reptilien Cortex2 bis 6 Lagen in Säugetieren Cortex1. Kortikalen Areale auf der anderen Seite sind verschiedene Regionen des Cortex, die unterschiedliche Funktionalitäten, z.B.weitgehend entsprechen, somatosensorische Cortex in der Empfindung des Touch oder den visuellen Cortex bei der Verarbeitung von visuellen Eingänge beteiligt ist. Diese kortikalen Bereiche können oft in Patches oder Module3, unterteilt werden, die regelmäßig zu, anatomische Strukturen, die im wesentlichen parallel zur pial Oberfläche des Gehirns gefunden wiederholen. Kortikale Module können auf einem bestimmten Layer4beschränkt oder erstrecken sich über mehrere Ebenen5.
Strukturierendes Standardmethoden des Gehirns umfassen Abschnitte des Gehirns, wie koronale oder sagittale senkrecht zur Fläche. Während diese Methoden verwendet werden können, kortikale Module zu visualisieren, kann eine Vielzahl von interessanten Features aufgedeckt werden, wenn die kortikalen Module in einer Ebene parallel zur Oberfläche des Gehirns tangential, visualisiert werden. Zum Beispiel somatosensorischen Module im Nagetier Gehirn repräsentieren Schnurrhaare, erscheinen als Fässer als normal auf die Gehirn-Oberfläche visualisiert, und somit die Regionen ableiten den Name Fass Kortex. Jedoch auf die Fässer in einer tangentialen Ausrichtung zu visualisieren, offenbaren sie eine Whisker-Karte, mit den Fässern in einer topographischen Ausrichtung spiegeln das genaue Layout der Schnurrhaare auf die äußere Körperoberfläche angelegt. In bestimmten Fällen modulare Anordnung hat sogar entkommen Erkennung für einen erheblichen Zeitraum, wenn in gewissem Sinne nicht tangential visualisiert. Die mediale entorhinalen Kortex ist bekannt für das Vorhandensein der Gitterzellen, Neuronen, die in einem regelmäßigen hexagonalen Muster zu feuern, wenn ein Tier eine Umgebung durchlaufen ist. Obwohl es eine stark untersuchten Gegend bis vor kurzem, das Vorhandensein von Patches oder Module von Zellen in der medialen entorhinalen Kortex ist, die physisch in einem hexagonalen Muster6angelegt sind geflohen Erkennung. Das Vorhandensein und die Anordnung dieser Module in der Rattengehirn wurde durch tangentiale Abschnitte des medialen entorhinalen Kortex und untersucht die Cytoarchitecture in gewissem Sinne Schichtweiser erleichtert.
Im Anschluss an die schneiden, kann der besondere Aspekt der Visualisierung der kortikalen Module auch auf vielfache Weise realisiert werden. Klassisch, haben Studien Module basierend auf Zelle Dichte oder Faser Layout1abgegrenzt. Ein weiterer beliebter Ansatz ist die Verwendung von Cytochrom-Oxidase Histochemie, die Bereiche der höheren Aktivität8enthüllt. Neuere Ansätze beinhalten Blick auf genetisch bedingte Zelltypen unterschieden auf der Basis ihrer Protein Ausdruck Profile6,8.
In dieser Studie beleuchten wir Methoden zum Isolieren der Hirnrinde von Säugetier-Gehirne, abgeflachte tangential Abschnitte erhalten und kortikalen Module basierend auf Cytochrom-Oxidase Histochemie und Immunhistochemie Zelltyp spezifische Proteine zu visualisieren.
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Protocol
Alle experimentelle Verfahren wurden nach den deutschen Richtlinien im Bereich des Tierschutzes unter der Aufsicht der lokalen Ethik-Kommissionen (LaGeSo) durchgeführt. Mensch und Fledermaus Gehirn Daten stammen aus Naumann Et Al. 5 die folgende Prozedur erfolgt auf einer männlichen Erwachsenen Wistar Ratte (Stamm: RJHan:WI).
(1) Perfusion und Gehirn Extraktion
Hinweis: Um eine homogen fest und frei von Blut Gehirn zu erhalten, ist Transcardial Perfusion des Tieres dringend empfohlen, da verbleibende Blut unspezifische Hintergrundsignal während der Färbung erhöht. Dennoch ist es auch möglich, abgeflachten Abschnitte von UN-perfundierten Exemplar erhalten und färben sie. Die einfache Handhabung der Probekörpers hängt von der Konzentration des Fixiermittels verwendet. Zu wenig Fixierung erhöht das Risiko der Umgang mit Schädigung des Gehirns beim abflachen und schneiden, während zu hohe Konzentration die Flexibilität zum Abflachen und die Färbung Signalqualität zu senken.
- Transcardially Durchspülen des Tieres mit einer 23G-Nadel. Eine ausführlichere Anleitung finden Sie unter Gage Et al. 9
- Verwenden Sie Phosphat Puffer Kochsalzlösung10 (PBS 0,02 M; pH 7,4) zu spülen, Blut aus dem Gehirn und den Körper des Tieres. Fortgesetzt, bis die Infusion Flüssigkeit klar, mit mindestens 150 mL PBS wird über das Gefäßsystem infundiert wird angezeigt.
Hinweis: Die besten Ergebnisse werden erzielt bei einem Druck ähnlich wie das Spektrum der physiologischen Blutdruck des Tieres durchblutet wird (z.B., Ratte: 120-130 MmHg). Optional fügen Sie Heparin (10 U/mL hinzu), die Lösung für Blut Koagulation11zu vermeiden. - Um das Gehirn zu beheben, die Transcardially mindestens 100 mL Paraformaldehyd12 Infusion (PFA, 4 %, in 0,1 M Phosphat-Puffer (PB)13) bis der Hals des Tieres steif ist.
Achtung: PFA ist ein potential Karzinogen.
Hinweis: Für histochemische Färbung, wie z. B. Cytochrom-Oxidase Aktivität besten Ergebnisse werden erzielt, wenn 2 % PFA. Für andere Färbung, wie z. B. Immunohistochemistry, 4 % PFA wird bevorzugt.
- Verwenden Sie Phosphat Puffer Kochsalzlösung10 (PBS 0,02 M; pH 7,4) zu spülen, Blut aus dem Gehirn und den Körper des Tieres. Fortgesetzt, bis die Infusion Flüssigkeit klar, mit mindestens 150 mL PBS wird über das Gefäßsystem infundiert wird angezeigt.
- Extrahieren Sie das Gehirn aus dem Schädel.
Hinweis: Siehe Gage Et al. 9 für Details.- Isolieren Sie den Kopf mit großen Scheren oder Knochen Scheren.
- Mit einer feinen Schere, schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie von Hals, Nase. Auseinanderziehen der Haut um den Schädel zu entlarven. Entfernen Sie Hals und zeitlichen Muskeln mit feiner Schere.
- Machen Sie eine Mittellinie durch den interparietal Knochen ab das Foramen Magnum bis zu den Parietal Knochen geschnitten.
- Verwenden Sie Rongeurs, um die interparietal Knochen abziehen. Schieben Sie feine Schere entlang der sagittale Naht und schneiden Sie vom hinteren Ende der parietalen am vorderen Ende der Stirnbeine.
- Verwenden Sie Rongeurs, um der parietalen und Stirnbeine abziehen. Alternativ, heben Sie die Knochen entfernt mit Pinzette. Verwenden Sie einen Löffel zu schneiden ventralen Nervenstränge und das Gehirn zu entfernen. Das Gehirn auf PB (0,1 M, pH 7,4) übertragen.
- UN-perfundierten Gehirne zu beheben, durch Eintauchen in 4 % PFA für 1-3 h bei 4 ° C (abhängig von der Größe des Gehirns und Sonde: Zähmung: ~ 1 h, Human: ~ 3 h).
Hinweis: Für große und Gyrencephalic Gehirne wie die Menschen isolieren und den Bereich von Interesse, Fixierzeit zu reduzieren. - Um größeren kortikalen Bereiche in einem Abschnitt zu erhalten, glätten Sie das Gehirn vor weiteren Post-Fixierung; fahren Sie mit Schritt 2 fort. Jedoch um Teile der schwerer zugänglichen Bereichen wie den medialen entorhinalen Kortex zu erhalten, nach dem Beheben des Gehirns bei 4 % PFA für 24 h bevor Sie mit Schritt 2 fortfahren.
2. Präparation und Abflachung des Gehirns
- Trennen Sie die Gehirnhälften mithilfe einer Rasierklinge (Lissencephalic Köpfe) oder Skalpell (Gyrencephalic Köpfe).
Hinweis: Wenn das Gehirn nach dem nicht feststeht, ist es anfällig für Beschädigungen durch Handhabung. - Optionaler Schritt für die Unterstützung der nachfolgende Abschnitt Registrierung und Schrumpfung Schätzung:
- Punktion den Kortex auf einer Fläche von nicht-Interesse, mit einer 35G-Nadel senkrecht zur kortikalen Fläche. Wiederholen Sie Schritt zwei Mal in definierten Abständen entlang der kortikalen Blatt. Um den Abstand entlang der kortikalen Blatt zu bestimmen, verwenden Sie einen vorgeschnittenen Thread auf eine feste Länge (z.B. 5 mm) und legen Sie es entlang der kortikalen Oberfläche Punkte der Punktion zu bestimmen.
- Lissencephalic Gehirne: subkortikale Strukturen mithilfe einer sezierenden Spachtel entfernen. Kritisch: Halten Sie das Gehirn feucht mit PB (0,1 M, pH 7,4) während des gesamten Verfahrens.
- Halten Sie das Gehirn durch das Kleinhirn und sanft legen Sie den Spatel um eine Dissektion Flugzeug im Corpus Callosum zu öffnen. Die Runde Spitze des Spachtel darauf von der Hirnrinde.
- Schieben Sie die Spachtel weiter und ziehen Sie, bis die Spachtel zwischen dem Thalamus und Kortex ist. Separate subkortikalen Strukturen mit Kratzen Bewegungen.
- Überprüfen der Hemisphäre für gleichmäßige Dicke.
Hinweis: Alle unebenen Regionen könnte ein Trans-Schicht Gefälle während Schnitt führen. Verwenden Sie für tangentiale schneiden ein Skalpell, um einen sauberen Schnitt durch das Gehirn parallel zur pial Oberfläche der Region machen aus dem tangentialen Abschnitte gewünscht werden. - Optionale Schritte zur Abflachung Qualitätsverbesserung:
- Machen Sie einen sauberen Schnitt durch das Striatum, Nucleus Accumbens und orbitofrontalen Kortex, da sie die Dicke der Rinde in der lateralen Region erhöhen. Fügen Sie außerdem einen Linderung Schnitt an der Basis des inneren Bereich des präfrontalen Kortex, der ermöglicht die Entfaltung des medialen Teile des Cortex.
- Legen Sie die Hemisphäre (Kortex nach unten) auf einen Objektträger. Fahren Sie mit Schritt 2.6.
- Gyrencephalic Gehirne: Entfernen der weißen Substanz Windungen zu entfalten (ausführliche Protokolle finden Sie unter: Sincich Et Al. 14; Tootell und Silverman (15). Kritisch: Verwendung PB (0,1 M; pH 7,4), das Gehirn feucht zu jeder Zeit zu halten.
- Ein feuchtes Filterpapier in einer großen Petrischale, setzen Sie den gewünschten Bereich mit dem Kortex nach oben auf.
- Entfernen Sie die Arachnoidea Membran und Pia mit zwei Pinzetten.
- Verwenden Sie einen feuchten Wattestäbchen und einführen Sie vorsichtig, in jeder Sulcus, Verwachsungen zwischen den Windungen zu lösen.
- Umdrehen Sie das Gehirn mit einem anderen feuchten Filterpapier.
- Verwenden Sie zwei gebogene Mikro Spachtel um zu einzelnen Windungen zu entfalten. Verwenden Sie die konvexe Seite der Spatel, um der weißen Substanz auseinander zu necken, bis hin zu nahe an das konkave Ende der Gyrus. Verwenden Sie einen feuchten Wattestäbchen und fahren Sie mit wirbelnden Bewegungen, konkave Ende der Gyrus zu erreichen.
- Neben einzelnen Windungen zu necken. Falls erforderlich, fügen Sie kleine Entlastung schneidet, wenn die Spannung zu hoch ist.
- Glätten Sie entfaltete Gehirn in der Petrischale oder einen ähnlichen Behälter.
- Optional legen Sie größere Gehirne auf einem Filterpapier bedeckt Schwamm, um sicherzustellen, dass die Regionen nicht austrocknen.
- Legen Sie zwei gerollte Stücke von Ton auf beiden Seiten. Kritisch: Wie die Dicke des Tons legt fest, wieviel die Hemisphäre abgewickelt werden kann, sicherstellen, dass der Ton 10-20 ist % dünner als die UN-abgeflachte Kortex.
- Drücken Sie vorsichtig eine zweiten Glas Folie/kleine Petrischale auf der Rinde, bis die Hemisphäre komplett flach ist. Um die besten Ergebnisse für eine gewünschte Region zu erhalten, legen Sie die Glas-Folie zuerst auf den entsprechenden Bereich. Um die besten Ergebnisse für Lissencephalic Gehirne zu erhalten, legen Sie den Objektträger tangential an den seitlichen Teil zuerst und konzentrierten Druck auf diese Region.
- Setzen Sie eine Gewicht (z.B. einem keramischen Uhrglas) auf der Glas-Folien/Petrischale und Glätten der Hemisphäre für 3-5 h bei 4 ° C in PB.
- Lassen Sie für Post-Fixierung den Druck und entfernen Sie die Glasplatten zu. Aufsetzen der abgeflachten Halbkugel in PFA (frei schwebend) für 24 h einen Shaker bei 4 ° C.
Hinweis: Beste Ergebnisse für histochemische Aktivität Keramikschalen werden erzielt, wenn 1 % mit PFA. Für andere Färbungen, wie z. B. Immunohistochemistry, für UN-perfundierten Gehirne, 2 % PFA verwendet werden kann.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Workflows für Abflachung der eine Ratte kortikalen Hemisphäre und Visualisierung von Modulen im somatosensorischen Kortex. Im Anschluss an die Transcardial Durchblutung des Gehirns einer Maus wurde seziert (A). Subkortikale Strukturen wurden entfernt und Kortex wurde zwischen zwei Glasplatten in Phosphatpuffer (B) dem Erdboden gleichgemacht. Abgeflachte Halbkugel (C) war nach dem fest, tangential geschnitten und gebeizt für Cytochrom-Oxidase-Aktivität (D). Skalieren von Balken = 1 cm. R: Rostral, C: am L: seitlich, M: Medial. Abbildung von Lauer Et Al. angepasst 23 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
3. Schneiden Tangential Abschnitte
Hinweis: Je nach den Anforderungen der Färbung Protokolle können der Schneidvorgang und Dicke angepasst werden. Ein Vibratome wurde verwendet, um den Hemisphären für histochemische Weiterverarbeitung (Schritt 3.2) auf 80-150 µm geschnitten. Jedoch für immunhistochemische Verarbeitung dünnere Sektionen sind erwünscht und ein Einfrieren Mikrotom diente für Stationspunkte (Schritt 3.3) bei 10-60 µm. Sehen Sie Video 1.
- Waschen Sie die abgeflachte Halbkugel in PB (0.1M; pH 7,4) für 15 Minuten.
- Geschnitten Sie die Hemisphäre auf eine Vibratome.
- Ort der Hemisphäre tangential auf dem slicing Halter. Drücken Sie gegebenenfalls noch einmal vorsichtig mit einem Objektträger vor der Befestigung in Position (z.B., mit Sekundenkleber).
Hinweis: Minimieren Sie die Kleber verwendet, da aufgrund der geringen Dicke der abgeflachten Halbkugeln schneiden Artefakten führen können. - Geschnitten Sie die Halbkugel aus dicker und stabiler Ende am Ende dünner (posterior, anterior, hier) an die gewünschte Dicke. Fahren Sie mit Schritt 3.4.
Hinweis: Wenn geringe Fixierung Konzentrationen verwendet wurden, schneiden Sie es mit einer langsamen Geschwindigkeit und eine hohe Amplitude.
- Ort der Hemisphäre tangential auf dem slicing Halter. Drücken Sie gegebenenfalls noch einmal vorsichtig mit einem Objektträger vor der Befestigung in Position (z.B., mit Sekundenkleber).
- Schneiden Sie die Hemisphäre auf ein Einfrieren Mikrotom.
- Cryoprotect sinkt das Gehirn durch Eintauchen in eine 30 % Saccharoselösung (in PB) bis es.
Hinweis: Abhängig von der Größe des Gewebes wird Cryoprotected Untergang in der Lösung von ein paar Stunden bis wenige Tage reichen. Für größere Gehirne alternative Cryoprotection Methoden angesehen werden könnten (siehe Rosene Et Al. ( 16). - Bilden Sie eine Eis auf der eisigen Mikrotom, das Gehirn zu montieren. Konstruieren Sie das Eis Basis durch Einfrieren PB auf dem Block Gesicht des eiskalten Mikrotom. Kritisch: Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des Eis-Basis parallel zu dem Mikrotom Klinge. Um dies zu tun, schneiden Sie das leere Eis Basis mit dem Mikrotom-Messer, die Eis-Basis parallel zu der Schnittfläche exakt auszurichten.
- Betten Sie des Gehirns im eiskalten Medium ein und montieren Sie ihn auf das Gesicht der Block des Mikrotom mit einer Fläche von Interesse, die parallel zu den Block-Gesicht. Gesicht der pial Oberfläche des Gehirns auf die Block-Gesicht der Mikrotom. Kritisch: Passen Sie die Gefriertemperatur je nach Probengröße; höhere Temperaturen besser Abschnitt Integrität sicherzustellen, beim Schneiden, aber größere Abschnitte erfordern niedrigere Temperaturen zum Beispiel gleichmäßig einfrieren.
- Schneiden Sie das Gehirn tangential auf die gewünschte Dicke (langsamer und einheitliche Schnittgeschwindigkeiten führen beste Schnittqualität).
- Cryoprotect sinkt das Gehirn durch Eintauchen in eine 30 % Saccharoselösung (in PB) bis es.
- Waschen Sie die Abschnitte in PB für 15 min auf einem Boston-Shaker.
Video 1: Schematische Video von tangential-Schnitt von einer Ratte mediale entorhinalen Kortex und Anordnung der Module Parasubicular und entorhinalen. Die mediale entorhinalen Kortex des Gehirns, Nagetier befindet sich am hinteren Ende des Kortex und in Richtung der medialen und ventralen Seite gekippt ist. Tangentiale Abschnitte erhält man durch ein Messer entlang dieser Winkel ausrichten. Folglich zeigt die entsprechenden Zelltyp-spezifische Färbung modulare Strukturen im medialen entorhinalen Kortex und angrenzenden Parasubiculum. Video von Ray und Brecht8angepasst. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
(4) Visualisierung der kortikalen Module mit Cytochrom-Oxidase Färbung
Hinweis: Unterschiedliche Färbung Protokolle entwickelt für histochemische Nachweis der Cytochrom-Oxidase Aktivität, z. B.zuerst von Wong-Riley17 und wurden später geändert durch Divac Et al. 18 dieses Protokoll basiert auf der von Divac Et al. 18, da die Verwendung von Nickel-Ammoniumsulfat (NiAS) in einen höheren Kontrast und besser definierte Module in gefärbten kortikalen Areale führt.
- Vorbereiten der Cytochrom-Oxidase Färbelösung (siehe Divac Et Al. 18). für 10 mL der Lösung hinzufügen: 10 mL HEPES-Puffer (0,1 M, pH 7,4), 400 mg Saccharose, 12,5 mg NiAS, 2 mg Cytochrom C, 6 mg Diaminobenzidine (DAB).
Achtung: DAB und NiAS sind krebserregend.
Hinweis: Fügen Sie DAB kurz vor der Inkubation der Abschnitte. - Waschen Sie die Abschnitte in HEPES-Puffer (0,1 M, pH 7,4) auf einen Shaker für 15 Minuten.
- Inkubieren Sie die Abschnitte in der Färbelösung bei Raumtemperatur auf einem Boston-Shaker.
Hinweis: Beachten Sie die Geschwindigkeit der Färbung. Wenn es keine sichtbare Reaktion, ändern Sie in Inkubation bei 37 ° C. Abhängig von der Menge der Fixierung kann Färbung nach 10 Minuten oder mehrere Stunden beobachtet werden. - Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 4 % PFA; Dies verhindert, dass unerwünschte wieder sterben und Erhöhung der Hintergrundsignal.
- Waschen Sie die Abschnitten drei Mal mit HEPES-Puffer für 10 Minuten.
- Montieren Sie und trocknen Sie die Abschnitte auf Objektträgern.
- Entwässern Sie in den Abschnitten mit einer zunehmenden Alkohol-Zeile:
- Waschen Sie Folien in 60 % Ethanol für 1 min. Waschen die Folien in 80 % Ethanol, für 1 min. Waschen die Folien in 96 % igem Ethanol für 2 min. Waschen die Folien in 100 % igem Ethanol für 3 min. Waschen Sie die Folien in Isopropanol für 5 min. die Objektträger in Xylol für 5 min waschen.
- Sofort eine schnelle Aushärtung-Eindeckmittel und hinzufügen ein Deckglas. Kritisch: Verwenden Sie nicht Montage wässrige Medien, wie NiAS ausgewaschen werden wird und die Färbung beeinträchtigen.
- Halten Sie die Abschnitte bei 4 ° C für langfristige Lagerung.
(5) Visualisierung der kortikalen Module mit immunhistochemischen Färbung
Hinweis: Mehrere Protokolle stehen für Immunohistochemistry, optimiert für die Probe und die Art der Sonde. Anpassungen können je nach Bedarf von unterschiedlichen Konzentrationen von Antikörpern, permeabilizing Agenten und Inkubationszeiten. Das folgende Protokoll führt zu guten Ergebnissen für die Erkennung einer Vielzahl von Antikörpern und Visualisierung durch fluoreszierende Sonden.
- Waschen Sie die Abschnitte mit PBS-Puffer (0,1 M, pH 7,4) für 15 Minuten.
- Optional: Führen Sie Antigen-Retrieval um ein Epitop über einem Wasserbad (basierend auf Jiao Et Al. zu entlarven 19; für alternative Methoden siehe Pileri Et al. ( 20).
- Ein Wasserbad auf 80 ° c vorheizen Tri-Natrium-Citrat Puffer19 (pH 8,0) vorbereiten und im Wasserbad auf 80 ° c vorheizen
- Übertragen Sie die Abschnitte auf Tri-Natrium-Citrat-Puffer. Inkubieren Sie die Abschnitte für 30 min bei 80 ° C
- Die Abschnitte auf Zimmertemperatur abkühlen
- Waschen Sie die Abschnitte mit PBS-Puffer für 15 Minuten.
- Waschen Sie die Abschnitten zwei Mal in PBS-X (0,5 % Triton-X, in 0,1 M PBS) für 15 Minuten.
- Unspezifische Epitope durch die Abschnitte in einer Lösung von Rinderserumalbumin (BSA; 2,5 %) und Triton-X (0,75 %) mit PBS-Puffer für 2 h Inkubation zu blockieren.
- Inkubieren Sie die Abschnitte in Primärantikörper, z.B.Calbindin - D28k (1:5 000, 1 % BSA in PBS-X), für 2-3 Tage auf einem Schüttler bei 4 ° C.
Hinweis: Optimale Verdünnung für den primären Antikörper richtet sich nach den spezifischen Antikörper verwendet. Beziehen sich auf Herstellerangaben Verdünnung Kriterien für einen spezifischen Antikörper zu erhalten. Mehrere Antikörper können zusammen verwendet werden aber gegen verschiedene Arten angehoben werden. - Waschen Sie die Abschnitte dreimal mit PBS-Puffer für 15 Minuten.
- Inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht in Sekundärantikörper (1: 200, 1 % BSA mit PBS-Puffer) bei 4 ° C in einen Shaker geben.
Hinweis: Mehrere sekundäre Antikörper können bei verschiedenen Spektren verwendet werden, wenn mehrere primäre Antikörper verwendet wurden. - Der sekundäre Antikörper durch Waschen in den Abschnitten dreimal mit PBS-Puffer für jeweils 10 min. abwaschen.
- Montieren Sie und trocknen Sie die Abschnitte auf einem Objektträger für die Mikroskopie.
Hinweis: Die Abschnitte sollte noch vor der Montage das Deckglas feucht sein. - Gelten Sie Eindeckmedium geeignet für Fluoreszenz-Farbstoffen auf die Gewebeschnitte und einem Deckgläschen.
- Trocknen Sie die Abschnitte für 1 h.
- Für langfristige Lagerung versiegeln Sie des Deckglases mit Nagellack und halten Sie im Dunkeln bei 4 ° C.
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Representative Results
Wir erhalten abgeflachten kortikale Abschnitte des somatosensorischen Kortex in einer Vielzahl von Gehirn und verarbeitet sie für Histochemie Cytochrom-Oxidase, die Somatotopic-Module für verschiedene Körperteile zu visualisieren. Diese vergleichende Ansatz ermöglicht es, studieren die evolutionären Kräfte dieser Form Kortex, z.B.hoch konservierte Darstellung der Mystacial Tasthaare in Nagetieren und Lagomorpha als Fässer21 (Abbildung 2) zeigt. Im Gegensatz dazu zeigen andere Körperteile wie Pfoten und Genitalien Variationen in ihrer relativen Größe und reflektieren die Spezialisierung auf eine ökologische Nische oder sexuelle Selektion22,23.
Um zu verstehen, die Architektur des medialen entorhinalen Kortex, erhielten wir Abschnitte Parallel zur pial Oberfläche. Dies gelang vor allem durch tangentiale Schneiden des medialen entorhinalen Kortex bei Mäusen, Ratten und ägyptischen Flughunde. Beim Menschen wegen der erheblich größeren Größe und mehr Wellenbewegungen im entorhinalen Kortex, abgeflacht wir sanft den Kortex im Anschluss an eine tangentiale Schnitt des entorhinalen Kortex. Anschließend wurden alle Gehirne kryokonserviert und geschnitten auf einem Kryostaten bei 60 µm. Immunohistochemistry erfolgte auf die erhaltenen Abschnitte mit einem Anti-Calbindin-Antikörper, die Calbindin-Positive pyramidale Zell-Module in der medialen entorhinalen visualisieren Kortex5 (Abbildung 3). Die Calbindin-Module im entorhinalen Kortex zeigen eine bemerkenswerte Periodizität über diese Gehirne und variieren in der Größe von nur einem Faktor 10 über ~ 20.000-fache Variation im Gehirn Größen5.
Abbildung 2: topographische Layout der Barrel Cortex Module über Säugetiere identifiziert durch Cytochrom-Oxidase Histochemie. Tangentiale Abschnitte der Schicht IV von somatosensorischen Cortex (A) Maus, Mongolische Wüstenrennmaus (B), (C) Ratte, Degu (D), (E) Hamster, Kaninchen (F), zeigt Barriques als hoch konservierte somatotopic Darstellung der Mystacial Tasthaare. Skalieren von Balken = 500 µm. M: L: Lateral, Medial, R: Rostral, C: am; Orientierung in A gilt auch für die B-E. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: regelmäßige Anordnung der medialen entorhinalen Kortex Module über Säugetiere von Calbindin Immunoreactivity identifiziert. Tangentiale Abschnitte von Schicht II des medialen entorhinalen Kortex (A) Maus, Ratte (B), (C) Nilflughunde und (D) menschliche, zeigt eine konservierte periodische Anordnung der Calbindin-Positive pyramidale Zell-Module. Skalieren von Balken = 250 µm. M: L: Lateral, D: Dorsal, V: Ventral, R: Rostral, Medial, C: am; Orientierung in D gilt auch für B, C. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Modularität in der Großhirnrinde ist mit einer Vielzahl von Techniken identifiziert worden. Die frühesten Studien in der Regel identifiziert kortikalen Module durch die beiden Visualisierung Zelle dichten Regionen oder fehlender Fasern1. Nachfolgende Methoden haben die Anwesenheit von dendritischen Bündel24, Afferenzen aus einer bestimmten Region25oder Anreicherung von Neurotransmittern26genutzt. Hier zeigen wir zwei Techniken, (i) Cytochrom-Oxidase Histochemie und (Ii) immunhistochemische Färbung.
Cytochrom-Oxidase Färbung wurde eine der beliebtesten Methoden, kortikale Module zu visualisieren, und ist weit verbreitet in der primären sensorischen Cortex27,28. Es visualisiert Module durch Färbung dunkler für Bereiche des höheren mitochondriale Aktivität17, dabei fungiert als Proxy für anatomische Module, die erhebliche funktionelle Reaktionen hervorrufen. Diese Methode wurde zur somatosensorischen kortikalen (Abbildung 2) und kortikalen Module in der Sehrinde27visualisieren.
Einer der Nachteile der traditionellen histochemische Techniken ist, dass ihre typische Visualisierung von Hellfeld Lichtmikroskopie begrenzt die Anzahl der Module, die gleichzeitig visualisiert werden können. Immunhistochemische Methoden in Konjugation mit fluoreszierenden Visualisierung Sonden können jedoch auch genutzt werden, um bestimmte Proteine und kortikalen Module zu identifizieren. Zum Beispiel Thalamische Afferenzen zum sensorischen Cortex-Projekt in einer Somatotopic Weise. So visualisieren diese Afferenzen, mit VGluT2 Immunoreactivity kann auch verwendet werden, die Körper-Karten im primären somatosensorischen Cortex zu visualisieren, die wir visualisiert haben mit Cytochrom-Oxidase-Aktivität (Abbildung 2). Selektive Proteine auch als zellulärer Marker lässt sich um Gruppen von genetisch definierten Zellen zu identifizieren. Mit Immunohistochemistry, wir identifiziert Gruppen von Pyramidenzellen im medialen entorhinalen Kortex mit dem Ausdruck der Kalzium-Bindeprotein, Calbindin6 (Abbildung 3) und festgestellt, dass die Cluster von diesem bestimmten genetisch determiniert Gruppe von Zellen werden geschont, über Evolution5, gemeinsame batteriegestützte Grundsätze ihrer Funktion angibt. Verwenden mehrere Fluorophore, abgegrenzt wir auch ergänzende Module in der medialen entorhinalen Kortex26, demonstrieren parallele Mikroschaltungen die räumliche Gedächtnis zugrunde liegen.
Historisch gesehen, hat das Gehirn in einer Ebene senkrecht zur seine Position im Körper, sagittal, koronal oder horizontalen Ausrichtungen geschnitten worden. Die Identifizierung der kortikalen Module, wie die Fass-Felder im somatosensorischen Cortex4 aufgefordert auch Schnitt entlang einer tangentialen und anschließend in abgeflachten kortikalen Vorbereitungen29, obwohl vereinzelt Fälle von solchen Schnitt waren viel früher30,31beobachtet. Nach der Identifizierung des Fasses Kortex wurden andere kortikale Module auch in der primären Sehrinde27sowie das Vorhandensein einer kompletten Karosserie Karte32 mit eine Somatotopic Darstellung des Körpers in der PV erkannt. somatosensorischen Cortex. Abgeflachten Abschnitte des visuellen Kortex Katze zeigte auch die topographische Organisation der Orientierung Spalten ohne die Notwendigkeit für zusätzliche Rekonstruktionen33. Kortikale Modularität wurde auch in Parahippocampal Rinde, einschließlich der Presubiculum und Parasubiculum26,34 und medialen entorhinalen Kortex6nachgewiesen. Abflachung in der Regel eine gekrümmte Objekt induziert Verzerrungen im laminaren Topographie - wie durch die Vielzahl der Prognosen über die gekrümmte Erdoberfläche auf eine flache Karte35beobachtet werden können. Eine relativ simple Methode, um teilweise ausgeglichen werden diese Verzerrungen ist durch die Einführung der Referenzpunkte in definierten Abständen vor Abflachung, und dann Messen des Abstands zwischen ihnen nach dem abflachen. Diese Marken dann nicht nur bei der Abschätzung der quantitativ Verzerrungen, die durch Abflachung dienstbar, sondern bieten auch einen einfache Bezugspunkt zu aufeinander folgenden Abschnitte ausrichten. Weitere wesentliche Aspekte für die Erhaltung der laminaren Treue umfassen die Gewährleistung homogene Abflachung über den Abschnitt und schließlich Schnitt genau tangential zu den laminaren Layout zu erhalten laminar kortikalen Bereiche optimiert.
Die Visualisierung der kortikalen Module in abgeflachten tangential Abschnitten spielte eine wichtige Rolle bei der Aufdeckung faszinierende Struktur-Funktions-Beziehungen in der Großhirnrinde. Die topographische Darstellung von Whisker und Körperteilen im primären somatosensorischen Cortex und das Vorhandensein eines anatomischen Netzes in der Erzeugung von funktionellen Rasterzellen in abgeflachten tangential kortikale Abschnitte Mikroschaltungen offenbaren komplizierte Mikroschaltungen Angaben, die schwer zu begreifen, von anderen Orientierungen sein würde. Unsere aktuellen Techniken bieten jedoch nur eine zweidimensionale Scheibe dieser im wesentlichen dreidimensionale Module. Mit Immunfluoreszenz-Techniken und Gewebe clearing Methoden36,37, würde es möglich sein, diese kortikalen Module als Ganzes zu visualisieren und vielleicht zeigen weitere Einblicke in unser Verständnis von kortikalen Karten und Module.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass die Forschung in der Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen geführt wurde, die als ein potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Bernstein Center for Computational Neuroscience Berlin, Humboldt Universität Zu Berlin, des Deutschen Zentrums für Neurodegenerative Erkrankungen (DZNE), das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF, Förderkennzeichen unterstützt. 01GQ1001A), NeuroCure, und der Gottfried Wilhelm Leibniz-Preis der deutschen Forschungsgemeinschaft. Wir danken Shimpei Ishiyama für hervorragende Grafik-Design und Juliane Diederichs für ausgezeichnete technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps - Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears - 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
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