Summary
이 문서는 포유류 외피가에서 평평된 접선 섹션을 가져오고 피 질 조직화 학적인 사용 모듈과 immunohistochemical 방법을 시각화 하는 상세한 방법론을 설명 합니다.
Abstract
포유류 두뇌의 대뇌 피 질은 별개 콘텐츠의 또는 모듈에 parcellated. 대뇌 피 질의 모듈 일반적으로 대뇌 피 질의 시트에 평행이 고 특정 immunohistochemical 조직화 학적인 방법에 의해 구분 된 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 대뇌 피 질의 시트 섹션 병렬을 얻기 위해 그들을 평평 하 게 포유류 두뇌에서 피 질을 분리 하는 방법을 강조 표시 합니다. 우리 더 강조 조직화 학적인 선택 하 고 이러한 처리 immunohistochemical 방법 평평 대뇌 피 질의 모듈을 시각화 하기 위해 접선 섹션. 다양 한 포유류의 somatosensory 피 질에 우리 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry 몸 지도 나 동물의 신체의 다른 부분을 대표 하는 대뇌 피 질의 모듈을 수행 합니다. 중간 entorhinal 외피, 그리드 셀 생성 되는 지역에서에서 우리 immunohistochemical 메서드를 여러 종에 걸쳐 대뇌 피 질의 시트에 그리드 패턴에서 배열 되는 유전자 결정된 뉴런의 모듈을 강조 표시 사용 합니다. 전반적으로, 프레임 워크를 분리 하 고 layer-wise 준비 대뇌 피 질의 섹션, 평평 하 고 대뇌 피 질의 모듈 사용 하 여 조직화 학적인 방법과 immunohistochemical 포유류 두뇌의 다양 한 시각화 제공 합니다.
Introduction
일부 계통에서 뇌 구조에서 가장 중요 한 변화는 대뇌 피 질에서 관찰할 수 있습니다. 중요 한 차이도 불구 하 고 동물의 피 질 일반적인 패턴 및 분할 될 수 있다 광범위 하 게 두 가지 방법으로 레이어 및 지역1. 대뇌 피 질의 레이어 두뇌의 표면에 평행이 고 파충류 외피가2 에 3 층에서 포유류 외피가16 레이어 숫자에서 다. 대뇌 피 질의 영역 다른 한편으로 주로 해당 고유 기능, 예를 들면하는 외피의 별개 영역, somatosensory 피 터치의 시각적 입력 처리에 시각 피 질 감각에 참여. 이러한 대뇌 피 질의 영역 수 종종 수 세분화 패치 또는 모듈3, 정기적으로 해 부 구조, 근본적으로 뇌의 pial 표면에 평행 하 게 반복 하는. 대뇌 피 질의 모듈 특정 레이어4에 갇혀 있을 수 있습니다 또는 여러 레이어5에서 확장.
두뇌의 표준 단면 방법 코로나 또는 화살 처럼 두뇌의 표면에 수직 섹션을 포함 한다. 대뇌 피 질의 모듈을 시각화 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다, 하는 동안 대뇌 피 질의 모듈은 두뇌의 표면에 평행한 평면에 접선, 시각 때 다양 한 흥미로운 기능 계시 될 수 있습니다. 예를 들어, 수염, 대표 설치류 두뇌 somatosensory 모듈 배럴 때 뇌 표면에 정상적인 시각으로 나타나고 따라서 지역 파생 이름 신 피 질. 그러나, 접선 방향에서 배럴, 머릿속에 외부 몸 표면에 수염의 정확한 레이아웃을 미러링 지형 방향에 배치 되 고 배럴을 가진 수염-지도, 공개 그들은. 경우에 따라, 모듈 배열도 탈출 상당한 기간에 대 한 감지 비 접선 방식으로 시각화 하는 경우. 중간 entorhinal 외피, 표 셀, 동물 환경이 이동 될 때 일반 육각 패턴에 발생 하는 신경 세포의 존재에 대 한 알려져 있다. 비록 그것은 무 겁 게 조사 지역, 최근, 패치의 존재 또는 중간 entorhinal 외피에 있는 세포의 모듈까지,이 실제로 6 각형 패턴6, 레이아웃 탐지를 탈출 했다. 존재와 쥐 뇌에서 이러한 모듈의 중간 entorhinal 외피의 접선 섹션을 만들고 layer-wise 방식으로 cytoarchitecture를 조사에 의해 촉진 되었다.
단면, 후 대뇌 피 질의 모듈의 시각화의 특정 측면도 여러 가지 방법으로 실현 될 수 있습니다. 고전적인, 연구 모듈 세포 밀도 또는 섬유 레이아웃1에 따라 구분 된 있다. 또 다른 인기 있는 방법은 높은 활동8의 영역을 계시 한다 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry의 사용 이다. 새로운 접근 유전자 결정된 세포 유형, 그들의 단백질 식 프로필6,8기준으로 구별을 보고 포함 한다.
이 연구에서 우리는 하 포유류 두뇌에서 외피 분리 평평된 접선 섹션, 대뇌 피 질의 모듈 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry 및 세포 형 특정 단백질의 immunohistochemistry 기반 시각화 방법을 강조 표시 합니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 로컬 윤리 위원회 (LaGeSo)의 감독 하에 동물 복지에 독일 지침에 따라 수행 했다. 인간 박쥐 뇌 데이터 노이만 외 에서 파생 했다 5 다음 절차는 성인 남성 Wistar 쥐에 수행 (스트레인: RJHan:WI).
1. 관류 및 뇌 추출
참고: homogenously 고정 하 고 혈액-무료 두뇌를 얻기 위해 동물의 transcardial 관류는 매우 권장 하 고, 잔여 혈액 얼룩 동안 불특정 배경 신호를 증가. 그럼에도 불구 하 고, 유엔 perfused 견본에서 평평된 섹션을 가져오고 얼룩 수 이기도 합니다. 시료 처리의 편리한 사용 정착 액의 농도 따라 다릅니다. 너무 작은 고정 병합 및 절단, 너무 높은 농도 병합에 대 한 유연성과 착 색 신호의 품질 낮은 하는 동안 하는 동안 두뇌에 손상을 처리의 위험을 증가 시킵니다.
- Transcardially perfuse는 동물 23 G 바늘을 사용 하 여. 더 자세한 안내 참조 게이지 외. 9
- 인산 염 버퍼 식 염 수10 (PBS, 0.02 M, pH 7.4) 동물의 몸과 뇌에서 피를 사용 하 여. 주입 액체 명확, 적어도 150 mL PBS 혈관 시스템을 통해 주입 되 고 표시 될 때까지 계속 합니다.
참고: 최상의 결과 얻으려면 끼얹는다 되 동물의 생리 적인 혈압의 범위와 유사한 압력에 달성 된다 (예를들면, 쥐: 120-130 mmHg). 필요에 따라 솔루션을 피하기 위해 혈액 응고11헤 파 린 (10 U/mL)를 추가 합니다. - 뇌를 해결 하려면 transcardially 최소 100 mL paraformaldehyde12 달 이다 (PFA, 4%; 0.1 M 인산 버퍼 (PB)13) 동물의 목은 뻣 뻣 한 때까지.
주의: PFA는 잠재적인 발암 물질 이다.
참고: 얼룩, 같은 시 토 크롬 산화 효소 조직화 학적인 활동에 대 한 가장 좋은 결과 달성, 2%를 사용 하는 경우 PFA. 다른 얼룩, immunohistochemistry, 등 4 %PFA 것이 좋습니다.
- 인산 염 버퍼 식 염 수10 (PBS, 0.02 M, pH 7.4) 동물의 몸과 뇌에서 피를 사용 하 여. 주입 액체 명확, 적어도 150 mL PBS 혈관 시스템을 통해 주입 되 고 표시 될 때까지 계속 합니다.
- 두개골에서 뇌를 추출 합니다.
참고: 게이지 외. 자세한 내용은 9 .- 머리 큰가 위 또는 뼈가 위를 사용 하 여 격리 합니다.
- 좋은 위를 사용 하 여 코 목에서 중간에 따라 피부를 잘라. 두개골을 노출 피부 떨어져 당겨. 목과 일시적인 근육 좋은 위를 사용 하 여 제거 합니다.
- 정수 리 뼈까지 구멍 매그넘에서 출발 interparietal 뼈 통해 잘라 중간을 확인 합니다.
- 벗기다 interparietal 뼈 Rongeurs를 사용 합니다. 화살 봉합을 따라 잘가 위를 정면 뼈의 앞쪽 끝에는 정수 리의 후부 끝에서 잘라.
- Rongeurs를 사용 하 여 정수 리와 정면 뼈 껍질. 또는, 멀리 집게를 사용 하 여 뼈를 들어 올립니다. 숟가락을 사용 하 여 복 부 신경 코드를 잘라내어 뇌를 제거. PB (0.1 m M, pH 7.4)에 뇌를 전송.
- 4%에 침수에 의해 유엔 perfused 두뇌 수정 4 ° C에서 1-3 h PFA (두뇌 크기 및 프로브에 따라: 말괄량이: ~ 1 h, 인간: ~ 3 h).
: 참고 대형 및 gyrencephalic 두뇌 인간 같이, 분리 하 고 고정 시간을 줄이기 위해 관심 영역 밖으로 잘라. - 섹션에 더 큰 피 질 영역을 얻기 위해 병합 더 후 고정; 이전 뇌 2 단계로 진행 합니다. 그러나, 부분의 중간 entorhinal 외피 같은 영역에 도달 더를, 후 4%에서 뇌 수정 PFA 2 단계를 진행 하기 전에 24 h에 대 한.
2. 뇌의 해 부와 병합
- 면도날 (lissencephalic 두뇌) 또는 메스 (gyrencephalic 두뇌)를 사용 하 여 두뇌 반구를 분리 합니다.
참고: 경우에 뇌 후 고정 되지이 처리에 의해 손상 될입니다. - 후속 섹션 등록 및 수축 추정을 방 조에 대 한 선택적 단계:
- 비-관심의 영역에서 피 질 대뇌 피 질의 표면에 정상 35 G 바늘으로 찔린 합니다. 대뇌 피 질의 시트 따라 정의 된 거리에서 두 번 단계를 반복 합니다. 대뇌 피 질의 시트 따라 거리를 결정 하려면 미리 잘라 스레드를 사용 하 여 고정된 길이 (예를 들어, 5 m m)에 하 고 펑크의 포인트를 결정 하는 대뇌 피 질의 표면에 따라 하다.
- Lissencephalic 두뇌: subcortical 구조 해 주걱을 사용 하 여 제거. 중요: 모든 절차에 걸쳐 PB (0.1 m M, pH 7.4)와 습 한 뇌를 유지.
- 소 뇌에 의해 뇌를 누른 부드럽게 신체 callosum에서 해 부 비행기 여 주걱을 삽입 합니다. 라운드 팁 주걱의 피 질에서 가리켜야 합니다.
- 추가 주걱을 주걱 시상과 피 질 사이 때까지 부드럽게 당겨. 별도 동작을 긁어와 subcortical 구조입니다.
- 반구도 두께 대 한 검사 합니다.
참고: 모든 고르지 못한 영역이 단면 중 트랜스 레이어 그라데이션에 발생할 수 있습니다. 접선 단면 메스는 뇌를 통해 접선 섹션은 원하는 지역의 pial 표면에 평행 하 게 깨끗 한 컷을 만들기 위해 사용 합니다. - 병합 품질 향상을 위한 선택적 단계를 수행:
- 그들은 측면에 피 층의 두께 증가 이후가, 핵 accumbens, orbitofrontal 외피를 통해 깨끗 한 컷을 확인 합니다. 또한, 외피의 중간 부분에의 전개를 수 있는 전 두 엽 피 질의 내부 지역에 구호 컷을 추가 합니다.
- 유리 슬라이드에 반구 (피 질 아래로)를 놓습니다. 2.6 단계로 진행 합니다.
- Gyrencephalic 두뇌: gyri 펼쳐 백색 질 제거 (자세한 프로토콜에 대 한 참조: Sincich 외. 14; Tootell 및 실버15)입니다. 중요: 사용 PB (0.1 m M, pH 7.4) 촉촉한 유지 하는 두뇌에서 모든 시간
- 관심 영역을 향하도록 피와 큰 페 트리 접시에 젖은 필터 종이 입었다.
- 거미 집 모양의 막과 두 개의 집게를 사용 하 여 pia를 제거 합니다.
- 젖은 면봉을 사용 하 고 gyri 사이의 유착을 분리 하려면 각 고 랑에 부드럽게 삽입.
- 다른 젖은 필터 종이 사용 하 여 두뇌를 돌아서.
- 2 개의 곡선된 마이크로 주걱을 사용 하 여 단일 gyri 전개. 이랑의 오목 끝 가까이 도달까지 떨어져 백색 질을 애타게 하는 주걱의 볼록한 쪽을 사용 합니다. 젖은 면봉을 사용 하 고는 이랑의 오목 끝에 도달 소용돌이 움직임 진행.
- 떨어져 단일 gyri 애타게. 필요한 경우 작은 구호 상처 긴장 너무 높은 경우 추가 합니다.
- 페 트리 접시 또는 이와 유사한 용기에서 펼친된 두뇌 평평.
- 필요에 따라 지역 밖으로 건조 하지 않습니다 보장 하기 위해 적용 하는 필터 종이 스폰지에 더 큰 두뇌를 배치 합니다.
- 양쪽에 찰 흙의 2 개의 연된 조각을 놓으십시오. 중요: 흙의 두께 정의 얼마나 많은 북반구를 결합 수, 점토 10-20% 인지 확인 취소 병합 된 피 질 보다 얇은.
- 북반구는 완전히 평평 때까지 부드럽게 피 질에 두 번째 유리 슬라이드/작은 페 트리 접시 누릅니다. 원하는 지역에 대 한 최상의 결과 얻으려면 해당 지역에 유리 슬라이드를 먼저 놓습니다. Lissencephalic 두뇌에 대 한 최상의 결과 얻으려면, 유리 슬라이드 tangentially 측면 부분에 먼저 놓고이 지역에 집중 된 압력을 적용 합니다.
- 유리 슬라이드/페 트리 접시 (예, 세라믹 시계 유리) 무게를 넣어 샌드위치에 4 ° C에서 3-5 h에 대 한 반구를 평평 하 게.
- 후 고정을 위한 압력을 해제 하 고 유리 슬라이드를 제거 합니다. 4 ° c.에 통에 24 h 평평된 반구 PFA (무료 부동)에 넣어
참고: 조직화 학적인 활동 stainings에 대 한 최상의 결과 달성 1%를 사용 하는 경우 PFA. Immunohistochemistry, 유엔 perfused 두뇌, 2 %PFA 사용할 수 등 다른 stainings에 대 한.
그림 1: 쥐 대뇌 반구 및 시각화 somatosensory 피 질에 모듈의 병합에 대 한 워크플로의 도식 대표. 쥐의 뇌 해 부 transcardial 관류 후 (A). 바꾸어 구조 제거 하 고 피 질 인산 버퍼 (B)에서 두 개의 유리 슬라이드 사이 평평 했다. 병합 된 반구 (C) 후 고정, 접선 sectioned, 고 시 토 크롬 산화 효소 활동 (D)에 대 한 스테인드. 스케일 바 = 1 cm. r: Rostral, c: 꼬리, l: 측면, m: 중간. 라우 어 외. 에서 적응 하는 그림 23 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
3. 절단 접선 섹션
참고: 얼룩 프로토콜의 요구에 따라 절단 절차 및 두께 적용할 수 있습니다. Vibratome는 80-150 µ m에서 더 조직화 학적인 처리 (3.2 단계) 반구를 잘라 사용 되었다. 그러나, immunohistochemical 처리, 얇은 단면도 원하는 및 냉동 톰 단계에 대 한 단면 (3.3) 10-60 µ m에 사용 되었다. 동영상 1을참조 하십시오.
- 샌드위치에 평평된 반구를 세척 (0.1M, pH 7.4) 15 분.
- vibratome에 있는 반구를 잘라.
- 접선 조각화 홀더는 반구를 놓습니다. 필요에 따라 다시 눌러 부드럽게 위치 (예를 들어, superglue 함께) 그것을 고정 하기 전에 유리 슬라이드와 함께.
참고: 절단 아티팩트 평평된 반구의 작은 간격으로 발생할 수 있기 때문에 사용 하는 접착제의 양을 최소화 합니다. - 필요한 두께에 얇은 끝 (앞쪽, 하 후부 여기) 두꺼운 하 고 더 안정적인 끝에서 반구를 잘라. 3.4 단계로 진행 합니다.
참고: 고정은 낮은 농도 사용 하는 경우 그것을 잘라 느린 속도 높은 진폭에서.
- 접선 조각화 홀더는 반구를 놓습니다. 필요에 따라 다시 눌러 부드럽게 위치 (예를 들어, superglue 함께) 그것을 고정 하기 전에 유리 슬라이드와 함께.
- 냉동 톰에 반구를 잘라.
- Cryoprotect 때까지 (PB)에 30% 자당 해결책에 그것을 immersing 하 여 두뇌 싱크.
참고: 조직 되 고 cryoprotected의 크기에 따라 솔루션에 싱킹 범위는 몇 시간에서 몇 일입니다. 큰 머리에 대 한 대체 cryoprotection 방법 간주 될 수 있습니다 (참조 Rosene 외. 16)입니다. - 기본 탑재 두뇌 동결 톰에 얼음을 형성 합니다. PB 동결 톰의 블록 얼굴에 결빙으로 기본 얼음을 생성 합니다. 중요: 얼음 기지의 표면 톰 블레이드 병렬 인지 확인 합니다. 이 위해 정확 하 게 절단 표면에 평행 하 게 얼음 베이스에 맞게 톰 블레이드를 사용 하 여 기본 빈 얼음 잘라.
- 중간에 두뇌를 포함 하 고 평행 블록 얼굴을 관심 영역으로는 톰의 블록 얼굴에 그것을 마운트. 얼굴은 톰의 블록 얼굴 쪽으로 두뇌의 pial 표면. 중요: 샘플 크기;에 따라 동결 온도 조정 높은 온도 단면, 하는 동안 더 나은 섹션 무결성을 보장 하지만 큰 섹션 필요 낮은 온도 균일 하 게 샘플을 동결.
- (느리고 균일 한 절삭 속도 섹션 최상의 결과) 필요한 두께에서 접선 뇌를 잘라.
- Cryoprotect 때까지 (PB)에 30% 자당 해결책에 그것을 immersing 하 여 두뇌 싱크.
- 세척 통에 15 분 동안 샌드위치에 섹션.
비디오 1: 쥐 중간 entorhinal 외피 및 parasubicular 및 entorhinal 모듈의 레이아웃에서 접선 단면 구조 동영상. 설치류 두뇌의 중간 entorhinal 외피 외피의 뒤 끝에 위치 하 고 중간과 복 부 측으로 기울어져 있다. 접선 섹션이이 각도 따라 칼 동쪽으로 향하게 하 여 얻을 수 있습니다. 따라서, 적절 한 세포 유형 특정 얼룩 중간 entorhinal 외피와 인접 한 parasubiculum에서 모듈형 구조를 계시 한다. 비디오 레이 브레히트8에서 적응. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
4. 시 토 크롬 산화 효소 얼룩을 사용 하 여 대뇌 피 질의 모듈의 시각화
참고: 다른 얼룩 프로토콜 웡 라일리17 에 의해 먼저 예를 들면, 시 토 크롬 산화 효소 활동의 조직화 학적인 탐지에 대 한 개발 되었고 나중 수정 Divac 외. 18 이 프로토콜 기반 Divac 외. 여 하나 18, 니켈 염화 황산 염 (니 아 스)를 사용 하 여 이후 높은 명암과 얼룩진된 피 질 영역에서 잘 정의 된 모듈에 발생합니다.
- 시 토 크롬 산화 효소 솔루션 얼룩을 준비 (참조 Divac 외. 18). 솔루션의 10 ml, 추가: 10 mL HEPES 버퍼 (0.1 m M, pH 7.4), 400 mg 자당, 12.5 mg 니 아 스, 2 mg 시 토 크롬 C, 6 mg diaminobenzidine (한 덩어리).
주의: DAB 및 니 아 스는 발암 성입니다.
참고: 섹션의 부 화 직전 한 덩어리를 추가 합니다. - 15 분 동안 통에 HEPES 버퍼 (0.1 m M, pH 7.4)에 섹션을 씻어.
- 통에 실 온에서 착 솔루션에서 섹션을 품 어.
참고:는 얼룩의 속도 관찰 합니다. 보이는 반응이 있는 경우에, 37 ° c.에 외피로 변경 정착의 양에 따라 얼룩이 지 관찰할 수 있습니다 또는 10 분 후 몇 시간에. - 4%를 추가 하 여 반응을 중지 PFA; 이렇게 하면 원하지 않는 다시 죽어가 고 배경 신호 증가.
- 섹션 3 시간 10 분 동안 HEPES 버퍼를 사용 하 여 씻는 다.
- 탑재 하 고 유리 슬라이드에 섹션을 건조.
- 탈수는 증가 알콜 행 섹션:
- 워시 1 분 세척에 대 한 60% 에탄올에 슬라이드 슬라이드 80% 에탄올에 1 분 2 분 3 분 5 분 5 분 크 실 렌에 슬라이드를 씻어 한 소 프로 파 놀에 슬라이드 세척 한 100% 에탄올에 슬라이드 세척 한 96% 에탄올에 슬라이드 세척에 대 한.
- 즉시 빠른 경화 설치 매체를 추가 하 고는 coverslip 추가. 중요: 사용 하지 마십시오 물 기반 설치 매체, 니 아 스 밖으로 세척 될 것 이다 하 고 저하는 얼룩.
- 장기 저장을 위한 4 ° C에서 섹션을 유지.
5. 대뇌 피 질의 모듈 Immunohistochemical 얼룩을 사용 하 여 시각화
참고: 여러 개의 프로토콜 immunohistochemistry, 표본 및 조사 유형의 최적화에 대 한 사용할 수 있습니다. 적응을 만들 수 있습니다 필요에 따라, 항 체, permeabilizing 에이전트 및 보육 시간 다양 한 농도 의해. 다음 프로토콜 형광 프로브에 의해 항 체 및 시각화의 넓은 범위를 검색 하 여 좋은 결과 이끌어 낸다.
- 15 분 동안 PBS (0.1 m M, pH 7.4)에 섹션을 씻어.
- 선택 사항: 정체 (Jiao 외 에 따라 물 목욕을 사용 하는 epitope를 항 원 복구 수행 19; 대체 참조 하십시오 Pileri 외. 20)입니다.
- 80 ° c 물 목욕을 예 열 트라이-나트륨 시트르산 버퍼19 (pH 8.0)를 준비 하 고 80 ° c 물 목욕에 예 열
- 트라이-나트륨 시트르산 버퍼 섹션을 전송 합니다. 80 ° C에서 30 분에 대 한 섹션을 품 어
- 차가운 실내 온도 아래로 섹션
- 15 분에 대 한 PBS에 섹션을 씻어.
- PBS-X에 두 번 섹션을 세척 (0.5 %0.1 M PBS에 트리톤-X) 15 분.
- 잠복기 2 h에 대 한 소 혈 청 알 부 민 (BSA; 2.5%)과 트리톤-X (0.75%) PBS에 솔루션에서 섹션으로 불특정 epitopes를 차단 합니다.
- 1 차적인 항 체, 예를 들어, Calbindin-D28k에에서 섹션을 품 어 (1:5, 000, PBS-X에 1 %BSA), 4 ° c.에 셰이 커에 2-3 일
참고: 기본 항 체에 대 한 최적의 희석 사용 하는 특정 항 체에 따라 달라 집니다. 특정 항 체에 대 한 희석 기준을 제조 업체의 정보를 참조 하십시오. 여러 항 체 함께 사용 될 수 있다 그러나 다른 종에 대 한 발생 합니다. - 15 분에 대 한 PBS에 세 번 섹션을 씻어.
- 통에 4 ° C에서 이차 항 체 (1: 200, PBS에서 1 %BSA)에서 하룻밤 섹션을 품 어.
참고: 여러 2 차 항 체 여러 기본 항 체 사용 되 면 다른 스펙트럼에서 사용할 수 있습니다. - 10 분에 대 한 PBS에 세 번 섹션을 세척 하 여 이차 항 체를 씻어.
- 탑재를 건조 한 유리에 대 한 섹션입니다.
참고: 섹션 여전히는 coverslip 장착 전에 촉촉한 이어야 한다. - 조직 섹션에 형광 염료에 대 한 적합 한 설치 매체를 적용 하 고는 coverslip 적용.
- 1 시간에 대 한 섹션을 건조.
- 장기 저장용 coverslip 매니큐어를 사용 하 여 밀봉 하 고 4 ° c.에 어둠 속에서 계속
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Representative Results
우리 somatosensory 피 다양 한 두뇌, 대뇌 피 질의 평평된 섹션을 획득 하 고 그들을 다른 신체 부위를 나타내는 somatotopic 모듈을 시각화 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry에 대 한 처리. 이 비교 방법을 공부 진화 세력 그 모양 피 질, 예를 들어, 설치류 그리고 토끼목 배럴21 (그림 2)로 mystacial 털의 높은 보존된 표현을 보여주는 수 있습니다. 반면, 발, 성 기 등 다른 신체 부위 표시에 그들의 친척 크기 변화와 생태 틈새 또는 성적 선택22,23전문화를 반영.
중간 entorhinal 외피의 아키텍처를 이해 하려면 우리는 섹션 pial 표면에 평행 하 게 획득 이 주로 쥐, 쥐, 및 이집트 과일 박쥐에 중간 entorhinal 외피의 접선 단면에 의해 달성 되었다. 인간에서는, 상당히 큰 크기와 entorhinal 외피에서 더 많은 파동 때문에 우리가 부드럽게 결합 entorhinal 외피의 접선 컷 만들기 후 피 질. 그 후, 모든 두뇌 cryopreserved 되었고 60 cryostat에 구분 µ m. Immunohistochemistry 중간 entorhinal calbindin 양성 피라미드 셀 모듈을 시각화 하는 안티-calbindin 항 체로 얻은 섹션에서 수행 피 질5 (그림 3). Entorhinal 외피에 있는 calbindin 모듈 이러한 모든 두뇌에서 놀라운 주기를 표시 하 고 다양 한 크기에 걸쳐 10만 배 ~ 뇌에 20,000-fold 변이5크기.
그림 2: 포유류 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry에 의해 식별에 걸쳐 총 신 피 질 모듈의 지형 레이아웃. 레이어 4 (A) 마우스, (B) 몽골 햄스터, 쥐 (C), (D) degu, (E) 햄스터, (F) 토끼 somatosensory 피 질에서 매우 보존된 somatotopic로 배럴을 보여주는의 접선 섹션 mystacial 털의 표현입니다. 스케일 바 = 500 µ m. m: 중간, l: 측면, r: Rostral, c: 꼬리; A에서 방향 B.에도 적용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: calbindin immunoreactivity에 의해 식별 하는 포유류에 걸쳐 중간 entorhinal 외피 모듈의 정기적인 레이아웃. (A) 마우스, 쥐 (B), (C) 이집트 과일 박쥐, 및 (D) calbindin-긍정적인 피라미드 셀 모듈의 보존된 정기적인 레이아웃을 보여주는 인간 중간 entorhinal 외피의 층 II에서에서 접선 섹션입니다. 스케일 바 = 250 µ m. m: 중간, l: 측면, d: 지, v: 복 부, r: Rostral, c: 꼬리; 방향 d에서 B, C.에도 적용 됩니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
대뇌 피 질에서 모듈화는 다양 한 기법을 사용 하 여 확인 되었습니다. 어느 시각화 하 여 초기 연구는 일반적으로 식별 대뇌 피 질의 모듈 세포 밀도 영역 또는 섬유1의 부재. 후속 메서드 수지상 번들24, 특정 지역25, afferents의 존재 또는 신경 전달 물질26의 농축 활용 했습니다. 여기 두 가지 방법, (i) 시 토 크롬 산화 효소 histochemistry 및 (ii) immunohistochemical 얼룩이 보여 줍니다.
시 토 크롬 산화 효소 얼룩 그리고 대뇌 피 질의 모듈을 시각화 하는 가장 인기 있는 방법 중 하나 되었습니다 기본 감각 외피가27,28에 널리 사용 되 고 있다. 그것은 더 높은 미토 콘 드리 아 활동17, 그로 인하여 상당한 기능 응답을 유도 하는 해 부 모듈에 대 한 프록시 역할 영역에 대 한 어두운 얼룩으로 모듈을 시각화. 이 방법은 somatosensory 대뇌 피 질의 모듈 (그림 2)와 대뇌 피 질의 시각 령27모듈을 시각화 하기 위해 사용 되었습니다.
전통적인 조직화 학적인 방법의 단점 중 하나는 밝은 필드 가벼운 현미경 검사 법에 의해 그들의 전형적인 시각화 동시에 구상 될 수 있는 모듈의 수를 제한입니다. 그러나, 형광 시각화 프로브 활용에 immunohistochemical 방법, 특정 단백질을 확인 하 고 피 질 모듈을 식별 하도 활용할 수 있습니다. 예를 들어, 감각 외피가에 thalamic afferents somatotopic 방식으로 프로젝트. 따라서, 머릿속이 afferents, VGluT2 immunoreactivity를 사용 하 여 사용할 수 있습니다 우리 시각을 기본 somatosensory 피 질에 몸 지도 시각화를 사용 하 여 시 토 크롬 산화 효소 활동 (그림 2). 선택적 단백질 유전자 정의 된 셀의 그룹을 식별 하기 위해 세포 표식으로 사용할 수 있습니다. 우리 중간 entorhinal 외피 표현 칼슘 의무적인 단백질, calbindin6 (그림 3) 피라미드 세포의 클러스터를 식별 immunohistochemistry를 사용 하 고 클러스터의이 특정 유전자 결정 결정 셀 그룹 진화5, 그들의 기능을 기본 일반적인 마이크로 회로 원리를 나타내는 통해 보존 됩니다. 여러 fluorophores에 사용 하 여, 우리 또한 구분 된 중간 entorhinal 외피26, 보완 모듈 공간 메모리 기반이 병렬 칩을 보여주는.
역사적으로, 두뇌 화살, 코로나, 또는 수평 방향에서 본문에 그 위치에 수직 평면에서 구분 되어 있다. Somatosensory 피4 배럴 필드 같은 대뇌 피 질의 모듈의 식별도 메시지가 평평된 대뇌 피 질의 준비29, 후와 따라는 접선 단면 단면 같은 경우 비록 많은 이전30,31관찰. 배럴 피 식별 후 다른 대뇌 피 질의 모듈 또한에서 시체의 somatotopic 표현으로 완전 한 몸 지도32 의 존재로 서 1 차 시각 영역이27에서 확인 되었다 somatosensory 피 질입니다. 고양이 시각 피 질의 평평된 섹션도 추가 개조33에 대 한 필요 없이 방향 열 지형 조직을 밝혔다. 대뇌 피 질의 모듈화 또한 parahippocampal 외피가, presubiculum 및 parasubiculum26,34 중간 entorhinal 외피6등에서 입증 되었습니다. 평면 지도35곡선된 지구 표면의 계획의 무리에 의해 관찰 될 수 있다로 층 류 지형-왜곡 유도 일반적으로 곡선된 개체를 병합 합니다. 병합, 및 다음 병합 후 그들 사이 거리를 측정 하기 전에 정의 된 거리에 기준점을 도입 하 여 부분적으로 이러한 왜곡에 대 한 보상 하는 비교적 단순한 방법이입니다. 이 표 다음 양적 왜곡, 병합에 의해 도입 된 추정에 보조 하다 뿐만 아니라 또한 연속 섹션에 맞게 쉽게 기준점을 제공. 추가 층 류 충실도 보존 하기를 위한 중요 한 측면 섹션을 통해 동종 병합 보장 포함 하 고 마지막으로 정확 하 게 얻기 위해 층 류 레이아웃 접선 단면 최적화 층 류 피 질 부분.
평평된 접선 섹션에서 대뇌 피 질의 모듈의 시각화는 대뇌 피 질에서 매혹적인 구조-기능 관계를 드러내는에서 중요 한 부분을 담당해 왔습니다. 기본 somatosensory 피 질에 수염 및 신체 부의 지형 표현과 평평된 접선 대뇌 피 질의 섹션에 생성 하는 기능 그리드 셀 칩에 해 부 눈금의 존재 복잡 한 칩 공개 세부 정보는 다른 방향에서 이해 하기 어려울 것 이다. 그러나, 우리의 현재 기술만이 본질적으로 3 차원 모듈의 2 차원 조각을 제공합니다. 면역 형광 검사 기술과 조직 삭제 방법36,37을 사용 하 여, 그것은 전체적으로 대뇌 피 질의 모듈을 시각화 하 고 아마도 대뇌 피 질의 지도 및 모듈에 대 한 우리의 이해에 추가 공개 가능한 것.
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Disclosures
저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 신경 퇴행 성 질병 (DZNE), 독일 연방 교육부 (BMBF, Förderkennzeichen 연구에 대 한 훔볼트 대학 촉 산 베를린, 계산 신경 과학 베를린의 번스타인 센터, 독일 센터에 의해 지원 되었다 01GQ1001A), NeuroCure, 그리고 고트프리트 빌헬름 라이프니츠 DFG의 상. 우리 Shimpei 이시야마 우수한 그래픽 디자인 및 우수한 기술 지원 Juliane Diederichs 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps - Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears - 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- Brodmann, K. Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , Barth. (1909).
- Naumann, R. K., et al. The reptilian brain. Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).
- Kaas, J. H. Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).
- Woolsey, T. A., Van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
- Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex. J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).
- Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex. Science. 343 (6173), 891-896 (2014).
- Wong-Riley, M. T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity. Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).
- Ray, S., Brecht, M. Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex. Elife. 5, e13343 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Olson, S. T., Chuang, Y. J. Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases. Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).
- Paraformaldehyde (PFA; 4%). Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- Sodium phosphate (PB). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex. Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).
- Tootell, R. B., Silverman, M. S. Two methods for flat-mounting cortical tissue. J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).
- Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact. J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol. J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
- Krubitzer, L. The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different? Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).
- Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex. J Comp Neurol. , (2017).
- Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W.
- Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex. J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).
- Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex. Front Syst Neurosci. 11, (2017).
- Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).
- Land, P. W., Simons, D. J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex. J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).
- Welker, C., Woolsey, T. A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse. J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).
- Retzius, G. Die Cajal'schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).
- Cajal, S. R. Histologie du Systeme Nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Talleres Grafios. Montana, Madrid. (1911).
- Chapin, J. K., Lin, C. S. Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats. J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).
- Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).
- Tang, Q., et al.
- Snyder, J. P. Map projections--A working manual (Vol. 1395). , US Government Printing Office. (1987).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
