Summary
Denna artikel beskriver en detaljerad metod för att erhålla tillplattade tangentiella snitt från däggdjur cortices och visualisera kortikala moduler med histochemical och immunohistokemiska metoder.
Abstract
Cortex i däggdjurs hjärnor är parcellated in i distinkta underordnade strukturer eller moduler. Kortikala moduler vanligtvis lieparallell till kortikala blad och kan avgränsas av vissa histochemical och immunohistokemiska metoder. I denna studie belyser vi en metod för att isolera cortex från däggdjurs hjärnor och platta till dem för att få avsnitt parallell till kortikala blad. Vi ytterligare höjdpunkt utvalda histochemical och immunohistokemiska metoder att bearbeta dessa tillplattade tangentiella sektioner för att visualisera kortikala moduler. I somatosensoriska cortex av olika däggdjur utför vi cytokrom oxidas histokemi avslöja kropp kartor eller kortikal moduler som representerar olika delar av kroppen av djuret. I mediala entorhinal cortex, ett område där rutnätsceller genereras, använder vi immunohistokemiska metoder för att markera moduler av genetiskt betingade nervceller som är ordnade i ett rutnät-mönster i bladet kortikala över flera arter. Sammantaget ger vi en ram för att isolera och förbereda layer-wise tillplattad kortikala sektioner och visualisera kortikala moduler med histochemical och immunohistokemiska metoder i en mängd olika däggdjurs hjärnor.
Introduction
Några av de mest betydande förändringarna i hjärnans struktur över fylogeni kan observeras i hjärnbarken. Trots betydande skillnader, cortex av djur följer ett gemensamt mönster och kan delas på två olika sätt, genom lager och områden1. Kortikala skikt ligga parallellt med ytan av hjärnan och varierar i antal från 3 lager i reptils cortices2 till 6 lager i däggdjur cortices1. Kortikala områden är däremot distinkta områden av hjärnbarken som till stor del motsvarar distinkta funktioner, t.ex., somatosensoriska cortex är involverat i känslan av beröring eller syncentrum i bearbetning visuella ingångar. Dessa kortikala områden kan ofta delas in i fläckar eller moduler3, som regelbundet återkommande anatomiska strukturer, i huvudsak hittade parallell till pial ytan av hjärnan. Kortikala moduler kan begränsas till en viss lager4, eller sträcker sig över flera lager5.
Snittningen standardmetoder i hjärnan innebär sektioner normala till ytan av hjärnan, som koronalt eller sagittal. Medan dessa metoder kan användas för att visualisera kortikala moduler, kan en mängd intressanta funktioner avslöjas när modulerna kortikala visualiseras tangentiellt, i ett plan parallellt med ytan av hjärnan. Exempelvis somatosensoriska moduler i gnagare hjärnan som representerar morrhår, visas som fat när visualiseras normalt att hjärnan ytan, och därmed regionerna härleda namnet fat cortex. Dock på visualisera fat i en tangentiell riktning, avslöjar de en morrhår-karta, med tunnorna placeras i en topografisk orientering spegling exakta layouten på morrhåren på yttre kroppsytan. I vissa fall moduluppställning även har undgått upptäckt för betydande perioder, när visualiseras på ett icke-tangentiella sätt. Den mediala entorhinal cortexen, är känd för förekomsten av rutnätsceller, nervceller som eld i ett regelbundet hexagonala mönster när ett djur korsar en miljö. Även om det är ett tungt undersökta område, tills nyligen, förekomsten av fläckar eller moduler av celler i mediala entorhinal cortex, hade som fysiskt är lagda i ett hexagonalt mönster6, undgått upptäckt. Närvaro och arrangemang av dessa moduler, i råtthjärna, underlättades av att göra tangentiella sektioner av mediala entorhinal cortex och utreda cytoarchitecture på ett sätt som konstruktionsdata.
Efter snittning, kan den särskilda aspekten av visualisering av kortikala moduler också realiseras på flera sätt. Studier har klassiskt, avgränsad moduler baserade på cell densiteten eller fiber layout1. En annan populär metod är användningen av cytokrom oxidas histokemi, som avslöjar områden av högre aktivitet8. Nyare metoder inkluderar tittar på genetiskt bestämd celltyper, distingerad på grundval av deras protein uttryck profiler6,8.
I denna studie belyser vi metoder för att isolera cortex från däggdjurs hjärnor, få tillplattade tangentiella snitt och visualisera kortikala moduler baserade på cytokrom oxidas histokemi och immunohistokemi av celltyp specifika proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella rutiner utfördes enligt tyska riktlinjer om djurskydd under överinseende av lokala etiska kommittéer (LaGeSo). Mänskliga och bat hjärnan data härleddes från Naumann o.a. 5 följande procedur utförs på en manlig vuxen Wistar råtta (stam: RJHan:WI).
1. perfusion och hjärnan utvinning
Obs: För att få en likartad fasta och blod-fri hjärna, transcardial perfusion av djur är mycket uppmuntras, eftersom kvarstående blod ökar ospecifikt bakgrund signal under färgningen. Det är emellertid även möjligt att erhålla tillplattade snitt från un-perfunderade prov och färga dem. Enkel hantering av preparatet varierar med koncentrationen av fixativ används. För lite fixering ökar risken för hantering av skador på hjärnan under plattas och skärning, medan för höga koncentrationer lägre flexibilitet för flackare och kvaliteten på signalen färgning.
- Transcardially BEGJUTA djuret, med hjälp av en 23-G nål. För en mer detaljerad guide, se Gage et al. 9
- Använda fosfat buffert saltlösning10 (PBS; 0,02 M; pH 7,4) för att spola ut blod från hjärnan och kroppen av djuret. Fortsätta tills infusion vätska visas tydligt, med minst 150 mL PBS som infunderas genom kärlsystemet.
Obs: Bästa resultat uppnås vid ett tryck som är liknande till spänna av fysiologiska blodtrycket djuret vara perfusion (t.ex., råtta: 120-130 mmHg). Du kan också lägga till heparin (10 U/mL) till lösning för att undvika blod koagulation11. - För att fixa hjärnan, ingjuta transcardially minst 100 mL PARAFORMALDEHYD12 (PFA, 4%, 0,1 M fosfat buffert (PB)13) tills halsen på djuret är stel.
FÖRSIKTIGHET: PFA är potentiellt cancerframkallande.
Obs: Bästa resultat för histochemical aktivitet färgning, exempelvis för cytokrom oxidas, uppnås, när du använder 2% PFA. För andra färgning, såsom immunohistokemi, 4% PFA är att föredra.
- Använda fosfat buffert saltlösning10 (PBS; 0,02 M; pH 7,4) för att spola ut blod från hjärnan och kroppen av djuret. Fortsätta tills infusion vätska visas tydligt, med minst 150 mL PBS som infunderas genom kärlsystemet.
- Extrahera hjärnan från skallen.
Obs: Se Gage et al. 9 för mer information.- Isolera huvudet med stor sax eller ben saxar.
- Använda fina sax, skära huden längs mittlinjen från hals till näsa. Dra isär huden för att exponera skallen. Ta bort hals och temporala muskler med fina sax.
- Göra en mittlinjen som skär genom interparietal benet start från foramen magnum upp till parietala ben.
- Använd Rongeurs lossnar interparietal benet. Skjut fin sax längs sagittal suturen och skär från den bakre änden av parietala främre ände pannben.
- Använd Rongeurs lossnar den parietala och pannben. Alternativt, lyft benen bort med pincett. Använd en sked för att klippa ventrala nerv sladdar och ta bort hjärnan. Överföra hjärnan till PB (0,1 M; pH 7,4).
- Fixa un-perfunderade hjärnor genom nedsänkning i 4% PFA för 1-3 h vid 4 ° C (beroende på hjärnans storlek och sond: argbigga: ~ 1 h, mänskliga: ~ 3 h).
Obs: För stora och gyrencephalic hjärnor som människor, isolera och klipp ut området av intresse att minska fixering tid. - För att få större kortikala områden i ett avsnitt, platta hjärnan före ytterligare efter fixering; Fortsätt till steg 2. Men för att få delar av svårare att nå områden som den mediala entorhinal cortexen, efter fixa hjärnan i 4% PFA för 24 h innan du fortsätter till steg 2.
2. hjärnan dissektion och plattas
- Separera hjärnhalvorna med hjälp av ett rakblad (lissencephalic hjärnor) eller skalpell (gyrencephalic hjärnor).
Obs: Om hjärnan inte har åtgärdats efter, det är känsliga för skador av hantering. - Valfria steg för medhjälp efterföljande avsnittet registrering och krympning uppskattning:
- Punktera cortex i ett område av icke-intresse, med en 35G nål normala till kortikala ytan. Upprepa detta två gånger på definierade avstånd längs bladet kortikala. För att bestämma avståndet längs bladet kortikala, använda en färdigskurna tråd på en fast längd (t.ex., 5 mm) och lägga den längs kortikala ytan att bestämma punkter för punktering.
- Lissencephalic hjärnor: ta bort subkortikala strukturer med hjälp av en dissekera spatel. Kritisk: Hålla hjärnan fuktig med PB (0,1 M; pH 7,4) under hela förfarandet.
- Håll hjärnan lillhjärnan och försiktigt in spateln för att öppna en dissektion plan i corpus callosum. Den runda spetsen av spatel ska peka bort från cortex.
- Skjut spateln ytterligare och dra försiktigt tills spateln är mellan thalamus och cortex. Separata subkortikala strukturer med skrapa rörelser.
- Inspektera halvklotet för jämn tjocklek.
Obs: Någon ojämn regioner kan resultera i en trans-lager lutning vid snittning. För tangentiell snittning, använda en skalpell för att göra ett rent snitt genom hjärnan, parallell till pial ytan av regionen som tangerar sektioner önskas. - Valfria steg att förbättra slätande kvalitet:
- Göra ett rent snitt genom striatum, nucleus accumbens och orbitofrontal cortex, eftersom de ökar tjockleken på hjärnbarken i regionen laterala. Också lägga till ett befriande snitt vid basen av regionen inre i prefrontala cortex, som tillåter unfoldingen av mediala delar av cortex.
- Placera halvklotet (cortex nedåt) på en glasskiva. Fortsätt till steg 2,6.
- Gyrencephalic hjärnor: ta bort vit substans att veckla gyri (för detaljerade protokoll, se: Sincich et al. 14. Tootell och Silverman15). Kritisk: Använda PB (0,1 M; pH 7,4) för att hålla hjärnan fuktig hela tiden.
- Pålagt en fuktig filterpapper i en stor petriskål, området av intresse med cortex uppåt.
- Ta bort spindelvävshinnan membran och pia med två pincett.
- Använd en fuktad bomullspinne och sätt försiktigt i varje sulcus att lösgöra sammanväxningar mellan gyri.
- Vända hjärnan med hjälp av en annan fuktig filterpapper.
- Använda två böjda micro spatlar för att utveckla enda gyri. Använd den konvexa sidan av spatlar för att retas isär den vita substansen tills de når nära konkav slutet av gyrus. Använd en fuktad bomullspinne och fortsätt med virvlande rörelser att nå konkav slutet av gyrus.
- Retas apart enda gyri. Om det behövs, tillsätt små lindra nedskärningar om spänningen är för hög.
- Platta till Övik hjärnan i petriskål eller en liknande behållare.
- Du kan också placera större hjärnor på ett filterpapper omfattas svamp, att se till att regionerna inte torka.
- Placera två rullade bitar av lera på båda sidor. Kritisk: Som tjockleken på leran definierar hur mycket halvklotet kan slätas, se till att leran är 10-20% tunnare än un-tillplattad cortex.
- Tryck försiktigt en andra glas slide/liten petriskål cortex tills halvklotet är helt platt. För att få bästa resultat för en önskad region, placera glas bilden först på respektive område. Att uppnå bästa resultat för lissencephalic hjärnor, placera glasskiva tangentiellt på den laterala delen först och Applicera koncentrerad trycket på denna region.
- Lägga en vikt (t.ex., en keramisk urglas) på glas diabilder/petriskål och platta på halvklotet för 3-5 h vid 4 ° C i PB.
- Efter fixering, släpp trycket och ta bort glasskivor. Sätta den tillplattade halvklotet i PFA (gratis flytande) för 24 h på en shaker vid 4 ° C.
Obs: Bästa resultat för histochemical aktivitet infärgning uppnås när man använder 1% PFA. För andra färgningar, såsom immunohistokemi, för un-perfunderade hjärnor, 2% PFA kan användas.
Figur 1: Schematisk bild av arbetsflöde för flackare en råtta kortikala halvklotet och visualisering av moduler i somatosensoriska cortex. Efter transcardial perfusionen, hjärnan av en mus var dissekerade (A). Subkortikala strukturer togs bort och cortex var tillplattad mellan två glasskivor i fosfatbuffert (B). Tillplattad halvklotet (C) var efter fasta, tangentiellt sektioneras och färgas för cytokrom oxidas aktivitet (D). Skala barer = 1 cm. R: rostralt, C: Caudal, L: Lateral, M: mediala. Figur anpassad från Lauer o.a. 23 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. skär tangentiella sektioner
Obs: Beroende på kraven i de olika färgprotokollen, skärande förfarandet och tjocklek kan anpassas. En vibratome användes för att skära halvkloten för ytterligare histochemical bearbetning (steg 3,2) på 80-150 µm. Dock för immunhistokemiska bearbetning, tunnare sektioner önskas och en frysning mikrotom användes för snittning (steg 3.3) på 10-60 µm. Se Video 1.
- Tvätta den tillplattade halvklotet i PB (0.1M; pH 7,4) för 15 min.
- Skär halvklotet på en vibratome.
- Placera halvklotet tangentiellt på hållaren för skivning. Alternativt, tryck igen försiktigt med en glasskiva innan fastskruvning i position (t.ex., med superlim).
Obs: Minimera mängden lim används, eftersom skärande artefakter kan leda till följd av tillplattad halvklot liten tjocklek. - Skär halvklotet från tjockare och mer stabil slutet mot tunnare slutet (bakre till främre, här) vid krävs tjocklek. Fortsätt till steg 3,4.
Observera: Om låg fixering koncentrationer användes, skär den med en långsam hastighet och en hög amplitud.
- Placera halvklotet tangentiellt på hållaren för skivning. Alternativt, tryck igen försiktigt med en glasskiva innan fastskruvning i position (t.ex., med superlim).
- Skär halvklotet på en frysning mikrotomen.
- Cryoprotect hjärnan genom nedsänkning i en 30% sackaroslösning (i PB) tills det sjunker.
Obs: Beroende på storleken av vävnaden som cryoprotected, sjunka i lösningen kan variera från några timmar till några dagar. För större hjärnor alternativa cryoprotection metoder kan övervägas (se Rosene o.a. ( 16). - Bilda en bas på frysning mikrotomen att montera hjärnan is. Konstruera isen bas genom frysning PB i block ansiktet frysning mikrotomen. Kritisk: Se till att ytan av is basen är parallell mikrotomen bladet. Detta gör klipp tomma isen bas med mikrotomen bladet att exakt anpassa is basen parallellt med skärytan.
- Bädda in hjärnan i frysning medium och montera den på blocket ansiktet av mikrotom med området av intresse parallellt block ansiktet. Ansikte pial ytan av hjärnan mot block ansiktet mikrotomen. Kritisk: Justera Frystemperaturen beroende på provstorlek; högre temperaturer säkerställa bättre avsnitt integritet medan snittning, men större sektioner kräver lägre temperaturer för att frysa prov jämnt.
- Skär hjärnan tangentiellt på krävs tjocklek (långsammare och enhetlig skärhastigheter resultera i bästa avsnittet kvalitet).
- Cryoprotect hjärnan genom nedsänkning i en 30% sackaroslösning (i PB) tills det sjunker.
- Tvätta avsnitten i PB 15 min på en shaker.
Video 1: Schematisk video av tangentiell snittning från en råtta mediala entorhinal cortex och layout av parasubicular och entorhinal moduler. Den mediala entorhinal cortexen av en gnagare hjärnan är belägen vid den bakre delen av hjärnbarken och lutas mot den mediala och ventrala sidan. Tangentiell sektioner erhålls genom orientera en kniv längs denna vinkel. Följaktligen, lämplig cell-typ specifik färgning avslöjar modulära strukturer i mediala entorhinal cortex och angränsande parasubiculum. Video anpassad från Ray och Brecht8. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
4. visualisering av kortikala moduler som använder cytokrom oxidas färgning
Obs: Olika färgprotokollen har utvecklats för histochemical upptäckt av cytokrom oxidas aktivitet, t.ex., först av Wong-Riley17 och senare ändrats av Divac o.a. 18 detta protokoll baseras på en av Divac o.a. 18, eftersom användningen av nickel-ammoniumsulfat (NiAS) resulterar i en högre kontrast och bättre definierade moduler i betsad kortikala områden.
- Förbereda de cytokrom oxidas färgning lösning (se Divac o.a. 18). för 10 mL lösning, lägga till: 10 mL HEPES buffert (0.1 M, pH 7,4), 400 mg sackaros, 12,5 mg NiAS, 2 mg cytokrom C, 6 mg Diaminobenzidin (DAB).
FÖRSIKTIGHET: DAB och NiAS är cancerframkallande.
Lägg Till DAB strax före inkubering av sektioner. - Tvätta avsnitten i HEPES buffert (0.1 M, pH 7,4) på en shaker i 15 min.
- Inkubera i avsnitt i färglösningen i rumstemperatur på en shaker.
Obs: Observera hastigheten på färgningen. Om det finns ingen synlig reaktion, ändra till inkubation vid 37 ° C. Beroende på mängden fixering, kan färgning observeras efter 10 min eller i flera timmar. - Stoppa reaktionen genom att lägga till 4% PFA; Detta förhindrar oönskade åter döende och ökning av bakgrund signal.
- Tvätta i avsnitt tre gånger med HEPES buffert för 10 min.
- Montera och torka avsnitten på glasskivor.
- Torkar ut avsnitten med en ökande alkohol-raden:
- Tvätta objektglasen i 60% etanol för 1 min. Tvätta bilderna i 80% etanol för 1 min. Tvätta bilderna i 96% etanol för 2 min. Tvätta bilderna i 100% etanol för 3 min. Tvätta bilderna i isopropanol för 5 min. Tvätta bilderna i xylen i 5 min.
- Omedelbart lägga till en snabb härdning-monteringsmedium och ett täckglas. Kritisk: Använd inte vattenbaserad montering medier, som NiAS kommer att spolas och försämras färgningen.
- Hålla avsnitten vid 4 ° C för långtidsförvaring.
5. visualisering av kortikala moduler med immunhistokemisk färgning
Obs: Flera protokoll finns tillgängliga för immunohistokemi, optimerad för preparatet och vilken typ av sond. Anpassningar kan göras efter behov, av varierande koncentrationer av antikroppar, permeabilizing agenter och inkubationstider. Följande protokoll leder till bra resultat för att upptäcka ett stort utbud av antikroppar och visualisering av fluorescerande sonder.
- Tvätta avsnitten i PBS (0,1 M; pH 7,4) 15 min.
- Valfritt: Utföra antigen hämtning att demaskera en epitop använder vattenbad (baserat på Jiao o.a. 19. för alternativa metoder, se Pileri o.a. ( 20).
- Värm ett vattenbad till 80 ° C. Förbereda tri-natrium citrat buffert19 (pH 8,0) och värm den i vattenbad till 80 ° C.
- Överföra avsnitten till tri-natrium citratbuffert. Inkubera avsnitten för 30 min vid 80 ° C
- Cool avsnitten ner till rumstemperatur
- Tvätta avsnitten i PBS för 15 min.
- Tvätta i avsnitt två gånger i PBS-X (0,5% Triton-X, i 0,1 M fosfatbuffrad Koksaltlösning) för 15 min.
- Blockera ospecifikt epitoper genom ruvning i avsnitt i en lösning av bovint serumalbumin (BSA; 2,5%) och Triton-X (0,75%) i PBS för 2 h.
- Inkubera i avsnitt i primär antikropp, t.ex., Calbindin - D28k (1:5, 000, 1% BSA i PBS-X), för 2-3 dagar på en shaker vid 4 ° C.
Obs: Optimal utspädning för den primära antikroppen beror på den specifika antikroppen som används. Läs tillverkarens information att få utspädning kriterier för en specifik antikropp. Flera antikroppar kan användas tillsammans men måste höjas mot olika arter. - Tvätta i avsnitt tre gånger i PBS för 15 min varje.
- Inkubera i avsnitt övernattning i sekundär antikropp (1: 200, 1% BSA i PBS) vid 4 ° C i en shaker.
Obs: Flera sekundära antikroppar kan användas på olika spectra om flera primära antikroppar användes. - Tvätta bort den sekundära antikroppen genom tvättning i avsnitt tre gånger i PBS för 10 min varje.
- Montera och torka avsnitten på en glasskiva för mikroskopi.
Obs: Avsnitten bör fortfarande vara fuktig före montering på täckglas. - Applicera monteringsmedium lämpad för fluorescens färgämnen på avsnitten vävnad och Lägg på ett täckglas.
- Torka avsnitten för 1 h.
- För långtidsförvaring, försegla på täckglaset med nagellack och hålla i mörker vid 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi erhålls tillplattade kortikala snitt av somatosensoriska cortex i en mängd olika hjärnor, och bearbeta dem för cytokrom oxidas histokemi att visualisera de somatotopic moduler som representerar olika kroppsdelar. Denna jämförande metod tillåter studera evolutionära krafter det form cortex, t.ex., visar mycket representation av mystacial vibrissae på gnagare och hardjur som fat21 (figur 2). Däremot visar andra kroppsdelar som tassar och könsorgan variationer i deras relativa storlek och återspegla specialiseringen till en ekologisk nisch eller sexuellt urval22,23.
För att förstå arkitektur av mediala entorhinal cortex, erhöll vi sektioner parallell till pial ytan. Detta uppnåddes främst genom tangentiell snittning av mediala entorhinal cortex hos möss, råttor och egyptiska flyghundar. I människor tillplattad på grund av den betydligt större och mer vågor i entorhinal cortex, vi försiktigt cortex efter att göra ett tangentiellt snitt av entorhinal cortex. Därefter alla hjärnor var fryst tillstånd och sektioneras på ett kryostaten på 60 µm. immunhistokemi utfördes på den erhållna delar med en anti-calbindin antikropp, att visualisera calbindin-positiv pyramidal cell modulerna i den mediala entorhinal cortex5 (figur 3). Calbindin-moduler i entorhinal cortex visar en anmärkningsvärd periodicitet över alla dessa hjärnor, och varierar i storlek med endast en faktor 10 över ~ 20,000-fold variation i hjärnan storlekar5.
Figur 2: topografiska layout av fat cortex moduler över däggdjur som identifierats av cytokrom oxidas histokemi. Tangentiell delar av lagret IV från somatosensoriska cortex av (A) mus, (B) mongoliska gerbil, (C) råtta, (D) degu, (E) hamster, (F) kanin, visar fat som en mycket somatotopic representation av de mystacial vibrissae. Skala barer = 500 µm. M: mediala, L: Lateral, R: rostralt, C: Caudal; Orientering i A gäller även B-E. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: periodiska layout av mediala entorhinal cortex moduler över däggdjur som identifierats av calbindin immunoreaktivitet. Tangentiell sektioner från layer II av mediala entorhinal cortex av (A) mus, (B) råtta, (C) egyptiska frukt bat och (D) människa, visar en bevarade periodiska layout av calbindin-positiv pyramidal cell moduler. Skala barer = 250 µm. M: mediala, L: Lateral, D: dorsala, V: ventrala, R: rostralt, C: Caudal; Orientering i D gäller även för B, C. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modularitet i hjärnbarken har identifierats med hjälp av olika tekniker. De tidigaste studier vanligtvis identifieras kortikala modulerna genom att antingen visualisera cell tät regioner, eller avsaknad av fibrer1. Efterföljande metoder har utnyttjat förekomsten av dendritiska buntarna24, afferenter från en viss region25eller anrikning av signalsubstanser26. Här visar vi två tekniker, a cytokrom oxidas histokemi och (ii) immunhistokemisk färgning.
Cytokrom oxidas färgning har varit en av de mest populära metoderna att visualisera kortikala moduler, och har använts i primära sensoriska cortices27,28. Det visualiserar moduler av färgning mörkare för områden av högre mitokondriell aktivitet17, därmed fungerar som proxy för anatomiska moduler som framkallar betydande funktionella svaren. Denna metod har använts för att visualisera somatosensoriska kortikala moduler (figur 2) och kortikala moduler i syncentrum27.
En av nackdelarna med traditionella histochemical metoder är att deras typiska visualisering av ljusa fält ljusmikroskopi begränsar antalet moduler som kan visualiseras samtidigt. Immunohistokemiska metoder, i konjugering med fluorescerande visualisering sonder kan dock också användas för att visa särskilda proteiner och identifiera kortikala moduler. Exempelvis thalamic afferenter till sensoriska cortices projektet på en somatotopic sätt. Således, visualisera dessa afferenter, använder VGluT2 immunoreaktivitet kan även användas att visualisera kropp kartorna i den primära somatosensoriska cortex som vi har visualiseras med hjälp av cytokrom oxidas aktivitet (figur 2). Selektiv proteiner kan också användas som cellulära markörer för att identifiera grupper av genetiskt definierade celler. Med immunohistokemi, vi identifierade kluster av pyramidala celler i mediala entorhinal cortex uttrycker det kalcium bindande proteinet, calbindin6 (figur 3) och beslutade att kluster av detta särskilt genetiskt betingade grupp av celler bevaras över evolution5, som anger gemensamma resonanskrets principerna bakom deras funktion. Använda flera fluorophores, avgränsad vi också kompletterande moduler i den mediala entorhinal cortex26, visar parallella mikrokretsar som ligger bakom rumsliga minne.
Hjärnan har historiskt sett varit sektioneras i ett plan som är normal till dess position i kroppen, i antingen sagittal, koronalt eller vågrät orientering. Identifiering av kortikala moduler, såsom fälten fat i somatosensoriska cortex4 uppmanas också snittning längs en tangentiell och därefter i tillplattad kortikala preparat29, även om enstaka fall av sådan snittning var observerades mycket tidigare30,31. Efter identifiering av fat cortex identifierades andra kortikala moduler också i de primära syncentrum27, liksom förekomsten av en komplett kropp karta32 med en somatotopic representation av kroppen i primär somatosensoriska cortex. Tillplattade snitt av katt syncentrum avslöjade också topografiska organisationen av orientering kolumner utan behov av ytterligare rekonstruktioner33. Kortikala modularitet har också påvisats i parahippocampal cortices, inklusive presubiculum och parasubiculum26,34 och mediala entorhinal cortex6. Vanligtvis plattas ett böjda objekt inducerar snedvridningar i laminar topografi - som kan observeras av en mängd olika projektioner av den krökta jordytan på en platt karta35. En relativt enkel metod att delvis kompensera för dessa snedvridningar är genom att införa referenspunkter på definierade avstånd innan plattas, och sedan mäta avståndet mellan dem efter utplattning. Dessa märken sedan inte bara subserve kvantitativt uppskatta snedvridning införs genom tillplattning, men ger också en lätt referenspunkt för att justera raka sektioner. Ytterligare avgörande aspekter för att bevara laminar trohet inkluderar att säkerställa homogen plattas hela avsnittet, och slutligen snittning exakt tangentiell till layouten laminärt att få optimerad laminar kortikala sektioner.
Visualisering av kortikala moduler i tillplattade tangentiella snitt har spelat en viktig roll i avslöjar fascinerande struktur-funktionssamband i hjärnbarken. Den topografiska framställningen av morrhår och kroppsdelar i den primära somatosensoriska cortexen och närvaron av en anatomisk rutnätet i de mikrokretsar generera funktionella rutnätsceller i tillplattade tangentiella kortikala snitt avslöjar intrikata mikrokretsar Detaljer som skulle vara svårt att förstå från andra inriktningar. Vår nuvarande teknik ger dock endast en tvådimensionell bit av dessa i huvudsak tredimensionella moduler. Med hjälp av immunofluorescens tekniker och vävnad clearing metoder36,37, skulle det vara möjligt att visualisera dessa kortikal moduler som helhet och kanske avslöjar ytterligare insikter i vår förståelse av kortikala kartor och moduler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av några kommersiella eller finansiella relationer som kunde tolkas som en potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Humboldt-Universität zu Berlin, Bernstein Center for Computational neurovetenskap Berlin, den tyska Center för neurodegenerativa sjukdomar (DZNE), den tyska förbundsministeriet för utbildning och forskning (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure och Gottfried Wilhelm Leibniz pris av DFGEN. Vi tackar Shimpei Ishiyama för utmärkt grafisk design och Juliane Diederichs för utmärkt teknisk assistans.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps - Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears - 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- Brodmann, K. Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , Barth. (1909).
- Naumann, R. K., et al. The reptilian brain. Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).
- Kaas, J. H. Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).
- Woolsey, T. A., Van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
- Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex. J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).
- Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex. Science. 343 (6173), 891-896 (2014).
- Wong-Riley, M. T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity. Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).
- Ray, S., Brecht, M. Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex. Elife. 5, e13343 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Olson, S. T., Chuang, Y. J. Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases. Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).
- Paraformaldehyde (PFA; 4%). Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- Sodium phosphate (PB). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex. Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).
- Tootell, R. B., Silverman, M. S. Two methods for flat-mounting cortical tissue. J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).
- Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact. J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol. J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
- Krubitzer, L. The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different? Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).
- Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex. J Comp Neurol. , (2017).
- Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W.
- Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex. J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).
- Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex. Front Syst Neurosci. 11, (2017).
- Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).
- Land, P. W., Simons, D. J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex. J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).
- Welker, C., Woolsey, T. A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse. J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).
- Retzius, G. Die Cajal'schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).
- Cajal, S. R. Histologie du Systeme Nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Talleres Grafios. Montana, Madrid. (1911).
- Chapin, J. K., Lin, C. S. Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats. J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).
- Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).
- Tang, Q., et al.
- Snyder, J. P. Map projections--A working manual (Vol. 1395). , US Government Printing Office. (1987).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
