Summary
توضح هذه المقالة منهجية مفصلة الحصول على مقاطع عرضية مسطح من الثدييات كورتيسيس ووضع تصور للوحدات القشرية باستخدام histochemical وأساليب المناعي.
Abstract
قشرة أدمغة الثدييات بارسيلاتيد في هياكل فرعية منفصلة أو الوحدات النمطية. الوحدات القشرية عادة ما تقع موازية للورقة القشرية، ويمكن أن تحدد ببعض الأساليب histochemical والمناعي. في هذه الدراسة، نسلط الضوء على أسلوب لعزل القشرة من الثدييات العقول وتسطيح لهم الحصول على التوازي المقاطع إلى ورقة القشرية. ونحن كذلك تسليط الضوء على تحديد histochemical وأساليب المناعي تجهيز هذه الأرض مقاطع عرضية لتصور الوحدات القشرية. في قشرة somatosensory الثدييات المختلفة، نقوم هيستوتشيميستري السيتوكروم أوكسيديز للكشف عن خرائط الجسم أو الوحدات القشرية التي تمثل أجزاء مختلفة من جسم الحيوان. في قشرة entorhinal الآنسي، منطقة حيث يتم إنشاء خلايا الشبكة، فنحن نستخدم أساليب المناعي لتسليط الضوء على نماذج من الخلايا العصبية مصممة وراثيا التي يتم ترتيبها في نمط شبكة في ورقة القشرية عبر العديد من الأنواع. وعموما، نحن نقدم إطارا لعزل وإعداد لاييرويسي دكت أبواب القشرية، ووضع تصور للوحدات القشرية باستخدام histochemical وأساليب المناعي في مجموعة متنوعة واسعة من أدمغة الثدييات.
Introduction
ويمكن ملاحظة بعض أهم التغييرات في بنية الدماغ عبر نسأله في قشرة الدماغ. وعلى الرغم من الاختلافات الكبيرة، قشرة الحيوانات يتبع نمط شائع ويمكن تقسيم بطريقتين متميزة، ب الطبقات والمجالات1. الطبقات القشرية تقع موازية لسطح الدماغ وتختلف في عدد من الطبقات 3 في كورتيسيس الزواحف2 إلى 6 طبقات في الثدييات كورتيسيس1. المناطق القشرية من ناحية أخرى مناطق متميزة من القشرة التي تتوافق إلى حد كبير مع وظائف متميزة، مثل، قشرة somatosensory تشارك في الإحساس باللمس أو القشرة البصرية في تجهيز مرئي المدخلات. هذه المناطق القشرية يمكن غالباً تقسيمها إلى بقع أو الوحدات النمطية3، الذي يتم بانتظام تكرار الهياكل التشريحية، وجدت أساسا موازيا للسطح بيل في الدماغ. الوحدات القشرية قد تقتصر على طبقة معينة4، أو تمتد عبر عدة طبقات5.
أساليب تقطيع القياسية للدماغ إشراك الأقسام العادية إلى السطح في الدماغ، مثل الاكليلية أو السهمي. وفي حين يمكن استخدام هذه الأساليب لتصور الوحدات القشرية، يمكن كشف العديد من الميزات للاهتمام عندما يتم تصور الوحدات القشرية عرضية، في طائرة موازية لسطح الدماغ. على سبيل المثال، وحدات سوماتوسينسوري في الدماغ القوارض تمثل شعيرات، تظهر كبرميل عند تصور العادي على سطح الدماغ، وهكذا تستمد المناطق القشرة البرميل اسم. ومع ذلك، في تصور برميل في اتجاه عرضية، أنها تكشف خارطة الخط الطولي، مع برميل يجري المنصوص عليها في اتجاه طبوغرافية النسخ المتطابق على التخطيط الدقيق لشعرات على سطح الجسم الخارجي. وفي بعض الحالات، حتى هرب ترتيب وحدات الكشف لفترات طويلة، عندما تصور بطريقة غير عرضية. قشرة انتورهينال الآنسي، المعروف لوجود خلايا الشبكة، الخلايا العصبية التي تطلق في نمط سداسية منتظمة عند حيوان هي تعبر بيئة. على الرغم من أنها منطقة يتم التحقيق بشكل كبير، حتى الآونة الأخيرة، وجود بقع أو وحدات من الخلايا الموجودة في قشرة entorhinal الآنسي، الذي ترد جسديا في نمط سداسية6، هرب الكشف. الوجود وترتيب هذه الوحدات، في الدماغ الفئران، تيسرت بصنع مقاطع عرضية من قشرة انتورهينال الآنسي والتحقيق في سيتوارتشيتيكتوري بطريقة لاييرويسي.
بعد تمزيقها، يمكن أيضا تحقيق جانب معين من التصور للوحدات القشرية بطرق متعددة. تقليديا، قد حددت الدراسات الوحدات النمطية استناداً إلى الخلية الكثافة أو الألياف تخطيط1. نهج شعبية آخر هو استخدام هيستوتشيميستري السيتوكروم أوكسيديز، الذي يكشف عن مجالات النشاط العالي8. وتشمل النهج الجديدة تبحث في أنواع الخلايا المحددة وراثيا، تميز على أساس هم البروتين التعبير ملامح6،8.
في هذه الدراسة، نسلط الضوء على الأساليب عزل القشرة من أدمغة الثدييات والحصول على مقاطع عرضية مسطح، وتصور الوحدات القشرية على أساس هيستوتشيميستري السيتوكروم أوكسيديز وإيمونوهيستوتشيميستري من البروتينات نوع من الخلايا المحددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية الألمانية بشأن الرفق بالحيوان بإشراف لجان الأخلاقيات المحلية (لاجيسو). الإنسان وبات الدماغ البيانات المستمدة من نومان et al. 5 يتم تنفيذ الإجراء التالي على ذكور البالغين جرذان ويستار (السلالة: RJHan:WI).
1. نضح واستخراج الدماغ
ملاحظة: للحصول على دماغ المتجانسة ثابتة وخالية من الدم، نضح ترانسكارديال للحيوان تشجيعا كبيرا، كما يزيد الدم المتبقية الإشارات الخلفية غير محدد أثناء تلطيخ. ومع ذلك، من الممكن أيضا الحصول على أجزاء الأرض من العينة بيرفوسيد الأمم المتحدة ووصمة عار لهم. سهولة التعامل مع العينة يختلف مع تركيز مثبت المستخدمة. التثبيت قليل جداً يزيد من الخطر لمعالجة الأضرار التي لحقت المخ أثناء التسوية والقطع، في حين خفض تركيزات عالية جداً المرونة اللازمة للتسوية ونوعية إشارة المصبوغة.
- نتخلل ترانسكارديالي الحيوان، واستخدام إبرة ز 23. للحصول على دليل أكثر تفصيلاً، راجع سبر et al. 9
- استخدام الفوسفات المخزن المؤقت المالحة10 (برنامج تلفزيوني؛ 0.02 م؛ ودرجة الحموضة 7.4) لطرد الدم من الدماغ والجسم للحيوان. يستمر ضخ السائل تظهر واضحة، مع مالا يقل عن 150 مل برنامج تلفزيوني يجري غرست من خلال نظام الأوعية الدموية.
ملاحظة: يتم تحقيق أفضل النتائج عند ضغط مماثل لمجموعة ضغط الدم الفسيولوجية للحيوان يجري perfused (مثلاً، والفئران: 120-130 ملم زئبق). بشكل اختياري، إضافة الهيبارين (10 U/mL) لإيجاد حل لتجنب تجلط الدم11. - لإصلاح الدماغ، يبث ترانسكارديالي حدا أدنى من 100 مل بارافورمالدهيد12 (منهاج عمل بيجين، 4%؛ في الفوسفات 0.1 م المخزن المؤقت (PB)13) حتى تيبس رقبة الحيوان.
تنبيه: منهاج عمل بيجين مادة مسرطنة محتملة.
ملاحظة: تحقيق أفضل النتائج للنشاط histochemical تلطيخ، مثل السيتوكروم أوكسيديز، هي، عند استخدام 2% منهاج عمل بيجين. البعض تلطيخ، مثل إيمونوهيستوتشيميستري، 4% لمنهاج عمل بيجين المفضل.
- استخدام الفوسفات المخزن المؤقت المالحة10 (برنامج تلفزيوني؛ 0.02 م؛ ودرجة الحموضة 7.4) لطرد الدم من الدماغ والجسم للحيوان. يستمر ضخ السائل تظهر واضحة، مع مالا يقل عن 150 مل برنامج تلفزيوني يجري غرست من خلال نظام الأوعية الدموية.
- استخراج المخ من الجمجمة.
ملاحظة: انظر سعة et al. 9 لمزيد من التفاصيل.- عزل رأسه باستخدام مقص كبير أو مقصات العظام.
- باستخدام مقص جيد، قطع الجلد على طول خط الوسط من الرقبة الآنف. سحب الجلد لفضح الجمجمة عن بعضها البعض. إزالة العنق والعضلات الزمنية باستخدام مقص جيد.
- جعل خط الوسط قطع طريق عظم إينتيرباريتال بدءاً من ماغنوم ثقبة حتى العظم الجداري.
- استخدم رونجيورس تقشر العظم إينتيرباريتال. الشريحة مقص غرامة على طول خياطة السهمي وقطع من نهاية الجداري الخلفي إلى نهاية العظام الأمامية الأمامي.
- استخدم رونجيورس لقشر قبالة الجداري وعظام أمامي. وبدلاً من ذلك، رفع العظام بعيداً باستخدام الملقط. استخدام ملعقة لقطع الحبال العصبية البطني وإزالة الدماغ. نقل الدماغ للجريدة الرسمية (0.1 متر؛ ودرجة الحموضة 7.4).
- إصلاح الأمم المتحدة perfused العقول بالانغماس في 4% منهاج عمل بيجين ح 1-3 في 4 درجات مئوية (تبعاً لحجم الدماغ والتحقيق: النمرة: ~ 1 ح، الإنسان: ~ ح 3).
ملاحظة: بالنسبة الكبيرة والعقول جيرينسيفاليك مثل البشر، عزل وقطع مجال اهتمام لتقليل وقت التثبيت. - للحصول على أكبر المناطق القشرية في مقطع، تتسطح في الدماغ قبل التثبيت بعد أخرى؛ انتقل إلى الخطوة 2. ومع ذلك، للحصول على مقاطع من صعوبة الوصول إلى مناطق مثل قشرة entorhinal الآنسي، بعد إصلاح الدماغ في 4% منهاج عمل بيجين ل 24 ساعة قبل الانتقال إلى الخطوة 2.
2-الدماغ التشريح والتسوية
- فصل نصفي الكرة الدماغ باستخدام شفرة حلاقة (ليسينسيفاليك العقول) أو مشرط (جيرينسيفاليك العقول).
ملاحظة: إذا كان الدماغ لم يتحدد بعد، أنها عرضه للضرر بالمناولة. - خطوة اختيارية لمساعدة تقدير التسجيل وانكماش الفرع اللاحق:
- ثقب القشرة في منطقة لغير مصلحة، مع ز 35 إبرة عادية على السطح القشرية. كرر الخطوة مرتين على مسافات محددة على طول الورقة القشرية. لتحديد المسافة على طول الورقة القشرية، استخدام مؤشر ترابط قبل قطع بطول ثابت (مثلاً، 5 ملم) ووضع على طول السطح القشرية لتحديد النقاط للثقب.
- ليسينسيفاليك العقول: إزالة الهياكل سوبكورتيكال باستخدام ملعقة تشريح. الحرجة: الحفاظ على الدماغ رطبة مع PB (0.1 متر؛ ودرجة الحموضة 7.4) في جميع أنحاء الإجراء بأكمله.
- عقد المخ المخيخ وإدراج البسط لفتح طائرة تسلخ في كلثوم الإحضار بلطف. ينبغي أن تشير جولة طرف الملعقة بعيداً عن القشرة.
- الشريحة ملعقة أخرى وسحب بلطف حتى الملعقة بين المهاد والقشرة. هياكل سوبكورتيكال منفصلة مع خدش الالتماسات.
- تفتيش في نصف الكرة الأرضية لسمك حتى.
ملاحظة: قد يؤدي أي مناطق متفاوتة في تدرج عبر طبقة خلال تمزيقها. لتقطيع عرضية، استخدام مشرط لجعل قطع نظيفة من خلال الدماغ، موازية للسطح بيل المنطقة المرجوة منه مقاطع عرضية. - اختياري من الخطوات لتحسين نوعية التسوية:
- جعل قطع نظيفة من خلال المخطط، نواة accumbens، والقشرة أوربيتوفرونتال، نظراً لأنها تزيد من سمك القشرة في المنطقة الجانبية. أيضا، أضف قطع التصريف في قاعدة المنطقة الداخلية من القشرة بريفرونتال، الذي يسمح تتكشف الآنسي أجزاء من القشرة.
- مكان في نصف الكرة الأرضية (القشرة إلى الأسفل) على شريحة زجاجية. انتقل إلى الخطوة 2، 6.
- جيرينسيفاليك العقول: إزالة المسألة الأبيض تتكشف جيري (لبروتوكولات مفصلة، انظر: سينسيتش et al. 14؛ توتيل وسيلفرمان15). الحرجة: استخدام PB (0.1 متر؛ ودرجة الحموضة 7.4) الحفاظ على الدماغ رطبة في كل وقت.
- وضع مجال الاهتمام على ورقة تصفية رطبة في طبق بتري كبيرة، مع قشرة مواجها لأعلى.
- إزالة الغشاء العنكبوتي وبيا استخدام الملقط اثنين.
- استخدم مسحه القطن رطبة وإدراج بلطف في كل ناصف لفصل الالتصاقات بين جيري.
- يستدير الدماغ باستخدام ورق الترشيح رطبة أخرى.
- استخدام اثنين ملاعق صغيرة منحنية تتكشف جيري واحدة. استخدم الجانب المحدب ملاعق لندف أربا المسألة الأبيض حتى يصل إلى قرابة نهاية مقعرة المغزلي. استخدم مسحه القطن رطبة والمضي قدما في دوامات الاقتراحات للوصول إلى نهاية مقعرة المغزلي.
- نفش جيري واحدة عن بعضها البعض. إذا لزم الأمر، إضافة إلى تخفيف الصغيرة تخفيضات إذا كان التوتر مرتفع جداً.
- تسطيح الدماغ تكشفت في طبق بتري أو حاوية مماثلة.
- بشكل اختياري، مكان العقول أكبر على ورق الترشيح تغطي الأسفنج، التأكد من أن المناطق لم تجف.
- وضع قطعتين تدحرجت من الطين على كلا الجانبين. الحرجة: كما يحدد سمك الطين يمكن تسويتها مقدار نصف الكرة الغربي، ضمان أن الطين هو 10-20% أرق من قشرة الأرض في الأمم المتحدة.
- اضغط برفق شرائح زجاجية ثانية/طبق بيتري صغيرة على القشرة حتى نصف الكرة الأرضية مستوية تماما. للحصول على أفضل النتائج لمنطقة المطلوب، ضع الشريحة الزجاجية أولاً في منطقة كل منها. للحصول على أفضل النتائج للعقول ليسينسيفاليك، ضع الشريحة الزجاجية عرضية في الجزء الجانبي أولاً والضغط تتركز في هذه المنطقة.
- وضع على وزن (مثلاً، يشاهد زجاج سيراميك) على الطبق شرائح/بيتري الزجاج وتتسطح في نصف الكرة الأرضية ح 3-5 في 4 درجات مئوية في الجريدة الرسمية.
- بعد انتهاء التثبيت، الإفراج عن الضغط وإزالة الشرائح الزجاجية. وضع في الأرض في نصف الكرة الأرضية في منهاج عمل بيجين (العائمة الحرة) ح 24 على شاكر عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم تحقيق نتائج أفضل للنشاط histochemical ستينينجس عند استخدام 1% منهاج عمل بيجين. للأخرى ستينينجس، مثل إيمونوهيستوتشيميستري، للأمم المتحدة perfused العقول، 2% يمكن استخدام منهاج عمل بيجين.
رقم 1: التمثيل التخطيطي لسير العمل لتسطيح الفئران القشرية نصف الكرة والتصور من الوحدات النمطية في قشرة سوماتوسينسوري. بعد نضح ترانسكارديال، تم تشريح الدماغ بالماوس (A). تم إزالة الهياكل سوبكورتيكال وكان بقشرة الأرض بين شريحتين من الزجاج في المخزن المؤقت للفوسفات (ب). (ج) الأرض في نصف الكرة بعد إصلاحها، عرضية مقطوع، والملون لنشاط السيتوكروم أوكسيديز (د). تغيير حجم أشرطة = 1 سم. r: روسترال، كودال c:، l: الجانبية والانسي م:. الشكل مقتبس من لوير et al. 23 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
3-قطع مقاطع عرضية
ملاحظة: تبعاً لمتطلبات البروتوكولات المصبوغة، الإجراء القطع وسمك يمكن تكييف. فيبرتوم استخدمت لقطع نصفي الكرة الأرضية لمزيد من histochemical المعالجة (الخطوة 3، 2) في 80-150 ميكرومتر. ومع ذلك، لتجهيز المناعي، المرغوب فيها أقسام أرق ومبضع تجميد كان يستخدم لتقطيع في 10-60 ميكرومتر (الخطوة 3، 3). مشاهدة فيديو 1.
- تغسل الأرض نصف الكرة الغربي في الجريدة الرسمية (0.1M؛ ودرجة الحموضة 7.4) لمدة 15 دقيقة.
- قطع نصف الكرة الغربي على فيبرتوم.
- مكان نصف الكرة عرضية على حامل تشريح. اختيارياً، اضغط مرة أخرى بلطف مع شريحة زجاجية قبل تحديد ذلك في موقف (مثلاً، مع superglue).
ملاحظة: تقليل كمية الغراء التي تستخدم، لأنه يمكن أن يؤدي إلى قطع التحف بسبب سمك صغيرة من الأرض في نصفي الكرة الأرضية. - قطع نصف الكرة الغربي من نهاية أكثر سمكا وأكثر استقرارا نهاية أرق (الخلفي إلى الأمامي، هنا) في السمك المطلوب. انتقل إلى الخطوة 3، 4.
ملاحظة: إذا استخدمت تركيزات منخفضة من التثبيت، قطع في سرعة بطيئة وسعه عالية.
- مكان نصف الكرة عرضية على حامل تشريح. اختيارياً، اضغط مرة أخرى بلطف مع شريحة زجاجية قبل تحديد ذلك في موقف (مثلاً، مع superglue).
- قطع نصف الكرة الأرضية في مبضع تجميد.
- كريوبروتيكت الدماغ بتخبط في محلول سكروز 30% (في الجريدة الرسمية) حتى أنه يغرق.
ملاحظة: تبعاً لحجم الأنسجة يجري كريوبروتيكتيد، غرق في الحل يمكن أن تتراوح بين بضع ساعات إلى بضعة أيام. قد تعتبر الأساليب البديلة كريوبروتيكشن للعقول الكبيرة (انظر روسيني et al. 16). - شكل الثلج قاعدة على مبضع تجميد لتركيب الدماغ. بناء الجليد الأساسي بالجريدة الرسمية على وجه كتلة مبضع تجميد تجميد. الحرجة: ضمان أن سطح قاعدة الجليد موازية بليد مبضع. للقيام بذلك، قطع الجليد فارغ قاعدة استخدام شفرة مبضع لمحاذاة قاعدة الجليد موازية لسطح القطع بالضبط.
- تضمين في الدماغ في تجميد المتوسطة ويتصاعد إلى وجه كتلة مبضع مع مجال اهتمام مواز لمواجهة كتلة. وجه بيل سطح الدماغ نحو مواجهة كتلة مبضع. الحرجة: ضبط درجة حرارة التجميد تبعاً لحجم العينة؛ ارتفاع درجات الحرارة ضمان أفضل قسم السلامة أثناء تقطيع، ولكن أقسام أكبر تتطلب درجات حرارة منخفضة لتجميد نموذج موحد.
- قص الدماغ عرضية في السمك المطلوب (قطع أبطأ وموحدة بسرعة ينتج أفضل جودة للقسم).
- كريوبروتيكت الدماغ بتخبط في محلول سكروز 30% (في الجريدة الرسمية) حتى أنه يغرق.
- أغسل المقاطع في الجريدة الرسمية لمدة 15 دقيقة على شاكر.
1 الفيديو: فيديو التخطيطي وتمزيقها عرضية من قشرة انتورهينال الآنسي الفئران وتخطيط الوحدات باراسوبيكولار وانتورهينال- وهو يقع في نهاية مؤخرة القشرة entorhinal الآنسي قشرة الدماغ القوارض ويميل نحو الجانب الآنسي والبطني. يتم الحصول على مقاطع عرضية حسب توجيه سكين على طول هذه الزاوية. ونتيجة لذلك، نوع الخلية المناسبة تلوين المحددة يكشف عن هياكل نموذجية في قشرة entorhinal الآنسي وباراسوبيكولوم المجاورة. فيديو مقتبس من رأي وبريخت8. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
4-تصور وحدات القشرية استخدام تلطيخ السيتوكروم أوكسيديز
ملاحظة: وضعت للكشف عن histochemical من نشاط السيتوكروم أوكسيديز، مثلاً، أولاً وونغ-رايلي17 مختلف البروتوكولات المصبوغة وتعديلها في وقت لاحق بواسطة ديباك et al. 18 يستند هذا البروتوكول من قبل ديباك et al. 18، حيث يؤدي استخدام سلفات الأمونيوم النيكل (نياس) على النقيض من أعلى وأفضل تعريف الوحدات في المناطق القشرية الملون.
- إعداد أوكسيديز الفسفرة تلطيخ الحل (انظر ديفاك et al. 18)-10 مل من محلول، إضافة: 10 مل حبيس المخزن المؤقت (0.1 م، درجة الحموضة 7.4)، 400 ملغ السكروز، 12.5 mg ونياس، 2 ملغ السيتوكروم ج، 6 ملغ ديامينوبينزيديني (DAB).
تنبيه: الدأب ونياس المسببة للسرطان.
ملاحظة: إضافة الدأب قبل الحضانة للمقاطع. - أغسل المقاطع في حبيس المخزن المؤقت (0.1 م، درجة الحموضة 7.4) على شاكر لمدة 15 دقيقة.
- احتضان المقاطع في الحل المصبوغة على شاكر درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: نلاحظ سرعة تلطيخ. إذا لم يكن هناك أي رد فعل مرئي، تغيير للحضانة عند 37 درجة مئوية. اعتماداً على مقدار التثبيت، تلطيخ يمكن ملاحظتها بعد 10 دقائق أو ساعات عدة. - وقف رد الفعل بإضافة 4% منهاج عمل بيجين؛ وهذا ما يمنع إعادة الموت والزيادة من الإشارات الخلفية غير المرغوب فيها.
- أغسل المقاطع ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت هيبيس لمدة 10 دقائق.
- جبل والجاف للأقسام المتعلقة بالشرائح الزجاجية.
- يذوي المقاطع مع صف الكحول بزيادة:
- يغسل الشرائح في الإيثانول 60% للحد الأدنى 1 يغسل الشرائح في الإيثانول 80% للحد الأدنى 1 يغسل الشرائح في الإيثانول 96% للحد الأدنى 2 يغسل الشرائح في الإيثانول 100% للحد الأدنى 3 يغسل الشرائح في الايزوبروبانول للحد الأدنى 5 يغسل الشرائح في زيلين نفط لمدة 5 دقائق.
- فورا إضافة وسيلة تصلب-تصاعد سريع، وإضافة ساترة. حاسمة: لا تستخدم وسائل التركيب القائم على المياه، كما نياس سوف تغسل والحط من تلطيخ.
- إبقاء الأبواب عند 4 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
5-تصور وحدات القشرية استخدام التلوين المناعي
ملاحظة: تتوفر بروتوكولات متعددة إيمونوهيستوتشيميستري، الأمثل للعينة والنوع من التحقيق. يمكن إجراء التعديلات حسب الاقتضاء، بتركيزات مختلفة من الأجسام المضادة ووكلاء بيرميبيليزينج وأوقات الاحتضان. البروتوكول التالي يؤدي إلى نتائج جيدة للكشف عن مجموعة كبيرة من الأجسام المضادة والتصور بالمسابير الفلورسنت.
- أغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني (0.1 متر؛ ودرجة الحموضة 7.4) لمدة 15 دقيقة.
- اختياري: إجراء استرداد antigen لكشف حانمه استخدام حمام مائي (استناداً إلى جياو et al. 19؛ للأساليب البديلة، راجع بيليري et al. 20).
- يسخن بحمام الماء إلى 80 درجة مئوية. إعداد المخزن المؤقت الصوديوم ثلاثي سترات19 (pH 8.0) وتسخَّن في حمام الماء إلى 80 درجة مئوية.
- نقل المقاطع إلى المخزن المؤقت لسترات الصوديوم الثلاثية. احتضان الفروع لمدة 30 دقيقة عند 80 درجة مئوية
- تبريد الأجزاء وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة
- أغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
- أغسل المقاطع مرتين في برنامج تلفزيوني-X (0.5% تريتون العاشر، في برنامج تلفزيوني 0.1 M) لمدة 15 دقيقة.
- كتلة غير محدد [ابيتوبس] التي تفرخ المقاطع في حل من ألبومين المصل البقري (جيش صرب البوسنة؛ 2.5 ٪) وتريتون العاشر (0.75 في المائة) في برنامج تلفزيوني ح 2.
- احتضان المقاطع في جسم الأولية، مثلاً، كالبيندين-D28k (1:5، 000، 1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني-X)، لمدة 2-3 وفي شاكر عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: تمييع الأمثل لجسم الأساسي يعتمد على جسم معين المستخدمة. راجع معلومات الشركة المصنعة للحصول على تخفيف معايير لجسم معين. أجسام مضادة متعددة يمكن استخدامها معا ولكن يجب أن تثار ضد الأنواع المختلفة. - أغسل المقاطع ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة.
- احتضان المقاطع بين عشية وضحاها في جسم الثانوي (1: 200، 1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني) في 4 درجات مئوية على شاكر.
ملاحظة: يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية متعددة في مختلف الأطياف إذا استخدمت الأجسام الأولية متعددة. - يغسل الجسم المضاد الثانوي بالغسيل المقاطع ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
- جبل والجاف للمقاطع على شريحة زجاجية للفحص المجهري.
ملاحظة: لا يزال ينبغي المقاطع رطبة قبل تصاعد ساترة. - تطبيق المتوسطة التركيب الأنسب للأصباغ الفلورية على قطاعات النسيج وتطبيق ساترة.
- الجاف للمقاطع ح 1.
- للتخزين على المدى الطويل، ختم ساترة استخدام طلاء الأظافر وتبقى في الظلام في 4 درجات مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ونحن الحصول على الأرض الفروع القشرية لقشرة سوماتوسينسوري في مجموعة متنوعة من العقول، والمجهزة لهم السيتوكروم أوكسيديز هيستوتشيميستري لتصور وحدات سوماتوتوبيك تمثل أجزاء مختلفة من الجسم. ويسمح هذا النهج المقارن دراسة تطورية قوات هذا اللحاء الشكل، مثلاً، بعرض تمثيل يحافظ على درجة عالية من بيبرس ميستاسيال في القوارض وارنبيات كبرميل21 (الشكل 2). وفي المقابل، إظهار أجزاء أخرى من الجسم مثل الكفوف والأعضاء التناسلية حجم الاختلافات في أقاربهم ويعكس التخصص مكانة إيكولوجية أو الانتقاء الجنسي22،23.
لفهم بنية القشرة entorhinal الآنسي، حصلنا على أقسام موازية للسطح بيل. وقد تحقق أساسا بتقطيع عرضية من قشرة انتورهينال الآنسي في الفئران والجرذان والخفافيش الفاكهة المصرية. في البشر، بسبب حجم أكبر بكثير وتموجاته أكثر في قشرة انتورهينال، نحن بلطف تسطيح القشرة بعد صنع قطع عرضية من قشرة انتورهينال. في وقت لاحق، cryopreserved جميع العقول ومقطوع على كريوستات في 60 ميكرومتر. Immunohistochemistry قد أنجز في المقاطع التي يتم الحصول عليها مع جسم كالبيندين المضادة، لتصور وحدات الخلايا الهرمية كالبيندين الإيجابية في انتورهينال الآنسي قشرة5 (الشكل 3). كالبيندين--الوحدات النمطية في قشرة انتورهينال تظهر تواتر ملحوظ عبر كل هذه العقول، وتختلف في الحجم بمقدار 10 عبر فقط ~ الاختلاف 20,000-fold في المخ أحجام5.
رقم 2: تخطيط الطوبوغرافية وحدات اللحاء البرميل عبر الثدييات التي حددها هيستوتشيميستري السيتوكروم أوكسيديز- مقاطع عرضية الرابع طبقة من قشرة سوماتوسينسوري الماوس (A)، عضل المنغولية (ب)، والفئران (ج)، ديجو (د)، الهامستر (E)، وارنب (F)، عرض برميل سوماتوتوبيك عالية المصانة تمثيل بيبرس ميستاسيال. تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر. م: الآنسي، الجانبي l:، ص: روسترال، كودال جيم؛ التوجه في ألف ينطبق أيضا على ب-هاء الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تخطيط الدوري entorhinal الآنسي اللحاء الوحدات عبر الثدييات التي حددها إيمونوريكتيفيتي كالبيندين. مقاطع عرضية من الطبقة الثانية من قشرة انتورهينال الآنسي الماوس (A) الفئران (ب)، خفاش الفاكهة المصري (ج) و (د) البشرية، عرض تخطيط دوري مصانة من وحدات الخلايا الهرمية كالبيندين إيجابية. تغيير حجم أشرطة = 250 ميكرومتر. م: الآنسي الجانبي l: الظهرية d:، البطني الخامس:، روسترال r:،، c: كودال؛ التوجه في د ينطبق أيضا على باء، جيم الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم التعرف على نمطية في قشرة الدماغ باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات. خلية الدراسات المحددة عادة أقرب الوحدات القشرية التي تصور أما المناطق كثيفة، أو عدم وجود ألياف1. وقد استخدمت أساليب اللاحقة وجود حزم الجذعية24، أفيرينتس من منطقة معينة25، أو إثراء العصبية26. هنا نظهر اثنين من التقنيات، هيستوتشيميستري السيتوكروم أوكسيديز (ط) و (ثانيا) المناعي تلطيخ.
تلوين السيتوكروم أوكسيديز كانت واحدة من الأساليب الأكثر شيوعاً لتصور الوحدات القشرية، وقد استخدمت على نطاق واسع في27،كورتيسيس الحسية الأولية28. فإنه يتصور الوحدات النمطية تلطيخ أكثر قتامة للمناطق أعلى نشاط المتقدرية17، وبالتالي يتصرف كوكيل للوحدات التشريحية والحصول على ردود وظيفية كبيرة. وقد تم استخدام هذا الأسلوب لتصور الوحدات القشرية سوماتوسينسوري (الشكل 2) والوحدات القشرية في القشرة البصرية27.
أحد المآخذ على تقنيات histochemical التقليدية هو أن التصور نموذجية على جانب مشرق الميدانية الخفيفة الميكروسكوب يحد من العدد من الوحدات النمطية التي يمكن تصور في وقت واحد. ومع ذلك، أساليب المناعي، بالاقتران مع التصور الفلورسنت تحقيقات يمكن أن تستخدم أيضا عرض البروتينات خاصة وتحديد الوحدات القشرية. على سبيل المثال، ثالاميك أفيرينتس للمشروع كورتيسيس الحسية بطريقة سوماتوتوبيك. وهكذا تصور هذه أفيرينتس، باستخدام إيممونوريكتيفيتي VGluT2 أيضا يمكن أن تصور الخرائط الجسم في قشرة somatosensory الأولية التي كنا قد تصور استخدام نشاط السيتوكروم أوكسيديز (الشكل 2). يمكن أيضا استخدام البروتينات انتقائية كعلامات الخلوية لتحديد مجموعات من الخلايا المحددة وراثيا. باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري، حددت مجموعات من الخلايا الهرمية في قشرة entorhinal الآنسي معربا عن البروتين ملزمة الكالسيوم، كالبيندين6 (الشكل 3)، وقرر أن مجموعات من هذا خاصة مصممة وراثيا يتم حفظ مجموعة من الخلايا عبر تطور5، التي تشير إلى المبادئ سليكون المشتركة الكامنة وراء وظيفتها. استخدام فلوروفوريس متعددة، ونحن أيضا تتحدد وحدات متكاملة في قشرة entorhinal الآنسي26، مما يدل على رقائق الموازية التي تكمن وراء الذاكرة المكانية.
تاريخيا، وقد كان مقطوع الدماغ على متن طائرة عادية إلى موضعه في الجسم، وفي توجهات السهمي، الاكليلية، أو الأفقي. المطالبة تحديد الوحدات القشرية، مثل الحقول البرميل في قشرة somatosensory4 أيضا تمزيقها على طول عرضية، وبعد ذلك في الأعمال التحضيرية القشرية مسطح29، وأن كانت حالات متفرقة من هذا القبيل تمزيقها ولاحظ كبير سابق30،31. بعد تحديد القشرة للبرميل، كما تم تحديد الوحدات القشرية الأخرى في القشرة البصرية الأولية27، فضلا عن وجود خريطة الجسم الكامل32 بتمثيل سوماتوتوبيك للجسم في التعليم الابتدائي قشرة سوماتوسينسوري. أقسام الأرض من القشرة البصرية القط كشفت أيضا عن المنظمة الطبوغرافية لاتجاه الأعمدة دون الحاجة لإعادة البناء الإضافي33. كما ثبتت نمطية القشرية في كورتيسيس باراهيبوكامبال، بما في ذلك بريسوبيكولوم وباراسوبيكولوم26،34 و قشرة entorhinal الآنسي6. تسطيح عادة كائن منحنى يستحث التشوهات في التضاريس طبقية-كما يمكن أن يلاحظ من العديد إسقاطات سطح الأرض المنحنى على خريطة مسطحة35. أسلوب التبسيط نسبيا للتعويض جزئيا عن هذه التشوهات عن طريق إدخال النقاط المرجعية على مسافات محددة قبل التسوية، ومن ثم قياس المسافة بينهما بعد التسوية. هذه العلامات ثم أفاد في تقدير كمي التشوهات التي أدخلها في التسوية، بل أيضا توفر نقطة مرجعية سهلة لمحاذاة الأقسام على التوالي. كذلك تشمل الجوانب الحاسمة للحفاظ على الإخلاص الصفحي ضمان التسوية متجانسة عبر المقطع، وأخيراً تمزيقها عرضية بالضبط إلى التخطيط الصفحي للحصول على الأمثل الصفحي الفروع القشرية.
تصور الوحدات القشرية في الأرض مقاطع عرضية لعبت دوراً هاما في الكشف عن علاقات الهيكل-وظيفة رائعة في قشرة الدماغ. تمثيل طبوغرافية لأجزاء الجسم والخط الطولي في قشرة somatosensory الأولية ووجود شبكة التشريحية في رقائق توليد خلايا الشبكة الوظيفية في الفروع القشرية عرضية الأرض تكشف عن رقائق معقدة التفاصيل التي سيكون من الصعب أن نفهم من التوجهات الأخرى. إلا أن تقدم لنا التقنيات الحالية فقط شريحة ثنائية الأبعاد من هذه الوحدات أساسا ثلاثي الأبعاد. باستخدام تقنيات الفلورة وأنسجة تطهير الطرق36،37، سيكون من الممكن تصور هذه الوحدات القشرية ككل وربما تكشف عن زيادة رؤى في فهمنا لخرائط القشرية والوحدات النمطية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أنه أجرى البحث في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن أن يفسر تضارب المصالح محتملة.
Acknowledgments
هذا العمل كان تدعمها "جامعة هومبولت" زو برلين، مركز "برلين علم الأعصاب الحسابية" بيرنشتاين، المركز الألماني لأمراض الأعصاب (دزني) والوزارة الألمانية الاتحادية للتعليم والبحوث (الألمانية، Förderkennzeichen 01GQ1001A)، نيوروكوري، وغوتفريد فيلهلم لايبنتز جائزة DFG. ونحن نشكر شيمبي ايشياما لتصميم الرسوم البيانية ممتازة وديديريتشس جولين للمساعدة التقنية الممتازة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps - Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears - 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- Brodmann, K. Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , Barth. (1909).
- Naumann, R. K., et al. The reptilian brain. Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).
- Kaas, J. H. Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).
- Woolsey, T. A., Van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
- Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex. J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).
- Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex. Science. 343 (6173), 891-896 (2014).
- Wong-Riley, M. T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity. Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).
- Ray, S., Brecht, M. Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex. Elife. 5, e13343 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Olson, S. T., Chuang, Y. J. Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases. Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).
- Paraformaldehyde (PFA; 4%). Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- Sodium phosphate (PB). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex. Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).
- Tootell, R. B., Silverman, M. S. Two methods for flat-mounting cortical tissue. J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).
- Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact. J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol. J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
- Krubitzer, L. The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different? Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).
- Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex. J Comp Neurol. , (2017).
- Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. Vertical bundles of dendrites in the neocortex. Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).
- Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex. J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).
- Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex. Front Syst Neurosci. 11, (2017).
- Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).
- Land, P. W., Simons, D. J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex. J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).
- Welker, C., Woolsey, T. A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse. J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).
- Retzius, G. Die Cajal'schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).
- Cajal, S. R. Histologie du Systeme Nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Talleres Grafios. Montana, Madrid. (1911).
- Chapin, J. K., Lin, C. S. Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats. J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).
- Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).
- Tang, Q., et al. Functional architecture of the rat parasubiculum. J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).
- Snyder, J. P. Map projections--A working manual (Vol. 1395). , US Government Printing Office. (1987).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
