Summary
Denne artikkelen beskriver en detaljert metodikk for å få flat tangentiell deler fra pattedyr halvdelene og visualisere kortikale modulene ved hjelp av histochemical og immunohistochemical metoder.
Abstract
Cortex pattedyr hjerner er parcellated i forskjellige underlag eller moduler. Kortikale moduler vanligvis ligger parallelt kortikale arket, og kan være preget av visse histochemical og immunohistochemical metoder. I denne studien markere vi en metode for å isolere cortex fra pattedyr hjerner og flat dem for å få deler parallelt kortikale arket. Vi ytterligere høydepunkt valgt histochemical og immunohistochemical metoder for å behandle disse flatet tangentiell inndelinger for å visualisere kortikale moduler. I somatosensory cortex av ulike pattedyr utfører vi cytochrome oxidase histochemistry å avsløre kroppen kart eller kortikale moduler som representerer forskjellige deler av kroppen på dyret. I mediale entorhinal cortex, et område der rutene er generert, bruker vi immunohistochemical metoder for å markere moduler av genetisk betinget neurons som er ordnet i et rutenettmønster i kortikale arket over flere arter. Total, vi gir et rammeverk for å isolere og forberede layer-wise flat kortikale deler og visualisere kortikale moduler med histochemical og immunohistochemical metoder i en rekke pattedyr hjerner.
Introduction
Noen av de viktigste endringene i hjernen strukturen over fylogeni kan observeres i hjernebarken. Til tross for betydelige forskjeller, cortex dyr følger vanlig og kan imidlertid grovt deles i to forskjellige måter, med lag og områder1. Kortikale lag ligger parallelt med overflaten av hjernen og varierer i antall fra 3 lag i reptilian halvdelene2 til 6 lag i pattedyr halvdelene1. Kortikale områder derimot er atskilte områder på cortex som i hovedsak tilsvarer forskjellige funksjoner, f.eks, somatosensory cortex er involvert i følelsen av touch eller i hjernebarken i behandling av visuelle innganger. Disse kortikale områder kan ofte deles inn i flekker eller moduler3, som er regelmessig gjentatte anatomiske strukturer, hovedsakelig fant parallelt pial overflaten av hjernen. Kortikale moduler kan være begrenset til en bestemt lag4eller strekker seg over flere lag5.
Snitteprosessen standardmetoder for hjernen innebære deler normalt på overflaten av hjernen, som koronale eller sagittal. Mens disse metodene kan brukes til å visualisere kortikale moduler, kan en rekke interessante funksjoner vises når kortikale modulene er visualisert tangentially, i et fly parallelt på overflaten av hjernen. For eksempel somatosensory moduler i gnager hjernen representerer Visvas, vises som FAT når visualisert normalt på hjernen overflaten, og dermed regionene avlede navnet fat cortex. Imidlertid på å synliggjøre fat i en tangentiell retning, avslører de en whisker-kart, med fat opprettes i en topografiske orientering speiling den eksakte utformingen av kinnskjegg på eksternt organ overflaten. I enkelte tilfeller modulære ordningen har selv flyktet gjenkjenning for betydelig perioder, når visualisert på en ikke-tangentiell måte. Mediale entorhinal cortex, er kjent for tilstedeværelsen av rutenettet celler, neurons som brann i sekskantede mønsteret når et dyr er krysser et miljø. Selv om det er et tungt undersøkte område, inntil nylig, tilstedeværelse av oppdateringer eller moduler av celler i mediale entorhinal cortex, hadde som er fysisk lagt ut i et Sekskantet mønster6, rømt gjenkjenning. Tilstedeværelse og ordning av disse modulene, i rotte hjernen, var tilrettelagt av gjør tangentiell deler av mediale entorhinal cortex og undersøke cytoarchitecture på en layer-wise måte.
Etter snitting kan aspektet av visualisering av kortikale moduler også bli realisert på flere måter. Studier har tradisjonelt vært moduler basert på celle tetthet eller fiber oppsett1. En annen populær tilnærming er bruk av cytochrome oxidase histochemistry, som avslører områder av høyere aktivitet8. Nyere tilnærmingsmåtene er ser på genetisk betinget celletyper, utmerket på grunnlag av deres protein uttrykk profiler6,8.
I denne studien markere vi metoder for å isolere cortex fra pattedyr hjerner få utstrakte tangentiell snitt og visualisere kortikale moduler basert på cytochrome oxidase histochemistry og immunhistokjemi av celle-type spesifikke proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til tyske retningslinjer på dyrevelferd under oppsyn av lokale komiteer (LaGeSo). Menneskelige og bat hjernen data var avledet fra Naumann et al. 5 den følgende prosedyren utføres på en mannlig voksen Wistar rotten (belastning: RJHan:WI).
1. perfusjon og hjernen utvinning
Merk: For å få en homogenously fast og blod-fri hjerne, transcardial perfusjon av dyret er svært oppmuntret, som gjenværende blod øker uspesifikke bakgrunn signal under fargingen. Likevel, det er også mulig å få utstrakte snitt fra un perfused prøven og stain dem. Enkel håndtering prøven varierer med konsentrasjonen av bindemiddel brukes. For lite fiksering øker risikoen for håndtering skade på hjernen under sammenslåing og skjæring, mens for høye konsentrasjoner lavere fleksibilitet for sammenslåing og kvaliteten av flekker.
- Transcardially perfuse dyr, bruker en 23G nål. For en mer detaljert guide, se Gage et al. 9
- Bruk fosfat buffer saltvann10 (PBS, 0.02 M, pH 7.4) å skylle ut blod fra hjernen og kroppen på dyret. Fortsett til tilførsel væske synes klart, med minst 150 mL PBS infundering gjennom det vaskulære systemet.
Merk: Best resultater oppnås ved trykk lignende utvalg av fysiologiske blodtrykket av dyr blir parfyme (f.eks, rotten: 120-130 mmHg). Du kan eventuelt legge heparin (10 U/mL) til løsningen å unngå blod koagulasjon11. - For å fikse hjernen, transcardially sette mot minst 100 mL paraformaldehyde12 (PFA, 4%, i 0.1 M fosfat buffer du (PB)13) til halsen av dyret er stiv.
FORSIKTIG: PFA er et potensielt karsinogen.
Merk: Best for histochemical aktivitet flekker, slik som cytochrome oxidase, resultat, ved 2% PFA. For andre flekker, som immunohistochemistry, 4% PFA foretrekkes.
- Bruk fosfat buffer saltvann10 (PBS, 0.02 M, pH 7.4) å skylle ut blod fra hjernen og kroppen på dyret. Fortsett til tilførsel væske synes klart, med minst 150 mL PBS infundering gjennom det vaskulære systemet.
- Pakk ut hjernen fra skallen.
Merk: Se Gage et al. 9 for detaljer.- Isolere hodet med store saks eller bein saks.
- Med fine saks, kuttet huden langs midtlinjen fra halsen til nese. Dra fra hverandre huden til å utsette skallen. Fjerne nakken og tidsmessige muskler med fine saks.
- Gjøre en midtlinjen skjære gjennom interparietal bein fra de foramen magnum til parietal benet.
- Bruk Rongeurs til å skrelle av interparietal bein. Skyv fine saks langs det sagittal suture og kuttet fra den bakre enden av parietal til den fremre delen av frontal bein.
- Bruk Rongeurs til å skrelle av parietal og frontale ben. Alternativt, løft bein bort ved hjelp av pinsett. Bruk en skje til å kutte ventrale nerve ledninger og fjerne hjernen. Overføre hjernen til PB (0.1 M; pH 7.4).
- Fastsette un perfused hjernen av nedsenking i 4% PFA for 1-3 h på 4 ° C (avhengig av hjernestørrelse og sonde: Troll: ~ 1 h, Human: ~ 3 h).
Merk: For store gyrencephalic hjernen som mennesker, isolere og kutte ut området av interesse å fiksering. - For å oppnå større kortikale områder i en inndeling, flat hjernen før videre etter fiksering; Fortsett med trinn 2. Men for å få deler av vanskeligere å nå områder som mediale entorhinal cortex, etter fikse hjernen i 4% PFA for 24 timer før du går videre til trinn 2.
2. hjernen disseksjon og flatere
- Skille hjernen halvkuler med et barberblad (lissencephalic hjerner) eller skalpell (gyrencephalic hjerner).
Merk: Hvis hjernen ikke er løst etter, er det utsatt for skade ved håndtering. - Valgfritt trinn for å hjelpe etterfølgende delen registrering og krymping estimering:
- Punktering cortex i et område av ikke-rente, med en 35G nål normal til kortikale overflaten. Gjenta trinnet to ganger på definerte avstander langs kortikale arket. For å bestemme avstanden langs kortikale arket, bruk en pre-cut tråd på en fast lengde (f.eks, 5 mm) og legge det langs kortikale overflaten til å se poeng av punktering.
- Lissencephalic hjernen: fjerne subkortikal strukturer ved hjelp av en dissecting slikkepott. Kritisk: Holde hjernen fuktig med PB (0.1 M; pH 7.4) gjennom hele prosedyren.
- Hold hjernen lillehjernen og forsiktig sett spatula for å åpne et disseksjon fly i corpus callosum. Runde tuppen av slikkepott skal peke fra cortex.
- Skyver spatula videre og trekk forsiktig til spatula mellom thalamus og cortex. Separat subkortikal strukturer med skrape bevegelser.
- Inspisere halvkulen for jevn tykkelse.
Merk: Ingen ujevne områder kan resultere i en trans-lags gradient under snitting. Tangentiell snitting bruk skalpell for å gjøre et rent kutt gjennom hjernen, parallelt pial overflaten av regionen som tangentiell deler er ønsket. - Valgfritt trinn for å forbedre flatere kvaliteten:
- Lage et rent kutt gjennom striatum, nucleus accumbens og orbitofrontal cortex, siden de øker tykkelsen på cortex i regionen sideveis. Også legge til en lindrende kutt på basen indre regionen i prefrontal cortex, hvilke innrømmer unfolding mediale deler av cortex.
- Plass halvkulen (cortex vender ned) på et glass lysbilde. Fortsett med trinn 2.6.
- Gyrencephalic hjernen: fjerne hvit substans å utfolde seg gyri (for detaljert protokoller, se: Sincich et al. 14; Tootell og Silverman15). Kritisk: Bruk PB (0.1 M; pH 7.4) for å holde hjernen fuktig hele tiden.
- Sette området av interesse på fuktig filter papir i en stor Petriskål, med cortex grossist.
- Fjern araknoide membran og pia bruker to tang.
- Bruk en fuktig bomullspinne og sett forsiktig i hver sulcus koble adhesjon mellom gyri.
- Snu hjernen ved hjelp av en annen fuktig filter papir.
- Bruk to buet mikro spatler å utfolde seg enkelt gyri. Bruk den konvekse siden av spatler for å erte hverandre hvit saken fram nær den konkave enden av gyrus. Bruk en fuktig bomullspinne og fortsette med virvlende bevegelser å nå den konkave enden av gyrus.
- Erte hverandre enkelt gyri. Eventuelt legge liten lindrende kutter hvis spenningen er for høy.
- Flat ufalsede hjernen i Petriskål eller lignende beholder.
- Eventuelt plassere større hjerner på et filter papir dekket svamp, slik at områdene ikke tørr.
- Plass to rullet stykker av leira på begge sider. Kritisk: Som tykkelsen på leire definerer hvor mye halvkulen kan være flat, sikre at leire er 10-20% tynnere enn un flat cortex.
- Forsiktig trykk en second glass skyve/liten Petriskål på cortex til halvkulen er helt flatt. For å oppnå de beste resultatene for en ønsket region, plass av objektglass først på det aktuelle området. For å oppnå de beste resultatene for lissencephalic hjernen, plasser av objektglass tangentially på den laterale delen først og påfør konsentrert press på dette området.
- Sette en vekt (f.eks, en keramisk se glass) på glass lysbilder/Petriskål og flat halvkule til 3-5 h på 4 ° C i PB.
- I post fiksering, slipp trykket og fjerne glass lysbilder. Sette den sammenslåtte halvkulen i PFA (gratis flytende) 24 h på en shaker på 4 ° C.
Merk: Best resultater for histochemical aktivitet stainings oppnås ved 1% PFA. For andre stainings, for eksempel immunohistochemistry, for un perfused hjernen, 2% PFA kan brukes.
Figur 1: skjematisk fremstilling av arbeidsflyten for sammenslåing av en rotte kortikale halvkule og visualisering av moduler i somatosensory cortex. Etter transcardial perfusjon, hjernen av en mus ble dissekert (A). Subkortikal strukturer ble fjernet og cortex var flat mellom to glass lysbilder i fosfatbuffer (B). Flat halvkule (C) var etter fast tangentially delt og farget cytochrome oxidase aktivitet (D). Skalere barer = 1 cm. R: Rostral, C: Caudal, L: Lateral, M: mediale. Figur tilpasset fra Lauer et al. 23 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. skjæring tangentiell deler
Merk: Avhengig av kravene i flekker protokollene kan kutte framgangsmåten og tykkelse kan tilpasses. En vibratome ble brukt til å kutte halvkuler for ytterligere histochemical behandling (trinn 3.2) på 80-150 µm. Men for immunohistochemical behandling, tynnere delene er ønsket og en frysing mikrotom ble brukt for snitting (trinn 3.3) på 10-60 µm. Se Video 1.
- Vaske den sammenslåtte halvkulen i PB (0.1M, pH 7.4) i 15 min.
- Kutte halvkulen på en vibratome.
- Plass halvkulen tangentially kutting holderen for. Trykk eventuelt på nytt forsiktig med et glass lysbilde før fikse det i posisjon (f.eksmed superglue).
Merk: Redusere lim brukes, fordi kutte gjenstander kan resultere skyldes små tykkelsen på flat halvkuler. - Klipp halvkulen fra tykkere og mer stabil slutten mot tynnere slutten (bakenfor fremre, her) nødvendige tykkelsen. Fortsett med trinn 3.4.
Merk: Hvis lav fiksering konsentrasjoner ble brukt, klippe den på sakte fart og en høy amplitude.
- Plass halvkulen tangentially kutting holderen for. Trykk eventuelt på nytt forsiktig med et glass lysbilde før fikse det i posisjon (f.eksmed superglue).
- Kutte halvkulen på en frysing mikrotomen.
- Cryoprotect hjernen ved å leve det i en 30% sukrose løsning (i PB) før den synker.
Merk: Avhengig av vev blir cryoprotected, synker i løsningen kan variere fra noen timer til noen dager. Alternativ cryoprotection metoder kan anses for større hjerner (se Rosene et al. 16). - Danne en is base på frysing mikrotomen montere hjernen. Konstruere isen base ved å fryse PB i blokk ansiktet til frysing mikrotomen. Kritisk: Kontroller at overflaten av isen basen er parallell til mikrotomen bladet. Dette kuttet tom isen base ved hjelp av mikrotomen bladet nøyaktig justere is basen parallell til skjæring overflate.
- Embed hjernen i iskaldt medium og montere den blokk ansiktet til mikrotomen med området av interesse parallell blokk ansiktet. Møte pial overflaten av hjernen mot blokken ansiktet til mikrotomen. Kritisk: Justere frysing temperaturen avhengig av utvalgsstørrelsen; høyere temperaturer bedre delen integritet under snitting, men større deler krever lavere temperaturer fryse eksempel jevnt.
- Kuttet hjernen tangentially på nødvendige tykkelsen (tregere og ensartet kutte hastigheter føre beste delen kvalitet).
- Cryoprotect hjernen ved å leve det i en 30% sukrose løsning (i PB) før den synker.
- Vask avsnittene i PB i 15 min på en shaker.
Video 1: skjematisk video av tangentiell snitting fra en rotte mediale entorhinal cortex og utformingen av parasubicular og entorhinal moduler. Mediale entorhinal cortex av en gnager hjerne ligger nederst i bakre cortex og beveges mot mediale og ventrale. Tangentiell deler hentes ved å orientere en kniv langs denne vinkelen. Derfor avslører riktig celle-type spesifikk farging modulære strukturer i den mediale entorhinal cortex og tilstøtende parasubiculum. Video tilpasset fra Ray og Brecht8. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
4. visualisering av kortikale moduler bruker Cytochrome Oxidase flekker
Merk: Forskjellige flekker protokoller har utviklet for histochemical påvisning av cytochrome oxidase aktivitet, f.eksførst av Wong-Riley17 og senere endret av Divac et al. 18 denne protokollen er basert på en av Divac et al. 18, siden bruk av nikkel-ammonium sulfate (NiAS) resulterer i en høyere kontrast og bedre definert moduler i farget kortikale områder.
- Forberede cytochrome oxidase flekk løsning (se Divac et al. 18). for 10 mL løsning, legge: 10 mL HEPES buffer (0.1 M, pH 7.4), 400 mg sukrose, 12.5 mg NiAS, 2 mg cytochrome C, 6 mg diaminobenzidine (DAB).
FORSIKTIG: DAB og NiAS er kreftfremkallende.
Merk: Legg DAB like før inkubasjonstiden for deler. - Vask delene i HEPES buffer (0.1 M, pH 7.4) på en shaker i 15 min.
- Inkuber delene i flekker løsningen ved romtemperatur i en shaker.
Merk: Se hastigheten på den flekker. Hvis det er ingen synlige reaksjon, endre til inkubasjon på 37 ° C. Avhengig av fiksering, kan flekker observeres etter 10 min eller i flere timer. - Stoppe reaksjonen ved å legge til 4% PFA; Dette forhindrer uønsket re dø og øke bakgrunn signal.
- Vask delene tre timene benytter HEPES buffer for 10 min.
- Montere og tørr delene på glass lysbilder.
- Tørke delene med en økende alkohol rad:
- Vask lysbildene i 60% etanol i 1 vask lysbildene i 80% etanol for 1 min. vaske lysbildene i 96% etanol for 2 min. vaske lysbildene i 100% etanol for 3 min. vaske lysbildene i isopropanol for 5 min. vaske lysbildene i xylen for 5 min.
- Straks legge til en rask herding-montering medium, og legge til en dekkglassvæske. Kritisk: Bruk ikke vannbasert montering medier, som NiAS vil bli vasket ut og svekke den flekker.
- Hold delene på 4 ° C for langtidslagring.
5. visualisering av kortikale moduler bruker Immunohistochemical flekker
Merk: Flere protokoller er tilgjengelige for immunohistochemistry, optimalisert for prøven og av sonden. Tilpasninger kan gjøres etter behov, av varierende konsentrasjoner av antistoffer, permeabilizing agenter og inkubasjon ganger. Følgende protokollen fører til gode resultater for å oppdage et stort utvalg av antistoffer og visualisering av fluorescerende sonder.
- Vask avsnittene i PBS (0.1 M; pH 7.4) i 15 min.
- Valgfritt: Utfør antigen henting for å avsløre en epitope ved hjelp av et vannbad (basert på Jiao et al. 19; alternative metoder, se Pileri et al. 20).
- Forvarm et vannbad til 80 ° C. Forberede tri-natrium citrat buffer19 (pH 8.0) og Forvarm det i vannbad til 80 ° C.
- Overføre delene til tri-natrium citrat bufferen. Inkuber delene i 30 min ved 80 ° C
- Cool delene til romtemperatur
- Vask avsnittene i PBS i 15 min.
- Vask avsnittene to ganger i PBS-X (0,5% Triton-X, i 0.1 M PBS) i 15 min.
- Blokkere uspesifikke epitopes ved rugende delene i en løsning av bovin Serum Albumin (BSA, 2,5%) og Triton-X (0,75%) i PBS 2 h.
- Inkuber avsnittene i primære antistoff, f.eksCalbindin - D28k (1:5, 000, 1% BSA i PBS-X), 2-3 dager på en shaker på 4 ° C.
Merk: Optimal fortynning primære antistoffer, avhenger av spesifikke antistoffer brukes. Se produsentens informasjon å få fortynning kriterier for et spesifikt antistoff. Flere antistoffer kan brukes sammen, men må fremsettes mot forskjellige arter. - Vask avsnittene tre ganger i PBS i 15 min.
- Inkuber delene overnatter i sekundære antistoff (1:200, 1% BSA i PBS) på 4 ° C i en shaker.
Merk: Flere sekundære antistoffer kan brukes på ulike spektra hvis flere primære antistoffer ble brukt. - Vask av sekundær antistoffer ved å vaske avsnittene tre ganger i PBS i 10 min.
- Montere og tørr delene på et glass lysbilde til mikroskopi.
Merk: Delene skal fortsatt være fuktig før montering på dekkglassvæske. - Bruke montering middels egnet for fluorescens fargestoffer på delene vev og bruke en dekkglassvæske.
- Tørre delene 1t.
- For langtidslagring, seal dekkglassvæske bruker neglelakk og mørkt på 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi fikk flat kortikale deler av somatosensory cortex i en rekke hjerner, og behandlet dem for cytochrome oxidase histochemistry å visualisere somatotopic modulene som representerer ulike kroppsdeler. Denne sammenlignende kan studere evolusjonære krefter at figuren cortex, f.eksviser høyt konservert representasjon av mystacial vibrissae i gnagere og lagomorpha som FAT21 (figur 2). Derimot viser andre kroppsdeler som labber og kjønnsorganene variasjoner i deres slektning størrelse og reflektere spesialisering en økologisk nisje eller seksuell seleksjon22,23.
For å forstå arkitektur mediale entorhinal cortex, fikk vi deler parallelt med pial overflaten. Dette var hovedsakelig oppnås ved tangentiell snitting av mediale entorhinal cortex i mus, rotter og egyptiske frukt ball. Hos mennesker flatet på grunn av betydelig større størrelse og mer undulations i entorhinal cortex, vi forsiktig cortex etter gjør en tangentiell kutt på entorhinal cortex. Deretter alle hjernen var cryopreserved og delt på en kryostaten på 60 µm. Immunohistochemistry ble utført på delene innhentet med et anti-calbindin antistoff, visualisere calbindin-positive pyramideformet celle modulene i den mediale entorhinal cortex5 (Figur 3). Calbindin-modulene i entorhinal cortex viser en bemerkelsesverdig periodisitet på tvers av alle disse hjerner, og varierer i størrelse med bare en faktor på 10 over ~ 20,000-fold variasjon i hjernen størrelser5.
Figur 2: topografiske utformingen av fat cortex moduler over pattedyr identifisert av cytochrome oxidase histochemistry. Tangentiell deler av lag IV fra somatosensory cortex (A) musen, (B) Mongolsk gerbil, (C) rotte, (D) Degus, hamster (E), (F) kanin, viser fat som en høyt konservert somatotopic fremstilling av mystacial vibrissae. Skalere barer = 500 µm. M: mediale L: Lateral R: Rostral, C: Caudal; Orientering i A gjelder også B-E. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: periodiske utformingen av mediale entorhinal cortex moduler over pattedyr identifisert av calbindin immunoreactivity. Tangentiell deler fra lag II av mediale entorhinal cortex (A) musen, (B) rotte, (C) egyptiske frukt balltre og (D) menneskelig, viser en bevart periodiske utformingen av calbindin-positive pyramideformet celle moduler. Skalere barer = 250 µm. M: mediale L: Lateral D: Dorsal, V: ventrale, R: Rostral, C: Caudal; Orientering i D gjelder også B, C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modularitet i hjernebarken har blitt identifisert ved hjelp av en rekke teknikker. De tidligste studier identifiseres kortikale modulene ved å enten visualisere celle tett regioner eller fravær av fiber1. Etterfølgende metoder har utnyttet tilstedeværelsen av dendrittiske bunter24, afferente fra en bestemt region25eller berikelse nevrotransmittere26. Her viser vi to teknikker, (i) cytochrome oxidase histochemistry og (ii) immunohistochemical flekker.
Cytochrome oxidase flekker har vært en av de mest populære metodene for å visualisere kortikale moduler, og har vært mye brukt i de primære sensoriske halvdelene27,28. Det visualiserer moduler av flekker mørkere for områder av høyere mitokondrie aktivitet17, og dermed fungerer som en proxy for anatomiske moduler som framprovosere betydelig funksjonelle reaksjoner. Denne metoden er brukt til å visualisere somatosensory kortikale moduler (figur 2) og kortikale moduler i hjernebarken27.
En av ulempene med tradisjonelle histochemical teknikker er at deres typiske visualisering av lys-feltet * lys begrenser antallet moduler som kan visualiseres samtidig. Men kan immunohistochemical metoder, i Bøyning med fluorescerende visualisering sonder benyttes for å vise spesielle proteiner og identifisere kortikale moduler. For eksempel thalamic afferente til sensorisk halvdelene prosjektet på en somatotopic måte. Dermed visualisere disse afferente, bruk VGluT2 immunoreactivity kan også brukes til å visualisere kroppen kartene i primære somatosensory cortex som vi har visualisert cytochrome oxidase aktiviteten (figur 2). Selektiv proteiner kan også brukes som mobilnettet markører av genetisk definerte celler. Bruker immunohistochemistry, vi identifisert klynger av pyramideformet celler i mediale entorhinal cortex uttrykke kalsium bindende protein, calbindin6 (Figur 3) og bestemt at klynger dette gener cellegruppen er bevart over utviklingen5, som indikerer felles microcircuit prinsipper sin funksjon. Bruker flere fluorophores, avgrenset vi også komplementære moduler i den mediale entorhinal cortex26, demonstrere parallelle microcircuits som ligger til grunn romlig minne.
Historisk har hjernen blitt delt i en skjæringsplanet til sin posisjon i kroppen, i enten sagittal, koronale eller vannrett orientering. Identifikasjon av kortikale moduler som FAT feltene i somatosensory cortex4 også bedt snitting langs en tangentiell og flat kortikale forberedelser29, isolerte tilfeller av slike snitting var observert mye tidligere30,31. Etter identifikasjon av fat cortex, ble andre kortikale moduler også identifisert i de primære hjernebarken27, samt tilstedeværelsen av en hele kroppen kart32 med en somatotopic representasjon av kroppen i primær somatosensory cortex. Utstrakte snitt av katten hjernebarken avslørte også topografiske organiseringen av retning kolonner uten behov for ekstra rekonstruksjoner33. Kortikale modularitet har også blitt vist i parahippocampal halvdelene, inkludert presubiculum og parasubiculum26,34 og mediale entorhinal cortex6. Vanligvis flatere en buet objektet induserer skjevheter i laminær topografi - som kan observeres av mangfoldet av projeksjoner av buet jordoverflaten på et flatt kart35. En relativt enkle metoden å delvis kompensere for disse skjevheter er innføring referansepunkt på definerte avstander før sammenslåing og deretter måle avstanden mellom dem etter sammenslåing. Disse merkene så ikke bare subserve ved kvantitativt estimering skjevheter introdusert av sammenslåing, men også gi en enkelt referansepunkt for å justere etterfølgende avsnittene. Videre viktige aspekter for å bevare laminær gjengivelse inkludere homogen sammenslåing delen, og endelig snitting nøyaktig tangentiell laminær oppsettet å få optimalisert laminær kortikale deler.
Visualisering av kortikale moduler i utstrakte tangentiell snitt har spilt en viktig rolle i avslørende fascinerende struktur-funksjon relasjoner i hjernebarken. Topografiske representasjon av whisker og kroppsdeler i primære somatosensory cortex og tilstedeværelsen av en anatomisk rutenettet i microcircuits generere funksjonelle rutene i utstrakte tangentiell kortikale snitt avsløre intrikate microcircuits detaljer som ville være vanskelig å forstå fra andre retninger. Men gi vår nåværende teknikker bare en todimensjonal stykke modulene i hovedsak tredimensjonale. Bruker immunofluorescence teknikker og vev fjerne metoder36,37, ville det være mulig å visualisere disse kortikale moduler som helhet og kanskje avsløre ytterligere innsikt i vår forståelse av kortikale kart og moduler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av noen kommersielle eller økonomiske relasjoner som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Humboldt-Universität zu Berlin, Bernstein Center for beregningsorientert nevrovitenskap Berlin, tyske senter for nevrodegenerative sykdommer (DZNE), tysk Federal Utdannings og forskning (BMBF, Förderkennzeichen 01GQ1001A), NeuroCure og Gottfried Wilhelm Leibniz prisen på DFG. Vi takker Shimpei Ishiyama for god grafisk design og Juliane Diederichs for utmerket kundestøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytochrome oxidase staining | |||
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| 3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Ammonium nickel(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | A1827 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antigen retrieval | |||
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffer/phosphate-buffered saline/prefix/PFA | |||
| Potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth | 3904.2 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265.1 | |
| Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Carl Roth | 4984.3 | |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| TRITON-X 100 | Carl Roth | 3051.3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Calbindin D-28k puriefied from chicken gut, Mouse monoclonal | Swant | RRID: AB_10000347 | |
| Calbindin D-28k from recombinant rat calbindin D-28k, Rabbit polyclonal | Swant | RRID: AB_10000340 | |
| Albumin Fraction V, biotin free | Carl Roth | 0163.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mounting or freezing media | |||
| Fluoromount (immunofluorescence) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Eukitt (histochemistry) | Sigma-Aldrich | 03989 | |
| Tissue freezing medium | Leica Biosystems | NC0696746 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol dehydration | |||
| Ethanol 100% | Carl Roth | 9065.3 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth | P075.3 | |
| 2-Propanol | Carl Roth | 6752.4 | |
| Xylene substitute | Fluka | 78475 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Devices/tools | |||
| Microm HM 650V | Thermo Scientific | ||
| Jung RM2035 | Leica Biosystems | ||
| Dumont #55 Forceps - Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5 Forceps - Inox Biology Tip | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Dumont #5SF Forceps - Inox Super Fine Tip | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Bone Shears - 24 cm | Fine Science Tools | 16150-24 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Blunt Scissors | Fine Science Tools | 14000-18 | |
| Surgical Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- Brodmann, K. Vergleichende Lokalisationslehre der Grosshirnrinde in ihren Prinzipien dargestellt auf Grund des Zellenbaues. , Barth. (1909).
- Naumann, R. K., et al. The reptilian brain. Curr Biol. 25 (8), R317-R321 (2015).
- Kaas, J. H. Evolution of columns, modules, and domains in the neocortex of primates. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (Supplement 1), 10655-10660 (2012).
- Woolsey, T. A., Van der Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex: the description of a cortical field composed of discrete cytoarchitectonic units. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
- Naumann, R. K., Ray, S., Prokop, S., Las, L., Heppner, F. L., Brecht, M. Conserved size and periodicity of pyramidal patches in layer 2 of medial/caudal entorhinal cortex. J Comp Neurol. 524 (4), 783-806 (2016).
- Ray, S., Naumann, R., Burgalossi, A., Tang, Q., Schmidt, H., Brecht, M. Grid-layout and theta-modulation of layer 2 pyramidal neurons in medial entorhinal cortex. Science. 343 (6173), 891-896 (2014).
- Wong-Riley, M. T. Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity. Trends Neurosci. 12 (3), 94-101 (1989).
- Ray, S., Brecht, M. Structural development and dorsoventral maturation of the medial entorhinal cortex. Elife. 5, e13343 (2016).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Olson, S. T., Chuang, Y. J. Heparin activates antithrombin anticoagulant function by generating new interaction sites (exosites) for blood clotting proteinases. Trends Cardiovasc Med. 12 (8), 331-338 (2002).
- Paraformaldehyde (PFA; 4%). Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- Sodium phosphate (PB). Cold Spring Harb. Protoc. , (2006).
- Sincich, L. C., Adams, D. L., Horton, J. C. Complete flatmounting of the macaque cerebral cortex. Visual Neurosci. 20 (6), 663-686 (2003).
- Tootell, R. B., Silverman, M. S. Two methods for flat-mounting cortical tissue. J Neurosci Methods. 15 (3), 177-190 (1985).
- Rosene, D. L., Roy, N. J., Davis, B. J. A cryoprotection method that facilitates cutting frozen sections of whole monkey brains for histological and histochemical processing without freezing artifact. J Histochem Cytochem. 34 (10), 1301-1315 (1986).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Divac, I., Mojsilovic-Petrovic, J., López-Figueroa, M. O., Petrovic-Minic, B., Møller, M. Improved contrast in histochemical detection of cytochrome oxidase: metallic ions protocol. J Neurosci Methods. 56 (2), 105-113 (1995).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. J Pathol. 183 (1), 116-123 (1997).
- Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the SmL face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
- Krubitzer, L. The organization of neocortex in mammals: are species differences really so different? Trends Neurosci. 18 (9), 408-417 (1995).
- Lauer, S. M., Lenschow, C., Brecht, M. Sexually selected size differences and conserved sexual monomorphism of genital cortex. J Comp Neurol. , (2017).
- Fleischhauer, K., Petsche, H., Wittkowski, W. Vertical bundles of dendrites in the neocortex. Anat Embryol. 136 (2), 213-223 (1972).
- Bernardo, K. L., Woolsey, T. A. Axonal trajectories between mouse somatosensory thalamus and cortex. J Comp Neurol. 258 (4), 542-564 (1987).
- Ray, S., Burgalossi, A., Brecht, M., Naumann, R. K. Complementary Modular Microcircuits of the Rat Medial Entorhinal Cortex. Front Syst Neurosci. 11, (2017).
- Livingstone, M. S., Hubel, D. H. Thalamic inputs to cytochrome oxidase-rich regions in monkey visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (19), 6098-6101 (1982).
- Land, P. W., Simons, D. J. Cytochrome oxidase staining in the rat SmI barrel cortex. J Comp Neurol. 238 (2), 225-235 (1985).
- Welker, C., Woolsey, T. A. Structure of layer IV in the somatosensory neocortex of the rat: description and comparison with the mouse. J Comp Neurol. 158 (4), 437-453 (1974).
- Retzius, G. Die Cajal'schen zellen der grosshirnrinde beim menschen und bei säugetieren. Biol Unters. 5, 1-9 (1893).
- Cajal, S. R. Histologie du Systeme Nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Talleres Grafios. Montana, Madrid. (1911).
- Chapin, J. K., Lin, C. S. Mapping the body representation in the SI cortex of anesthetized and awake rats. J Comp Neurol. 229 (2), 199-213 (1984).
- Löwel, S., Freeman, B., Singer, W. Topographic organization of the orientation column system in large flat-mounts of the cat visual cortex: A 2-deoxyglucose study. J Comp Neurol. 255 (3), 401-415 (1987).
- Tang, Q., et al. Functional architecture of the rat parasubiculum. J Neurosci. 36 (7), 2289-2301 (2016).
- Snyder, J. P. Map projections--A working manual (Vol. 1395). , US Government Printing Office. (1987).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
