Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Стандартные измерения перепада Transepithelial потенциал слизистой (NPD)

doi: 10.3791/57006 Published: September 13, 2018

Summary

Здесь мы представляем стандартизированный протокол для измерения носовой разность потенциалов (NPD). Кистозный фиброз регулятор трансмембранной проводимости (МВТР) и эпителиальных натрия канала (ENaC) функции оцениваются изменения напряжения в через носовой эпителий после superfusion решения, которые изменяют канала активности ионов, предоставляя результат измерения.

Abstract

Мы описываем стандартизированных измерение разности потенциалов носовой (NPD). В этой технике регулятор трансмембранной проводимости кистозный фиброз (МВТР) и функцию эпителиальной натрия канал (ENaC) контролируются изменением напряжения через носовой эпителий после superfusion решения, которые изменяют ионного канала деятельности. Это возможно путем измерения разности потенциалов между подкожной отсека и эпителия дыхательных путей в ноздрю, используя катетером при контакте с нижней носовой раковины.

Тест позволяет измерение напряжения стабильной базовой и последовательных напряжению изменения после перфузии 100 мкм амилорид, ингибитор реабсорбции Na+ в растворе Рингера; хлоридно свободный раствор, содержащий Амилорид для привода хлорид секрецию и 10 мкм isoproterenol в растворе хлоридно свободный с Амилорид стимулировать циклический аденозинмонофосфат (лагерь)-зависимых хлорид проводимости, относящиеся к МВТР.

Этот метод имеет преимущество демонстрации электрофизиологических свойств двух ключевых компонентов, создания гидратации поверхности жидкости сократимость эпителия дыхательных, ENaC и МВТР. Таким образом это средство полезно исследования для этапа 2 и доказательство концепции испытаний агентов, которые нацелены МВТР и ENaC активности для лечения заболевания легких кистозный фиброз (CF). Это также ключевые процедуры последующих действий создать МВТР дисфункции, когда генетическое тестирование и тестирование пота неопределенны. В отличие от пота хлорид тест относительно более трудоемким и дорогостоящим. Это также требует обучения операторов и опытом для эффективного проведения теста. В этой технике, особенно в молодых или отказывающихся предметов было сообщено subject и внутри изменчивости. Чтобы помочь с этой озабоченностью, интерпретация была улучшена через недавно одобренного алгоритм.

Introduction

Общая цель этого метода является измерить носовой разность потенциалов (NPD) которая направлена расследовать транс эпителиальных ионного транспорта в естественных условиях1. Эта техника позволяет измерение натрия (Na+) и хлорид (Cl) транспорта. NPD был использован в качестве исследовательского инструмента с конца 80-х и был принят в 1998 году в качестве диагностической процедуры муковисцидоз Foundation (CFF) консенсуса заявление2 и в 2017 году в руководящих принципах диагностики консенсуса муковисцидоз Foundation (ФФС) 3. действительно, биологических МВТР дисфункции, которая является причиной CF, подтверждается увеличение поглощения Na+ в апикальном мембрана и дефект в Cl секреции. Этот функциональный тест обеспечивает преимущество инструмент дополнительной диагностики, когда генетика является неоспоримым в больных с неопределенным промежуточных пота теста результаты3. Хотя эта информация может быть также получено кишечных текущего измерения биопсий (ICM), ICM, однако, только в несколько центров во всем мире и нуждается в дальнейшем стандартизации. NPD более доступен в приблизительно 60 глобальных центров и, Кроме того, цели эпителия дыхательных, который является основным местоположением болезни.

Учитывая информацию, которую он предоставляет МВТР деятельности, он также используется в доказательство концепции исследования, стремясь оценить функциональное восстановление МВТР белка модулятор терапии4,5,6,7, 8. Действительно, данные исследований с редактирования мРНК/ген МВТР МВТР potentiator и Корректор терапии, выделить значительные изменения в Cl и Na+ транспорта с терапии6,9 и подтверждает, что NPD может быть чутко конечная точка в клинических испытаниях. Как нам не хватает чувствительных клинические конечные точки может обнаружить тонкие изменения в клиническое состояние пациента в краткосрочной перспективе, этот доклинических биомаркёра может быть весьма информативным. Быстро расширяет поле МВТР модулятор терапии и нам срочно нужны тесты в естественных условиях , способны быстро расшифровать активных соединений перед большой этап 3 испытания10.

Физиологическое обоснование метода основан на измерении разности потенциалов между эпителия дыхательных путей в ноздрю и подкожной отсека. Ионный канал деятельности изучаются путем измерения стабильной максимальной базовых разность потенциалов (PD), его изменения после блокирования ENaC связанных с Na+ поглощения и вождения Cl секреции через различные апикальной Cl транспортеры включая МВТР. МВТР дисфункции отображается с минимальными изменениями в разность потенциалов при стимуляции секреции Cl через лагеря зависит от пути и увеличение ENaC опосредованной поглощения Na+ как обнаружены более негативные базовые разность и расширение ответ на амилорид. Механистический основы для CF по сравнению с нормальной PD приводится на рисунке 1.

Figure 1
Рисунок 1: резюме фигура ионного канала активности. (A) Ион деятельность эпителия дыхательных демонстрируя сбалансированной деятельности ENaC и МВТР в обычные предметы и (B) потеря активности МВТР, что приводит к увеличилось ENaC опосредованной транспорт натрия и снижается МВТР зависимых хлорид транспорта. ENaC: эпителиальный натриевых каналов, Na+: натрия, МВТР: кистозный фиброз трансмембранного регулятор, CL: хлорид, МВ: милливольт, PD: разность потенциалов, мин: минута/s пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Однако этот тест демонстрирует определенную степень изменчивости как на повторные измерения в пределах той же пациентки и среди пациентов с же генотипом. Это имеет огромное значение для облегчения интерпретации изменений после лечения модулятор. Кроме того мы все еще не проверенных порогов, проведения различий между CF и здоровых испытуемых. Это может частично объясняться различия между наличием клинических средств и методов, используемых. Таким образом значительные международные усилия, направленные на стандартизации теста продолжается. НАС ФФС-TDN (муковисцидоз Foundation-терапии развития сети) и ECFS-CTN (Европейский муковисцидоз общества-клинические испытания сети) создал NPD стандартные оперативные процедуры (СОП) для использования в многоцентрового и научно-исследовательских испытаний. Этот недавно совместной работы CTN и TDN привело к комбинированные, международные СОП, объединяя опыт CTN и TDN (2014)11. Этот документ представляет протокол и тест методы для того, чтобы нанимать NPD для диагностики CF или следователь начало судебных разбирательств доказательства в концепция. Каждый центр реализации метода отвечает за применение ее институциональных исследований человеческого этики Комитету для утверждения.

Figure 2
Рисунок 2: схема всего рекомендуется установка NPD. Обратите внимание, что рекомендуемые установки показано, в том числе последовательный перфузии насосы и установки серии 4-стоп кран. В СОП показаны конкретных соединений и примеры компонентов. (Диаграмма изменения с разрешения от Соломона, г.м. грудь, 201013) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Общий поток экспериментальной изложена в Рисунок 2, согласно которому NPD измеряется между осмотра моста, позиционируется на мосту эпителия поверхности и ссылка помещены в подкожной пространстве, оба связаны с электродами и высокоомные вольтметр.

Это обеспечивается 2 различных систем: есть 2 установок электрода приемлемыми ссылка: (i) сбалансированный Ag/AgCl электродов и электрокардиограммы (ЭКГ) мост крем заполнены подключен к подкожного пространства незначительные ссадины или (ii) насыщенных каломель Half-Cells и агар заполнены 22 - для 24-иглы введен подкожно. Контакт для слизистой оболочки носа включена по двойной просвета катетера. Один люмен заполнены с агар или ЭКГ крем и подключен к измерительного электрода, другой позволяет перфузии на слизистую оболочку носа различных решений.

Кончик знакомства труб помещается на слизистую оболочку дыхательных под нижней носовой раковины (рис. 3).

Figure 3
Рисунок 3: размещение изучения труб на слизистую оболочку дыхательных. (A) внешний вид показаны размещения. (B) Rhinoscopic вид, демонстрируя размещения. (C) диаграмма указанием анатомического расположения для размещения катетера. PD: разность

Для изучения реакции PD несколько препаратов, superfusion решения применяются через второй просвета катетера. Есть несколько ключевых шагов относительно подготовки и проведения измерений NPD, которые подробно описаны ниже в протоколе, от первоначальной подготовки для анализа данных.

После подготовки решений и электродов адекватного качества тестирования электродов и катетеры позволяет для основных проведения теста. Базальные измерения производятся вдоль нижней носовой раковины, которая позволяет выбрать лучшее место для измерения, обычно, с самым негативным измерения. Затем последовательно орошений определить Na+ (ENaC) и Cl (МВТР зависимые) ионов потока через изменения напряжения через носовой эпителий.

Protocol

Протокол, с участием человека предметов был одобрен Комитетом исследования всех участвующих институтов. Каждый центр реализации метода отвечает за применение ее институциональных исследований человеческого этики Комитету для утверждения.

1. решение подготовка

  1. Подготовка решений #1, #2 и #3, которые являются базовые решения, в пакетах 1 Л до процедуры и хранимые на местах (таблица 1).
    Примечание: Амилорид светочувствительных и должны храниться в темноте (см. таблицу 1 для решения композиции) (см. СОП для подготовки подробного решения11).
    1. Помещать в буфер все решения в рН 7,4 и 0,22 мкм фильтром бутылку топ.
    2. Для решения #3 сначала добавьте фосфат содержащие соли, дать им возможность ионизировать для предотвращения кристаллизации (см. в таблице 2 для решения композиции).
      Примечание: Последовательность смешивания имеет решающее значение для решения #3.
    3. Храните эти решения на 4 ° C (стабильный за 3 месяца) или при-20 ° C (стабильный на 6 месяцев).
    4. Подготовка решений #4 и #5, добавив агенты на день тестирования NPD. Isoproterenol свет и окисления чувствительных и он теряет свою активность при комнатной температуре (демонстрации 4% распада более 4 ч в 4 – 8 ° C). Хранить при 4 ° C.
      Примечание: СПС является свет и окисления чувствительных (см. таблицу 3).
Соединение Молекулярная масса Концентрация (мм) Композиция (г/Л)
NaCl 58 148 8.58
CaCl2 2 H2O 147 2.25 0,33
KCl 75 4.05 0,3
K2HPO4 174 2.4 0.42
KH2 PO4 136 0.4 0.05
MgCl2 6 H2O 203 1.2 0,24

Таблица 1: Раствор состава.

Соединение Молекулярная масса Концентрация (мм) Композиция (г/Л)
Na глюконат 218 148 33,26
Глюконат CA 430 2.25 0,97
K глюконат 234 4.05 0,95
K2 HPO4 174 2.4 0.42
KH2 PO4 136 0.4 0.05
MgSO4 7 H2O 246 1.2 0,24

Таблица 2: Решение композиции.

Решение Решение номер Содержание EDC Марк
Звонарей инъекций Решение № 1/А Буферизованный звонарей для инъекций ЗВОНАРЕЙ
Звонарей + Амилорид Решение № 2/B Буферизованный звонарей + 100 мкм Амилорид АМИЛ
Нулевой Cl + Амилорид Решение № 3/C Буфер нулевой Cl + 100 мкм Амилорид OCL
Нулевой Cl , амилорид + isoproterenol Решение № 4/D Буфер нулевой Cl + 100 мкм Амилорид + 10 мкм isoproterenol ISO
Нулевой Cl+ isoproterenol + Амилорид СПС Решение № 5/E Буфер нулевой Cl + 100 мкм Амилорид + 10 мкм isoproterenol + 100 мкм СПС ATP

Таблица 3: Список решение.

2. катетер

  1. Использование ПВХ, стерильные, одного использования, 2 люменов (0.7 мм внутренний Ø) катетер с круглой и гладкой конечности (2,5 мм Наружный Ø), который разработан специально для NPD.
    1. Установить контакты с слизистую оболочку на стороне отверстие, 2 мм до кончика с отверстием на вершине для перфузии (см. шаг 10.1).
    2. Подключите один из этих двух подключений Luer-lock катетера измерительного электрода и другое одно к перфузионного насоса. Используйте канал, окрашенных в синий как измеряя люмен. Тег катетер на каждом интервале 0,5 см на 10 см.
      Примечание: Мертвое пространство-0,3 мл. Предпочтительнее использовать описанную выше процедуру для подготовки катетер если это не представляется возможным выполнить следующие два шага.
    3. Вырежьте равных (~ 76 см) длины трубки катетера PE50 и PE90.
    4. Прикрепите их вместе в 1 см кусок кремния резиновой трубки. Вставьте 25 G тупым кончик иглы ожидающий в противоположном конце трубы PE-90. Вставьте 25 G Бабочка иглы ожидающий в противоположном конце трубки PE50, убедившись, что не прокол трубы, как это делается.

Figure 4
Рисунок 4: катетер используется для измерения NPD. Врезные окно демонстрирует катетера с измерительного отверстия.

3. Подготовка агар кожи мост (Бабочка иглы) и катетер

Примечание: Манипуляции расплавленный агар может вызвать ожоги, и это должно быть сделано с осторожностью.

  1. Подготовка 3% агар, смешивая 3 g агар с 100 мл раствора #1 в широкий рот бутылку. Расплава агар в микроволновой печи до растворимые (прозрачный).
    1. Заполните шприц 10 мл теплой агар.
    2. Подключите шприц впоследствии к Бабочка иглы (23 G) и отмеченные просвета катетера. Придать агар, пока он не появится на кончике.
    3. Позвольте ему остыть по крайней мере 10 минут.
    4. Убедитесь, полностью заполнены и визуализированы быть свободным от пузырьков воздуха мост кожи и катетер.
    5. Хранения сыпучих кожи мостов в #1 на 4 ° C и не использовать после 1 недели.

4. Если использование ЭКГ крем

  1. Разбавьте ЭКГ крем с решением #1 (1:1, v/v Рингера). Пусть пока без воздушных пузырьков.
    1. Заполните шприц 10 мл разбавленной ЭКГ крем.
    2. Подключите шприц к заметному просвета катетера и медленно вводить ЭКГ крем, до тех пор, пока он появится на нижней стороне отверстие.
    3. Убедитесь, что катетер полностью заполнены и без воздушных пузырьков.

5. система сбора данных

Примечание: Общие установки система сбора данных показано на рисунке 5.

Figure 5
Рисунок 5: Настройка системы сбора данных. Демонстрируя соединения bioamplifier и headstage для интерфейса компьютера, а также подключения электрода в headstage11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Соединения
    1. Подключите компьютер к системе сбора данных (Таблица материалов) с помощью кабеля USB.
    2. Для подключения к bioamplifier система сбора данных, подключите BNC кабель от канала 1 вход на системе сбора данных (спереди) выход на bioamplifier (бэк).
    3. Подсоедините bioamplifier к headstage с пользовательских кабель предварительно headstage винты в входной части передней bioamplifier.
    4. Подключите headstage электродов и земли электрода. Используйте стандартный 2 мм женщина женщина разъемы для подключения передней headstage к электродам.
      Примечание: Порт утоплена и подходит только одно направление 2 мм кабеля: красный измерительный электрод для пациента носа (через носовой катетер); Черный-ссылка электрода к мосту кожи пациента; Белый для ЭКГ электродов заземлен для субъекта кожи.
    5. Установите bioamplifier как описано: смещение: потяните, чтобы активировать, включите для регулировки, оставить в запрашиваемой позиции после перестройки; Напряжение: DC; 1 МВ cal: нейтральную позицию; Мощность: На сбор данных, Выкл для зарядки батареи; Прибыль: Установка до 10; Полосовые: LoFreq (космического ручку): DC; Полосовые: HighFreq (внутренние ручки): 1 кГц; Объем: выкл.

6. Настройка смещения головы этап

  1. Подключите ноутбук и усилитель в последовательности, как указано в СОП11. Включите систему сбора данных, а затем ноутбук (последовательность имеет важное значение для программного обеспечения признать аппарат используется для сбора данных).
    1. Отрегулируйте смещение головы-этап согласно последовательности СОП.

7. смещения

Примечание: Существует несколько смещения, чтобы быть проверены для обеспечения стабильности системы электрические измерения. (см. рис. 6)

  1. Для смещения электродов место электрод сравнения (отрицательный) и измерительного электрода (положительные) вместе в разреженных ЭКГ крем или 3 M KCl. Убедитесь, что разность потенциалов, читая между электродами близок к нулю на headstage.
    1. Для создания моста смещение катетера и/или кожи, место Luer-lock конец носовой катетер или Luer-lock конце моста кожи в ванну с измерительного электрода (положительные). Поместите другой конец катетера в ЭКГ крем Ванна или 3 M KCL, содержащий ссылку (отрицательный) электрода обеспечение того, что разность потенциалов близок к нулю на headstage.
    2. Чтобы настроить смещение замкнутой, убедитесь, что цепь закрыт при замене носовой катетер в ванне электродов. Проверьте, что замкнутой смещение чтения около 0 mV (= «смещение»; ± 2,5 МВ). Отрегулируйте ручку смещения headstage довести смещение 0 mV.
      Примечание: Это подтверждает, что все соединения в цепи нетронутыми. Если это не так, носовой катетер не может быть нетронутыми (воздушные пузыри в агар или крем ЭКГ). Измените моста агар или толкать крем ЭКГ в установке. Смещение электрода должны быть выполнены прежде, последовали закрытые системы (замкнутой смещение) с электродом и мост (рис. 6).

Figure 6
Рисунок 6: Настройка смещение электрода (A), (B) катетера (или мост) смещение, смещение замкнутой (C).

8. шприц Set-up

Примечание: Ниже приводится рекомендуемая настройка.

  1. Оттепель решения #1, #2 и #3 примерно 1 час перед измерением.
    1. Подключите к запорный ближе к катетер расширение линии.
    2. Включите все насосы и промойте катетер с решением #1 полностью очистить от катетер пока запорные краны ясно пузырьков.

9. размещение ссылок и измерения электрод

Figure 7
Рисунок 7: Субъект с измерительным электродом и подкожной мост готов к измерениям.

  1. Были предметом исследования принять в положении сидя перед оператором NPD. Для большего комфорта место ноги на дополнительный антистатический коврик и голову на остальной ортоптическое Чин.
    1. Подключите электрод свинца местах на ЭКГ площадку на руку субъекта (рис. 7).
    2. Вставить подкожные иглы в спинной предплечья (агар системы) либо применить электрод сравнения к ЭКГ крем на область ранее минимально прошлифовать на предплечье (см. пункты 7 – 10 ниже).
    3. Проверьте подключение к подкожного пространства путем измерения разности потенциалов с кожей (палец PD) и просят тему закрыть «измеряя дыра», щипать катетера между кончик его большим и указательным пальцем.
    4. Если палец PD -30 mV или более негативным, проверьте вставки Бабочка иглы. Повторите истиранию (для ЭКГ крем set-up) и проверьте мостов.
    5. Запустите решение #1 шприцевый насос на 80 мл/ч начала с правую ноздрю.
    6. Измерить PD палец как устойчивый отрицательного напряжения (типичный диапазон от -40 до -80 МВ).
    7. При использовании системы крем ЭКГ: разбавить ЭКГ крем 1:1 и заполнить катетер после полного флеша от из зонда дыра, как ранее видели для агар.
    8. Подключите катетер к 50 мл шприц, наполовину заполненный кремом ЭКГ электродов, позволяя проверить смещение электрода и мост от множества купаться.
    9. Подключите ссылка Ag/Cl электрода к подкожного пространства, незначительные предыдущих минимальный ссадины кожи, кожа будет отображаться «розовый и блестящие» когда будет достигнут уровень дермы.
    10. Расположите измерительного электрода, покрытые ЭКГ крем на кожу прошлифовать. Проверьте палец PD, как ранее показанный для агар системы.

10. Измерение базальной PD

  1. Вставьте носовой катетер в правую ноздрю, освещающей rhinoscope (или эквивалент) для визуализации нижней носовой раковины. Использование передней оконечности как ориентир, заранее катетер, ориентация уступает сайт нижней носовой раковины на слизистую оболочку дыхательных путей. В качестве альтернативы если размещение является сложным, дыра зонда могут быть размещены в контакте с полом ноздрю.
    Примечание: Катетер является достаточно жесткой, чтобы руководствоваться оператора в ноздрю. Для облегчения размещения, один канал катетера окрашен в синий и содержит зонд стороне отверстие при контакте с нижней носовой раковины. Это предотвращает вращение катетера. Указанную на катетер от 1 до 10 см обеспечивают легкий опорных точек.
    1. Измерьте PD на нижней носовой раковины. Для этой цели убедитесь, что измерения отверстием катетера закрыт путем ее размещения против слизистой оболочки нижней носовой раковины (Марк право базальной на).
    2. Измерить PD, 3.0, 2.0, 1.5, 1.0 и 0,5 см (расстояние в пределах уступает слухового прохода от нижней носовой раковины): Марк право базальной PDs.
    3. Сохранить каждое измерение, на заданном расстоянии приблизительно 5 s каждый обеспечить постоянное чтение (± 1 mV) и для облегчения точной интерпретации базальной PD ценностей.
    4. Повторите действия, описанные в левую ноздрю, используя функциональную клавишу левой базальной PDs (3 см, 2см и т.д.) и слева базальной на.
    5. С помощью базальной PD меры как руководство, щуп носовой катетер на сайт наиболее негативный сигнал (до 3 см от передней оконечности нижней носовой раковины) и безопасный с небольшой кусок ленты на кончике носа (или эквивалент).

11. NPD трассировки последовательный орошений

  1. Для правую ноздрю
    1. Убедитесь, что решение капает из носа пациента. У субъекта себя удобную позицию с их головы вниз (часто помогал, имея отдыха их голову на руки или использовать chinrest или других иммобилизации устройства). Напомните предметом к минимуму движение и не прикасайтесь к носу или трубы и избегать разговоров.
    2. Поверните решение #1 (Ringers) насос (5 мл/мин или 300 мл/ч). Запись до тех пор, пока стабильное значение получается (< 1 mV изменения/30 сек).
      Примечание: Это занимает около 3 минут для достижения стабильности.
    3. Выключите перфузии с решением #1.
    4. Запустите перфузии с решением #2 (амилорид). Запись NPD минимум 3 мин (если напряжение плато в сомнения, продолжить запись для до 5 мин).
    5. Запустите перфузии с решением #3 (Zero хлорид). Запись NPD минимум 3 мин (если плато напряжения не является стабильным, продолжить запись для до 5 мин).
    6. Запустите перфузии с решением #4 (Isoproterenol). Запись NPD минимум 3 мин [если плато напряжения не является стабильным (постоянное напряжение трассировки для по крайней мере 30 s < 1 mV дрейфа), продолжить запись для до 5 мин].
    7. Запустите перфузии с решением #5 (АТФ). Запись NPD не менее 1 мин, пока не получается пик гиперполяризирующий ответ.
    8. Включите перфузии с решением #1 (Ringers) и позволяют 30 s для сброса катетера.
    9. Выключите перфузии решение #1.
    10. Повторите эту процедуру для левую ноздрю.

12. конец теста

  1. Проверьте и записывать стабильной палец PD («пост палец») для 5 s.
    1. Удаление субъекта кожный мост и повязка с сайта вставки на коже. Для системы крем AgCl/ЭКГ удалите электрода от руки.
    2. Запись напряжения «Окончательный закрыто петля смещение», как описано для измерения смещение начального замкнутой (см. шаг 7.1.3).
    3. Марк окончательный смещение с функциональной клавиши.
    4. Остановить сбор данных (нажмите «начать»).
      Примечание: Текущий СОП рекомендует использовать 100 мкм СПС для того чтобы активировать purinergic кальция зависимых Cl секреции, в качестве позитивного элемента управления для тестирования; Однако это дополнительный тест.

Representative Results

В нормальной сократимость эпителия Na+ поглощения является основной Ион транспортной деятельности. Это приводит к негативным сократимость поверхности разность отношении интерстиция. Перфузии ENaC канала блокатор Амилорид приводит к менее негативные разность потенциалов. Затем, superfusion Cl-бесплатное решение создает химических градиент для Cl-, который создает более негативные разность потенциалов и активирует все перевозчики Cl , включая МВТР. Далее Isoproterenol, который увеличивает внутриклеточную лагерь, увеличивает секрецию Cl активируя специально МВТР и увеличивает разность потенциалов.

Напротив CF предметам, отсутствует или неблагополучных МВТР приводит к увеличению ENaC опосредованной Na+ поглощения12. В результате разность базовых более негативными. Деполяризации, наблюдается с применением Амилорид больше, тогда как минимальный или никаких изменений в разность потенциалов при стимуляции секреции Cl зависимых путями МВТР. Это можно увидеть в представительных Прориси в рисунке 8показаны «здоровый» против «CF» Прориси.

Figure 8
Рисунок 8: представитель Прориси «здоровый» темы и темы с сравни PD: разность потенциалов, ΔAmiloride: Дельта амилорид, 4с 0 Cl: низкая хлорид: изменения в PD между завершением решения #2 и #4 решения перфузии, S1-S4: этапы 1-4, зеленая линия на графиках A и B указывают NPD трассировки и черный стрелки показывают разницу в разности потенциалов

Discussion

В естественных условиях, NPD предоставляет уникальный измерения, которые могут выполняться неоднократно на основе продольных и демонстрирует, что с повторных измерений, аналогичные продольной результаты наблюдаются на group-wise и индивидуальной основе14, 15. Существует убедительные доказательства того, что NPD имеет отличные дискриминации ценностьь для разграничения CF от не CF. 25 исследования последовательно показали статистически значимой разницы в Cl и Na+ проводимость между пациентами с CF и здорового управления10. В то время как несколько ранее разработанной индексы демонстрации этой способности, мы ожидаем, что новые обновления необходимы, учитывая недавние стандартизации методологии7,8.

Модификации и устранение неполадок

Этот тест требует несколько основных шагов для обеспечения точных измерений. Это включает смещение замкнутой электродов и катетеры обеспечить выполнение системы к рекомендуемым стандартам. Пациенты должны оставаться по-прежнему и воздерживаться от говорить как это минимизирует артефакты и катетер смещения. Это затрудняет тест в некооперативных больных и техника поступили только в одном исследовании у детей до 6 лет7лет.

Предварительная инспекция носовой эпителий необходимо обеспечить, что не существует корки или слизь на эпителий, который может повлиять на измерения.

Очень важно необходимо отметить, что место размещения катетера является предметом обсуждения. СОП, представленные здесь использует измерения под нижней носовой раковины (ИТ). Размещение катетера под его была стандартизирована в многоцентровых исследованиях и, таким образом, это рекомендуемый метод. С отверстие сбоку катетер, который может быть трудно поддерживать фирма контакт со слизистой оболочки носа, находясь в контакте с решения производится измерение под его. Другие группы могут измерить PD на носовой этаже, который является технически проще. Важно отметить, что Вермюлен (2011) продемонстрировал, что 2 методы являются сопоставимыми16.

Потепление решения остается предметом дискуссии между европейскими и центры США17,18. Она пропагандируется что использование решений при 37 ° C вместо 22 ° C увеличивает наблюдаемое общее хлорид ответ приблизительно 25% и isoproterenol зависимых хлорид ответ приблизительно 95%18. Однако потепление увеличивает изменчивость, как оцениваются более стандартное отклонение всего хлорид ответ17. Поэтому как потепление решения является дополнительным фактором изменчивости, рекомендуется не для того, чтобы согреть решения, если требуется на основе исследования.

Мы ранее сравнить оба электрода методы и обнаружили, что каломель, так и AgCl электродов системы аналогичным образом действовали в базальную и стимулированную течений в обычные предметы13.

Ограничения метода

Этот тест является предметом значительной изменчивости в пределах субъекта. Изменчивость скоринга особенно распространена в больных с неопределенным Прориси и это должны быть учтены для диагностики приложения19. Изменчивости факторами острого верхних дыхательных путей, обширные носовые полипы, предварительного синуса хирургия и CF-связанных воспаление, которые уменьшают его специфичность и чувствительность20,10. Кроме того, интерпретация Прориси могут отличаться между читателей, хотя эксперт читателей продемонстрировать отличные соглашения количественные скоринга и интерпретируемость CF и-CF Прориси, контрастируя с значительной изменчивости в доверия трассировки19.

Внутренняя изменчивость против существенных порогов

Очень важно, что физиологические изменчивость измерения является значительным, как показано в различных исследованиях10, такие испытания терапии гена МВТР, которые продемонстрировали значительную изменчивость в изменения в общем объеме перевозок хлорида и Амилорид диапазон2221,. Поперечного сечения оценки предполагает, что нулевой Cl плюс isoproterenol ответ выше порога -5 -7 mV является светотеневой границы между CF и предметы-CF10.

Мы тем не менее отсутствие четкого знания о величину изменения этого параметра, представляющих эффективной коррекции МВТР в испытаниях фаза II с болезнью, изменении терапии. Для оценки индивидуального ответа, повторные тесты контроля ответ на вмешательство может потребоваться выделить значительные изменения от внутренней изменчивости. Очень важно, что будущие долгосрочные исследования с болезнью, изменяя наркотиков должны продемонстрировать, что улучшение МВТР функции коррелирует с улучшением в клинически значимых исходах или суррогатных исходов (например, увеличение ОФВ1) МВ болезни. Действительно последний этап II Ivacaftor исследование продемонстрировало отмечены положительные клинические результаты, несмотря на небольшое улучшение секреции хлорид23.

Такие исследования поможет установить, если порогового значения улучшения в транс эпителиальных Clпроводимость может быть параметром суррогат для клинические выгоды. Это будет важным параметром для направления развития МВТР модификации терапии.

Значение в отношении существующих методов: пот тест и кишечные текущего измерения (ICM)

У больных с '' сомнительных '' кистозный фиброз как оценку промежуточных пота концентрация Cl между 30 и 60 мм, NPD композитный баллов чувствительный инструмент для диагностики пациентов '' CF-скорее '' и '' CF-вряд ли ''10 . Кишечные измерения тока (ICM), который обеспечивает ex vivo измерение чистой Cl потоков через ректальной эпителий, также позволяет определение остаточного МВТР функции с высокой чувствительностью, потому что МВТР высоко выражается в Этот эпителий.

Учитывая изменение функции МВТР МВТР модуляторы, связь между эти различные изменения биомаркеров МВТР в настоящее время неясно. Хотя недавние работы на основе Ivacaftor определено что NPD и пот тест коррелированных4, не еще не было установлено, если измерения в дыхательных путях лучше предиктором дыхательных исход чем, например, потом протестировать24 , 25 или изменения в ICM. Кроме того модификатор препараты также могут отличаться в конкретные недостатки их органа. Что касается NPD важно отметить, что изменения в базальной PD и Амилорид ответ Экспресс Na+ транспорта, в то время как изменения в 0 Cl и isoproterenol реакции Экспресс транспорт Cl . Это еще не устанавливается, какие из них более важным для мелиорации болезни.

Будущее применение этой техники

Ожидается, что использование этой техники вне поле CF. Поскольку этот метод уникально подходит для демонстрации+ Na и Cl ионного канала, он может применяться для демонстрации дисфункции заболеваний дыхательных путей, включая астмы26,27хронический бронхит, бронхоэктатическая болезнь-CF28 и рецидивирующий панкреатит29. Кроме того изменения этой техники использовались в нижних дыхательных путей (LAPD) для демонстрации ниже airways сосредоточены МВТР дисфункции в хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) пациентов с хроническим бронхитом30.

NPD обеспечивает чувствительных в vivo биомаркеров МВТР функции, которая может использоваться для обоих диагностики и, Кроме того, для доказательства в концепция исследования, стремясь исправить МВТР и ENaC канала активности в трансляционного исследования. Это позволяет Продольная Оценка транс эпителиальных функции и перспективным в качестве стратегии для персонализированной медицины адаптировать наиболее эффективным корректором для каждого пациента с CF.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Рабочей группой для МВТР функции Комитета по стандартизации (клинические испытания сети, Европейское общество муковисцидоза) и национальных ресурсов центр рабочей группе (сеть развития терапии, кистозный фиброз Фонд). Дополнительная поддержка была оказана Фондом CF (Clancy FY09 для GMS) и низ (DK072482 СМР и GMS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KD Scientific infusion pump (or equivalent – such as programmable infusion pumps provided by the institution/hospital) Fisher Scientific
Powerlab 4/30 AD Instruments
BMA-200 AC/DC portable bioamplifier AD Instruments
IS0-Z isolation headstage for BMA-200 AD Instruments
Windows compatible PC - Minimum requirements of Windows XP or higher Various
AD Instruments software: GLP Client V6 (Windows) or higher AD Instruments
ECG electrode (ground for study subject) Hospital standard
2 mini calomel reference electrodes Fisher Scientific 13-620-79
Potassium Chloride KCl, Granular – USP, formula weight 76, qty: 500 gm Spectrum
Sterile container (such as specimen collection container , or similar) to be used for KCl calomel bath, with holes cut in lid to hold electrodes in place. (If not provided by electrode manufacturer.) Hospital standard
2 electrodes: Ag/AgCl 8 mm TP electrode BIOPAC Systems UNSHLD-EL258
2 Ag/AgCl electrodes, B0194, plug 4 mm SLE Instruments
Signacreme® Conductive Electrode Cream Fisher Scientific Parker Labs ref # 17-05
Skin abrasion device PROMED Feeling Ref 374901
Hi Di 541 M, Diamond tipped dental burrs Ash Instruments
Becton Dickinson PE 50 tubing Fisher Scientific 427411
Becton Dickinson PE 90 tubing Fisher Scientific 427421
Silastic tubing, 0.062” ID, 0.095” OD Fisher Scientific 508-007
Micropore Surgical Tape Paper (25 mm x 9.1 m) 3M 1530-1
Marquat double lumen catheter Length: 80 cm; Outer diameter: 2.5 mm; Internal diameter of the channels: 0.8 mm; Distance of the side-holes to the tip: 2 mm. EU label Agreement for NPD: I0202US Marquat I0202US
1" X 10 yards silk tape 3M Durapore 1538-1
IV extension tubing (30", 50/box) International Limited IMN30
Three-way stopcock (50/box) Medex MX5311L
Sterile syringe filters (ANOTOP 25 sterile 50 pk; 0.22-μm or smaller filters; or equivalent) Fisher Scientific 09-926-7
Becton Dickinson Intramedic Luer stub adapter (20 G, for connection to PE90 if using nasal catheter produced at study site) Fisher Scientific 427564
Becton Dickinson 23 G, 0.75” Vacutainer (“butterfly”) needles (0.6 mm x 19 mm; 50 U/box) (for connection to PE50) if using nasal catheter produced at study site) Fisher Scientific 367283
Becton Dickinson Syringe 60 mL without needle Luer-Lok tip (40/Box) Fisher Scientific 309653
Becton Dickinson Syringe 10 mL without needle Luer-Lok tip (100/Box) Fisher Scientific 309604
Single use sterile wipes (per institutional availability) Hospital standard
70% EtOH (1 pint), Aaper Alcohol and Chemical Co. catalog number NC9274019 (or equivalent) Fisher Scientific
Corning single use sterile bottle-top filters, 0.22 μm pore size (0.15 – 1.0 L volumes acceptable) Fisher Scientific 430624
Buffer Cert Ph 10.00 (1 L Sn04332) – for pH meter calibration Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 4.00 (1 L Sn04327) – for pH meter calibration Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 7.00 (500 mL Sn04328) – for pH meter calibration Fisher Scientific
Disposable underpads (Blue Pads; 23" x 36" 150/Box; or equivalent per hospital standard) SureCare
23 G, 0.75” Vacutainer “butterfly” needles (0.6 mm x 19 mm; 50 U/box) Becton Dickinson 367283
Difco Laboratories Agar (Noble 100 g 0142-15-2; or equivalent) Fisher Scientific
Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (or equivalent) Fisher Scientific
Welch Allyn Convertible Handle Battery 72300 (or equivalent) OR Otoscope with battery Fisher Scientific
Head and chin rest (or equivalent; optional) Richmond Products, Inc 629R
Static Dissipative Anti-Fatigue Matting  (or equivalent) Fisher Scientific No. 791
REAGENTS FOR SOLUTIONS MIXED ON SITE
Sodium Chloride, Granular – USP NaCl Spectrum Formula Weight: 58; Size: 500 gm
Calcium Chloride CaCl2 •2H2O – USP Spectrum Formula Weight: 147; Size: 500 gm
Magnesium Chloride Hexahydrate Crystal, MgCl2•6H2O – USP Spectrum Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Dibasic, Anhydrous, Granular, KH2PO4 – USP Spectrum Formula Weight: 174; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Monobasic Crystals – NF (KH2PO4) Spectrum Formula Weight: 136; Size: 500 gm
Sodium Gluconate- USP (monosodium salt) Spectrum Formula Weight: 218; Size: 500 gm
Calcium Gluconate – USP (Anhydrous Powder) Spectrum Formula Weight: 430; Size: 500 gm
Potassium Gluconate- USP (Anhydrous) Spectrum Formula Weight: 234; Size: 500 gm
Magnesium Sulfate Heptahydrate – USP MgSO4•7H2O Spectrum Formula Weight: 246; Size: 500 gm
Amiloride HCl – USP Spectrum Formula Weight: 302; Size: 5gm
Adenosine 5’-Triphosphate (ATP) (Disodium salt) Spectrum Formula Weight: 551; Size: 5 gm
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Crystal – USP MgCl2•6H2O Spectrum Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Double-distilled water (ddH2O) Hospital Pharmacy Formula Weight: NA; Size: 1 L
Isoproterenol HCL Injection - USP 1 mg/5 mL ampule Hospital Pharmacy Formula Weight: 248; Size: single use
Ringers Injection, USP or Ringers Irrigation Hospital Pharmacy Formula Weight: NA; Size: 5 L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosenstein, B. What is a Cystic Fibrosis Diagnosis? Clinics in Chest Medicine. 19, 423-441 (1998).
  2. Rosenstein, B., Cutting, G. R. The Diagnosis of Cystic Fibrosis: A Consensus Statement: Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. The Journal of Pediatrics. 132, 589-595 (1998).
  3. Farrell, P. M., et al. Diagnosis of Cystic Fibrosis: Consensus Guidelines from the Cystic Fibrosis Foundation. The Journal of Pediatrics. 181, S4-S15 (2017).
  4. Mesbahi, M., et al. Changes of CFTR functional measurements and clinical improvements in cystic fibrosis patients with non-p.Gly551Asp gating mutations treated with ivacaftor. Journal of Cystic Fibrosis. 16, 45-48 (2017).
  5. Accurso, F., et al. Sweat chloride as a biomarker of CFTR activity: proof of concept and ivacaftor clinical trial data. Journal of Cystic Fibrosis. 13, (2), 139-147 (2014).
  6. Accurso, F., et al. Effect of VX-770 in Persons with Cystic Fibrosis and the G551D-CFTR Mutation. New England Journal of Medicine. 363, 1991-2003 (2010).
  7. Sermet, I., et al. Measurement of nasal potential difference in young children with an equivocal sweat test following newborn screening for cystic fibrosis. Thorax. 65, (6), 539-544 (2010).
  8. Wilschanski, M., et al. Mutations in the Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator Gene and In vivo Transepithelial Potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174, (7), 787794 (2006).
  9. Sermet-Gaudelus, I., et al. Clinical Phenotype and Genotype of Children with Borderline Sweat Test and Abnormal Nasal Epithelial Chloride Transport. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182, (7), 929-936 (2010).
  10. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate endpoint? European Respiratory Journal. 14, 38 (2013).
  11. US CFF-TDN (Cystic Fibrosis Foundation-Therapeutics Development Network) and the ECFS-CTN (European Cystic Fibrosis Society- Clinical Trials Network). Standard Operating Procedure 528.01. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). (2014).
  12. Knowles, M., et al. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in CF. New England Journal of Medicine. 305, (25), 1489-1493 (1981).
  13. Solomon, G. M., et al. An international Randomised Multicentre Comparison of NPD Techniques. Chest. 138, 919-928 (2010).
  14. Sermet, I., et al. Chloride Transport in Nasal Ciliated Cells of Cystic Fibrosis Heterozygotes. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171, 1026-1031 (2005).
  15. Naehrlich, L., et al. Nasal potential difference measurements in diagnosis of cystic fibrosis: an international survey. Journal of Cystic Fibrosis. 13, (1), 24-28 (2014).
  16. Vermeulen, F., et al. Nasal potential measurements on the nasal floor and under the inferior turbinate: Does it matter? Pediatric Pulmonology. 46, (2), 145-152 (2011).
  17. Bronsveld, I., et al. Influence of perfusate temperature on nasal potential difference. European Respiratory Journal. 42, 389-393 (2013).
  18. Boyle, M., et al. A multi-center study on the effect of solution temperature on nasal potential difference measurements. Chest. 124, (2), 482-489 (2003).
  19. Solomon, G. M., et al. A Multiple Reader Scoring System for Nasal Potential Difference Parameters. Journal of Cystic Fibrosis. 16, (5), 573-578 (2017).
  20. Beekman, J. M., et al. CFTR functional measurements in human models for diagnosis, prognosis and personalized therapy: Report on the pre-conference meeting to the 11th ECFS Basic Science Conference, Malta, 26-29 March 2014. Journal of Cystic Fibrosis. 13, 363-372 (2014).
  21. Accurso, F., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363, 1991-2003 (2010).
  22. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38, 59-69 (2011).
  23. Accurso, F., et al. Sweat Chloride as a biomarker of CFTR activity: proof of concept and Ivacaftor clinical trial data. Journal of Cystic Fibrosis. 13, (2), 139-147 (2014).
  24. Rowe, S., et al. Clinical Mechanism of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Potentiator Ivacaftor in G551D-mediated Cystic Fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190, (2), 175-184 (2014).
  25. Boyle, M., et al. A CFTR corrector lumacaftor and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. The Lancet Respiratory Medicine. 2, (7), 527-538 (2014).
  26. Schulz, A., Tummler, B. Non-allergic asthma as a CFTR-related disorder. Journal of Cystic Fibrosis. 15, (5), 641-644 (2016).
  27. Sloane, P. A., et al. A pharmacologic approach to acquired cystic fibrosis transmembrane conductance regulator dysfunction in smoking related lung disease. PLoS One. 7, (6), e39809 (2012).
  28. Bienvenu, T., et al. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Channel Dysfunction in Non-Cystic Fibrosis Bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181, (10), 1078-1083 (2010).
  29. Werlin, S., et al. Genetic and electrophysiological characteristics of recurrent acute pancreatitis. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 60, (5), 675-679 (2015).
  30. Dransfield, M. T., et al. Acquired Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Dysfunction in the Lower Airways in COPD. Chest. 144, (2), 498-506 (2013).
Стандартные измерения перепада Transepithelial потенциал слизистой (NPD)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Solomon, G. M., Bronsveld, I., Hayes, K., Wilschanski, M., Melotti, P., Rowe, S. M., Sermet-Gaudelus, I. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). J. Vis. Exp. (139), e57006, doi:10.3791/57006 (2018).More

Solomon, G. M., Bronsveld, I., Hayes, K., Wilschanski, M., Melotti, P., Rowe, S. M., Sermet-Gaudelus, I. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). J. Vis. Exp. (139), e57006, doi:10.3791/57006 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter