Summary
エピジェネティックなメカニズムは、神経膠腫で頻繁に変更されます。クロマチン免疫沈降は、クロマチン構造と遺伝子の転写を調節するヒストンの修正の変更から発生する神経膠腫の遺伝子変異の結果を研究に使用できます。このプロトコルはマウスの脳腫瘍細胞のネイティブのクロマチン免疫沈降をについて説明します。
Abstract
エピジェネティック修飾は、開発と神経膠腫の進行に関与する可能性があります。メチル化とプロモーターのアセチル化の腫瘍のサプレッサー遺伝子の規定する領域で変更できる遺伝子発現の変化につながるし、脳腫瘍の病因に重要な役割を果たします。ネイティブのクロマチン免疫沈降 (チップ) は、変更または DNA と密接に他の蛋白質の検出を可能にする一般的な手法です。ネイティブのチップで、架橋のチップとは対照的細胞は DNA にタンパク質を共有リンクするホルムアルデヒドと扱われない。これは、時々 架橋のみ一過性 DNA と対話し、遺伝子調節の機能的意義を持っていないタンパク質を定めることができるので有利です。さらに、抗体は固定されていないペプチドに対する一般に します。したがって、抗体の特異性はネイティブのチップに増加します。ただし、ネイティブ チップのみ適用されるヒストンや DNA にしっかりと結合する他の蛋白質を研究する心に留めて重要です。このプロトコルはマウスの脳腫瘍細胞のネイティブのクロマチン免疫沈降をについて説明します。
Introduction
エピジェネティックなイベントは頻繁に神経膠腫、腫瘍発症の重要な役割を果たす可能性が高い。確かに、小児の悪性グリオーマの変異遺伝子ヒストン H3.3 と H3.1 頻繁に発生する1。突然変異のヒストンの修正に影響を与える主要なエピジェネティックな影響2,の3を持っている.大人のスペクトルに思春期、イソクエン酸脱水素酵素遺伝子 1/2 (IDH1/2)、α KG 依存ヒストンと DNA ・ デ ・ methylasaes、阻害する突然変異の再発突然変異と ATRX DAXX など他のクロマチンの規制当局における遺伝的変化発生する4. したがって、クロマチン構造と規制ヒストン修飾、ターンでは、腫瘍細胞のトランスクリプトームの劇的な影響を与えるのエピジェネティックな調節物質に影響を与える突然変異の変更の研究に非常に重要です。
クロマチン免疫沈降 (チップ) はゲノム5,6、7のエピジェネティックな修飾の影響を評価するために使用する強力なツールです。ネイティブ ・ チップ、クロマチンはミクロコッカスヌクレアーゼ (MNase)、興味の蛋白質に対する抗体を用いた免疫沈降したと消化され、沈澱クロマチン複合6からの DNA の精製し。細胞は、この手法はしっかりと DNA6と相互作用するタンパク質の研究に適用プロシージャの間に固定されていません。架橋の不在エイズ抗体の特定性の抗体が固定されていないペプチッドまたは蛋白質の7に対して通常発生しますので。さらに、架橋ステップがないのでこれは非固有およびない規制7、8にある一時的な蛋白質 DNA の相互作用の修正の可能性を低減します。チップは、特定のゲノム領域でのヒストンの修正の濃縮を識別するために使用できます。ここで、神経膠腫のマウス ・ モデルを設計から遺伝的生成細胞 (NS) でネイティブ チップを実行するためのプロトコルは詳細します。
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Protocol
ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ミシガン大学によって承認されています。
1. 脳腫瘍 NS と培養条件の世代。
- ダルベッコ変更イーグル培地/F12B27 サプリメント (1 x)、N2 サプリメント (1 x)、および抗菌剤で神経幹細胞培地 (NSC) を準備します。ひと遺伝子組換え血管内皮成長因子 (EGF) と基本的な線維芽細胞成長因子 (FGF) 20 ng/mL の各最終濃度使用日 NSC 媒体を補完します。
- 特発性脳腫瘍9を生成する新生児の側脳室に癌遺伝子や腫瘍のサプレッサーをターゲット shRNA プラスミドは注入された眠れる森の美女トランスポゾン システムを使用してマウスの脳腫瘍を誘発します。生物発光イメージング ヒンシツ大型の腫瘍を持つマウスを選択します。
注: Calinescuらで使用される睡眠美容トランスポゾン システムおよびプラスミドの構造に関する詳細な情報を見つけることができます。9。- マウスを画像の腹腔内 26 ゲージの針を使用して 30 mg/mL ルシフェリン溶液 100 μ L を注入します。
- ルシフェリンの注射後 5 分 2% イソフルランに設定酸素/イソフルラン フローと麻酔室を用いた動物を麻酔します。
- 動物を麻酔するとき (通常 2-3 分) 2% イソフルランに設定酸素イソフルランと発光室に動物を配置。動物が 5 分以上麻酔の場合、麻酔中の乾燥を防ぐために眼軟膏を使用します。
- 体内光イメージング システム、次のパラメーターを使用してマウスを画像: 自動露出、大きなビニング、絞り f = 1。それに大きな腫瘍を考慮すべきパラメーターは発光 > 106光子/s/cm2/sr。
- 安楽死させる密閉室内イソフルレン吸入麻酔薬の過剰摂取でマウス、動物は麻酔、つま先ピンチによるチェックとマウスの首をはねます。
- 脳を抽出し、Calinescuらで前述のようにそれを解剖9。
- 10 cm シャーレに脳を配置します。誘導される腫瘍は、蛍光蛋白質を表現、解剖顕微鏡蛍光蛍光に適切なチャネルと 0.3 倍にセットを使用はそれ以外の場合組織の色と質感の違いによって腫瘍を識別します。メスや鉗子を使用して通常の脳から腫瘍を区切ります。
- ペトリ皿の中の小さな断片に腫瘍をミンチします。NSC の中の 300 μ L で 1.5 mL チューブに切り裂かれた腫瘍を配置します。
- 円錐形遠心チューブの壁に腫瘍を優しく均一にフィットする使い捨てプラスチック ペレット杵を使用します。細胞分離用培地 1 mL を追加し、37 ° C で 5 分間サンプルをインキュベート
注: 杵の使用は、いくつかの細胞を殺すかもしれない。リーダーがセル実行可能性を最大化する場合、杵の使用は省略できます。 - 70 μ m 携帯こし器を通ってステップ 1.7 から細胞懸濁液を渡すし、25 ml の NSC の中のストレーナーを洗浄します。
- 室温で 5 分間 300 x グラムの懸濁液を遠心、上清をデカント、NSC 媒体の 6 mL にペレットを再中断します。
- T-25 培養用フラスコ ステップイン 1.9 から腫瘍細胞懸濁液をプレートし、95% 空気と 5% CO2の大気と組織文化のインキュベーターで 37 ° C で培養します。通常 3 日後、いくつかの死んだ細胞、付着細胞と培地でフロート NS を形成細胞の混合物があります。
- 15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を転送マイクロ ピペットを使用して底に沈む細胞のみを収集し、再 T-75 培養フラスコにそれらをプレートします。
- 比較的高密度 (1-3、T-25 の 10 の6セル X) のセルを維持します。合流しているとき、セルを通過します。
注: 密度球のサイズによって決定されます。ブラック センター大球平均の中心で死んでいるセルは、セルがすぐに継代することを示すこと。 - 成長因子を追加 (EGF および basic FGF; 20 ng/mL) 3 日おき。セルが合流し中ターン ライト オレンジではない場合は、媒体を変更します。
- 媒体を変更するには、古い媒体を収集し 5 分間室温で 300 × g で遠心分離し、再手順 1.1 で指定した濃度で EGF と FGF NSC 培の細胞ペレットを中断します。
注: 場合、球は、半ば-高密度が、継代する準備ができていません (球サイズが小さい直径 < 100 μ m) ペレットは 2 つのフラスコに分割できますし。 - セルを通過するには、部屋の温度で 5 分間 300 x g で細胞を遠心、上清をデカント、37 ° C で 5 分間細胞剥離培地で細胞をインキュベート
- 希薄剥離中にバランスの取れた塩溶液の 5 mL を追加し、室温で 5 分間 300 × g で遠心分離機します。
- 上清をデカント、NSC 媒体の 18 mL で細胞ペレットを再懸濁します 3 T-25 フラスコに懸濁液を均等に分割します。
- セルの因数を凍結するには、ステップ、1.15 のように細胞を切り離して、10% ジメチルスルホキシドと 90% 牛胎児血清 1 mL 因数のセルをフリーズします。ゆっくりと、10 分間氷の上のセルを配置するし、-20 ° C、30 分で細胞を保つことによって冷却セルと 1 日-80 ° C。次の日は、液体窒素貯蔵容器にセルを転送します。
2. ネイティブ チップ
- クロマチンの準備
- NS になる合流まで派生 NS の在庫が完了したら、95% の空気と 5% CO2の大気と NSC 培地で培養のインキュベーターで 37 ° C の 15 mL の T-75 で NS の文化.1 つ合流 T-75 プレート 3-5 X 10 の6セルが得られます。
- 細胞がコンフルエントになると、NS を 5 分間 300 × g で遠心、上清をデカントし、細胞解離液の 1 mL を追加します。5 分追加 5 ml 中の 37 ° C で細胞をインキュベートし、検定10を使用してセルをカウントします。
注: 免疫沈降法 (IP) 反応あたり 1 x 10 の6セルが必要です。あらかじめ免疫血清または IgG コントロールには含まれている11もある必要があります注意してください。 - 300 × g で 5 分で 1 つ 1.5 mL 遠心チューブに NS を遠心、上清をデカントし再平衡塩溶液の 1 ml NS ペレットを中断し、懸濁液を低蛋白結合 1.5 mL 遠心チューブに転送します。
- 300 x g で 5 分間遠心分離機 NS、上清をデカントし、再プロテアーゼを添加した 1 x 10 の6セルごと消化バッファー (50 mM トリス-HCl、pH 8.0、1 mM CaCl20.2% ポリエチレング リコール オクチルフェニル エーテル) の 95 μ L で細胞ペレットを中断抑制剤の高濃度 (1: 100) カクテル。すぐにピペットのセルを上下に凝集を防ぐため、任意の気泡を作成しないようにします。
- 50% のグリセロール ストック"1 x"と呼ばれる、1 mg/mL ソリューション (1.15 ユニット/μ L、-20 ° C で保存) を作成するには、MNase を再懸濁します。作る、"0.1 x」株式 50% のグリセロールの 2 番目の 1:9 希釈により (例えば、900 μ l"1 x"の MNase と 50% のグリセロールの 100 μ l) し、-20 ° c で保存。
- ミックス 5 μ L の「0.1 x"MNase、145 μ l 消化バッファーの。氷の上の酵素のすべての時間をしてください。1 x 10 の6セルあたり消化バッファーで希釈した MNase の 5 μ L を追加します。12 分の正確なインキュベーション時間を確保する時に混ぜるし、丁度 12 分プロセスの 37 ° C ブロックにチューブを配置するチューブ サンプルの 1 つにフリックします。
- 10 の 10 μ L を追加 x 1 x 10 の6セルごと停止バッファー MNase (110 mM トリス-HCl、pH 8.0、55 ミリメートルの EDTA)。サンプルは、この時点から氷で保たれなければなりません。
- 110 μ L「2 x RIPA バッファー」を追加 (280 mM の NaCl、1.8% ポリエチレング リコール ポリオキシエチレンノニルフェニル エーテル、0.2% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、0.2 %na デオキシ コール酸、5 mM エチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸); 4 ° C で保存) を添加しました。プロテアーゼ抑制剤の高濃度 (1: 100) 1 x 10 の6セルごとのカクテル。ミックス チューブをフリックします。
- 15 分で 4 ° C および microfuge の管を遠心し、1700 x g. (低蛋白結合マイクロ遠心チューブ用が不要になる) 新しい正規 1.5 mL 遠心チューブに上清を転送し、氷の上保存します。ペレットを破棄します。
- 免疫沈降法 (IP)
- ミックス蛋白質 A、蛋白質 G 磁気ビーズ 1:1 の比率で。すべての ip のビーズの 25 μ L を準備します。
- RIPA バッファーの 1 つの mL を追加することで、ビーズを洗浄 (10 mM トリス pH 8.0、1 ミリメートルの EDTA、140 mM 1% ポリエチレング リコール ポリオキシエチレンノニルフェニル エーテル、塩化ナトリウム 0.1% SDS 0.1 %na-デオキシ コール酸; 4 ° C で保存) 低濃度 (1: 1000) プロテアーゼ阻害剤を添加しました。
- 磁石を使用すると、洗浄液から分離し洗浄液 (約 1 分) をデカント ビーズを許可できます。洗浄ステップを 2 回実行します。
- プロテアーゼ阻害剤 (1: 1000) を添加した RIPA バッファーを使用して元の体積にビーズを再停止します。
- 必要に応じて、希釈各 IP がある 100 から 200 までのボリュームは、プロテアーゼ阻害剤 (1: 1000) を添加した RIPA バッファーを用いたクロマチン μ。 予約クロマチン IP ごとの入力に使用されるボリュームの 10% です。
注: たとえば、IP あたり 200 μ L を使用している場合 20 μ L 希釈クロマチンの引当する入力。4 つの ip アドレスの合計は、合計クロマチン量は 820 μ L に希釈してください。 - 入力を準備します。入力にプロティナーゼ K (0.5 mg/mL) を添加した TE バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、1 mM EDTA) の 100 μ L を追加し、55 ° C 1 時間の入力を孵化させなさい。
注: 手順 2.3.4 と 2.4.1 と一緒に手順 2.2.6-2.2.7 を実行できます。 - 製造元の指示に従って PCR 精製キットを使用して入力を浄化し、50 μ L のキットで提供される溶出バッファーで溶出します。
- 微量分光光度計を使用して入力の濃度を測定し、結果をノートに記録。キットから溶出バッファーでは空白です。
注意: マウス神経幹細胞で各 IP の DNA の約 6 μ g を使用しました。 - 1% ゲル上で入力を実行または標準設定を使用して DNA バイオアナライザーに 1 μ L をロードします。下流のアプリケーションで入力として使用する残りの部分を格納します。
- すべての ip 10 洗浄蛋白 A μ L & G 磁気ビーズを追加し、IP の 4 ° C で 1 時間インキュベート
注: たとえば、3 つの IPs の 30 のタンパク質 A の μ L & G 磁気ビーズを追加します。 - 磁石にサンプルを置き、ビーズを分離するを許可します。クロマチンを新しい 1.5 mL チューブに以前に決定された量を転送することによって分割します。
- 抗体を追加し、蒸発を避けるためにプラスチック パラフィン フィルムとキャップをラップします。20 rpm で回転と一晩で 4 ° C のサンプルをインキュベートします。
注: 濃度は経験的の製造元の推奨事項に従う決定する必要があります。 - 次の日、スピン 10 の室温、2000 x g で小型遠心分離機を使用してチューブ s。各 IP にビーズの 10 μ L を追加し、IP を 20 rpm で回転で 4 ° C で 3 時間孵化させなさい。
- IP の洗浄およびタンパク質の消化
- 各 ip アドレスに低濃度 (1: 1000) プロテアーゼ阻害剤を添加した RIPA バッファーの 150 μ L を追加し、マグネット スタンドのサンプル 5 分場所 20 rpm で回転と 4 ° C で IP をインキュベートを分離する磁気ビーズを許可します。上澄みを除去するのに、ピペットを使用します。この tep 5 洗浄を繰り返します。
- LiCl バッファーの 150 μ L を追加 (250 mM LiCl、10 mM Tris pH 8.0、1 mM EDTA、0.5% 0.5%、NP 40 Na デオキシ コール酸; 4 ° C でストア) 低濃度 (1: 1000) 各 IP にプロテアーゼ阻害剤を添加した、IP を, 5 分位サンプル 20 rpm で回転の 4 ° C で磁気スタンドし、分離する磁気ビーズを許可します。上清を除去するのに、ピペットを使用します。
- 冷たいテ (ないのプロテアーゼ阻害剤) の 150 μ L を追加し、マグネット スタンドのサンプル 5 分場所 20 rpm で回転と 4 ° C でサンプルをインキュベートを分離する磁気ビーズを許可します。上澄みを除去するのに、ピペットを使用します。
- 最終的な洗浄ステップの後再プロティナーゼ K (0.5 mg/mL) を添加した TE バッファーの 100 μ L のサンプルを中断し、55 ° C 1 時間でサンプルをインキュベートします。
- DNA の精製とチップの量的なリアルタイム PCR (qPCR)
- PCR 精製キットを使用して沈澱 DNA を浄化します。後に各サンプル キットから DNA 結合バッファーの追加により、磁石にチューブを配置、磁気ビーズ集約、クリーンアップ列に上清を転送まで待ちます。製造元の指示に従って、50 μ L のキットで提供される溶出バッファーで溶出します。
- IP が成功したかどうか、チェックするには、qPCR を実行します。理想的には、正と負のコントロール領域のプライマーを設計する必要があります。
注: たとえば、IP は H3K4me3 と H3K27me3 を実行、次のサンプル実行してください qPCR: H3K4me3、H3K27me3、IgG チップの DNA、DNA、および、テンプレートなしのコントロール (NTC) H3K4me3 を豊かにする地域のためのプライマーを使用しての入力 (肯定的な制御) とH3K4me3 を豊かにする地域 (マイナス コントロール);同様の H3K27me3。 - QPCR12を実行する標準的なプロトコルに従います。簡単に言えば、SYBR グリーン マスター ミックス、作業各前方および逆プライマー濃度 10 μ M の 0.5 μ L および 2 μ L チップまたは入力の DNA の使用して qPCR を実行します。リアルタイム PCR システムを使用して板をお読みください。表 2は、プライマー シーケンスを提供しています。ファンらから Gapdh のプライマー シーケンス。使用される13であった。
- チップのデータを分析、入力基準 %すなわち、入力メソッド (%ip)14。次の数式を使用した入力のパーセントを計算します。
入力を調整 = 平均 ct (入力)-2(DF) をログに記録
DF が開始入力の希釈係数と
DF = IP 量/入力のボリューム
%Ip = 100 × 2 ^ (入力 - Ct (IP) を調整)
ここ Ct はしきい値の係数です。
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Representative Results
腫瘍脳腫瘍脳腫瘍細胞が肯定的な Katushka から生成された NS の概略は、図 1で示されます。図 2は、全体のチップ技術の概略図です。図 3番組脳腫瘍 NS からクロマチンの代表の結果は、12 分、モノ、ジ及びトリ ヌクレオソームの大半を降伏の MNase と消化されます。チップ、qPCR チップで実行することがあります、DNA を入力サンプル。図 4は、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素 (Gapdh) の qPCR から代表的なチップ qPCR データを示しています。Gapdh は H3K4me3、アクティブな転写に関連付けられている変更と濃縮されてハウスキーピング遺伝子です。Gapdh H3k4me3 と濃縮されてない抑圧されたクロマチン領域に関連付けられている変更である H3K27me3 がつきを示した。
図 1: 腫瘍 NS Katushka 肯定的な脳腫瘍から生成されたスケマティック。明視野/蛍光画像マウスから採取した脳の終点段階に達しています。腫瘍領域は点線で区切られて、蛍光レポーター、Katushka 陽性。腫瘍が孤立し、腫瘍組織を 1.5 mL チューブに収集します。セルは解離し、NSC 媒体および腫瘍 NS 形で培養します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ネイティブ チップのワークフローを図式化します。腫瘍 NS が培養され、展開されます。それぞれの IP は、1 X 10 の6セルで実行されます。クロマチンはモノ、ジ及びトリ ヌクレオソームを取得する MNase 消化による断片化されます。クロマチンは、ヒストン修飾または興味の DNA 関連蛋白質の抗体と培養です。抗体 DNA の複合体は、磁気蛋白質 A/G ビーズ沈澱です。最終的に、タンパク質は消化され、DNA はヒストン修飾または興味の DNA 関連タンパク質濃縮 DNA のみを取得する浄化されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: MNase によるクロマチン断片化します。丁度 12 分代表的な DNA 解析の結果バイオアナライザーの入力サンプルを示す、モノ-、ジ-、トリ - DNA の大部分に断片化されたがために、クロマチンは MNase 添加による脳腫瘍 NS と 37 ° C で培養から調製しました。ヌクレオソーム。車線 1 は塩基対 (BP) のはしごです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 代表チップ qPCR データ入力のパーセントとして表示します。IgG、H3K4me3、H3K27me3 チップ DNA プライマーを用いたグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素 (Gapdh) と qPCR を行った。代表的な結果を示す Gapdh、ハウスキーピング遺伝子が H3K4me3 変更、アクティブな転写に関連付けられている、抑圧されたクロマチンに関連付けられている H3K27me3 変更ないと濃縮されてのみ。このグラフでは、各 3 つのレプリケート井戸を実行 2 つの生物学的実験の結果を表します。誤差範囲 (SEM) 平均値の標準誤差を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 遺伝子 | 前方のプライマー | 逆プライマー |
| Gapdh | TCCCCTCCCCCTATCAGTTC | GACCCGCCTCATTTTTGAAA |
表 1:チップ qPCR 実験用プライマー。Gapdh の使用されるプライマーのシーケンスは、次の表で提供されます。
| 平均 Ct (入力) | 標準偏差 | 調整入力 | |
| 24.265 | 0.071 | 20.943 | |
| パーセントの入力 | |||
| サンプル | 生の平均 Ct | 標準偏差 | パーセント入力 = 100 * 2 ^ (input-Ct(IP)) の調整 |
| IgG | 32.23 | 0.112 | 0.04 |
| H3K4me3 | 22.148 | 0.128 | 43.37 |
| H3k27me3 | 32.79 | 0.519 | 0.027 |
| NTC | 未定 | 未定 | 未定 |
表 2: 割合の計算例入力チップ qPCR 分析法。チップ 10% 入力; で実行のための入力割合のサンプル計算DF = 10。この表の数値は、井戸を各サンプルの実行 3 の複製を 1 つの生物学的実験の生の値を示しています。
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Discussion
ここで提示されたプロトコルが遺伝子組み換え脳腫瘍由来 NS でネイティブ チップを実行するユーザーを有効にします。チップを架橋と対照をなしてこのプロトコルは DNA6密接に関連付ける蛋白質の研究のために限られました。使用されているセルの数は、必要に応じて変更することができます、プロトコルをスケール アップすることができます。IP あたり 1 X 10 の6セルを使いました、しかし、ネイティブ チップ、またとしてはほとんど 4 × 104セル5で実行できます。このプロトコルでは qPCR; を介して DNA チップを分析しかし、このプロトコルは、ゲノム全体のレベルで蛋白質 DNA の相互作用を研究する次世代シーケンシングとも組み合わせることが。我々 は、腫瘍細胞のゲノムの特定の領域内でのヒストンの修正の沈着に神経膠腫の遺伝子の効果を分析するのに正常にこのチップ プロトコルを使用しています。
ネイティブ チップを実行するときにいくつかの重要なステップがあります。まず、セル タイプごとに消化条件が経験的決定する必要があります。Chromatin の大部分がモノラル ヌクレオソームをする必要があります (150 bp) いくつかのディとトライ ヌクレオソームのピーク (図 3)。70% モノ-、ジ - またはトライ ヌクレオソームのピークよりも多くの我々 のプロトコルの結果しかし、いくつかの未消化の DNA は残ります。プロトコルは、チップ seq に使用される、追加の手順によって、未消化の DNA を削除いただきます。さらに、購入した MNase の各バッチが活動で異なり、したがって消化条件の最適化が必要なことを覚えておくことが重要です。第二に、チップの品質は11使用される抗体の特異性に大きく依存します。高品質チップ抗体標的に対して高い反応性と低交差反応 DNA 蛋白またはターゲット ヒストン変更11オフが必要です。この理由から、ペプチド結合テストを使用して抗体の特異性をテストすることをお勧めします。エンコードのガイドラインでは、10 倍濃縮する必要があります他の変更11と関連する関心の変更の観察されることを提案します。また、必要な制御 immunoprecipations、すなわち、前免疫または IgG のコントロールが重要です。これらの考慮事項が満たされたとき、ネイティブ チップ データは蛋白質 DNA 相互作用によって調整されるエピジェネティックな機構を研究対象に強力な信頼性の高い方法です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、M.G.C.; に R21 NS091555 R01 NS074387 ・ ストローク (NIH/NINDS) 助成金 R37-NS094804 国立健康/国立研究所の神経疾患に支えられNIH/NINDS 付与 R01 NS076991、R01-NS082311、および R01 NS096756 P.R.L.;NIH/NINDS R01-EB022563;脳神経科リアの幸せな心と M.G.C. にチャドが財団と P.R.L. RNA バイオ グラント F046166 M.G.C. F.M.M. にはサポートによって、F31 NIH/NINDS-F31NS103500 です。R.I.Z. V。NIH でサポートされて/助成金 5T34GM007821 37 の日の出。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2946-90004 | bioanalyzer |
| AccuSpin Micro 17R, refrigerated | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
| Calcium Chloride | Aldrich | 22350-6 | buffer reagent |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Goldbio | LuckK-1g | |
| DiaMag1.5 magnetic rack | Diagenode | B04000003 | for magnetic bead washes |
| DiaMag Rotator EU | Diagenode | B05000001 | rotator |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330-057 | NSC component |
| Dynabeads Protein A | Thermo Fisher Scientific | 10001D | protein A magnetic beads |
| Dynabeads Protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | protein G magnetic beads |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E-4884 | buffer reagent |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA) | Sigma | E-4378 | buffer reagent |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | qPCR reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437028 | for freezing cells |
| FGF | PeproTech | 100-18b | Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | for dissection of tumor |
| Glycerol, MB Grade | EMD- Millipore | 356352 | |
| H3K4me3 | Abcam | Ab8580 | |
| H3K27me3 | Millipore | 07-449 | |
| HBSS | Gibco | 14175-103 | balanced salt solution |
| Fluriso | VETone | 501017 | inhalation anesthetic |
| Ivis Spectrum | Perkin-Elmer | 124262 | in vivo optical imaging system |
| Hyqtase | HyClon | SV3003001 | cell detachment media |
| Lithium Chloride | Sigma | L8895 | buffer reagent |
| Low binding microtubes | Corning Costar | CLS3207 | low protein binding microcentrifuge tube |
| Microcentrifuge tube | Fisher | 21-402-903 | regular microcentrifuge tube |
| Micrococcal Nuclease | Thermo Fisher Scientific, Affymetrix | 70196Y | each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot. |
| N2 | Gibco | 17502-048 | NSC component |
| Normal Rabbit IgG | Millipore | 12-372 | |
| Normocin | Invivogen | NOL-36-063 | anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL. |
| NP-40 (Igepal CA-630) | Sigma | 18896-50ML | buffer reagent |
| Kimble Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749515-0000 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | aliquot and store at -20 °C. |
| Protinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA purification kit |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10007-16 | for dissection of tumor |
| Sodium Chloride | VWR | 0241-5KG | buffer reagent |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D670-25G | buffer reagent |
| Sodium Dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L-4390 | buffer reagent |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | Bp152-1 | buffer reagent |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP 151-500 | polyethylene glycol octylphenyl ether |
| Standard Mini Centrifuge | Fisherbrand | 12-006-901 | standard mini centrifuge |
| SZX16 microscope | Olympus | SZX16 | flourescent dissecting microscope |
| ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | Applied Biosystems | 4453535 | |
| Nanodrop One | Thermo-Fisher Scientific | ND-ONEC-W |
References
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