Summary
Formålet med dette oplæg er at præsentere en trinvis procedure til at indsamle forskellige hvide fedtvæv fra mus, behandle de fedt prøver og udtrække RNA.
Abstract
I forhold til andre væv, har hvidt fedtvæv en betydeligt mindre RNA og protein indhold til downstream applikationer såsom real-time PCR og Western Blot, da det for det meste indeholder lipider. RNA isolering fra fedtvæv prøver også udfordrende som ekstra trin er nødvendige for at undgå disse lipider. Vi præsenterer her, en procedure for at indsamle tre anatomisk anderledes hvidt fedtvæv fra mus, til at behandle disse prøver og udføre RNA isolering. Vi yderligere at beskrive syntesen af cDNA og gen expression eksperimenter ved hjælp af real-time PCR. Den hermed beskrevne protokol giver mulighed for reduktion af forurening fra dyrets hår og blod på fedtpuder samt krydskontaminering mellem forskellige fedtpuder under væv samling. Det er også blevet optimeret til at sikre tilstrækkelig kvantitet og kvalitet af RNA ekstraheret. Denne protokol kan i vid udstrækning anvendes til enhver musemodel, hvor fedtvæv prøver er nødvendige for rutinemæssig eksperimenter såsom real-time PCR men er ikke beregnet til isolation fra primære adipocytter cellekultur.
Introduction
Fedme er en verdensomspændende epidemi, som kan føre til komplikationer såsom type 2-diabetes1. Kost-induceret fede og genetisk modificerede animalske modeller er ofte anvendes til forskning i fedme og dens tilknyttede komplikationer. Traditionelt hvidt fedtvæv er kendt som et opbevaringsrum til overskydende energi og er for det meste består af lipider, mens brunt fedtvæv omdanner energi til varme2,3. Fedtvæv vil er dynamisk og udvide og krympe afhængig af mange faktorer såsom fødeindtagelse og fysisk aktivitet. Derfor, bestem medvirkende faktorer til disse ændringer ved passende fedtvæv indsamling og håndtering er påkrævet4.
Blandt hvide fedtvæv, er det generelt accepteret, at subkutan og visceralt fedt depoter har forskellige egenskaber såsom anatomiske lokalisering og fungere2,5. Derfor, for at undgå modstridende resultater eller store forskelle i cadmiumkoncentrationerne, opmærksomhed skal træffes for at undgå krydskontaminering mellem disse forskellige fedt depoter når indsamling fedtpuder.
Desuden er der tre store udfordringer, når isolering af RNA og protein fra mus hvidt fedtvæv. Første er indsamling fedtpuder i overvægtige mus ikke en let opgave, som den grænse, der adskiller forskellige hvide fedt depoter ikke er altid klart, i modsætning til andre organer som nyrer og hjerte6. For det andet på grund af den høje lipid indhold af fedtvæv under RNA eller protein isolation, et lag af lipider flyder ovenpå og forhindrer direkte adgang til prøven. Tredje, i modsætning til brunt fedtvæv eller andre væv, hvidt fedtvæv har betydeligt lavere RNA og protein indhold og det er af største bekymring, når du bruger unge mus, mus fodret med en normal (N) kost og mus, som forventes at have lav fedt masserne (dvs. KO modeller, behandling med lægemidler, motion uddannelse, osv.) 7 , 8.
Derfor, at vælge den passende metode til at isolere RNA fra fedtvæv er kritisk. Alternative metoder til fenol/chloroform udvinding er kommercielle kits. De er typisk baseret på en indledende phenol ekstraktionstrinet, efterfulgt af RNA oprensning på en kolonne9. Disse kits er typisk dyrere og give prøver af lavere udbytte, mens RNA kvalitet kan være variabel men er mindre tidskrævende. Men en af de største fordele til phenol løsning/chloroform udvinding beskrevet her er muligheden for isolering af RNA, DNA og protein fra en enkelt prøve10. Da mus fedtpuder er som regel små og give lille mængde af RNA og proteiner (især i lean musemodeller), maksimere disse protokoller den data, man kan få ud af et lille udsnit.
Formålet med dette papir er at beskrive i detaljer en metode til at sikre passende stikprøve samling fra tre mus hvidt fedtvæv depoter samt mængden og kvaliteten af RNA isolering. RNA opnås ved at følge denne protokol kan bruges til at udføre real-time PCR assays. Denne protokol er ikke beregnet til RNA isolering fra kulturperler primære adipocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pleje af musene brugt i procedurerne, der overholdes standarder for pleje og anvendelse af forsøgsdyr fastsat af den canadiske Rådet for beskyttelse af dyr. Alle procedurer blev godkendt af universitetet Animal Care og brug Udvalget på kammerat Research Center.
1. obduktion og fedtvæv samling fra mandlige mus
- Gøre eksperimentelle grupper efter undersøgelse mål. I denne undersøgelse blev prøverne indsamlet fra to grupper af mandlige mus på en C57Bl/6 baggrund (n = 12-14/gruppe). Sikre, at musene brugt her er 12-15 uger gammel og vedligeholdes på 12-h lys/mørke cyklus med adgang til enten normal (N) eller høj-fedt (HF) kost og vand ad libitum i en periode på 10 uger11.
- Aflive en mus ved at placere musen i et lukket kammer, hvor det er udsat for 6% CO2 i løbet af 10 min.
- Udføre hjerte punktering ved langsomt at indsætte en 1 mL sprøjte monteret med en 26G 1/2po nålen lige til venstre for dyrets brystbenet og langsomt trække stempel til at fjerne det meste af dyrets blod. Sørg for, at sprøjten er parallel til dyrets krop. Rotere sprøjten langsomt mens du trækker stemplet, hvis blod ikke kommer ind i sprøjten.
Bemærk: Vellykket hjerte punktering (mellem 0,8 og 1 mL blodvolumen) vil formindske forurening af fedtvæv med blod. - Lægge mus på ryggen og pin hver pote på pad'en ved brug af 22G nåle, som vist i figur 1.
- Med en gaze, gnide huden af mus med alkohol flere gange starter fra halsen hele vejen ned til genitalierne ved at følge en ensrettet bevægelse, da dette sikrer, at håret forbliver flade og reducerer hår kontaminering af fedtvæv prøver uden hårfjerning.
- Bruger ren men ikke steril pincet og kirurgisk saks, ophøje den centrale huden i nærheden af kønsorganer og lave en lille 0.3 mm snit.
- Indsætte saks vandret i åbnede hullet og frigøre den abdominale hud fra den abdominale væg.
Bemærk: Dette er gjort af stump dissektion i mellemrummet mellem huden og bugvæggen og ikke skære membraner fundet i dette rum. - Brug af pincet, ophøje den centrale huden nær den åbnede hul og skære huden den linea alba indtil du er i nærheden af brystkassen (~ 4 cm afhængigt af mus størrelse).
Bemærk: Undgå at skære den mavemuskel, da dette kan udsætte det viscerale fedtvæv til luften og føre til udtørring af de fedtpuder, som kan ændre integriteten af vævet og dens indhold. - Fra midten af brystkassen, skære huden mod højre arm på ~ 2 cm. Fra skære i nærheden af kønsorganer, huden over det højre bagben lemmer på ~ 2 cm.
- Strække et hjørne af den åbnede hud og pin det ned på puden ved hjælp af en 22G nål. Gentag med andet hjørnet.
Bemærk: Fedtvæv udsat på huden er den abdominale spæk (SCF) (fig. 1A). - Indsamle SCF af stump dissekere og skære det fra huden ved hjælp af kirurgiske saks placeret så fladt som muligt mod huden. Når indsamlet, sætte SCF på forhånd identificerede aluminiumsfolie.
Bemærk: Indsamling eller forurener adipøst væv med hud eller hår vil ændre prøve kvalitet og RNA udbytte på grund af RNases. Hvis er brugt for meget tid, indsamle fedtvæv, kan prøven også tørre som kan også ændre kvaliteten af prøven. - Gentag trin 1,9 til 1.11 på venstre side af dyret. Pool både venstre og højre fedt puder i aluminiumsfolie og fryse prøven i flydende kvælstof.
- For at få adgang til de viscerale fedtvæv, skære mavemuskel ved hjælp af ren men ikke steril kirurgiske saks og pincet langs den linea alba, på ~ 4 cm, afhængigt af mus størrelse, fra kønsdelene til brystkassen. Derefter foretage et snit i mavemusklerne fra kønsdelene mod bagsiden af musen på ~2.5 cm skal have adgang til siden af den abdominale organer.
- Fedt omkring de reproduktive organer er det peri-gonadale fedt (PGF) (figur 1B). Som PGF er knyttet til epididymis, testiklerne og ductus deferens, Fjern forsigtigt den venstre fedt pad fra disse strukturer og sætte på forhånd identificerede aluminiumsfolie. Gentag for højre side. Når begge PGFs er indsamlet, fryse prøven i flydende kvælstof.
- Begyndende med den venstre side, udsætte nyrerne ved at flytte gut fra bughulen til højre side. Fedtvæv omkring nyrerne er den peri-renal fedt (PRF) (figur 1C). PRF omgiver også binyrerne (fig. 1D).
- Isolere og fjerne binyrerne før indsamling PRF. Dette kan være trættende, da de er bare en smule pinker end fedtvæv.
Bemærk: Nyrerne skal ikke fjernes under dette trin, som blod kan forurene fedtvæv og gøre det vanskeligere at identificere binyrerne inden for denne fedt pad. - Isolere PRF fra tilbage muskulære væg, slutter ved at skære ureter, renal arterie og vene, som adskiller PRF og nyre fra resten af kroppen. Isolere PRF fra nyre ved at skære og fjerne den renale kapsel. PRF forbliver knyttet til kapslen.
- Gentag trin 1,15 og 1,17 for højre side. Sætte begge PRF i aluminiumsfolie og fryse prøven i flydende kvælstof.
- Gentag proceduren fra trin 1.2 til 1.18 for alle mus der skal indsamles.
- På dette punkt fortsætte med fedtvæv slibning eller opbevare prøver i et-80 ° C fryser for senere udvinding. Prøver kan opbevares stabilt ved-80 ° C for flere år4.
2. forberedelse af jorden hvid fedtvæv til RNA isolering
Bemærk: Bære handsker for hvert trin, som huden indeholder RNases, som kan fremme RNA nedbrydning og som sådan ændrer prøve kvalitet og RNA udbytte efter isolation.
- Forberede og identificere tre RNase-fri 1,5 mL konisk skruelåg rør pr. mus, én for hver type af hvidt fedtvæv, og placere dem på en rist.
Bemærk: Fede dyr kan kræve ekstra rør, som de har øget fedt masserne. Dette er især sandt for SCF, op til 7 rør til en mus blev opnået. - Ren bænk med 70% ethanol og sætte en ren og ny bænk papir på overfladen.
- Fedtvæv er frisk indsamlet fra mus eller gemt på forhånd i en-80 ° C fryser, samle alle prøver i en flydende nitrogen-fyldt beholder indtil begyndelsen af proceduren.
- Fryse den mørtel, spatel og pistillen ved at placere dem i flydende nitrogen container. Når den flydende kvælstof stopper '' koge '', kan slibning af fedtvæv startes.
Bemærk: Fra dette trin, mørtel, spatel skal koniske rør og fedtvæv holde kølet under hele processen. Eventuel varme, der vil smelte fedtvæv og gøre det vanskeligere at udtrække RNA. Også, hvis du bruger en keramisk morter og støder, man kan bruge tøris og/eller flydende kvælstof til at holde det koldt. - Placere alle RNase-fri 1,5 mL konisk skruelåg rør parat på trin 2.2 på tøris til at køle dem.
- For at undgå frostbites på hænderne, skal du bruge et par lag af brunt papir til at løfte mørtlen fra den flydende kvælstof og sætte det på en bænk i orden.
- Bruge pincet til at indsamle en fedtvæv prøve fra den flydende kvælstof og sætte det i mørtel. Hurtigt unwrap aluminiumsfolie og slip prøven på midten af mørtel.
Bemærk: Hvis eksemplet fedtvæv er for stor, som er tilfældet med overvægtige mus, bryde prøverne i mindre dele i aluminiumsfolie ved hjælp af dine tommelfingre og pulverisere hver del adskilt. - Bruge et par lag af brunt papir til at løfte pistil fra den flydende kvælstof og passe det ind i mørtel. Mens du holder pistil med brun papirer, brug hammer til at ramme toppen af pistil gange. Tryk på pistil ned mod mørtel med roterende bevægelser at male prøven, indtil der opnås et fint pulver.
Bemærk: Dette trin er afgørende for at opnå tilstrækkelig RNA isolering. Faktisk vil tilstedeværelsen af større fragmenter hindre RNA isolering og reducere udbyttet. - Når et fint pulver, der er opnået, fjerne pistil og afhente spatel fra den flydende kvælstof og bruge den til at overføre prøven til de tilsvarende præ kølet 1,5 mL konisk tube.
Bemærk: Dyppe spatlen tilbage i flydende kvælstof fra tid til anden at forhindre prøven fra smeltende. Også, holde den koniske rør i tøris altid at forhindre prøven fra optøning. En koniske rør fyldt med jorden prøve at omkring 2/3 kapacitet (~ 1 mL) er påkrævet for passende RNA udbytte og mængde. - Når fyldt til omkring 1 mL, lukke røret og slip det i de andre flydende nitrogen-fyldt beholder.
Bemærk: Overskydende prøver kan sætte i separate pre kølet RNase-fri 1,5 mL koniske rør og gemt i et-80 ° C fryser til senere brug. - Ren mørtel, pistil og spatel med brun papirer at undgå fremførsel til eksemplet næste fedtvæv. Sætte pistil og spatel tilbage til de flydende kvælstof til køling. Selv om den brune papir er ikke RNase-fri, bruger vi en frisk åbnet pakke i brunt papir for hver dag i RNA isolering.
- Gentag trin 2.4 til 2.11 med den næste prøve.
- Når alle prøver er behandlet, starte RNA isolering eller opbevare prøver i et-80 ° C fryser til senere brug.
Bemærk: For at forhindre, at rørene brister, fryse en prøve boks ved fuldstændig nedsænkning det i flydende nitrogen beholder. Når cool nok fjerne det overskydende kvælstof fra boks og lad det flyde ovenpå den flydende kvælstof. Sortere prøverne ind i boksen og sætte det i en-80 ° C fryser.
3. RNA isolering fra jorden fedtvæv
Forsigtighed: Phenol løsning er skadelige for huden. Bære en laboratoriekittel, handsker, sikkerhedsbriller og udføre proceduren under en kemisk hætte. En trin for trin flowchart er vist i figur 2.
- Forberede og identificere to sæt af RNase-fri 1,5 mL koniske rør og læg dem i en rack.
- Om fedtvæv var frisk jord eller allerede gemte i et-80 ° C fryser, samle alle prøver i en flydende nitrogen-fyldt beholder indtil begyndelsen af den procedure, der er for det meste udført ved stuetemperatur.
- Bruge pincet til at udtage jorden fedtvæv fra den flydende kvælstof og sætte det i en tube rack. Rørene skal indeholde ~ 1 mL pulver, hvilket svarer til omkring 100 mg af væv pulver.
- Langsomt Åbn røret.
Bemærk: Forlader et lukket rør ved stuetemperatur eller åbne den rørets låg for hurtigt kan føre til prøven tab eller skade som pres fra kvælstof tendens til at flygte fra røret. - Tilføje 500 µL af phenol løsning til prøven (1:2 forholdet af phenol løsning: væv pulver).
- Luk låget af rør og vortex ved maksimal hastighed for omkring 5 s. langsomt og åbne omhyggeligt røret for at frigive trykket fra kvælstof (en lyden af luft, der kommer ud af røret kan blive hørt).
- Gentag trin 3.5 og 3.6. Den endelige phenol løsning volumen tilsættes prøven er 1 mL.
- Gentag trin 3.6 indtil prøven er helt opløst.
Bemærk: Det er vigtigt at frigive alle pres fra røret før du går videre til at forhindre, at røret sprænger. - Lad prøven stå ved stuetemperatur mens gentage trin 3.4 til 3.8 næste prøverne.
- Når alle prøver er behandlet kort vortex ved maksimal hastighed og inkuberes alle prøver 5 min ved stuetemperatur.
- Centrifugeres 10 min. ved 12 000 x g ved 4 ° C. Bringe rør tilbage til stuetemperatur.
Bemærk: Efter centrifugering, 3 faser er til stede som vist i figur 2: fedt (top), RNA (i midten) og pellet (nederst). - For hver prøve, skal du overføre så meget RNA (midterste pink lag) som muligt ind i det første sæt af tilsvarende rør med P1000 pipette bruger en filtreret tip. Ændre tips mellem prøver.
- For at sikre minimal kontaminering af RNA (midterste lag) af lipid (øverste lag), gennembore den øverste fase med spids i nærheden af siden af røret. Dispensere RNA i de nye koniske rør uden at røre siderne af de nye rør til at forhindre overførsel af lipider, der kan være på ydersiden af spidsen.
- Tilføje 200 µL af ren chloroform til hver prøve og blandes ved inversion for 15 s. Ruger 10 min ved stuetemperatur.
- Centrifugeres 15 min på 12 000 x g ved 4 ° C og bringe rør tilbage til stuetemperatur.
Bemærk: Efter centrifugering, 3 faser er til stede: RNA (top), interfase, som indeholder DNA (i midten) og rød phenol-chloroform, som indeholder proteiner (nederst). - For hver prøve, overføre som meget gennemsigtig RNA-holdige vandfasen (top fase) som muligt til det andet sæt af tilsvarende koniske rør med P1000 pipette ved hjælp af filtreret-tips. Ændre tips mellem hver prøve.
Bemærk: Interphase er skrøbelige og kan forurene den øverste fase, hvis aspiration er gjort alt for hurtigt. Som et alternativ bruge P200 pipette til at reducere chancerne for at forstyrre interfasen. - Tilsæt 500 µL af 100% isopropanol til hver prøve og bland af inversion i 15 sek.
- Ruger 10 min ved stuetemperatur
- Centrifugeres 10 min. ved 12 000 x g ved 4 ° C og bringe rør tilbage til stuetemperatur. Kassér isopropanol af invertere hver tube.
Bemærk: En lille hvid RNA pellet kan normalt ses men kan lejlighedsvis ikke. - Der tilsættes 1 mL af 75% ethanol (fremstillet af 100% ethanol og RNase-fri vand) til hver prøve og kortvarigt vortex hver tube ved maksimal hastighed.
- Centrifugeres 5 min på 7 500 x g ved 4 ° C og bringe rør tilbage til stuetemperatur.
- Kassér 75% ethanol af invertere hver tube og let tap mod et brunt papir til at fjerne eventuelle rester.
Bemærk: Hvis det kræves, skal du bruge en filtreret-tip til at fjerne alkohol nær RNA pellet. Ændre spidsen mellem prøver. - Lad låget åbnes og luft tørre RNA pellet for omkring 15-20 min.
Bemærk: RNA pellets kan blive gennemsigtig under dette trin. - Som RNA oploesning fra pellet størrelse-afhængige, vurdere størrelsen af toerstoffet til at bestemme mængden af RNase-fri vand skal bruges til solubilize af RNA. Skrive ned for lydstyrken (10-25 µL) for hver prøve.
Bemærk: Dette trin er blot kvalitative. Hvis RNA pellet ikke kan ses, tilføje 10 µL af RNA-gratis vand til prøven. - Tilføje 10-25 µL af RNase-fri vand til hver prøve (forudbestemte volumen på trin 3.24).
- Inkuber prøve 5 min i en varme blok sat til 60 ° C. Kort vortex rør.
- Inkuber prøve for en yderligere 5 min i den samme varme blok ved 60 ° C.
- Quick-spin alle prøver i en mini spin centrifuge og straks lagt på is.
- Bestemme RNA koncentration og renhed. Udføre reverse transkription (RT) til at opnå cDNA eller opbevare prøver i et-80 ° C fryser til senere brug.
Bemærk: Undgå flere fryse/tø cykler, da dette forringer RNA prøver.
4. bestemmelse af fedtvæv RNA koncentration og renhed
- Om fedtvæv RNA prøver var frisk udvundet og solubilized eller allerede gemte i et-80 ° C fryser, samle alle prøver og tillade dem at tø på is indtil starten af proceduren. Dette gøres lige før starten af den næste skridt eller i slutningen af isolation at undgå flere fryse/tø cykler.
- Forberede og identificere to sæt af RNase-fri 1,5 mL koniske rør og læg dem i en tube rack.
- Når alle RNA prøver er helt optøet, vortex en prøve for 1 s og sat tilbage på isen.
- Fortyndet din RNA 100-fold i 1 x TE løsning i det første sæt af RNase-fri 1,5 mL konisk rør ved hjælp af filtreret RNase-fri tips (sætte 99 µL 1 x TE løsning og 1 µL af RNA til røret).
- Gentag for hver prøve.
Bemærk: Mængderne, der kan være forskellige for hver Spektrofotometer afhængigt af kuvette anvendes. - Når alle prøver er behandlet, fortyndes vortex hver prøven.
- Følg protokol spektrofotometrets at kalibrere instrumentet ved hjælp af en blank (1 x TE) før behandling de fortyndede RNA prøver.
- Overføre de fortyndede RNA prøver til kvarts kuvette og bestemmes koncentrationen af hver prøve på 260 nm.
Bemærk: Hvis spektrofotometrets ikke giver den endelige RNA-koncentration, bruges denne formel til at beregne: RNA (µg/µL) = OD260 x fortyndingsfaktoren x (40 µg RNA/1 000 µL). - Bestemme RNA renheden af hver prøve ved beregning af forholdet OD260/OD280.
Bemærk: Forholdet OD260/OD280 omkring 2.0 er generelt betragtes som ren for RNA12. Det anbefales, at RNA kvalitet er kontrolleret. For at gøre det, sætte 1 µg af RNA på en 1% blegemiddel agarosegel lavet med 1 x TBE buffer (89 mM Tris base, 89 mM borsyre og 2 mM EDTA, pH 8,0) og 1% blege løsning13 (figur 3). RNA af meget god kvalitet viser både 28S og 18S rRNA bands og 28S bandet bør være mere intens end 18S. RNA kvalitet er acceptabel, når begge rRNA bands er synlige på en tilsvarende intensitet. RNA kvalitet bliver mangelfuld øjeblikket 18S band er mere intens end 28S band, og når en smear er synlige, vejledende RNA nedbrydning. - For hver prøve, forberede 10 µL af 0,5 µg/µL af RNA fra bestanden i det andet sæt af RNase-fri 1,5 mL konisk rør ved hjælp af RNase-fri vand til at fortynde prøverne efter behov. Disse prøver anvendes til RT for at opnå cDNA.
- Når alle prøver er behandlet, starte RT eller opbevare prøver i et-80 ° C fryser til senere brug.
5. reverse-transskription (RT)
- Om fedtvæv RNA prøver var frisk fortyndet til 0,5 µg/µL eller allerede gemte i et-80 ° C fryser, samle alle prøver og reagenser og tillade dem at tø på is indtil starten af proceduren.
- Sætte PCR rør strip rack på is. Når kold nok forberede og identificere ét sæt af RNase-fri PCR rør strimler og læg dem på en rist. Omfatte en tom.
- Forberede reaktion for DNase behandling af RNA: gøre en master mix (for den nødvendige mængde af prøven + 1 prøve) af følgende (mængder for 1 prøve): 1 µL af 10 X reaktion buffer med MgCl2, 0,5 µL af DNase jeg (1 U/µl) og 7,5 µL af RNase-fri vand ved hjælp af filtreret-tips. Give afkald 9 µL i hver tube.
- Tilføje 1 µL af 0,5 µg/µL af RNA fra hver prøve til den tilsvarende tube, sætte hætter på hver strimmel og quick-spin alle strimler i en mini spin centrifugeres for at bringe prøven til bunden af røret. Tilføj 1 µL af RNA-gratis vand til blindprøven.
- Inkuber alle rør strimler i en termisk cycler eller en opvarmning blok ved 37 ° C i 30 min. sæt rør strimlen tilbage på rack på is.
- Tilføje 1 µL af EDTA (50 mM) til hver tube og inkuberes alle rør strimler i en termisk cycler eller en opvarmning blok på 65 ° C i 10 min. sæt rør strimlen tilbage på rack på is.
- Gøre en master mix (for det krævede antal prøver plus 1 prøve) af følgende (mængder for 1 prøve): 1 µL af tilfældige hexamers (0,2 µg/µL) og 1 µL af dNTP mix (indeholder hver af de fire deoxynucleotides i en koncentration på 10 mM). Undvære 2 µL af den master mix i hver tube ved hjælp af filtreret-tips. Ændre spidsen mellem prøver.
- Inkuber alle rør strimler i en termisk cycler eller en opvarmning blok på 65 ° C i 5 min. sættes tube strimlen tilbage i rack på is.
- Gøre en master mix (for det krævede antal prøver plus 1 prøve) af følgende (mængder for 1 prøve): 4 µL af 5 x RT buffer, 1 µL af RNase inhibitor (20 U/µL), 0,25 µL af reverse transkriptase (200 U/µL) og 1,75 µL nukleasen-gratis vand. Dispensere 7 µL i hvert rør ved hjælp af filtreret tips. Ændre spidsen mellem prøver.
- Udføre RT i en termisk cycler ved at indstille følgende program: 10 min. ved 25 ° C, 30 min ved 50 ° C, 5 min ved 85 ° C. Sæt rør strips tilbage på rack på is.
- Forberede og identificere ét sæt af RNase-fri PCR rør strips og læg dem på rack.
- For hver prøve, forberede den ønskede mængde af 1:5 fortyndet cDNA fra bestanden i de nye rør strimler bruger ultrarent vand. 1:5 fortyndet cDNA prøver vil blive brugt til real-time PCR.
- Når alle prøver er behandlet, starte real-time PCR eller opbevare prøver (lager og fortyndede prøver) i en-20 ° C fryser til senere brug.
6. real-time PCR for genekspression i fedtvæv
Bemærk: Undgå at udsætte den fluorescerende farvestof til lys. Protokollen nedenfor beskriver forstærkningen af reference gen s1614. Primere og PCR betingelser bør være tilpasset gen af interesse.
- Om cDNA prøver var frisk fortyndet til 1:5 eller allerede gemte i en-20 ° C fryser, samle alle prøver og reagenser og tillade dem at tø på is indtil starten af proceduren.
- Sætte rack for real-time PCR rør strimler på is. Når kold nok forberede og identificere ét sæt af real-time PCR rør strimler og læg dem på rack. Forberede hver prøve og Tom i to eksemplarer.
- Gøre en master mix (for det krævede antal prøver plus 1 prøve) af følgende (mængder for 1 prøve): 1,9 µL ultrarent vand, 5 µL af fluorescerende farvestof (fx SYBR green) og 0,3 µL af en fremadrettet primer og 0,3 µL af den omvendte primer. Dispensere 7,5 µL i hver tube.
- Tilføje 2,5 µL af 1:5 fortyndet cDNA fra hver prøve til den tilsvarende tube. Tilføje 2,5 µL ultrarent vand til de tomme felter. Sæt lågene på hver strimmel.
- Følg fabrikantens instruktioner for at konfigurere følgende program på real-time PCR: 10 min. ved 95 ° C og 40 cykler med 15 s ved 50 ° C, 30 s på 60 ° C, 30 s ved 70 ° C. Læg prøven strimler ind i rotoren af real-time PCR maskine og start programmet.
Bemærk: Betingelser, der termisk cycler kan variere afhængigt af den benyttede apparatur og gen af interesse. mRNA udtryk resultaterne præsenteres i fig. 3 viser leptin mRNA forstærkning normaliseret af reference gen S16 mRNA forstærkning14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter proceduren obduktion blev tre hvide fedtvæv indsamlet og vægtet fra de to grupper af mus (N og HF kost-fed mus). Som forventet, havde mus på HF kost øget endelige kropsvægt og vægtøgning i forhold til søskende på N kost (tabel 1). Disse observationer blev ledsaget af mere end en 2-fold stigning i vægten af PGF, PRF og SCF i overvægtige mus i forhold til dem på N kost.
Før du udfører eksperimenter med den isolerede RNA, blev dets renhed evalueret som beskrevet i trin 4.9. For hver hvidt fedtvæv, RNA isolering af phenol løsning produceret prøver med passende kvalitet som forholdet OD260/OD280 var omkring 2,0, der betragtes som ren for RNA (tabel 2). Real-time PCR data viste, at leptin mRNA udtryk var steget betydeligt i PGF, PRF og SCF af overvægtige mus i forhold til dem på N kost (figur 4A). Forskelle observeret i leptin mRNA udtryk var faktisk ikke på grund af en variation af s16, reference gen bruges til at normalisere resultater, mellem de to grupper af mus Ct værdier var ikke ændres (fig. 4B). Således kan s16 pålideligt bruges som en reference-genet til mRNA udtryk i PGF, PRF og SCF når HF kost er en parameter i en undersøgelse protokol.
Figur 1 . Anatomiske lokalisering af hvidt fedtvæv i mus. En mandlig mus på N kost er blevet dissekeret for at vise lokalisering af hver fedtvæv depot og binyrerne. SCF (A), PGF (B), PRF (C) og binyrerne (D). PGF, peri-gonadale fedt; PRF, peri-renal fedt; SCF, abdominal spæk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . RNA isolering protokol flowdiagram ved hjælp af phenol løsning. Skematisk fremstilling af de nødvendige skridt til at isolere RNA fra jordet hvidt fedtvæv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . RNA kvalitetsvurdering på blegemiddel gel. 1 ug af RNA isoleret fra spæk (SCF) og peri-gonadale fedt (PGF) er adskilt på en 1% agarosegel blegemiddel af elektroforese. 28s og 18s rRNA er visualiseret ved ved UV-gennemlysning. På gel er RNA isoleret fra SCF og PGF af en mus fodret en normal kost. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Effekten af HF kost om leptin og s16 mRNA ekspression i hvidt fedtvæv. Leptin (A) og s16 (B) mRNA udtryk. Data for leptin er normaliseret til s16 mRNA niveau, mens tallene for s16 vises som Ct værdi og begge præsenteres som gennemsnit ± SE med n = 12-13 pr. gruppe. * p < 0,05 sammenlignet med N kost. Nielsen, normal; HF, høj-fedt; PGF, peri-gonadale fedt; PRF, peri-renal fedt; SCF, abdominal spæk. Dette tal er blevet ændret fra Tan, P. et al, fedme (2014) 22, 2201-2209. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| N kost | HF kost | |
| Endelige vægt (g) | 37,5 ± 1.3 | 46,7 ± 1.7* |
| Vægtøgning (g) | 6.6 ± 0,7 | 16,7 ± 1.0* |
| PGF (g) | 1.08 ± 0,17 | 2.19 ± 0.15* |
| PRF (g) | 0,79 ± 0,15 | 1,71 ± 0.06* |
| SCF (g) | 1.62 ± 0,35 | 3,55 ± 0.20* |
Tabel 1. Effekten af HF kost på kroppen og hvidt fedtvæv vægte. Værdier udtrykkes som middel ± SE med n = 14-15 pr. gruppe. * p < 0,05 sammenlignet med N kost. Nielsen, normal; HF, høj-fedt; PGF, peri-gonadale fedt; PRF, peri-renal fedt; SCF, abdominal spæk. Dette tal er blevet ændret fra Tan, P. et al, fedme (2014) 22, 2201-2209.
| Prøver | Forholdet OD260/OD280 |
| PGF 1 | 2.04 |
| PGF 2 | 2.04 |
| PGF 3 | 2.02 |
| PRF 1 | 1,95 |
| PRF 2 | 2,08 |
| PRF 3 | 2,08 |
| SCF 1 | 2.04 |
| SCF 2 | 2.02 |
| SCF 3 | 2,06 |
Tabel 2. RNA renhed efter isolation fra hvidt fedtvæv. n = 3 pr. fedtvæv. PGF, peri-gonadale fedt; PRF, peri-renal fedt; SCF, abdominal spæk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Følgende HF-kost fodring, blev overvægtige mus fundet at være steget krop og hvidt fedtvæv vægte sammenlignet med mus fodret en N kost. RNA udvundet ved hjælp af phenol løsning givet prøver med god renhed. Leptin er et adipokine primært fremstillet af fedtvæv og er kendt for at korrelere positivt med fedt masse16. Som forventet, øget leptin mRNA udtryk i overvægtige mus i bankkonsortiet med deres fedtmasse.
Denne metode har flere kritiske trin. Den store er forurening af et hvidt fedtvæv depot med en anden som det er kendt, at forskellige fedtvæv depoter har forskellige funktioner2,5. Kontaminering kan give misvisende resultater i downstream applikationer. Derudover som fedt tendens til at tørre en gang i kontakt med luft, indsamle hvide fedtvæv i en regelmæssig og ensartet tempo i mellem mus anbefales hvis vægten skal tages. Ellers, den samlede vægt af et fedt pad kan være forkert. For at få RNA af god kvalitet og udbytte, efter den nyligt offentliggjorte MIQE retningslinjer er en konkret aktiv17. Navnlig kan gør meget fine prøve pulver under slibningen hjælpe maksimere udbyttet. Dette maksimerer kontakt mellem væv pulver og phenol løsning under RNA isolering. Sidst men er ikke mindst isolering af RNA-holdige lag under RNA isolering (trin 3.12). Som fedt er mindre tæt end vand, er det placeret oven på fasen af interesse. Minimere fremførsel af fedt er nødvendige for at reducere interferens med downstream applikationer.
En begrænsning af denne metode er den færdighed, der kræves for at udføre flere trin i proceduren samt behovet for at arbejde med skadelige reagenser under RNA isolering. Hele processen er desuden arbejdskraftintensive.
Der er ikke mange alternativer til metoden af fedtvæv samling og prøve behandling før RNA isolering bortset fra små detaljer, som er normalt justeret af hver bruger. I tilfælde af RNA isolering er mange indstillinger tilgængelige som fenol/chloroform udvinding eller RNA isolering kits. Der er fordele og ulemper til hver indstilling, og det er op til brugeren at vælge den bedste metode baseret på downstream applikationer. Fenol/chloroform udvinding er billigere, men kræver brug af skadelige reagenser og er besværlige. RNA isolering kits er generelt dyrere men proceduren er hurtigere og typisk udbytter prøver med god kvalitet og renhed. Det er vigtigt at overveje udbyttet og renheden af RNA, fordi materialet er begrænset i hvidt fedtvæv som hovedsageligt består af fedt. Den største fordel ved at bruge phenol løsning til isolering (fenol/chloroform udvinding) er muligheden for isolering af RNA, DNA og protein fra en enkelt prøve18. Det er tid- og omkostningseffektive som det reducerer antallet af mus, der kræves for at opnå tilstrækkeligt materiale. Som tidligere nævnt, er fedtmasse begrænset i nogle musemodeller. For disse mus anbefales opdele jorden fedtvæv i tre dele separat få RNA, DNA og protein ikke som dette kan føre til utilstrækkelig materiale til downstream applikationer. For at omgå dette problem, er det også muligt at samle lignende fedtvæv depot fra flere mus baseret på brugerdefinerede kriterier, der fører til et øget antal dyr behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Diabetes Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
