Summary
Lo scopo di questa carta è di presentare una procedura dettagliata per raccogliere diversi tessuti adiposi bianchi dai topi, trattare i campioni di grasso ed estrarre RNA.
Abstract
Rispetto ad altri tessuti, tessuto adiposo bianco ha un considerevolmente meno contenuto di RNA e proteine per applicazioni a valle come Real-Time PCR e Western Blot, poiché esso contiene principalmente i lipidi. Isolamento del RNA dai campioni di tessuto adiposo è impegnativo anche come passaggi aggiuntivi sono necessari per evitare questi lipidi. Qui, presentiamo una procedura per raccogliere tre tessuti adiposi bianchi anatomicamente diversi da topi, per elaborare questi campioni ed eseguire isolamento del RNA. Descriviamo ulteriormente la sintesi di cDNA e gene esperimenti di espressione mediante Real Time PCR. Il protocollo descritto dichiara permette la riduzione della contaminazione dell'animale capelli e sangue su cuscinetti adiposi, nonché la contaminazione incrociata tra diversi rilievi grassi durante la raccolta del tessuto. Esso è stato ottimizzato anche per garantire un'adeguata quantità e qualità del RNA estratto. Questo protocollo può essere ampiamente applicato a qualsiasi modello di topo dove campioni di tessuto adiposo sono necessari per gli esperimenti di routine come la PCR in tempo reale, ma non è inteso per l'isolamento da colture cellulari primarie adipocytes.
Introduction
L'obesità è un'epidemia mondiale che può portare a complicazioni quali 2 diabete di tipo1. Modelli animali obesi e geneticamente indotta da dieta sono frequentemente utilizzati per la ricerca in obesità e delle complicanze associate. Tradizionalmente, il tessuto adiposo bianco è conosciuto come un vano portaoggetti per l'energia in eccesso ed è prevalentemente composto da lipidi mentre il tessuto adiposo bruno converte l'energia in calore2,3. Tessuto adiposo è dinamico e sarà ampliata e ridursi a seconda di molti fattori come l'ingestione di cibo e attività fisica. Quindi, per determinare i fattori che contribuiscono a questi cambiamenti, tessuto adiposo adeguata raccolta e manipolazione sono necessari4.
Tra i tessuti adiposi bianchi, è generalmente accettato che i depositi di grasso sottocutanei e viscerali hanno proprietà diverse, ad esempio la localizzazione anatomica e funzionano2,5. Di conseguenza, per evitare risultati contraddittori o grande variabilità, attenzione deve essere presa per evitare la contaminazione incrociata tra questi diversi depositi di grasso quando si raccolgono i cuscinetti adiposi.
Inoltre, ci sono tre grandi sfide quando isolando RNA o proteine da tessuto adiposo di topi bianchi. In primo luogo, raccogliendo i cuscinetti adiposi in topi obesi non è un compito facile come il confine che separa i diversi depositi di grasso bianchi non è sempre chiaro, a differenza di altri organi come i reni e cuore6. In secondo luogo, a causa del contenuto elevato del lipido del tessuto adiposo, durante l'isolamento di RNA o proteine, uno strato di lipidi galleggia sulla parte superiore e impedisce l'accesso diretto al campione. In terzo luogo, in contrasto con il tessuto adiposo bruno o altri tessuti, tessuto adiposo bianco è considerevolmente minore contenuto di RNA e proteine e questo è di grande preoccupazione quando si utilizza giovani topi, topi alimentati una dieta normale (N) e topi che dovrebbero abbiano basse masse grasse (cioè KO modelli, trattamento con farmaci, esercitano di formazione, ecc.) 7 , 8.
Di conseguenza, scegliere il metodo appropriato per isolare il RNA dal tessuto adiposo è fondamentale. Metodi alternativi all'estrazione del fenolo/cloroformio sono kit commerciali. In genere si basano su una fase di estrazione del fenolo iniziale, seguita da purificazione RNA su una colonna9. Tuttavia, quei kit sono in genere più costosi e dare campioni di rendimento più basso, mentre la qualità di RNA potrebbe essere variabile ma sono molto meno tempo. Tuttavia, uno dei maggiori vantaggi di estrazione del fenolo soluzione/cloroformio descritto qui è la possibilità di isolamento del RNA, DNA e proteina da un singolo campione10. Dal momento che i rilievi grassi topi sono solitamente piccoli e dare piccole quantità di RNA e proteine (soprattutto in modelli murini magra), questi protocolli massimizzano i dati uno può uscire da un piccolo campione.
L'obiettivo di questa carta è di descrivere in dettaglio un metodo per garantire la raccolta di campioni adeguati da depositi di tessuto adiposo bianco tre topi come pure la quantità e la qualità di isolamento del RNA. RNA ottenuto seguendo questo protocollo consente di eseguire analisi di PCR in tempo reale. Questo protocollo non è destinato all'isolamento del RNA dai adipocytes primario coltivati.
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Protocol
Cura dei topi utilizzati nelle procedure rispettate norme per la cura e l'uso di animali da esperimento fissato dal Consiglio canadese per la protezione degli animali. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato di uso del CHUM Research Center e Università Animal Care.
1. l'autopsia e raccolta di tessuto adiposo da topi maschi
- Fare gruppi sperimentali secondo obiettivi di studio. In questo studio, i campioni sono stati raccolti da due gruppi di topi maschi su uno sfondo di C57Bl/6 (n = 12-14/gruppo). Garantire che topi usati qui sono 12-15 settimane di età e sono mantenuti su 12 h ciclo luce/buio con accesso normale (N) o dieta ricca di grassi (HF) e acqua ad libitum per un periodo di 10 settimane11.
- Eutanasia un mouse posizionando il mouse in una camera stagna dove è esposto a 6% CO2 durante 10 min.
- Eseguire la puntura cardiaca lentamente inserendo una siringa da 1 mL, montata con un ago da 26G 1/2po appena a sinistra dello sterno dell'animale e tirando lentamente il pistone per rimuovere la maggior parte del sangue dell'animale. Assicurarsi che la siringa sia parallela al corpo dell'animale. Ruotare lentamente la siringa tirando il pistone se non arriva sangue nella siringa.
Nota: Successo puntura cardiaca (tra 0,8 e 1 mL di volume di sangue) farà diminuire la contaminazione del tessuto adiposo con il sangue. - Appoggiare i topi sul dorso e pin ogni zampa sul pad usando gli aghi 22G come mostrato in Figura 1.
- Con una garza, strofinare la pelle del mouse con alcool più volte a partire dal collo tutto il senso giù gli organi genitali seguendo un movimento unidirezionale come questo assicura che i capelli rimane piatto e riduce la contaminazione di capelli di campioni di tessuto adiposo senza rimozione dei capelli.
- Utilizzando pulito ma non sterile pinze e forbici chirurgiche, elevare la pelle centrale vicino gli organi genitali e praticare un'incisione piccola 0,3 mm.
- Inserire le forbici orizzontalmente nel foro aperto e staccare la pelle dell'addome dalla parete addominale.
Nota: Questo viene fatto tramite la dissezione smussata nello spazio tra la pelle e la parete addominale e non tagliando le membrane trovate in questo spazio. - Utilizzando le pinze, elevare la pelle centrale vicino al foro aperto e tagliare la pelle sopra il linea alba fino a quando non sei vicino la gabbia toracica (~ 4 cm a seconda delle dimensioni del mouse).
Nota: Evitare di tagliare il muscolo addominale come questo potrebbe esporre il tessuto adiposo viscerale all'aria e condurre alla essiccazione dei rilievi del grassi che possono alterare l'integrità del tessuto e del suo contenuto. - Dalla metà della gabbia toracica, tagliare la pelle verso il braccio destro su ~ 2 cm. Da vicino gli organi genitali, taglia la pelle sopra la destra dell'arto ~ 2 cm.
- Allungare un angolo della pelle aperto e pin sul pad usando un ago 22G. Ripetere con l'altro angolo.
Nota: Il tessuto adiposo esposto sulla pelle è il grasso sottocutaneo addominale (SCF) (Figura 1A). - Raccogliere il SCF di dissezione smussata e tagliarla dalla pelle utilizzando forbici chirurgiche posizionate pianamente come possibile contro la pelle. Una volta raccolti, mettere il SCF sulla lamina di alluminio pre-identificati.
Nota: Raccolta o contaminare il tessuto adiposo con la pelle o capelli altererà campione qualità e rendimento del RNA dovuto RNasi. Se troppo tempo è speso raccogliendo il tessuto adiposo, il campione può anche a secco che può anche alterare la qualità del campione. - Ripetere i passaggi da 1,9 a 1.11 sul lato sinistro dell'animale. Piscina sia a sinistra che a destra grasse pastiglie in foglio di alluminio e congelare il campione in azoto liquido.
- Per ottenere l'accesso del tessuto adiposo viscerale, tagliare il muscolo addominale utilizzando forbici chirurgiche pulite ma non sterili e forcipe lungo il linea alba, ~ 4 cm, a seconda delle dimensioni del mouse, dai genitali per la gabbia toracica. Quindi fare un'incisione nei muscoli addominali dai genitali verso la parte posteriore del mouse ~2.5 cm per avere accesso al lato degli organi addominali.
- Il grasso intorno agli organi riproduttivi è il grasso peri-gonadica (PGF) (Figura 1B). Come PGF è associata all'epididimo, testicolo e il dotto deferente, staccare con cura il cuscinetto di grasso sinistro da quelle strutture e mettere sul foglio di alluminio pre-identificati. Ripetere per il lato destro. Una volta che entrambi PGFs sono raccolti, è possibile congelare il campione in azoto liquido.
- A partire dal lato sinistro, esporre i reni spostando l'intestino dalla cavità addominale al lato destro. Il tessuto adiposo che circonda il rene è il grasso perirenale (PRF) (Figura 1C). PRF circonda anche le ghiandole surrenali (Figura 1D).
- Isolare e rimuovere le ghiandole surrenali prima di raccogliere PRF. Questo può essere noioso come sono appena un po' pinker che il tessuto adiposo.
Nota: Reni non devono essere rimosso durante questo passaggio come sangue potrebbe contaminare il tessuto adiposo e rendere più difficile identificare le ghiandole surrenali all'interno di questo rilievo grasso. - Isolare la PRF dalla parete posteriore muscolare, terminando tagliando l'uretere, l'arteria renale e la vena che separa il PRF e rene dal resto del corpo. Isolare la PRF dal rene di taglio e rimozione della capsula renale. La PRF rimane attaccata alla capsula.
- Ripetere i passaggi da 1,15 e 1.17 per il lato destro. Mettere entrambi PRF in foglio di alluminio e congelare il campione in azoto liquido.
- Ripetere la procedura dal passaggi 1.2 a 1.18 per tutti i topi per essere raccolti.
- A questo punto, procedere alla rettifica di tessuto adiposo o conservare i campioni in un congelatore-80 ° C per l'estrazione successiva. I campioni possono essere stabilmente conservati a-80 ° C per diversi anni4.
2. preparazione del terreno bianco tessuto adiposo per isolamento del RNA
Nota: Indossare guanti per ogni passo come pelle contiene RNasi che possono promuovere la degradazione del RNA e in quanto tale, altera la qualità del campione e rendimento del RNA dopo l'isolamento.
- Preparare e identificare tre tubi RNAsi-libera 1.5 mL tappo a vite conica per topo, uno per ogni tipo di tessuto adiposo bianco e metterli su una griglia.
Nota: Animali obesi possono richiedere ulteriori tubi hanno aumentato masse grasse. Ciò è particolarmente vero per SCF per i quali fino a 7 tubi per un mouse è stata ottenuta. - Pulire il banco con etanolo al 70% e mettere una carta pulita e nuova panca sulla superficie.
- Tessuti adiposi erano appena prelevati da topi o conservati in anticipo in un congelatore-80 ° C, raccogliere tutti i campioni in un contenitore riempito di azoto liquido fino all'inizio della procedura.
- Congelare il mortaio, pestello e spatola inserendoli nel contenitore di azoto liquido. Quando l'azoto liquido si ferma a 'bollire', macinazione del tessuto adiposo può essere avviato.
Nota: Da questo passaggio, il mortaio, spatola, tubo conico e tessuto adiposo necessario rimanere refrigerate durante l'intero processo. Il calore si scioglierà il tessuto adiposo e rendono più difficile da estrarre il RNA. Inoltre, se si utilizza un mortaio di ceramica e pestello, si può usare ghiaccio secco o azoto liquido per mantenere il freddo. - Posizionare tutte le RNAsi-libera 1,5 mL tappo a vite conica tubi preparati al passaggio 2.2 su ghiaccio secco per raffreddarli.
- Per evitare congelamenti sulle mani, utilizzare pochi strati di carta marrone per sollevare il mortaio dall'azoto liquido e metterla su un banco di lavoro.
- Utilizzare le pinze per raccogliere un campione di tessuto adiposo dall'azoto liquido e metterlo nel mortaio. Rapidamente scartare la carta stagnola e rilasciare il campione al centro del mortaio.
Nota: Se il campione di tessuto adiposo è troppo grande, come è il caso con topi obesi, rompere i campioni in parti più piccole in foglio di alluminio con i pollici e polverizzare ogni parte separatamente. - Utilizzare alcuni strati di carta marrone per sollevare il pestello dall'azoto liquido e inserirlo nel mortaio. Tenendo il pestello con documenti marrone, è possibile utilizzare il martello per colpire la parte superiore del pestello una o due volte. Premere il pestello contro il mortaio con rotazione mozioni per macinare il campione fino ad ottenuta una polvere fine.
Nota: Questo passaggio è fondamentale per ottenere adeguato isolamento del RNA. Infatti, la presenza di frammenti più grandi sarà impedire isolamento del RNA e ridurre la resa. - Una volta ottenuta una polvere fine, rimuovere il pestello e ritirare la spatola dall'azoto liquido e utilizzarlo per trasferire il campione nella provetta conica pre-refrigerati 1,5 mL corrispondenti.
Nota: Immergere la spatola torna in azoto liquido di volta in volta a impedire la fusione del campione. Inoltre, tenete il tubo conico in ghiaccio secco sempre per evitare il campione dallo scongelamento. Un tubo conico riempito con il campione di terreno di circa 2/3 della capacità (~ 1 mL) è necessario per un'adeguata quantità e rendimento del RNA. - Una volta riempito a circa 1 mL, tappare la provetta e rilasciarlo in altro contenitore riempito di azoto liquido.
Nota: Campioni in eccesso possono essere messo in pre-refrigerati RNAsi-libera 1,5 mL coniche provette separate e conservati in un congelatore-80 ° C per un uso successivo. - Pulire il mortaio, pestello e spatola con documenti marrone per evitare il riporto nel prossimo campione di tessuto adiposo. Rimettere pestello e spatola nell'azoto liquido per raffreddare. Anche se la carta marrone è non privo di RNasi, usiamo una confezione appena aperta di carta marrone per ogni giorno di isolamento del RNA.
- Ripetere i passaggi da 2.4 a 2.11 con l'esempio successivo.
- Una volta che tutti i campioni vengono elaborati, avviare isolamento del RNA o conservare i campioni in un congelatore-80 ° C per un uso successivo.
Nota: Per impedire la rottura di tubi, congelare una casella esempio immergendo completamente nel contenitore di azoto liquido. Quando fresco sufficiente rimuovere l'azoto in eccesso dalla scatola e far galleggiare sopra l'azoto liquido. Ordinare i campioni nella scatola e metterlo in un congelatore a-80 ° C.
3. isolamento RNA dal tessuto adiposo di terra
Attenzione: Soluzione di fenolo è dannoso per la pelle. Indossare un camice da laboratorio, guanti, occhiali di protezione ed eseguire la procedura sotto una cappa chimica. Un diagramma di flusso passo-passo è illustrato nella Figura 2.
- Preparare e identificare i due set di provette coniche da 1,5 mL RNAsi-libera e metterli in un rack.
- Se tessuti adiposi erano appena macinati o pre-memorizzati in un congelatore a-80 ° C, raccogliere tutti i campioni in un contenitore riempito di azoto liquido fino all'inizio della procedura che avviene per lo più a temperatura ambiente.
- Utilizzare pinze per selezionare un campione di tessuto adiposo di terra dall'azoto liquido e metterlo in una cremagliera del tubo. I tubi devono contenere ~ 1 mL di polvere, che corrisponde a circa 100 mg di polvere di tessuto.
- Aprire lentamente il tubo.
Nota: Lasciando un tubo chiuso a temperatura ambiente o coperchio del tubo di apertura troppo in fretta potrebbe portare alla perdita del campione o lesioni come pressione dall'azoto tende a fuoriuscire dal tubo. - Aggiungere 500 µ l di soluzione di fenolo al campione (rapporto 1:2 della soluzione di fenolo: polvere di tessuto).
- Chiudere il coperchio del tubo e vortice alla massima velocità per circa 5 s. lentamente e aprire con cautela il tubo per allentare la pressione dall'azoto (si può udire un suono d'aria proveniente dal tubo).
- Ripetere i passaggi da 3.5 e 3.6. Il volume di soluzione di fenolo finale aggiunto al campione è di 1 mL.
- Ripetere il passaggio 3.6 fino a quando il campione è completamente sciolto.
Nota: È importante liberare tutta la pressione dal tubo prima di procedere ulteriormente per impedire la rottura del tubo. - Lasciare il campione a temperatura ambiente mentre ripetendo i passaggi 3.4 a 3,8 per i prossimi campioni.
- Una volta che tutti i campioni sono elaborati, brevemente vortice alla massima velocità e incubare tutti i campioni 5 min a temperatura ambiente.
- Centrifugare 10 min a 12 000 x g a 4 ° C. Portare le provette a temperatura ambiente.
Nota: Dopo la centrifugazione, 3 fasi sono presenti come mostrato nella Figura 2: grasso (in alto), RNA (al centro) e pellet (in basso). - Per ogni campione, trasferire tanto RNA (strato rosa centrale) possibile nel primo set di provette corrispondenti con una pipetta P1000 utilizzando una punta di filtrato. Cambiare suggerimenti tra campioni.
- Per garantire la contaminazione minima del RNA (strato intermedio) da lipidi (strato superiore), perforare la fase superiore con la punta vicino al lato del tubo. Dispensare il RNA nei nuovi tubi conici senza toccare i lati del nuovo tubo per evitare trasferimento di lipidi che possono essere all'esterno della punta.
- Aggiungere 200 µ l di cloroformio puro per ogni campione e miscelare capovolgendo per 15 s. Incubare 10 min a temperatura ambiente.
- Centrifugare per 15 min a 12 000 x g a 4 ° C e riportare le provette a temperatura ambiente.
Nota: Dopo la centrifugazione, sono presenti 3 fasi: RNA (in alto), interfase che contiene DNA (al centro) e rosso fenolo-cloroformio che contiene proteine (in basso). - Per ogni campione, trasferire come molto acquosa trasparente contenente RNA fase (fase superiore) come possibile per la seconda serie di corrispondenti provette coniche con una pipetta P1000 utilizzando filtrata-suggerimenti. Cambiare suggerimenti tra ogni campione.
Nota: L'interfase è fragile e può contaminare la fase superiore se l'aspirazione è fatto troppo in fretta. In alternativa, è possibile utilizzare una pipetta P200 per ridurre le possibilità di disturbare l'interfase. - Aggiungere 500 µ l di isopropanolo 100% per ogni campione e miscelare capovolgendo per 15 sec.
- Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente
- Centrifugare 10 min a 12 000 x g a 4 ° C e riportare le provette a temperatura ambiente. Scartare l'isopropanolo capovolgendo ogni provetta.
Nota: Una piccola pallina bianca di RNA di solito può essere visto ma occasionalmente potrebbe non. - Aggiungere 1 mL di etanolo al 75% (preparato con 100% di etanolo e acqua RNAsi-libera) per ogni campione e brevemente vortex ogni provetta alla massima velocità.
- Centrifugare 5 min a 7 500 x g a 4 ° C e riportare le provette a temperatura ambiente.
- Scartare l'etanolo di 75% capovolgendo ogni provetta e picchiettare leggermente contro una carta marrone per rimuovere qualsiasi residuo.
Nota: Se necessario, utilizzare una punta di filtrato per rimuovere alcool vicino la pallina del RNA. Suggerimento per il cambio tra i campioni. - Lasciare il coperchio aperto e asciugare all'aria la pallina del RNA per circa 15-20 min.
Nota: Pellet di RNA potrebbe diventare traslucido durante questo passaggio. - Come solubilizzazione di RNA dal pellet è dipendente dalla dimensione, valutare la dimensione del pellet per determinare il volume di acqua RNAsi-libera per essere usato per solubilizzare il RNA. Annotare il volume (10-25 µ l) per ciascun campione.
Nota: Questo passaggio è meramente qualitativo. Se la pallina del RNA non è visibile, è possibile aggiungere 10 µ l di acqua esente da RNA al campione. - Aggiungere 10-25 µ l di acqua RNAsi-libere per ogni campione (pre-determinato volume al passo 3,24).
- Incubare il campione 5 min in un blocco di calore a 60 ° C. Brevemente il vortice dei tubi.
- Incubare il campione per altri 5 minuti nello stesso blocco di calore a 60 ° C.
- Rapido-spin tutti i campioni in un mini spin centrifuga e mettere immediatamente in ghiaccio.
- Determinare la concentrazione di RNA e la purezza. Eseguire la trascrizione inversa (RT) per ottenere cDNA o conservare i campioni in un congelatore-80 ° C per un uso successivo.
Nota: Evitare più cicli di congelamento/scongelamento come questo degrada campioni di RNA.
4. la determinazione della concentrazione di tessuto adiposo RNA e purezza
- Se i campioni di tessuto adiposo RNA erano appena estratta e solubilizzati o pre-memorizzati in un congelatore a-80 ° C, raccogliere tutti i campioni e lasciarli scongelare su ghiaccio fino all'inizio della procedura. Questo dovrebbe essere fatto appena prima dell'inizio del passaggio successivo o alla fine dell'isolamento per evitare più cicli di congelamento/scongelamento.
- Preparare e identificare i due set di provette coniche da 1,5 mL RNAsi-libera e metterli in una cremagliera del tubo.
- Quando tutti i campioni di RNA sono completamente scongelato, vortice un campione per 1 s e mettere indietro sul ghiaccio.
- Diluire la soluzione di TE 100 volte in 1 x RNA nel primo set di RNAsi-libera 1,5 mL provette coniche utilizzando filtrata suggerimenti RNAsi-libera (messi 99 µ l di soluzione di 1 x TE e 1 µ l di RNA al tubo).
- Ripetere per ogni campione.
Nota: I volumi potrebbero essere diversi per ogni spettrofotometro a seconda la cuvetta utilizzata. - Una volta che tutti i campioni vengono elaborati, vortex ciascun campione diluito.
- Seguire il protocollo dello spettrofotometro per calibrare lo strumento utilizzando uno spazio vuoto (1 x TE) prima di elaborare i campioni di RNA diluiti.
- Trasferire i campioni di RNA diluiti le cuvette in quarzo e determinare la concentrazione di ogni campione a 260 nm.
Nota: Se lo spettrofotometro non fornisce la concentrazione finale di RNA, è possibile utilizzare questa formula per calcolare: RNA (µ g / µ l) = OD260 x fattore di diluizione x (40 µ g RNA/1 000 µ l). - Determinare la purezza di RNA di ciascun campione calcolando il rapporto OD260/OD280.
Nota: Un rapporto OD260/OD280 intorno 2.0 è generalmente considerato come puro per RNA12. Si consiglia vivamente che la qualità di RNA viene verificata. Per farlo, mettere 1 µ g di RNA su un gel di candeggina di agarosio 1% realizzato con 1 tampone x TBE (89 mM di Tris base, acido borico 89 mM e 2 mM EDTA, pH 8.0) e 1% candeggina soluzione13 (Figura 3). RNA di molto buona qualità Mostra sia 28S e 18S rRNA bande e la band di 28S dovrebbe essere più intensa che i maggiori di 18 anni. Qualità di RNA è accettabile quando entrambe le bande di rRNA sono visibili a un'intensità simile. Qualità di RNA diventa carente al momento che la band 18S è più intensa rispetto alla banda di 28S, e quando uno striscio è visibile, indicativo di degradazione del RNA. - Per ogni campione, preparare 10 µ l di 0,5 µ g / µ l di RNA dal magazzino nel secondo set di RNAsi-libera 1,5 mL provette coniche con RNAsi-libera acqua per diluire i campioni secondo le necessità. Questi campioni vengono utilizzati per RT per ottenere cDNA.
- Una volta che tutti i campioni vengono elaborati, avviare RT o conservare i campioni in un congelatore-80 ° C per un uso successivo.
5. d'inversione-trascrizione (RT)
- Se i campioni di tessuto adiposo RNA erano appena diluiti a 0,5 µ g / µ l o pre-memorizzati in un congelatore a-80 ° C, raccogliere tutti i campioni e reagenti e lasciarli scongelare su ghiaccio fino all'inizio della procedura.
- Mettere il portaprovette striscia PCR in ghiaccio. Una volta freddo abbastanza preparare e identificare un set di provetta PCR RNAsi-libere le strisce e metterli sulla griglia. Includere uno spazio vuoto.
- Preparare la reazione per il trattamento della dnasi del RNA: fare un master mix (per la quantità richiesta di campione + 1 campione) dei seguenti (quantità per 1 campione): 1 µ l di tampone di reazione con MgCl2, 0,5 µ l di dnasi I (1 U / µ l) e 7,5 µ l di RNAsi-libera dell'acqua utilizzando 10x filtrata-suggerimenti. Dispensare 9 µ l in ogni provetta.
- Aggiungere 1 µ l di 0,5 µ g / µ l di RNA da ogni campione al tubo corrispondente, mettere i tappi su ogni striscia e rapido-spin tutte le strisce in un mini giro Centrifugare per portare il campione alla parte inferiore del tubo. Aggiungere 1 µ l di acqua priva di RNA per il bianco.
- Incubare tutte le strisce di tubo in un termociclatore o in un incubatore a 37 ° C per 30 min. mettere la striscia tubo indietro sulla griglia a ghiaccio.
- Aggiungere 1 µ l di EDTA (50 mM) in ogni provetta e Incubare tutte le strisce di tubo in un termociclatore o un blocco di riscaldamento a 65 ° C per 10 min. mettere la striscia tubo indietro sulla griglia a ghiaccio.
- Fare un mix master (per il numero di campioni, più 1 campione) dei seguenti (quantità per 1 campione): 1 µ l di random esameri (0,2 µ g / µ l) e 1 µ l di miscela del dNTP (contiene ciascuno dei quattro deossinucleotidi ad una concentrazione di 10 mM). Pipettare 2 µ l di mix master in ogni provetta utilizzando filtrata-suggerimenti. Suggerimento per il cambio tra i campioni.
- Incubare tutte le strisce di tubo in un termociclatore o un blocco di riscaldamento a 65 ° C per 5 min, mettere la striscia tubo indietro nel rack sul ghiaccio.
- Fare un mix master (per il numero di campioni, più 1 campione) dei seguenti (quantità per 1 campione): 4 µ l di 5 x RT buffer, 1 µ l di inibitore di RNAsi (20 U / µ l), 0,25 µ l della trascrittasi inversa (200 U / µ l) e 1,75 µ l di acqua priva di nucleasi. Versare 7 µ l in ogni provetta utilizzando suggerimenti filtrate. Suggerimento per il cambio tra i campioni.
- Eseguire RT in un termociclatore impostando il seguente programma: 10 min a 25 ° C, 30 min a 50 ° C, 5 min a 85 ° C. Mettere le strisce di tubo indietro sulla griglia a ghiaccio.
- Preparare e identificare un set di RNAsi-libera PCR tubo strisce e metterli sulla griglia.
- Per ogni campione, preparare il volume desiderato di cDNA diluito 1:5 da stock nelle nuove strisce di tubo utilizzando acqua ultrapura. I campioni di cDNA diluito 1:5 serviranno per PCR in tempo reale.
- Una volta che tutti i campioni vengono elaborati, PCR in tempo reale di inizio o conservare i campioni (stock e campioni diluiti) in un congelatore a-20 ° C per un uso successivo.
6. Real-Time PCR per l'espressione genica nel tessuto adiposo
Nota: Evitare di esporre il colorante fluorescente alla luce. Il protocollo qui sotto descrive l'amplificazione del gene riferimento s1614. I primers e le condizioni PCR debbono essere modificate secondo il gene di interesse.
- Se i campioni di cDNA erano appena diluito 1:5 o pre-memorizzati in un congelatore a-20 ° C, raccogliere tutti i campioni e reagenti e lasciarli scongelare su ghiaccio fino all'inizio della procedura.
- Inserite la griglia per Real-Time PCR tubo strisce sul ghiaccio. Una volta freddo abbastanza preparare e identificare un set di in tempo reale provetta PCR strisce e metterli sulla griglia. Preparare ogni campione e il vuoto in duplice copia.
- Fare un mix master (per il numero di campioni, più 1 campione) dei seguenti (quantità per 1 campione): 1,9 µ l di acqua ultrapura, 5 µ l di colorante fluorescente (per esempio SYBR green) e 0,3 µ l di primer forward e 0,3 µ l del reverse primer. Dispensare 7,5 µ l in ogni provetta.
- Aggiungere 2,5 µ l di cDNA diluito 1:5 da ogni campione al tubo corrispondente. Aggiungere 2,5 µ l di acqua ultrapura per gli spazii in bianco. Mettere i tappi su ogni striscia.
- Seguire le istruzioni del produttore per impostare il programma riportato sulla PCR in tempo reale: 10 min a 95 ° C e 40 cicli di 15 s a 50 ° C, 30 s a 60 ° C, 30 s a 70 ° C. Mettere le strisce di campione nel rotore della macchina PCR in tempo reale e avviare il programma.
Nota: Termociclatore condizioni possono variare a seconda l'apparecchio utilizzato ed il gene di interesse. risultati di espressione di mRNA presentati in Figura 3 Visualizza leptina amplificazione di mRNA normalizzato dal gene riferimento S16 mRNA amplificazione14,15.
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Representative Results
Seguendo la procedura di autopsia, tre tessuti adiposi bianchi sono stati raccolti e appesantiti da due gruppi di topi (N e HF topi dieta-federazione). Come previsto, i topi sulla dieta HF avevano aumentato peso corporeo finale e aumento di peso rispetto ai littermates sulla dieta N (tabella 1). Queste osservazioni sono state accompagnate da più di un aumento di 2 volte del peso della PGF, PRF e SCF in topi obesi rispetto a quelli sulla dieta N.
Prima di effettuare degli esperimenti con il RNA isolato, la sua purezza è stata valutata come descritto al punto 4.9. Per ogni tessuto adiposo bianco, isolamento del RNA dalla soluzione di fenolo prodotto campioni con qualità adeguata come il rapporto OD260/OD280 era circa 2.0 che è considerato come puro per RNA (tabella 2). Dati in tempo reale di PCR ha mostrato che l'espressione del mRNA leptina è stata aumentata significativamente in PGF, PRF e SCF di topi obesi rispetto a quelli sulla dieta N (Figura 4A). Infatti, le differenze osservate nell'espressione del mRNA di leptina non erano dovuto una variazione di s16, il gene di riferimento utilizzato per normalizzare i risultati, tra i due gruppi di topi come valori Ct non sono stati alterati (Figura 4B). Così, s16 può essere attendibilmente utilizzato come un gene di riferimento per l'espressione del mRNA in PGF, PRF e SCF quando dieta HF è un parametro in un protocollo di studio.
Figura 1 . Localizzazione anatomica del tessuto adiposo bianco in topi. Un topo maschio sulla dieta N è stato sezionato per mostrare la localizzazione di ogni deposito di tessuto adiposo e ghiandole surrenali. SCF (A), PGF (B), PRF (C) e della ghiandola surrenale (D). PGF, grasso peri-gonadi; PRF, grasso perirenale; SCF, grasso sottocutaneo addominale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Diagramma di flusso di protocollo del isolamento di RNA usando fenolo soluzione. Rappresentazione schematica dei passaggi richiesti per isolare RNA dal tessuto adiposo bianco con messa a terra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Valutazione di qualità di RNA su gel di candeggina. 1 ug di RNA isolato dal grasso sottocutaneo (SCF) e grasso peri-gonadica (PGF) è separato su un gel di candeggina di agarosio 1% tramite l'elettroforesi. 28s e 18s rRNA sono visualizzati con transilluminazione UV. Il gel RNA isolato da SCF e PGF del mouse è alimentato una dieta normale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Effetto della dieta HF sulla leptina e s16 espressione di mRNA in tessuto adiposo bianco. Leptina (A) e s16 (B) l'espressione del mRNA. Dati per la leptina sono normalizzati per i livelli di mRNA di s16 mentre dati per s16 sono indicati come valore di Ct ed entrambi sono presentati come media ± SE con n = 12-13 per ogni gruppo. * p < 0,05 rispetto alla dieta di N. N, normale; HF, alto contenuto di grassi; PGF, grasso peri-gonadi; PRF, grasso perirenale; SCF, grasso sottocutaneo addominale. Questa figura è stata modificata da Tan, p. et al., l'obesità (2014) 22, 2201-2209. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Dieta di N | Dieta di HF | |
| Peso finale (g) | 37.5 ± 1,3 | 46.7 ± 1.7* |
| Aumento di peso (g) | 6,6 ± 0,7 | 16,7 ± 1.0 |
| PGF (g) | 1,08 ± 0,17 | 2,19 ± 0.15* |
| PRF (g) | 0,79 ± 0,15 | 0.06* ± 1,71 |
| SCF (g) | 1,62 ± 0.35 | 3,55 ± 0.20* |
Tabella 1. Effetto della dieta HF su pesi del tessuto adiposo bianco e del corpo. i valori sono espressi come mezzi ± SE con n = 14-15 per ogni gruppo. * p < 0,05 rispetto alla dieta di N. N, normale; HF, alto contenuto di grassi; PGF, grasso peri-gonadi; PRF, grasso perirenale; SCF, grasso sottocutaneo addominale. Questa figura è stata modificata da Tan, p. et al., l'obesità (2014) 22, 2201-2209.
| Campioni | Rapporto OD260/OD280 |
| PGF 1 | 2.04 |
| PGF 2 | 2.04 |
| PGF 3 | 2.02 |
| PRF 1 | 1.95 |
| PRF 2 | 2.08 |
| PRF 3 | 2.08 |
| SCF 1 | 2.04 |
| SCF 2 | 2.02 |
| SCF 3 | 2.06 |
Tabella 2. Purezza di RNA dopo isolamento da tessuti adiposi bianchi. n = 3 al tessuto adiposo. PGF, grasso peri-gonadi; PRF, grasso perirenale; SCF, grasso sottocutaneo addominale.
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Discussion
HF-dieta seguente nutrire, topi obesi sono stati trovati una maggiore corpo e tessuto adiposo bianco pesi rispetto ai topi alimentati con una dieta di N. RNA estratto usando fenolo soluzione dato i campioni con buona purezza. Leptina è un'adipochina prodotta principalmente da tessuto adiposo ed è conosciuta per correlare positivamente con massa grassa16. Come previsto, espressione di mRNA di leptina aumentata di topi obesi in concomitanza con la loro massa grassa.
Questo metodo ha diversi passaggi critici. Quello principale è contaminazione di un deposito di tessuto adiposo bianco con un altro, come è noto che depositi di tessuto adiposo differenti hanno differenti funzioni2,5. Contaminazione può portare a risultati fuorvianti in applicazioni a valle. Inoltre, come il grasso tende ad asciugare una volta a contatto con aria, raccogliendo il tessuto adiposo bianco a un ritmo regolare e costante tra topi è consigliabile se il peso deve essere presa. In caso contrario, il peso totale di un cuscinetto di grasso potrebbe essere errato. Al fine di ottenere RNA di buona qualità e resa, dopo la recente pubblicazione MIQE orientamenti è un asset decisivo17. In particolare, fare polvere finissima campione durante la macinazione può aiutare a massimizzare il rendimento. Questo massimizza il contatto tra la soluzione di fenolo e polvere di tessuto durante l'isolamento di RNA. Ultimo ma non meno importante è l'isolamento dello strato contenente RNA durante l'isolamento di RNA (passo 3.12). Come grasso è meno denso dell'acqua, è posizionato sopra la fase di interesse. Minimizzando il riporto di grasso è necessario per ridurre le interferenze con applicazioni a valle.
Una limitazione di questo metodo è l'abilità necessaria per eseguire diversi passaggi della procedura, nonché la necessità di lavorare con reagenti nocivi durante l'isolamento di RNA. Inoltre, l'intero processo è alta intensità di manodopera.
Non ci sono molte alternative al metodo di raccolta del tessuto adiposo e campione di elaborazione prima di isolamento del RNA oltre a piccoli dettagli che solitamente sono regolati da ciascun utente. Nel caso di isolamento del RNA, molte opzioni sono disponibili, come l'estrazione del fenolo/cloroformio o kit di isolamento del RNA. Ci sono vantaggi e svantaggi di ogni opzione e spetta all'utente di selezionare il miglior metodo basato su applicazioni a valle. Estrazione del fenolo/cloroformio è meno costoso ma richiede l'uso di reagenti nocivi ed è laborioso. Kit di isolamento del RNA sono generalmente più costosi, ma la procedura è più veloce e in genere produce campioni con buona qualità e purezza. È importante considerare la resa e la purezza del RNA perché il materiale è limitato nel tessuto adiposo bianco che è composto principalmente di grasso. Il vantaggio principale nell'utilizzo di soluzione di fenolo per isolamento (estrazione del fenolo/cloroformio) è la possibilità di isolamento del RNA, DNA e proteina da un singolo campione18. Si tratta di costi e tempo efficace come riduce il numero dei topi per ottenere sufficiente materiale necessaria. Come accennato in precedenza, la massa grassa è limitato in alcuni modelli di mouse. Per questi topi, suddivisione del tessuto adiposo di terra in tre parti separatamente ottenere RNA, DNA e proteine non è raccomandato come questo potrebbe portare a materiale insufficiente per applicazioni a valle. Per ovviare a questo problema, è anche possibile mettere insieme simile deposito di tessuto adiposo da molti topi sulla base di criteri definiti dall'utente, che conduce a un aumento del numero di animali necessari.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da diabete Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
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