Summary
Syftet med denna uppsats är att presentera en steg för steg-procedur för att samla olika vit fettvävnad från möss, behandla fett proverna och extrahera RNA.
Abstract
Jämfört med andra vävnader, har vit fettvävnad ett betydligt mindre RNA och protein innehåll för nedströms tillämpningar såsom realtids PCR och Western Blot, eftersom det mestadels innehåller lipider. RNA isolering från fettvävnad prover också utmanande som extra steg krävs att undvika dessa lipider. Här presenterar vi ett förfarande för att samla in tre anatomiskt olika vit fettvävnad från möss, att bearbeta dessa prover och utföra RNA isolering. Vidare beskriver vi syntesen av cDNA och gen uttryck experiment med realtids-PCR. Härmed beskrivna protokollet tillåter en minskning av föroreningar från djurets hår och blod på fett kuddar samt korskontaminering mellan olika fett kuddar under vävnad samling. Det har också optimerats för att säkerställa tillräcklig kvantitet och kvalitet av RNA extraherade. Detta protokoll kan i stor utsträckning till någon musmodell där fettvävnad prover krävs för rutinmässig experiment såsom realtids-PCR men är inte avsedd för isolering från primära adipocyter cellodling.
Introduction
Fetma är en världsomfattande epidemi som kan leda till komplikationer såsom typ 2-diabetes1. Kost-inducerad feta och genetiskt modifierade djurmodeller används ofta för forskning i fetma och dess komplikationer. Traditionellt, vit fettvävnad är känd som ett förvaringsfack för överskottsenergi och mestadels består av lipider medan Brun fettvävnad omvandlar energi till värme2,3. Fettvävnad kommer att är dynamisk och expandera och krympa beroende på många faktorer såsom matintag och fysisk aktivitet. Därför, för att fastställa faktorer som bidrar till dessa förändringar, adekvat fettvävnad insamling och hantering är krävs4.
Bland vita fettvävnad, är det allmänt accepterat att underhudsfett och visceralt fett depåer har olika egenskaper såsom anatomiska lokalisering och funktion2,5. Följaktligen, för att undvika motstridiga resultat eller stor variabilitet, uppmärksamhet behöver vidtas för att undvika korskontaminering mellan dessa olika fett depåer när du samlar fett kuddar.
Dessutom finns det tre stora utmaningar när isolera RNA- eller protein från möss vit fettväv. Först är samlar fett kuddar i feta möss inte en lätt uppgift som gränsen som skiljer olika vit fett depåer inte är alltid tydlig, i motsats till andra organ såsom njurar och hjärta6. Andra, på grund av den höga fetthalten av fettvävnad, under RNA- eller protein isolering, ett lager av lipider flyter ovanpå och förhindrar direkt tillgång till provet. Tredje, i motsats till Brun fettvävnad eller andra vävnader, vit fettvävnad har betydligt lägre RNA och protein innehåll och detta är av stor vikt när du använder unga möss, möss matas en normal (N) kost och möss som förväntas ha låg fett massorna (dvs. KO modeller, behandling med läkemedel, utöva utbildning, etc.) 7 , 8.
Därför är att välja lämplig metod att isolera RNA från fettvävnaden kritiska. Alternativa metoder till fenol/kloroform utvinning är kommersiella kit. De baseras vanligen på en inledande fenol utvinning steg, följt av RNA rening på en kolumn9. Dessa kit är normalt dyrare och ge prover av lägre avkastning, medan RNA kvaliteten kan vara variabel men är mindre tidskrävande. En av de största fördelarna till fenol lösning/kloroform utvinning beskrivs här är dock möjligheten att isolera RNA, DNA och protein från en enda prov10. Eftersom möss fett kuddar är oftast små och ge liten mängd RNA och proteiner (särskilt i lean musmodeller), maximera dessa protokoll data man kan få ut ur ett litet smakprov.
Syftet med denna uppsats är att beskriva i detalj en metod för att säkerställa adekvat provtagning från tre möss vit fettvävnad depåer samt kvantitet och kvalitet av RNA isolering. RNA som erhållits genom att följa detta protokoll kan användas för att utföra realtids PCR-analyser. Detta protokoll är inte avsedd för RNA isolering från odlade primära adipocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vård av de möss som används i förfaranden uppfyllda normer för skötsel och användning av försöksdjur som kanadensiska rådet för skydd av djur. Alla förfaranden godkändes av universitet djur vård och användning kommittén vid CHUM Research Center.
1. obduktion och fettvävnad samling från hanmöss
- Göra experimentella grupper enligt studien mål. I denna studie prover samlades från två grupper av manliga möss på C57Bl/6 bakgrund (n = 12-14/grupp). Säkerställa att möss som används här är 12-15 veckor och underhålls på 12-h ljus/mörk cykel med tillgång till antingen normal (N) eller hög fetthalt (HF) kost och vatten ad libitum under en period av 10 veckor11.
- Avliva en mus genom att placera musen i en förseglad kammare där det utsätts för 6% CO2 under 10 min.
- Utföra hjärt punktering genom att långsamt sätta en 1 mL spruta monterad med 26G 1/2po nål precis till vänster om djurets bröstbenet och långsamt dra kolven för att ta bort de flesta av djurets blod. Kontrollera att sprutan är parallell med djurets kropp. Rotera sprutan långsamt samtidigt som du drar kolven om blodet inte kommer in i sprutan.
Obs: Framgångsrik hjärt punktering (mellan 0,8 och 1 mL blodvolym) kommer att minska förorening av fettvävnad med blod. - Låg mössen på ryggen och fästa varje tass på pad med 22G nålar som visas i figur 1.
- Med en gasbinda, gnida huden på musen med alkohol flera gånger start från nacken ända ner till könsorganen genom att följa en enkelriktad rörelse som detta säkerställer att håret förblir platt och reducerar hår kontaminering av fettvävnad prover utan hårborttagning.
- Använda ren men inte steril pincett och kirurgiska saxar, Höj centrala huden nära könsorganen och gör en liten 0.3 mm snitt.
- In saxen horisontellt i öppnade hålet och lossa bukhuden från bukväggen.
Obs: Detta görs genom trubbig dissektion i utrymmet mellan huden och den buk-väggen och inte genom att klippa de membran som finns i detta utrymme. - Använda tången, höja centrala huden nära öppnade hålet och skära huden över den linea alba tills du är nära bröstkorgen (~ 4 cm beroende på storleken på musen).
Obs: Undvik att skära magmuskelstation eftersom detta skulle utsätta viscerala fettvävnaden i luften och leda till uttorkning av de fett kuddar som kan förändra integriteten i vävnaden och dess innehåll. - Från mitten av bröstkorgen, skära huden mot höger arm på ~ 2 cm. Från skära nära könsorganen, huden ovanför den högra bakbenen på ~ 2 cm.
- Sträck ena hörnet av öppnade huden och fästa den på plattan med hjälp av en 22G nål. Upprepa med det andra hörnet.
Obs: Fettvävnaden exponeras på huden är buken underhudsfett (SCF) (figur 1A). - Samla SCF genom trubbiga dissekera och skära det från huden med hjälp av kirurgiska saxar placerade så platt som möjligt mot huden. När samlat, sätta SCF på förhand identifierade aluminiumfolie.
Obs: Insamling eller kontaminerande fett vävnad med hud eller hår kommer att förändra prova kvalitet och RNA avkastning på grund av RNaser. Om alltför mycket tid går åt att samla in fettvävnaden, kan provet också torka vilket kan också förändra kvaliteten på provet. - Upprepa steg 1,9 till 1.11 på vänster sida av djuret. Pool både vänster och höger fett kuddar i aluminiumfolie och frysa provet i flytande kväve.
- För att få tillgång till de visceral fettvävnad, skär den bukmuskeln som med ren men inte steril kirurgisk sax och pincett längs den linea alba, på ~ 4 cm, beroende på mus storleken, från könsorganen till bröstkorgen. Sedan göra ett snitt i magmusklerna från könsorganen mot baksidan av musen på ~2.5 cm ska ha tillgång till sidan av bukorganen.
- Fettet runt fortplantningsorganen är peri-gonadala fett (GRO) (figur 1B). Eftersom PGF är knuten till den ductus deferens, bitestiklarna och testiklarna, lossa försiktigt den vänstra fett pad från dessa strukturer och sätta på förhand identifierade aluminiumfolie. Upprepa för höger sida. När båda PGFs samlas, frysa provet i flytande kväve.
- Börja med vänster sida, exponera njurarna genom att flytta tarmen från bukhålan till höger sida. Fettvävnad kring njuren är peri-nedsatt fett (PRF) (figur 1C). PRF omger också binjurarna (figur 1D).
- Isolera och ta bort binjurarna innan du samlar in PRF. Detta kan vara långtråkig eftersom de är bara lite pinker än fettvävnad.
Obs: Njurar bör inte tas bort under detta steg eftersom blod kan förorena fettvävnaden och göra det svårare att identifiera binjurarna inom detta fett pad. - Isolera den PRF från tillbaka muskulösa väggen, slutar genom att skära urinledaren, nedsatt artär och ven som skiljer PRF och njure från resten av kroppen. Isolera PRF från njuren genom skärning och ta bort nedsatt kapseln. PRF förblir knutna till kapseln.
- Upprepa steg 1.15 och 1.17 för höger sida. Sätta båda PRF i aluminiumfolie och frysa provet i flytande kväve.
- Upprepa proceduren från steg 1.2 till 1,18 för alla möss samlas.
- Vid denna punkt, fortsätta med fettvävnad slipning eller lagra prover i-80 ° C frys för senare utvinning. Prover kan lagras stabilt vid-80 ° C för flera år4.
2. beredning av marken vit fettvävnad för RNA isolering
Obs: Använd handskar för varje steg som huden innehåller RNaser som kan främja RNA nedbrytning och som sådan, förändrar urvalet kvalitet och RNA avkastning efter isolering.
- Förbereda och identifiera tre RNase-fri 1,5 mL koniska skruvlock rör per mus, en för varje typ av vit fettvävnad, och placera dem på ett galler.
Obs: Feta djur kan kräva ytterligare rör som de har ökat fett massorna. Detta är särskilt sant för SCF som upp till 7 rör för en mus erhölls. - Rengöra bänken med 70% etanol och sätta en ren och ny bänk papper på ytan.
- Om fettvävnad var nyligen uppsamlat från möss eller lagras i förväg i-80 ° C frys, samla alla prover i en flytande kväve-fyllda behållare fram till början av förfarandet.
- Frysa den mortel och mortelstöt spatel genom att placera dem i behållaren med flytande kväve. När det flytande kvävet stannar '' koka '', kan slipning av fettvävnad startas.
Obs: Från detta steg, murbruk, spatel behöver koniska tube och fettvävnad bo kylda under hela processen. All värme kommer smälta fettvävnaden och göra det svårare att extrahera RNA. Också, om du använder en keramiska mortel och stöt, kan man använda torris och flytande kväve för att hålla det kallt. - Placera alla RNase-fri 1,5 mL koniska skruvlock rör beredd vid steg 2.2 på torris dem svalna.
- För att undvika köldskador på händerna, Använd några lager av brunt papper att lyfta mortel från det flytande kvävgasen och lägga den på en arbetande bänk.
- Använd tången för att samla in en fettvävnad prov från det flytande kvävgasen och lägga den i mortel. Snabbt packa aluminiumfolie och släpp provet på mitten av murbruk.
Obs: Om fettvävnad provet är för stor, vilket är fallet med feta möss, bryta proverna i mindre delar i aluminiumfolie med tummarna och pulverisera varje del separat. - Använda några lager av brunt papper att lyfta mortelstöten från det flytande kvävgasen och passa in det i mortel. Medan du håller mortelstöten med brunt papper, Använd hammaren för att träffa toppen av mortelstöten gånger. Tryck mortelstöten ner mot mortel med roterande rörelser för att finfördela provet tills ett fint pulver erhålls.
Obs: Detta steg är avgörande för att erhålla tillräcklig RNA isolering. Förekomsten av större fragment kommer faktiskt hindra RNA isolering och minska avkastningen. - När ett fint pulver erhålls, ta bort mortelstöten och plocka upp spateln från det flytande kvävgasen och använda den för att överföra provet i motsvarande pre kylda 1,5 mL koniska röret.
Obs: Doppa spateln tillbaka i flytande kväve från tid till annan för att förhindra att provet smältning. Håll också koniska röret i torris alltid för att förhindra att provet upptining. Ett koniskt rör fyllda med marken prov till ca 2/3 kapacitet (~ 1 mL) krävs för adekvat RNA avkastning och kvantitet. - En gång fyllt ca 1 ml, nära röret och släppa den i den andra flytande kväve-fyllda behållaren.
Obs: Överflödigt prov kan placeras i separata pre kylda RNase-fri 1,5 mL koniska rör och lagras i-80 ° C frys för senare användning. - Ren den mortel och mortelstöt spatel med brunt papper för att undvika överföring till nästa fettvävnad provet. Placera mortel och spatel i det flytande kvävet till chill. Även om det brunt papperet är inte RNase-fria, vi använder en nyöppnade förpackning med brunt papper för varje dag av RNA isolering.
- Upprepa steg 2,4 till 2.11 med nästa provet.
- När alla prover är bearbetat, starta RNA isolering eller lagra prover i-80 ° C frys för senare användning.
Obs: För att förhindra att rören spricker, frysa en provlåda genom att helt dränka det i behållaren med flytande kväve. När cool nog bort den överskott av kvävgasen från rutan och låt det flyta ovanpå det flytande kvävgasen. Sortera prover i rutan och lägga den i-80 ° C frys.
3. RNA isolering från marken fettvävnad
Varning: Fenol lösning är skadligt för huden. Bära en labbrock, handskar, skyddsglasögon och utföra proceduren under en kemisk huva. En steg för steg flödesschema visas i figur 2.
- Förbereda och identifiera två uppsättningar av RNase-fri 1,5 mL koniska rör och sätta dem i ett rack.
- Om fettvävnad var färska malda eller pre lagras i-80 ° C frys, samla alla prover i en flytande kväve-fyllda behållare fram till början av det förfarande som sker mestadels i rumstemperatur.
- Använd tången välja ett marken fettvävnad prov från det flytande kvävgasen och lägga den i en tube rack. Rören bör innehålla ~ 1 mL pulver, vilket motsvarar cirka 100 mg vävnad pulver.
- Långsamt öppna tuben.
Obs: Lämnar en stängd tub i rumstemperatur eller öppna rörets lock för snabbt kan leda till prov förlust eller skada som påtryckningar från kvävet tenderar att fly från röret. - Tillsätt 500 µL fenol lösning (1:2 förhållande av fenol lösning: vävnad pulver).
- Stäng locket på röret och vortex med maximal hastighet i ca 5 s. långsamt och öppna försiktigt tuben för att släppa trycket från det kväve (ljud av luft kommer ut ur röret kan höras).
- Upprepa steg 3.5 och 3.6. Den slutliga fenol lösning tillsätts provet är 1 mL.
- Upprepa steg 3.6 tills provet är helt upplöst.
Obs: Det är viktigt att släppa alla påtryckningar från röret innan du går vidare att hindra röret från spricker. - Låt provet stå i rumstemperatur medan Upprepa steg 3,4 till 3.8 för nästa prover.
- När alla prover är bearbetat, kort vortex med maximal hastighet och inkubera alla prover 5 min i rumstemperatur.
- Centrifugera 10 min vid 12 000 x g vid 4 ° C. Få rören tillbaka till rumstemperatur.
Obs: Efter centrifugering, 3 faser är närvarande som visas i figur 2: RNA (mitten), fett (överst) och pellet (nederst). - För varje prov, överföra så mycket RNA (rosa mellanlager) som möjligt till den första uppsättningen av motsvarande rör med P1000 pipett med en filtrerad spets. Ändra tips mellan prover.
- För att säkerställa minimal förorening av RNA (mellersta skikt) av lipid (översta lagret), pierce fasen topp med spets nära sidan av röret. Avstå från RNA in i ny konisk rören utan att vidröra sidorna av nya röret för att förhindra överföring av lipider som kan finnas på utsidan av toppen.
- Tillsätt 200 µL ren kloroform till varje prov och blanda genom inversion under 15 s. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera 15 min vid 12 000 x g vid 4 ° C och föra rören tillbaka till rumstemperatur.
Obs: Efter centrifugering, 3 faser är närvarande: RNA (överst), interphase som innehåller DNA (mitten) och röd fenol-kloroform som innehåller proteiner (nederst). - För varje prov, överföra som mycket transparent RNA-innehållande vattenfasen (övre fas) som möjligt i den andra uppsättningen av motsvarande koniskt rör med P1000 pipett använder filtrerad-tips. Ändra tips mellan varje prov.
Obs: Interphasen är bräcklig och kan förorena den övre fasen om aspiration sker för snabbt. Som ett alternativ, Använd en P200 pipetten för att minska risken för störande interphasen. - Tillsätt 500 µL 100% isopropanol i varje prov och blanda genom inversion i 15 sekunder.
- Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur
- Centrifugera 10 min vid 12 000 x g vid 4 ° C och föra rören tillbaka till rumstemperatur. Kassera isopropanol genom att vända varje rör.
Obs: En liten vit RNA pellet syns oftast men kanske ibland inte. - Tillsätt 1 mL 75% etanol (beredd från 100% etanol och RNase-fritt vatten) till varje prov och kort vortex varje tub med maximal hastighet.
- Centrifugera 5 min vid 7 500 x g vid 4 ° C och föra rören tillbaka till rumstemperatur.
- Kassera den 75% etanolen genom att vända varje rör och lätt tryck mot ett brunt papper att ta bort alla överblivna.
Obs: Om det behövs, använda en filtrerad-spets ta bort alkohol nära RNA pelleten. Ändra tip mellan prover. - Lämna locket öppnas och torka RNA pelleten i ca 15-20 min.
Obs: RNA pellets kan bli genomskinlig under detta steg. - Som RNA lösbarhet från pelleten storleken-beroende, utvärdera storleken på pelleten att bestämma volymen av RNase-fritt vatten för att användas för att solubilize RNA. Skriv ner volymen (10 till 25 µL) för varje prov.
Obs: Detta steg är endast kvalitativa. Om RNA pellet inte kan ses, tillsätt 10 µL av RNA-gratis vatten. - Tillsätt 10-25 µL RNase-fritt vatten i varje prov (förutbestämd volym vid steg 3.24).
- Inkubera provet 5 min i en värme block vid 60 ° C. Kort vortex rören.
- Inkubera provet för en ytterligare 5 min i samma värme block vid 60 ° C.
- Quick-spin alla prover i en mini snurra centrifug och omedelbart sätta på is.
- Fastställa RNA-koncentrationen och renheten. Utföra omvänd Transkription (RT) att erhålla cDNA eller lagra prover i-80 ° C frys för senare användning.
Obs: Undvik flera frysas och tinas cykler eftersom detta försämrar RNA-prover.
4. bestämning av fettvävnad RNA-koncentrationen och renheten
- Om fettvävnad RNA prover var färska utvinns och solubilized eller pre lagras i-80 ° C frys, samla alla prover och låt dem Tina på is fram till början av förfarandet. Detta bör göras strax före start av nästa steg eller i slutet av isolering att undvika flera frysas och tinas cykler.
- Förbereda och identifiera två uppsättningar av RNase-fri 1,5 mL koniska rör och sätta dem i en tube rack.
- När alla de RNA-proverna är helt tinade, vortex ett prov för 1 s och sätta tillbaka på isen.
- Utspädd RNA 100 gånger i 1 x TE lösningen i den första uppsättningen av RNase-fri 1,5 mL koniska rör använder filtrerad RNase-gratis tips (sätta 99 µL 1 x TE lösning och 1 µL RNA till röret).
- Upprepa för varje prov.
Obs: Volymerna kan vara olika för varje spektrofotometer beroende på den kyvetten används. - När alla prover är bearbetat, utspätt vortex varje prov.
- Följa protokollet spektrofotometerns att kalibrera instrumentet med hjälp av ett tomt (1 x TE) innan du bearbetar de utspädda RNA-proverna.
- Överföra de utspädda RNA-proverna till de quartz kyvetten och bestämma koncentrationen av varje prov på 260 nm.
Obs: Om spektrofotometer inte ger den slutliga RNA-koncentrationen, använda denna formel för att beräkna: RNA (µg/µL) = OD260 x utspädningsfaktorn x (40 µg RNA/1 000 µL). - Bestämma RNA renheten av varje prov genom att beräkna förhållandet OD260/OD280.
Obs: Förhållandet OD260/OD280 runt 2.0 anses allmänt ren för RNA12. Det rekommenderas starkt att RNA kvalitet är verifierad. För att göra detta, sätta 1 µg RNA på en 1% agaros blekmedel gel gjort med 1 x TBE buffert (89 mM Tris base, 89 mM borsyra och 2 mM EDTA, pH 8,0) och 1% blekmedel lösning13 (figur 3). RNA av mycket god kvalitet visar både 28S och 18S rRNA band och 28S bandet bör vara mer intensiv än 18S. RNA kvalitet är acceptabelt när båda rRNA-banden är synliga på en liknande intensitet. RNA kvalitet blir bristfällig nu 18S bandet är mer intensiv än 28S bandet, och när ett utstryk är synligt, vägledande av RNA nedbrytning. - För varje prov, förbereda 10 µL 0,5 µg/µL av RNA från lager i den andra uppsättningen av RNase-fri 1,5 mL koniska rör med RNase-fritt vatten för att späda ut proverna som behövs. Dessa prover används för RT för att erhålla cDNA.
- När alla prover är bearbetat, starta RT eller lagra prover i-80 ° C frys för senare användning.
5. omvänd-Transkription (RT)
- Oavsett om fettvävnad RNA prover var färska utspätt till 0,5 µg/µL eller pre lagras i-80 ° C frys, samla alla prover och reagenser och låt dem Tina på is fram till början av förfarandet.
- Sätta i PCR-röret strip racket på is. När kallt nog förbereda och identifiera en uppsättning RNase-fri PCR-röret remsor och lägga dem på hyllan. Inkludera en tom.
- Förbereda reaktionen för DNAS behandling av RNA: gör en master mix (för mängden prov + 1 prov) av följande (kvantiteter för 1 prov): 1 µL 10 X reaktion buffert med MgCl2, 0,5 µL av DNAS jag (1 U/µl) och 7,5 µL RNase-gratis vatten med filtrerad-tips. Dispensera 9 µL i varje rör.
- Tillsätt 1 µL 0,5 µg/µL av RNA från varje prov till motsvarande röret, sätta lock på varje remsa och quick-spin alla remsor i en mini spin Centrifugera för att ta provet till botten av röret. Tillsätt 1 µL av RNA-fritt vatten för blindtestet.
- Inkubera alla tube remsor i en termocykel eller en värmeblocket vid 37 ° C i 30 min. sätt tube remsan tillbaka racket på is.
- Tillsätt 1 µL av EDTA (50 mM) i varje rör och inkubera alla tube remsor i en termocykel eller en värmeblocket vid 65 ° C i 10 min. sätt tube remsan tillbaka racket på is.
- Gör en master mix (för erforderligt antal prover plus 1 prov) av följande (kvantiteter för 1 prov): 1 µL av slumpmässiga hexamers (0.2 µg/µL) och 1 µL dNTP mix (innehåller var och en av de fyra deoxinukleotider med en koncentration på 10 mM). Fördela 2 µL master mix i varje rör använder filtrerad-tips. Ändra tip mellan prover.
- Inkubera alla tube remsor i en termocykel eller en värmeblocket vid 65 ° C i 5 min. Placera röret remsan i racket på is.
- Gör en master mix (för erforderligt antal prover plus 1 prov) av följande (kvantiteter för 1 prov): 4 µL av 5 x RT buffert, 1 µL RNase inhibitor (20 U/µL), 0,25 µL av omvänt transkriptas (200 U/µL) och 1,75 µL nuclease-gratis vatten. Dispensera 7 µL i varje rör som med hjälp av filtrerade tips. Ändra tip mellan prover.
- Utföra RT i en termocykel genom att ange följande program: 10 min vid 25 ° C, 30 min vid 50 ° C, 5 min vid 85 ° C. Sätta tube remsorna tillbaka på racket på is.
- Förbereda och identifiera en uppsättning RNase-fri PCR-röret remsor och lägga dem på hyllan.
- För varje prov, förbereda önskad volym av 1:5 utspädda cDNA från lager i de nya röret remsor med hjälp av ultrarent vatten. 1:5 utspädda cDNA proverna kommer att användas för realtids-PCR.
- När alla prover är bearbetat, starta Realtidspcr eller lagra prover (lager och utspädda prover) i-20 ° C frys för senare användning.
6. realtids-PCR för genuttryck i fettvävnad
Obs: Undvik att utsätta den fluorescerande färgämnen för ljus. Protokollet nedan beskriver förstärkningen av referens gen s1614. Primers och PCR-villkor bör ändras enligt gen av intresse.
- Oavsett om cDNA prover var färska utspädd 1:5 eller pre förvaras i-20 ° C frys, samla alla prover och reagenser och låt dem Tina på is fram till början av förfarandet.
- Sätta racket för realtids PCR-röret remsor på is. När kallt nog förbereda och identifiera en uppsättning realtids PCR-röret remsor och Lägg dem på racket. Förbered varje prov och tomrummet i två exemplar.
- Gör en master mix (för erforderligt antal prover plus 1 prov) av följande (kvantiteter för 1 prov): 1,9 µL av ultrarent vatten, 5 µL av fluorescerande färgämne (t.ex. SYBR green) och 0,3 µL av en forward primer och 0,3 µL av reverse primer. Dispensera 7,5 µL i varje rör.
- Tillsätt 2,5 µL av 1:5 utspädda cDNA från varje prov till motsvarande röret. Tillsätt 2,5 µL av ultrarent vatten för tomrummen. Sätt lock på varje remsa.
- Följ tillverkarens instruktioner för att ställa in följande program på realtids PCR: 10 min vid 95 ° C och 40 cykler av 15 s vid 50 ° C, 30 s vid 60 ° C, 30 s vid 70 ° C. Tas provet remsorna i rotorn av realtids PCR-maskinen och starta programmet.
Obs: Termocykel villkor kan variera beroende på den apparat som används och gen av intresse. mRNA uttryck resultat som presenteras i figur 3 Visa leptin mRNA förstärkning normaliserade av Referensgenen S16 mRNA förstärkning14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter obduktion proceduren, tre vit fettvävnad samlades och vägt från de två grupperna av möss (N och HF kost-matade möss). Som väntat hade möss på HF diet ökat slutliga kroppsvikt och viktökning jämfört med littermates N kost (tabell 1). Dessa observationer åtföljdes av mer än en 2-faldig ökning av vikten av PGF, PRF och SCF i feta möss jämfört med de N kost.
Innan du utför några experiment med isolerade RNA, utvärderades dess renhet som beskrivs i steg 4,9. För varje vit fettvävnad, RNA isolering av fenol lösning producerade prover med tillräcklig kvalitet som förhållandet OD260/OD280 var cirka 2,0 som är ansedd som ren för RNA (tabell 2). Realtids PCR-data visade att leptin mRNA uttryck var ökat betydligt i PGF, PRF och SCF feta möss jämfört med de N kost (figur 4A). De skillnader i leptin mRNA uttryck var faktiskt inte på grund av en variant av s16, Referensgenen används för att normalisera resultat, mellan de två grupperna av möss som Ct-värden inte har ändrats (figur 4B). Således, s16 kan tillförlitligt användas som en referens-gen för mRNA uttryck i PGF, PRF och SCF när HF diet är en parameter i ett studieprotokoll.
Figur 1 . Anatomisk lokalisering av vit fettvävnad hos möss. En manlig mus N kost har varit dissekeras för att Visa localizationen av varje fettvävnad depot och binjurarna. SCF (A), GRO (B), PRF (C) och binjuren (D). PGF, peri-gonadala fett; PRF, peri-nedsatt fett; SCF, subkutan bukfett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . RNA isolering protokoll flödesschema med hjälp av fenol lösning. Schematisk bild av de steg som krävs för att isolera RNA från jordad vit fettväv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . RNA kvalitetsbedömning på blekmedel gel. 1 ug RNA isoleras från underhudsfett (SCF) och peri-gonadala fett (GRO) separeras på en 1% agaros blekmedel gel genom elektrofores. 28s och 18s rRNA visualiseras av UV-genomlysning. På gel matas RNA isoleras från SCF och gro musklick en normal kost. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Effekten av HF kost på leptin och s16 mRNA uttryck i vit fettväv. Leptin (A) och s16 (B) mRNA uttryck. Data för leptin är normaliserad till s16 mRNA nivåer medan data för s16 visas som Ct-värde och båda presenteras som medelvärde ± SE med n = 12-13 per grupp. * p < 0,05 jämfört med N kost. N, normala; HF, fettrik; PGF, peri-gonadala fett; PRF, peri-nedsatt fett; SCF, subkutan bukfett. Denna siffra har ändrats från Tan, P. et al, fetma (2014) 22, 2201-2209. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| N kost | HF-kost | |
| Slutliga kroppsvikt (g) | 37,5 ± 1,3 | 46,7 ± 1.7* |
| Viktökning (g) | 6,6 ± 0,7 | 16,7 ± 1.0* |
| PGF (g) | 1,08 ± 0,17 | 2.19 ± 0.15* |
| PRF (g) | 0,79 ± 0,15 | 1.71 ± 0.06* |
| SCF (g) | 1.62 ± 0,35 | 3,55 ± 0.20* |
Tabell 1. Effekt av HF kost på kropp och vit fettvävnad vikter. Värden uttrycks som medel ± SE med n = 14-15 per grupp. * p < 0,05 jämfört med N kost. N, normala; HF, fettrik; PGF, peri-gonadala fett; PRF, peri-nedsatt fett; SCF, subkutan bukfett. Denna siffra har ändrats från Tan, P. et al, fetma (2014) 22, 2201-2209.
| Prover | Baserat på OD260/OD280 |
| PGF 1 | 2,04 |
| PGF 2 | 2,04 |
| PGF 3 | 2,02 |
| PRF 1 | 1,95 |
| PRF 2 | 2,08 |
| PRF 3 | 2,08 |
| SCF 1 | 2,04 |
| SCF 2 | 2,02 |
| SCF 3 | 2,06 |
Tabell 2. RNA renhet efter isolering från vit fettvävnad. n = 3 per fettvävnad. PGF, peri-gonadala fett; PRF, peri-nedsatt fett; SCF, subkutan bukfett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Följande HF-kost utfodring, visade feta möss för att ökad kropp och vit fettvävnad vikter jämfört med möss ges en N kost. RNA extraherade med fenol lösning gav prover med bra renhet. Leptin är ett adipokine som främst produceras av fettvävnad och är känd att korrelera positivt med fett massa16. Som väntat ökade leptin mRNA uttryck i feta möss i concomitance med sin fettmassa.
Denna metod har flera kritiska steg. Den stora är förorening av en vit fettvävnad depot med ett annat eftersom det är känt att olika fettvävnad depåer har olika funktioner2,5. Kontaminering kan ge missvisande resultat i efterföljande program. Dessutom, eftersom fett tenderar att torka en gång vid kontakt med luft, samla vit fettvävnad i regelbunden och konsekvent takt mellan möss rekommenderas om vikten behöver vidtas. Annars, den totala vikten av en fet pad kan vara felaktiga. För att få RNA av god kvalitet och avkastning, efter den nyligen publicerade MIQE riktlinjer är en bestämd tillgång17. Framför allt kan gör mycket fina prov pulver under slipningen maximera avkastningen. Detta maximerar kontakten mellan den vävnad pulver och fenol lösningen under RNA isolering. Sist men är inte minst det RNA-innehållande lagret isolering under RNA isolering (steg 3.12). Eftersom fett är mindre tät än vatten, är den placerad ovanpå fasen av intresse. Att minimera överföringen av fett är nödvändigt att minska störningar med efterföljande program.
En begränsning med denna metod är den färdighet som krävs för att utföra flera steg i förfarandet samt behovet av att arbeta med skadliga reagens under RNA isolering. Dessutom är hela processen arbetskrävande.
Det finns inte många alternativ till metoden av fettvävnad samling och prov bearbetning innan RNA isolering bortsett från små detaljer som justeras vanligtvis av varje användare. När det gäller RNA isolering finns många alternativ som fenol/kloroform utvinning eller RNA isolering kit. Det finns fördelar och nackdelar med varje alternativ och det är upp till användaren att välja den bästa metoden baserat på nedströms tillämpningar. Fenol/kloroform utvinning är billigare men kräver användning av skadliga reagenser och mödosam. RNA isolering kit är generellt dyrare men förfarandet är snabbare och vanligtvis avkastning prover med bra kvalitet och renhet. Det är viktigt att överväga avkastningen och renheten av RNA eftersom materialet är begränsat i vit fettvävnad som huvudsakligen består av fett. Den största fördelen med fenol lösning för isolering (fenol/kloroform extraktion) är möjligheten att isolera RNA, DNA och protein från en enda prov18. Detta är kostnads - och tidseffektiv eftersom det minskar antalet möss som krävs för att erhålla tillräckligt material. Som tidigare nämnts, är fettmassa begränsad i vissa musmodeller. För dessa möss rekommenderas inte dela marken fettvävnad i tre delar separat få RNA, DNA och protein eftersom detta kan leda till otillräcklig material för nedströms tillämpningar. För att kringgå problemet, är det också möjligt att sammanföra liknande fettvävnad depot från flera möss baserat på användardefinierade kriterier, vilket leder till ett ökat antal djur behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Diabetes Kanada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
