Summary
Formålet med denne utredningen er å presentere en fremgangsmåte for å samle forskjellige hvite liggende under adipose vev fra mus, behandle fett prøvene og ekstra RNA.
Abstract
Sammenlignet med andre vev, har hvit fettvev et betydelig mindre RNA og protein innhold for nedstrøms programmer som sanntid PCR og Western Blot, siden det meste inneholder lipider. RNA isolasjon fra fettvev prøver er også utfordrende som ekstra trinn kreves for å unngå disse lipider. Her presenterer vi en prosedyre for å samle tre anatomisk forskjellige hvite liggende under adipose vev fra mus, til å behandle disse prøvene RNA isolasjon. Videre beskriver vi syntese av cDNA og gene expression eksperimenter ved hjelp av sanntids PCR. Herved beskrevet protokollen tillater reduksjon av forurensning fra dyrets hår og blod fett pads samt kryssforurensning mellom ulike fett pads under vev samling. Det har også blitt optimalisert for å sikre tilstrekkelig mengde og kvalitet av det utdraget. Denne protokollen kan bli mye brukt til alle musemodell der fettvev prøver kreves for rutinemessig eksperimenter som sanntid PCR, men er ikke ment for isolasjon fra primær adipocytter cellekultur.
Introduction
Fedme er en verdensomspennende epidemien som kan føre til komplikasjoner som type 2 diabetes1. Diett-indusert overvektige og genmodifiserte dyr modeller brukes ofte for forskning i fedme og dens tilknyttede komplikasjoner. Tradisjonelt hvit fettvev er kjent som en lagringen avlukke for overflødig energi og er stort sett består av lipider mens brun fettvev konverterer energi til varme2,3. Fettvev vil er dynamisk og utvide og forminske avhengig av mange faktorer som matinntaket og fysisk aktivitet. Derfor, for å bestemme faktorer som bidrar til disse endringene, tilstrekkelig fettvev informasjonsinnsamling og håndtering er nødvendig4.
Blant hvite liggende under adipose vev, er det generelt akseptert at subkutan og visceral fett depoter har ulike egenskaper som anatomisk lokalisering og fungere2,5. Derfor, for å unngå motstridende resultater eller stor variasjon, oppmerksomhet må tas å unngå kryss-kontaminering mellom disse forskjellige fett depoter når fett pads.
Videre er det tre store utfordringer når isolere RNA eller protein fra mus hvit fettvev. Først er samle fett pads i overvektige mus ikke en lett oppgave som grensen som skiller ulike hvite fett depoter ikke er alltid klart, i motsetning til andre organer som nyrer og hjerte6. Andre, på grunn av det høye lipid innholdet av fettvev, under RNA eller protein isolasjon, et lag av lipider flyter på toppen og hindrer direkte tilgang til prøven. Tredje i stedet for brun fettvev eller andre vev, hvit fettvev har betydelig lavere RNA og protein innhold og dette er av stor bekymring når unge mus, mus matet en normal (N)-diett og mus som er forventet å ha lav fett massene (dvs. KO modeller, behandling med medikamenter, trening trening, etc.) 7 , 8.
Velge den riktige isolere RNA fra fettvev er derfor kritisk. Alternative metoder til fenol/kloroform ekstraksjon er kommersielle kits. De er vanligvis basert på en første fenol utvinning trinn, etterfulgt av RNA rensing på kolonnen9. Men de kits er vanligvis dyrere og gi eksempler på lavere avkastning, mens RNA kvaliteten kan være variabel, men er mindre tidkrevende. Men er en av de største fordelene til fenol løsning/kloroform ekstraksjon beskrevet her muligheten for å isolere RNA og DNA protein fra en enkelt prøve10. Siden mus fett pads er vanligvis små, og gir liten mengde RNA og proteiner (spesielt i mager musen modeller), maksimere disse protokollene dataene kan få ut av et lite utvalg.
Målet med denne utredningen er å beskrive i detalj en metode for å sikre tilstrekkelig prøvetaking fra tre mus hvit fettvev depoter samt kvantitet og kvalitet av RNA isolasjon. RNA oppnås ved å følge denne protokollen kan brukes til å utføre sanntid PCR analyser. Denne protokollen er ikke ment for RNA isolasjon fra kulturperler primære adipocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pleie av musene som brukes i prosedyrene overholdt standarder og bruk av forsøksdyr angitt av kanadiske Rådet for beskyttelse av dyr. Alle prosedyrer ble godkjent av universitetet Animal Care og bruk komiteen på KOMPIS Research Center.
1. obduksjon og fettvev fra mannlige mus
- Gjøre eksperimentelle grupper etter studere mål. I denne studien innhentet prøver fra to grupper av mannlige mus på C57Bl/6 bakgrunn (n = 12-14/gruppe). Kontroller at mus brukes her er 12-15 ukens av alderen og vedlikeholdes på 12-h lys/mørke syklus med tilgang til normal (N) eller høy-fett (HF) diett og vann annonse libitum for en periode på 10 uker11.
- Euthanize en mus ved å plassere musen i et forseglet kammer hvor det utsettes for 6% CO2 under 10 min.
- Utføre cardiac punktering ved langsomt å sette inn en 1 mL sprøyte montert med en 26G 1/2po nål like til venstre av dyrets sternum og langsomt dra stempelet for å fjerne det meste av dyrets blod. Kontroller at sprøyten er parallell til dyrets kroppen. Rotere sprøyten sakte mens du trekker stempelet om blod ikke kommer i sprøyten.
Merk: Vellykket cardiac punktering (mellom 0,8 og 1 mL blodvolum) vil redusere forurensning av fettvev med blod. - Lå musene på ryggen og fester hver labb på puten over 22G pinner som vist i figur 1.
- Med en gasbind, gni huden av musen med alkohol flere ganger fra halsen helt ned genital organer ved å følge en enveis bevegelse som dette sikrer at håret er flatt og reduserer hår forurensning av fettvev prøver uten hårfjerning.
- Bruker ren men ikke sterilt tang og kirurgisk saks, heve sentrale huden i nærheten genital organer og gjøre en liten 0,3 mm snitt.
- Sett inn saksen vannrett i åpne hullet og koble abdominal huden fra bukveggen.
Merk: Dette gjøres ved sløv disseksjon i rommet mellom huden og bukveggen og ikke kutte membraner i dette rommet. - Bruke pinsett, heve sentrale huden i nærheten åpne hullet og kutt huden den linea alba til du er nær ribbe buret (~ 4 cm avhengig musen).
Merk: Unngå klipping bukmuskel som dette kan utsette visceral fettvev luften og føre til uttørking av fett pads som kan endre integriteten til vev og innholdet. - Fra midten av ribben buret, kutte huden mot den høyre armen på ~ 2 cm. Fra kuttet nær kjønnsorganer, huden over høyre hind lem på ~ 2 cm.
- Strekke et hjørne av åpnet huden og feste det på puten bruker en 22G nål. Gjenta med den andre hjørnet.
Merk: Fettvev utsatt på huden er det subkutant fettet (SCF) (figur 1A). - Samle SCF av sløv dissekere og kutte det fra huden med kirurgisk saks plassert så flat som mulig mot huden. Når samlet, satte SCF på pre identifiserte aluminiumsfolie.
Merk: Samle eller forurensende adipose vev med hud eller hår vil endre smake kvaliteten og RNA avkastning på grunn av RNases. Hvis for mye tid å samle fettvev, kan prøven også tørr som kan også endre kvaliteten på prøven. - Gjenta trinn 1,9 til 1,11 på venstre side av dyret. Basseng både venstre og høyre fett pads i aluminiumsfolie og fryse prøven i flytende nitrogen.
- For å få tilgang til visceral liggende under adipose vev, kuttet bukmuskel bruker ren men ikke sterilt kirurgisk saks og tang langs den linea alba, på ~ 4 cm, avhengig musen, fra kjønnsorganer til ribbe buret. Deretter lage et snitt i magemusklene fra kjønnsorganer mot baksiden av musen på ~2.5 cm tilgang til siden av abdominal organer.
- Fettet rundt den reproduktive organer er peri-gonadal fett (PGF) (figur 1B). Som PGF er knyttet til bitestikkel, testikkel og ductus deferens, løsne nøye venstre fett puten fra de strukturene og sette på pre identifiserte aluminiumsfolie. Gjenta for høyre side. Når begge PGFs er samlet, fryse prøven i flytende nitrogen.
- Starter med venstre side, utsette nyrene ved å flytte tarmen fra bukhulen til høyre side. Fettvev rundt nyre er peri-nyre fett (PRF) (figur 1C). PRF omgir også binyrene (figur 1D).
- Isolere og fjerne binyrene før samle PRF. Dette kan være kjedelig som de er bare litt pinker enn fettvev.
Merk: Nyrer bør ikke fjernes under dette trinnet som blod kan forurense fettvev og gjøre det vanskeligere å identifisere binyrene innenfor denne fett pad. - Isolere PRF fra tilbake muskel veggen, slutter ved å kutte ureter, nyre arterien og venen som skiller PRF og nyre fra resten av kroppen. Isolere PRF fra nyrene ved skjæring og fjerne nyre kapselen. PRF forblir knyttet til kapselen.
- Gjenta trinn 1.15 og 1.17 for høyre side. Sette begge PRF i aluminiumsfolie og fryse prøven i flytende nitrogen.
- Gjenta fra trinn 1.2 til 1.18 for alle mus inn.
- På dette punktet fortsette med fettvev sliping eller lagre prøver i-80 ° C fryser for senere utvinning. Eksempler kan lagres stabilt ved-80 ° C i flere år4.
2. forberedelse av bakken hvit fettvev RNA isolering
Merk: Bruk hansker for hvert trinn som hud inneholder RNases som kan fremme RNA fornedrelse og Slik endrer eksempel kvalitet og RNA avkastning etter isolasjon.
- Forberede og identifisere tre RNase-fri 1,5 mL konisk skrukork rørene per musen, en for hver type hvit fettvev, og plassere dem i en reol.
Merk: Overvektige dyr kan kreve ekstra rør som de har økt fett massene. Dette er spesielt sant for SCF for opp til 7 rør for en mus ble innhentet. - Rengjør benken med 70% etanol og sette en ren og ny benk papir på overflaten.
- Enten liggende under adipose vev ble nylig samlet fra mus eller lagret på forhånd i-80 ° C fryser, samle alle prøvene i en flytende nitrogen-fylt beholder til begynnelsen av prosedyren.
- Fryse den slikkepott med mørtel og pistil ved å plassere dem i flytende nitrogen beholderen. Når flytende nitrogen stopper '' koke '', kan sliping av fettvev startes.
Merk: Fra dette trinnet, mørtel, spatel må koniske rør og fettvev stay kjølt under hele prosessen. Noen varme vil smelte fettvev og gjøre det vanskeligere å trekke ut RNA. Hvis bruker en keramisk morter, kan man også bruke tørris og/eller flytende nitrogen for å holde den kald. - Sett alle RNase-fri 1,5 mL konisk skrukork rør forberedt på trinn 2.2 på tørris å avkjøle dem ned.
- For å unngå frostbites på hendene, bruke noen lag av brunt papir til å løfte mørtelen fra flytende nitrogen og sette den på en arbeider benk.
- Bruk tang til å samle en fettvev prøve fra flytende nitrogen og sette den på mørtelen. Raskt Pakk i aluminiumsfolie og slipp prøven på midten av mørtelen.
Merk: Hvis fettvev prøven er for stor, som er tilfellet med overvektige mus, bryte prøvene i mindre deler i aluminiumsfolie med tomlene og pulverisere hver del separat. - Bruk noen lag med brunt papir til å løfte pistil fra flytende nitrogen og passer det inn i mørtelen. Mens du holder pistil med brunt papir, bruke hammer til å treffe toppen av støter en eller to ganger. Trykk støter ned mot mørtelen med roterende bevegelser å slipe prøven til et fint pulver er oppnådd.
Merk: Dette trinnet er viktig å få tilstrekkelig RNA isolasjon. Faktisk vil tilstedeværelse av større fragmenter hindre RNA isolasjon og redusere avkastningen. - Når et fint pulver er oppnådd, fjerne støter og plukke opp spatula fra flytende nitrogen og bruke den til å overføre prøven inn i tilsvarende pre kjølt 1,5 mL konisk røret.
Merk: Dukkert spatula tilbake i flytende nitrogen fra tid til annen for å hindre at prøven smelter. Likeledes, holde konisk røret i tørris alltid å hindre prøven tining. En konisk rør fylt med bakken prøve om 2/3 kapasitet (~ 1 mL) er nødvendig for tilstrekkelig RNA avkastning og antall. - Når fylt til ca 1 mL, Lukk røret og slipper den på den andre flytende nitrogen-fylt beholderen.
Merk: Overflødig prøver kan settes i egen pre kjølt RNase-fri 1,5 mL konisk rør og lagret i en-80 ° C fryseren til senere bruk. - Rengjør den slikkepott med brunt papir å unngå bære-over i neste fettvev prøven med mørtel og pistil. Sett pistil og spatel tilbake i flytende nitrogen til chill. Selv om det brunt papiret er ikke RNase-fri, vi bruker en nylig åpnet pakken med brunt papir for hver dag i RNA isolasjon.
- Gjenta trinn 2.4 til 2.11 med neste prøven.
- Når alle prøver er behandlet, start RNA isolasjon eller lagre prøver i-80 ° C fryser for senere bruk.
Merk: For å forhindre rør bursting, fryse en eksempel-boksen ved helt submerging det til beholderen flytende nitrogen. Når kul nok fjerne overflødig nitrogen fra boksen og la den flyte over flytende nitrogen. Sortere prøvene i boksen og putte den i-80 ° C fryser.
3. RNA isolert fra bakken fettvev
Forsiktig: Fenol er skadelige for huden. Ha en labfrakk, hansker, vernebriller og utføre prosedyrekallet under kjemiske hette. En trinnvis flytskjema er vist i figur 2.
- Forberede og identifisere to sett av RNase-fri 1,5 mL konisk rør og sette dem i et rack.
- Enten liggende under adipose vev var ferske bakken eller forhåndslagrede i-80 ° C fryser, samle alle prøvene i flytende nitrogen-fylt beholder før starten av prosedyren som er stort sett gjort ved romtemperatur.
- Bruk tang til å velge et bakken fettvev utvalg fra flytende nitrogen og putte den i et rør rack. Rørene skal inneholde ~ 1 mL av pulver som tilsvarer rundt 100 mg av vev pulver.
- Åpne sakte røret.
Merk: Forlate en lukket rør ved romtemperatur eller åpne tuben lokk for fort kan føre til eksempel tap eller skade som press fra nitrogen pleier å flykte fra røret. - Legge til 500 µL av fenol løsning i prøven (1:2 forholdet mellom fenol løsning: vev pulver).
- Lukk lokket av rør og vortex med maksimal hastighet for ca 5 s. sakte og åpne forsiktig røret for å slippe ut trykket fra nitrogen (en lyden av luft som kommer ut av røret kan bli hørt).
- Gjenta 3.5 og 3.6. Den endelige fenol løsning lagt til utvalget er 1 mL.
- Gjenta trinn 3.6 til prøven er fullstendig oppløst.
Merk: Det er viktig å løslate alle presset fra tuben før du fortsetter å hindre røret sprengning. - La prøven stå ved romtemperatur mens Gjenta trinn 3.4 til 3.8 for neste prøvene.
- Når alle prøver er behandlet, kort vortex med maksimal hastighet og Inkuber alle prøver 5 min ved romtemperatur.
- Sentrifuge 10 min 12 000 x g på 4 ° C. Bringe rør tilbake til romtemperatur.
Merk: Etter sentrifugering, 3 faser er tilstede som vist i figur 2: fett (øverst), RNA (midten) og pellets (nederst). - For hver prøve, overfører du så mye RNA (midten rosa layer) som mulig til det første settet med tilsvarende rør med en P1000 pipette bruker en filtrert tips. Endre tips mellom eksempler.
- For å sikre minimal forurensning av RNA (midterste lag) av lipid (øverste lag), pierce den øverste fasen spissen nær siden av røret. Dispensere RNA i den nye koniske rør uten å berøre sidene av det nye røret å hindre overføring av lipider som er på utsiden av spissen.
- Legg 200 µL av ren kloroform hvert utvalg og bland ved inversjon i 15 s. ruge 10 min ved romtemperatur.
- Sentrifuge 15 min 12 000 x g på 4 ° C og bringe rør tilbake til romtemperatur.
Merk: Etter sentrifugering, 3 faser finnes: RNA (øverst), interphase som inneholder DNA (midten) og røde fenol-kloroform som inneholder proteiner (nederst). - For hver prøve, overføre som mye vandig gjennomsiktig RNA inneholder fase (topp fase) som mulig til det andre settet med tilsvarende konisk rør med en P1000 pipette bruker filtrert-tips. Endre tips mellom hvert utvalg.
Merk: Interphase er skjør og kan forurenser topp fasen hvis aspirasjon er gjort for fort. Som et alternativ, bruke en P200 pipette for å redusere sjansene for å forstyrre interphase. - Legg 500 µL av 100% isopropanol hvert utvalg og bland ved inversjon i 15 sek.
- Inkuber 10 min ved romtemperatur
- Sentrifuge 10 min 12 000 x g på 4 ° C og bringe rør tilbake til romtemperatur. Kast isopropanol ved å snu hver rør.
Merk: Små hvite RNA pellets kan vanligvis sees, men noen ganger kan ikke. - Legge 1 mL av 75% etanol (forberedt fra 100% etanol og RNase-fritt vann) til hver prøve og kort vortex hver rør med maksimal hastighet.
- Sentrifuge 5 min 7 500 x g på 4 ° C og bringe rør tilbake til romtemperatur.
- Forkaste 75% etanol ved å snu hver rør og lett trykk mot et brunt papir å fjerne alle leftover.
Merk: Om nødvendig kan du bruke en filtrert-spissen fjerne alkohol nær RNA pellet. Endre tips mellom eksempler. - La lokket åpne og luften tørr RNA pellet i ca 15-20 min.
Merk: RNA pellets kan bli gjennomsiktig i dette trinnet. - Som RNA solubilization fra pellet er avhengig av størrelse, vurdere størrelsen på pellet å finne volumet av RNase-fritt vann brukes til å solubilize RNA. Skriv ned volumet (10 til 25 µL) for hvert utvalg.
Merk: Dette trinnet er bare kvalitative. Hvis RNA pellets ikke kan sees, legge 10 µL av RNA-fritt vann til prøven. - Legge til 10-25 µL av RNase-fritt vann hver prøve (forhåndsbestemt volum på trinn 3.24).
- Inkuber prøven 5 minutter i en blokk på varme på 60 ° C. Kort vortex rørene.
- Inkuber utvalget for en ekstra 5 minutter i samme varme blokk på 60 ° C.
- Rask-rotere alle prøvene i en mini spinn sentrifuge og umiddelbart lagt på is.
- Bestemme RNA konsentrasjon og renhet. Utføre omvendt transkripsjon (RT) for å få cDNA eller lagre prøver i en-80 ° C fryseren til senere bruk.
Merk: Unngå flere fryse/tine sykluser som dette forringer RNA prøver.
4. fastsettelse av fettvev RNA konsentrasjon og renhet
- Om fettvev RNA prøvene var fersk ut og solubilized eller forhåndslagrede i-80 ° C fryser, samle alle prøver og tillate dem å tine på is til starten av prosedyren. Dette bør gjøres bare før starten av neste trinn eller på slutten av isolasjon å unngå flere fryse/tine sykluser.
- Forberede og identifisere to sett av RNase-fri 1,5 mL konisk rør og sette dem i en tube rack.
- Når alle RNA prøvene er fullt tint, vortex en prøve for 1 s og satt tilbake på isen.
- Fortynne RNA 100-fold i 1 x TE løsningen i det første settet med RNase-gratis 1,5 mL konisk rør med filtrert RNase gratis tips (sette 99 µL av 1 x TE løsningen og 1 µL av til røret).
- Gjenta for hvert utvalg.
Merk: Volumene kan være forskjellig for hver spektrofotometer avhengig av cuvette brukes. - Når alle prøver er behandlet, utvannet vortex hvert utvalg.
- Følg protokollen av spektrofotometer å kalibrere maskinen ved hjelp av en tom (1 x TE) før behandling utvannet RNA prøvene.
- Overføre utvannet RNA prøvene til kvarts cuvette og bestemme konsentrasjonen av hvert utvalg på 260 nm.
Merk: Hvis spektrofotometeret ikke gir den endelige RNA konsentrasjonen, bruk denne formelen til å beregne: RNA (µg/µL) = OD260 x fortynningsfaktoren x (40 µg RNA/1 000 µL). - Bestemme RNA renheten av hver prøve ved å beregne forholdet OD260/OD280.
Merk: Forholdet OD260/OD280 rundt 2.0 er generelt ansett som ren for RNA12. Det anbefales sterkt at RNA kvaliteten er kontrollert. For å gjøre så, sette 1 µg av på en 1% agarose blekemiddel gel laget med 1 x TBE buffer (89 mM Tris base, 89 mM borsyre og 2 mM EDTA, pH 8.0) og 1% bleike løsning13 (Figur 3). RNA i svært god kvalitet viser både 28S og 18S rRNA band og 28S bandet bør være mer intens enn den 18 år. RNA kvalitet er akseptabelt når begge rRNA bandene vises med samme intensitet. RNA kvalitet blir mangelfull øyeblikket 18S bandet er mer intens enn 28S bandet, og når en smear er synlige, indikativ av RNA degradering. - For hver prøve, forberede 10 µL av 0,5 µg/µL av fra lager i det andre settet med RNase-gratis 1,5 mL konisk rørene ved hjelp RNase-fritt vann for å fortynne prøvene etter behov. Disse prøvene brukes for RT for å få cDNA.
- Når alle prøver er behandlet, start RT eller lagre prøver i-80 ° C fryser for senere bruk.
5. omvendt-transkripsjon (RT)
- Om fettvev RNA prøvene var fersk utvannet til 0,5 µg/µL eller forhåndslagrede i-80 ° C fryser, samle alle eksempler og reagenser og tillate dem å tine på is til starten av prosedyren.
- Lagt PCR tube stripe stativet på is. Når kaldt nok forberede og identifisere ett sett av RNase-fri PCR strimler og sette dem på stativet. Inkluder et tomt.
- Forberede reaksjonen for DNase behandling av det: lage en master blande (for den nødvendige mengden av prøven + 1 prøve) av følgende (antall for 1 prøve): 1 µL av 10 X reaksjon buffer med MgCl2, 0,5 µL av DNase jeg (1 U/µl) og 7,5 µL av RNase-gratis vann ved hjelp av filtrert-tips. Dispensere 9 µL i hver retning.
- Legge til 1 µL av 0,5 µg/µL av fra hver prøve tilsvarende røret, sette caps på hver stripe og rask-rotere alle strimler i en mini spin sentrifuge for å bringe prøven til bunnen av røret. Legg 1 µL av RNA-fritt vann for tomt.
- Inkuber alle rør strimler i en termisk cycler og oppvarming blokk ved 37 ° C i 30 min. sette rør stripen tilbake på stativet på is.
- Legg 1 µL av EDTA (50 mM) til hver tube og ruge alle rør strimler i en termisk cycler og oppvarming blokk ved 65 ° C i 10 min. sette rør stripen tilbake på stativet på is.
- Lage en master blande (for det nødvendige antallet prøver pluss 1 prøve) av følgende (antall for 1 prøve): 1 µL av tilfeldige hexamers (0,2 µg/µL) og 1 µL dNTP mix (inneholder hver av de fire deoxynucleotides i en konsentrasjon av 10 mM). Dispensere 2 µL av master blandingen i hver tube med filtrert-tips. Endre tips mellom eksempler.
- Inkuber alle rør strimler i en termisk cycler og oppvarming blokk ved 65 ° C i 5 min. sette rør stripen tilbake i stativet på is.
- Lage en master blande (for det nødvendige antallet prøver pluss 1 prøve) av følgende (antall for 1 prøve): 4 µL av 5 x RT buffer, 1 µL av RNase hemmer (20 U/µL), 0,25 µL av revers transkriptase (200 U/µL) og 1,75 µL nuclease uten vann. Dispensere 7 µL i hver retning bruke filtrerte tips. Endre tips mellom eksempler.
- Utføre RT i en termisk cycler ved å angi følgende program: 10 min ved 25 ° C, 30 min ved 50 ° C, 5 min på 85 ° C. Sett røret strimler tilbake på stativet på is.
- Forberede og identifisere en rekke RNase-fri PCR tube strimler og satte dem på stativet.
- For hver prøve, forberede det ønskede volumet av 1:5 utvannet cDNA fra lager i nye rør strimler med ultrapure vann. 1:5 utvannet cDNA prøvene skal brukes for sanntids PCR.
- Når alle prøver er behandlet, start sanntid PCR eller lagre prøver (lager og fortynnede prøver) i en 20 ° C fryseren til senere bruk.
6. sanntid PCR for genuttrykk i fettvev
Merk: Unngå å utsette fluorescerende fargestoff til lys. Protokollen nedenfor beskriver forsterkning referanse genet s1614. Primerne og PCR forhold bør endres etter genet av interesse.
- Om cDNA prøver var fersk fortynnes 1:5 eller forhåndslagrede i 20 ° C fryser, samle alle prøver og reagenser og tillate dem å tine på is til starten av prosedyren.
- Sett stativet for sanntids PCR tube strimler på is. Når kaldt nok forberede og identifisere ett sett med sanntid PCR tube strimler og sette dem på stativet. Forbered hvert utvalg og tomt i duplikat.
- Lage en master blande (for det nødvendige antallet prøver pluss 1 prøve) av følgende (antall for 1 prøve): 1,9 µL av ultrapure vann, 5 µL fluorescerende fargestoff (f.eks SYBR grønne) og 0,3 µL av en frem primer og 0,3 µL av omvendt primer. Dispensere 7,5 µL i hver retning.
- Legge til 2,5 µL av 1:5 utvannet cDNA fra hver prøve tilsvarende røret. Legge til 2,5 µL ultrapure vann for de tomme feltene. Sette caps på hver stripe.
- Følg produsentens instruksjoner for å sette opp følgende program på sanntid PCR: 10 minutter til 95 ° C og 40 sykluser av 15 s ved 50 ° C, 30 s ved 60 ° C, 30 s på 70 ° C. Eksempel strimler inn rotoren av sanntids PCR maskinen og starter programmet.
Merk: Termisk cycler forhold kan variere avhengig av apparater og genet av interesse. mRNA uttrykk resultatene presentert i Figur 3 viser leptin mRNA forsterkning normalisert ved referanse genet S16 mRNA forsterkning14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter obduksjon prosedyren, tre hvite liggende under adipose vev var samlet og vektet fra de to gruppene av mus (N og HF kosthold-matet mus). Som forventet, hadde mus på HF diett økt siste kroppsvekt og vektøkning sammenlignet littermates på N diett (tabell 1). Disse observasjonene var ledsaget av mer enn en 2-fold økning i vekten av PGF, PRF og SCF i overvektige mus sammenlignet med de på N diett.
Før du utfører noen eksperimenter med den isolerte RNA, ble sin renhet evaluert som beskrevet i trinn 4,9. For hver hvit fettvev produsert RNA isolasjon av fenol løsning prøver med tilstrekkelig kvalitet som forholdet OD260/OD280 var rundt 2.0 som regnes som ren for RNA (tabell 2). PCR sanntidsdata viste at leptin mRNA uttrykk var betydelig økt i PGF PRF og SCF av overvektige mus sammenlignet med de på N diett (Figur 4A). Faktisk var forskjeller i leptin mRNA uttrykk ikke på grunn av en variant av s16, referanse genet brukes til å normalisere resultatene, mellom de to gruppene av mus som Ct verdier ikke ble endret (Figur 4B). Dermed kan s16 sikkert brukes som en referanse genet mRNA uttrykk i PGF PRF og SCF når HF kosthold er en parameter i en studie protokoll.
Figur 1 . Anatomisk lokalisering av hvite fettvev i mus. En mannlig mus på N diett har blitt dissekert for å vise lokaliseringen av hver fettvev depot og binyrene. SCF (A), PGF (B), PRF (C) og binyrene (D). PGF, peri-gonadal fat. PRF, peri-nyre fat. SCF, subkutant fett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . RNA isolasjon protokollen flytskjema med fenol løsning. Skjematisk fremstilling av trinnene som kreves for å isolere RNA fra jordet hvit fettvev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . RNA kvalitetsvurdering på blekemiddel gel. 1 ug av isolert fra subkutant fett (SCF) og peri-gonadal fett (PGF) deles på en 1% agarose blekemiddel gel av geleelektroforese. 28S og 18s rRNA er visualisert ved UV-transillumination. På gel fôres RNA isolert fra SCF og PGF museklikk et normalt kosthold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Effekten av HF kosthold på leptin og s16 mRNA uttrykk i hvit fettvev. Leptin (A) og s16 (B) mRNA uttrykk. Dataene for leptin normalisert s16 mRNA nivåer mens dataene for s16 vises som Ct og begge presenteres som gjennomsnittlig ± SE n = 12-13 per gruppe. * p < 0,05 sammenlignet N kosthold. N, normalt. HF, høy fett; PGF, peri-gonadal fat. PRF, peri-nyre fat. SCF, subkutant fett. Dette tallet har blitt endret fra Tan, P. et al, fedme (2014) 22, 2201-2209. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| N kosthold | HF kosthold | |
| Siste kroppsvekt (g) | 37,5 ± 1.3 | 46.7 ± 1.7* |
| Vektøkning (g) | 6.6 ± 0,7 | 16.7 ± 1.0* |
| PGF (g) | 1,08 ± 0,17 | 2.19 ± 0.15* |
| PRF (g) | 0,79 ± 0,15 | 1.71 ± 0.06* |
| SCF (g) | 1,62 ± 0,35 | 3.55 ± 0.20* |
Tabell 1. Effekten av HF kosthold på kroppen og hvit fettvev vekter. Verdier blir uttrykt som betyr ± SE n = 14-15 per gruppe. * p < 0,05 sammenlignet N kosthold. N, normalt. HF, høy fett; PGF, peri-gonadal fat. PRF, peri-nyre fat. SCF, subkutant fett. Dette tallet har blitt endret fra Tan, P. et al, fedme (2014) 22, 2201-2209.
| Prøver | Forholdet OD260/OD280 |
| PGF 1 | 2,04 |
| PGF 2 | 2,04 |
| PGF 3 | 2,02 |
| PRF 1 | 1,95 |
| PRF 2 | 2.08 |
| PRF 3 | 2.08 |
| SCF 1 | 2,04 |
| SCF 2 | 2,02 |
| SCF 3 | 2,06 |
Tabell 2. RNA renhet etter isolasjon fra hvit liggende under adipose vev. n = 3 per fettvev. PGF, peri-gonadal fat. PRF, peri-nyre fat. SCF, subkutant fett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Følgende HF-kosthold fôring, ble overvektige mus funnet å ha økt kroppen og hvite fettvev vekter sammenlignet med mus matet en N diett. RNA utdraget benytter fenol løsning gitt eksempler med god renhet. Leptin er et adipokine hovedsakelig produsert av fettvev, og er kjent for å korrelere positivt med fett masse16. Som forventet, økt leptin mRNA uttrykk i overvektige mus i concomitance med sine fett masse.
Denne metoden har flere viktige trinn. Den store er forurensning av en hvit fettvev depot med en annen som det er kjent at ulike fettvev depoter har ulike funksjoner2,5. Forurensning kan gi misvisende resultater i nedstrøms programmer. I tillegg som fat tendens til å tørke når med luft, samle hvit fettvev regelmessig og konsistent tempo mellom mus anbefales hvis vekt må tas. Ellers kan totalvekt en fett pute være feil. For å få RNA av god kvalitet og dekkevne, etter den nylig publiserte MIQE retningslinjer er en bestemt aktivum17. Spesielt kan gjør veldig fin prøve pulver under sliping bidra til å maksimere avkastning. Dette maksimerer kontakten mellom vev pulver og fenol løsningen under RNA isolasjon. Sist men er ikke minst isolering av RNA inneholder laget under RNA isolasjon (trinn 3.12). Fett er mindre tett enn vann, er det plassert oppå fasen av interesse. Minimere bære-over fett er nødvendig å redusere interferens med nedstrøms programmer.
En begrensning av denne metoden er ferdigheter kreves for å utføre flere trinn i prosedyren, i tillegg til behovet for å arbeide med skadelige reagenser under RNA isolasjon. Videre er hele prosessen arbeidsintensiv.
Det er ikke mange alternativer til fettvev samling og eksempel behandling før RNA isolasjon fra små detaljene som vanligvis tilpasses av den enkelte brukeren. I tilfelle av RNA isolasjon er mange alternativer tilgjengelige for eksempel fenol/kloroform utvinning eller RNA isolasjon kits. Det er fordeler og ulemper for hvert alternativ, og det er opp til brukeren velge den beste metoden basert på nedstrømsapplikasjoner. Fenol/kloroform utvinning er billigere, men krever bruk av skadelige reagenser og er arbeidskrevende. RNA isolasjon kits er vanligvis dyrere, men fremgangsmåten er raskere og gir vanligvis prøver med god kvalitet og renhet. Det er viktig å vurdere avkastning og renhet av RNA fordi materialet er begrenset i hvit fettvev som består hovedsakelig av fett. Den store fordelen ved fenol løsning for isolasjon (fenol/kloroform utvinning) er muligheten for å isolere RNA og DNA protein fra en enkelt prøve18. Dette er kostnader - og tid-effektive som reduserer antall mus pålagt å skaffe tilstrekkelig materiell. Som nevnt tidligere, er fettmasse begrenset i enkelte musen modeller. For mus anbefales splitting bakken fettvev i tre deler separat hente RNA, DNA og proteiner ikke da dette kan føre til utilstrekkelig materiale for nedstrøms programmer. For å omgå dette problemet, er det også mulig å samle sammen lignende fettvev depot fra flere mus basert på brukerdefinerte vilkår, som fører til et økt antall dyr nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Diabetes Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
