3Rs सिद्धांत को ध्यान में रखते हुए, पशु अध्ययन के लिए विकल्प के रूप में श्वसन मॉडल विकसित कर रहे हैं । विशेष रूप से श्वसन पदार्थों के जोखिम आकलन के लिए, वहाँ उचित परख की कमी है । यहां, हम हवाई पदार्थों के आकलन के लिए मानव परिशुद्धता कटौती फेफड़ों के स्लाइस के उपयोग का वर्णन ।
उनके व्यापक विविधता में श्वसन रोगों अंतर्निहित तंत्र को समझने और नए चिकित्सीय चिकित्सा के विकास को सक्षम करने के लिए उपयुक्त मॉडल प्रणालियों की जरूरत है । इसके अतिरिक्त, नए पदार्थों के पंजीकरण के लिए पर्याप्त परीक्षण प्रणालियों के साथ उचित जोखिम मूल्यांकन की आवश्यकता है व्यक्तियों के जोखिम से बचने के लिए, उदाहरण के लिए, काम के माहौल में नुकसान पहुंचाया जा रहा है । इस तरह के जोखिम मूल्यांकन आमतौर पर पशु अध्ययन में आयोजित की जाती हैं । 3Rs सिद्धांत और पशु प्रयोगों के खिलाफ सार्वजनिक उलझन को ध्यान में रखते हुए, मानव वैकल्पिक तरीकों, जैसे परिशुद्धता-कट फेफड़ों के स्लाइस (PCLS), विकसित किया गया है । वर्तमान पत्र में अमोनियम hexachloroplatinate (HClPt) जैसे कम आणविक भार वाले पदार्थों की इम्यूनोमॉड्यूलेटरी क्षमता का अध्ययन करने के लिए मानव PCLS की पूर्व वीवो तकनीक का वर्णन है । मापा समापन व्यवहार्यता और स्थानीय श्वसन सूजन, साइटोकिंस और chemokines के बदल स्राव द्वारा चिह्नित शामिल हैं । प्रो भड़काऊ साइटोकिंस, ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNF-α), और interleukin 1 अल्फा (IL-1α) PCLS की एक उप विषैले एकाग्रता के लिए जोखिम के बाद मानव HClPt में काफी बढ़ गए थे. हालांकि PCLS की तकनीक काफी पिछले दशकों में अनुकूलित किया गया है, चुहियों के परीक्षण के लिए अपनी प्रयोज्यता विकास में अभी भी है । इसलिए, यहां प्रस्तुत परिणाम प्रारंभिक हैं, भले ही वे श्वसन अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में मानव PCLS की क्षमता दिखाते हैं ।
श्वसन रोग जैसे एलर्जी अस्थमा, व्यावसायिक अस्थमा, जीर्ण प्रतिरोधी फेफड़ों के रोग (सीओपीडी), वातस्फीति, और ऊपरी और निचली एयरवेज के संक्रमण बढ़ रहे हैं और एक विश्वव्यापी स्वास्थ्य बोझ1,2का प्रतिनिधित्व करते हैं । उपयुक्त परीक्षण प्रणालियों की आवश्यकता है, क्रम में बुनियादी इन रोगों अंतर्निहित तंत्र के कुछ की पहचान करने के लिए, विकास और उचित पदार्थों के परीक्षण के अलावा । बुनियादी अनुसंधान के रूप में अच्छी तरह से नैदानिक दवा विकास के रूप में इन विट्रो में या vivo में परख में प्राप्त परिणामों पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । इन परख, तथापि, उनकी सीमाएं है3। सबसे पहले, इन विट्रो परख मानव कोशिकाओं है कि अलग थे और आसन्न ऊतक या अंगों से हटा दिया और इस प्रकार अब के साथ बातचीत करने के लिए या अन्य कोशिकाओं के द्वारा संरक्षित किया जा करने में सक्षम नहीं हैं का उपयोग3. दूसरे, पशु मॉडल अक्सर शरीर विज्ञान और जैव रासायनिक विचलन में मतभेद के कारण मनुष्यों के लिए अनुवाद नहीं कर रहे है4। आदेश में इन सीमाओं को कम करने के लिए, और 3Rs के संदर्भ में (प्रतिस्थापन, शोधन, कमी) सिद्धांत5, नए वैकल्पिक मॉडल लगातार विकसित कर रहे हैं ।
वैकल्पिक मानव ऐसे PCLS के रूप में 3 डी ऊतक मॉडल, मानव के बीच एक कड़ी है इन विट्रो और vivo मॉडल में जटिल जानवर के आधार पर । PCLS श्वसन तंत्र6में मौजूद सभी प्रासंगिक सेल प्रकारों के साथ कार्यात्मक विविधता को प्रतिबिंबित करते हैं । इसके अतिरिक्त, PCLS तकनीक एक भी जानवर या मानव ऊतक दाता से सटीक मोटाई के कई पतले स्लाइस की reproducible तैयारी का लाभ है । यह एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अलग सांद्रता या दवाओं का परीक्षण किया जा अनुमति देता है ।
के बाद से आगर के पहले परिचय-भर में मानव फेफड़ों के स्लाइस फिशर एट अल द्वारा १९९४ में । 7 टुकड़ा करने की क्रिया और फेफड़ों के ऊतकों की संवर्धन के लिए तकनीक में काफी सुधार किया गया है । क्रिश्चियन मार्टिन एट अल । आगे रासायनिक और औषधीय अनुप्रयोगों के लिए इस तकनीक में सुधार हुआ है8। हमारे समूह २००७ में ईसाई मार्टिन ने इस तकनीक के लिए शुरू की गई थी । तब से, अनुसंधान में PCLS के आवेदन कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं के परीक्षण से व्यापक है, जैसे airway9,10 और वाहिकासंकीर्णन11, प्रतिरक्षा, औषधीय12,13, और कई प्रयोगशालाओं में विभिन्न प्रजातियों में विषाक्तता7 परीक्षण । मसलन, Schlepütz एट अल. 14 जांच की प्रजातियों के मतभेदों के लिए airway प्रतिक्रियाओं और परिधीय ंयूरॉन सक्रियकरण की तुलना में या तो विद्युत क्षेत्र उत्तेजना (EFS) द्वारा या चूहों, चूहों, गिनी सूअर, भेड़, marmosets, और मनुष्यों में capsaicin द्वारा । वे विभिंन प्रजातियों के लिए अलग है लेकिन तंत्रिका की मध्यस्थता ब्रोन्कोकन्सट्रिक्शन के विभिंन पैटर्न पाया और निष्कर्ष निकाला है कि आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रयोगशाला जानवरों (चूहों और चूहों) हमेशा मानव प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित नहीं करते । फेफड़ों विषाक्तता परीक्षण के लिए और इस संदर्भ में जानवरों की संख्या को कम करने के लिए, हेस एट अल. 15 पूर्व मांय चूहा सांस लेना विषाक्तता अध्ययन के लिए एक पूर्व vivo विकल्प के रूप में PCLS । इस बहु केंद्रिक पूर्व मांयता अध्ययन दो भविष्यवाणी मॉडल के विकास के परिणामस्वरूप PCLS का उपयोग कर आशाजनक परिणाम के साथ ।
इसके अलावा, बुनियादी अनुसंधान में, PCLS16, जल्दी एलर्जी प्रतिक्रियाओं17, और वायरल संक्रमण प्रतिक्रियाओं18,19संकेत कैल्शियम स्पष्ट के लिए इस्तेमाल किया गया है । तकनीकी प्रगति चल रही है और आगे अग्रिम पड़ताल की जा रही है. उदाहरण के लिए, फ़ील्ड भंडारण और जमे हुए ऊतक के पुनः प्रयोग द्वारा मानव ऊतक के लाभ बढ़ रही है । Rosner एट अल. ठंड और गल murine PCLS कि उत्तेजना पर अनुबंध करने के लिए एयरवेज की क्षमता को बरकरार रखता है की एक तकनीक का वर्णन: इसलिए, तकनीक के भीतर सीमित समय खिड़की जो ऊतकों व्यवहार्य रहते हैं, और इसलिए आगे तक परख समय पर लागू किया जा सकता है एक ही दाता20। इन अनुसंधान अग्रिमों के अलावा, Lauenstein एट अल । 21 हाल ही में विभिंन रसायनों कि मानव PCLS में व्यावसायिक अस्थमा के लिए संभावित संवेदीकरण के रूप में कार्य हो सकता है जोखिम मूल्यांकन की जांच की ।
व्यावसायिक अस्थमा, जिसके लक्षण airflow रुकावट और airway hyperresponsiveness, एलर्जी अस्थमा के समान हैं, उच्च आणविक वजन (HMW)22 या कम आणविक वजन (LMW) पदार्थों के लिए जोखिम से प्रेरित है23 (उदा. , कार्यस्थल वातावरण में प्लैटिनम यौगिकों). LMW एजेंटों एक उच्च संवेदीकरण क्षमता है जब haptens बनाने और वाहक प्रोटीन के लिए बांध21। नए HMW या LMW रसायनों का पंजीकरण इन विट्रो में की आवश्यकता है और vivo जोखिम मूल्यांकन में उनके ख्यात संवेदीकरण क्षमता (उदा., ओईसीडी दिशानिर्देश ४२९)24के बारे में । ख्यात संवेदीकरण क्षमता निर्धारित करने के लिए उपयोग किए गए परीक्षण, तथापि, मूल रूप से श्वसन संवेदी पदार्थों के जोखिम मूल्यांकन के लिए तैयार नहीं थे, लेकिन संपर्क संवेदीकरण के लिए, हालांकि वहां पदार्थ के एक छोटे सबसेट के लिए कुछ अनुरूपता लग रहा था25 . Lauenstein एट अल द्वारा काम यूरोपीय संघ परियोजना संवेदन-आईटी-iv के हिस्से के रूप में डिजाइन किया गया था, ख्यात संपर्क या फेफड़े संवेदीकरण के जोखिम मूल्यांकन के लिए वैकल्पिक परीक्षण रणनीतियों को विकसित करने के लिए21। इस परियोजना के लिए, हम एक वैकल्पिक परीक्षण उपकरण के रूप में मानव PCLS के प्रयोज्य परीक्षण पर ध्यान केंद्रित किया । इसलिए, इम्यूनोमॉड्यूलेटरी अंतिमबिंदु का एक सेट (जैसे, व्यवहार्यता और cytokine स्राव) LMW प्लैटिनम यौगिकों जैसे रसायनों की अड़चन या भड़काऊ क्षमता निर्धारित करने के लिए चुना गया था । Lauenstein एट अल. कोई सामान्य पैटर्न है कि सभी श्वसन संवेदीकरण के लिए लागू किया जा सकता पाया; हालांकि, उनके काम को हाल ही में प्रकाशित प्रोटोकॉल26के लिए नींव प्रदान की है ।
संक्षेप में, तैयार करने के लिए यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल और मानव PCLS के बाद जोखिम संभावित फेफड़े के मूल्यांकन के लिए एक उपयोगी तरीका विषाक्त और/या इम्यूनोमॉड्यूलेटरी पदार्थ है कि श्वसन के विकास में शामिल हो सकता है प्रदान करता है रोग, जैसे व्यावसायिक अस्थमा ।
मानव PCLS तकनीक अच्छी तरह से हमारी प्रयोगशाला में स्थापित है । वर्तमान कागज फेफड़ों के ऊतकों में मादक पदार्थों की विषाक्तता परीक्षण के लिए इस तकनीक और इसके उपयोग का विवरण देता है पूर्व vivo. सामांय में, इस तकनीक का उपयोग कर किसी भी प्रयोगशाला को quantifiable पर्वतमाला, variabilities का आकलन की एक परख संबंधित परिभाषा की स्थापना की तलाश, और गुणवत्ता नियंत्रण प्रयोग की वैधता की गारंटी चाहिए । संभव मानक प्रक्रियाओं हो सकता है, उदाहरण के लिए, प्रत्येक समापन बिंदु दोहराने के लिए, उदा, cytotoxicity परख, तीन जैविक दाताओं की एक ंयूनतम में (व्यक्तिगत चलाता है) के साथ दो से तीन तकनीकी की प्रतिकृतियां प्रति नमूना सहित सकारात्मक और नकारात्मक संदर्भ । प्रयोगशाला कर्मियों को परख निरंतरता बढ़ाने और परख परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए प्रशिक्षित किया जाना चाहिए ।
अंतिमबिंदु अक्सर फेफड़ों के ऊतकों पर पदार्थों के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया cytotoxicity माप शामिल विभिन्न परख का उपयोग (उदा, LDH परख, WST-1 परख, सूक्ष्म धुंधला परख), cytokine रिलीज की परख, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में परिवर्तन और सेलुलर आबादी में परिवर्तन के लक्षण वर्णन immunohistopathological तरीकों से6। इसके अलावा, वहां ऐसे फुफ्फुसीय वृक्ष कोशिकाओं के रूप में कोशिकाओं के दृश्य का वर्णन तकनीक है, murine PCLS में28 कि भी मानव PCLS को हस्तांतरित किया जा सकता है और इस प्रकार सेलुलर संरचना में और अधिक विस्तृत जानकारी प्रदान करने से पहले और ख्यात साइटोटोक्सिक पदार्थों के साथ उपचार के बाद ।
इस बुनियादी प्रोटोकॉल और मानव फेफड़ों के ऊतकों को तैयार करने के लिए तकनीक की तकनीक है कि अच्छी तरह से प्रकाशन में वर्णित किया गया है तुलनीय है29। संक्षेप में, अंग सामग्री जीने से पीड़ित रोगियों से प्राप्त की है, फेफड़ों के कैंसर के रूप में पुराने रोगों की धमकी, जो लकीर या प्रत्यारोपण के लिए सर्जरी से गुजरना है । अध्ययन स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए । मरीजों की जानकार लिखित सहमति जरूरी है । क्लिनिक और प्रयोगशाला के बीच एक कार्यप्रवाह की स्थापना एक महत्वपूर्ण मुद्दा है और संचार, और दोनों साइटों के बीच इंटरफेस और बुनियादी सुविधाओं की परिभाषा की आवश्यकता है । मानव फेफड़ों सामग्री के लिए सीधे लकीर के बाद ऊतक की व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए संसाधित किया जाना है । यह उल्लेख है कि तकनीक मानव PCLS के लिए यहां वर्णित दोनों युवा और पुराने फेफड़े और स्वस्थ और रोगग्रस्त फेफड़ों के लिए लागू किया जा सकता लायक है । अमेरिका में, उदाहरण के लिए, यह स्वस्थ अंग दाताओं जो दुर्घटनाओं में मारे गए या जिनके अंगों प्रत्यारोपण के लिए अस्वीकार कर दिया गया है से फेफड़ों को प्राप्त करने के लिए संभव है ।
प्रोटोकॉल में पहला महत्वपूर्ण कदम agarose समाधान के साथ एयरवेज और आसपास के पैरेन्काइमा की मुद्रास्फीति है । इस चरण के बाद टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के लिए बहुत नरम ऊतक जमना आवश्यक है । मानव फेफड़ों की सामग्री की गुणवत्ता, रोग पृष्ठभूमि पर आधारित है, यहां महत्वपूर्ण है । बरकरार फुफ्फुस के साथ केवल पालियों को भरा जा सकता है । श्वसनी के पास अंतिम चरण ट्यूमर कभी-कभार भरने की प्रक्रिया को रोकते हैं । मानव सामग्री फुलाने से पहले, agarose समाधान के तापमान को अच्छी तरह से जांच की जानी चाहिए । बहुत अधिक रक्त (या अंय तरल पदार्थ, exudates) मानव फेफड़ों के ऊतकों के अंदर agarose के अवांछित कमजोर पड़ने में परिणाम होगा और बहुलकीकरण प्रक्रिया को प्रभावित करेगा । फेफड़े के ऊतकों और बर्फ पर agarose के बीच बढ़िया तालमेल की मुद्रास्फीति के बाद, फेफड़ों २०० के वर्गों में काट रहे है ३०० µm मोटाई । ऊतक की निरंतरता एक बहुत ही महत्वपूर्ण मुद्दा है । यदि ऊतक भी नरम है, बराबर वर्गों की टुकड़ा करने की क्रिया मुश्किल है । यहां तक कि अगर एक ही microtome पैरामीटर प्रत्येक दाता के लिए निर्धारित कर रहे हैं, दाताओं के बीच स्लाइस की मोटाई भिंन हो सकते हैं, व्यक्तिगत स्थितियों और प्रत्येक फेफड़ों के लिए inflating प्रक्रिया के दौरान परिवर्तन के कारण । ऊतक के सजातीय भरने अलग टुकड़ा मोटाई में परिणाम होगा । के बजाय को मापने और स्लाइस की मोटाई मानकीकरण, कुल प्रोटीन सामग्री की माप के लिए परोक्ष रूप से फेफड़े टुकड़ा मोटाई की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कई अंत चरण के रोगों टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया में बाधा; जैसे, रक्त वाहिकाओं अत्यंत फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप में और अधिक गाढ़ा कर रहे हैं, और fibrotic ऊतक इतना कठोर हो सकता है कि ऊतक सिलेंडर की टुकड़ा करने की क्रिया शायद ही संभव है और microtome ब्लेड बहुत बार प्रतिस्थापित किया जा करने की जरूरत है ।
मानव PCLS और गहन धुलाई कदम है, जो सेल मलबे और जारी एंजाइमों को दूर करने के लिए आवश्यक हैं की तैयारी के बाद, ऊतक वर्गों प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है29. मानव PCLS सामांय कोशिका संस्कृति की स्थिति और उजागर, उदाहरण के लिए, रसायनों, दवाओं, या lipopolysaccharides के तहत संस्कृति रहे हैं । (अज्ञात) संक्रमण के कारण PCLS के सामयिक संदूषण मानव फेफड़ों की सामग्री की संस्कृति में एक विशेष मुद्दा है । ऊतक संक्रमण दिखा संस्कृतियों छोड़ दिया जाना चाहिए और उपकरण पूरी तरह से संक्रमित होना चाहिए । एक हाथ पर तैयारी के लिए इस्तेमाल किया प्रयोगशाला स्थानों के बीच स्थानिक जुदाई और दूसरी ओर संवर्धन पार संक्रमण से बचने के लिए मदद कर सकते हैं । उपकरण के संबंध में, microtome रिसाव हो सकता है, और ढीला हेक्स शिकंजा मोटर नुकसान और ब्लेड आंदोलन के बंद करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । नहीं स्लाइसर के हर भाग स्टेनलेस स्टील से बना है, और इसलिए यह ऑक्सीकरण अगर तुरंत सफाई बदल सूख नहीं होगा । उपकरण की समस्याओं को दूर करने के लिए, यह कम एक बैकअप डिवाइस के लिए आवश्यक हो सकता है ।
पिछले प्रकाशनों में, agarose बाहर धोया और तैयारी के बाद गहन धुलाई कदम के दौरान हटा दिया गया है सूचित किया गया है । वास्तव में, यह संभव नहीं है, agarose नहीं निकाला जा सकता है । agarose को पूरा हटाने के लिए, यह उच्च तापमान पर फिर से पिघला हुआ है, जो ऊतक को नष्ट करने की जरूरत है । alveoli और एयरवेज में agarose वर्णित अंतिमबिंदु के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है । अन्य अंतिमबिंदु agarose की उपस्थिति से प्रभावित हो सकता है (यह भी सीमाएं देखें). ऊतक व्यवहार्यता संस्कृति में एक महत्वपूर्ण मुद्दा है के रूप में बहुत ताजा ऊतक वर्गों को तैयार करने की जरूरत है, पर जोर दिया है । ब्रोन्कोकन्सट्रिक्शन व्यवहार्यता के लिए एक मांय पैरामीटर नहीं है । हम अनुशंसा करते है का उपयोग करने के लिए ंयूनतम दो या तीन स्वतंत्र cytotoxicity परख आसपास के पैरेन्काइमा की व्यवहार्यता की जांच करने के लिए; यह हर प्रयोग में जांच की जानी है30। cytotoxicity परख में गुणवत्ता नियंत्रण अपर्याप्त ऊतक व्यवहार्यता के संकेतक के रूप में सेवा करते हैं । इसलिए, यह ऊतक की जवाबदेही का आकलन करने के लिए सिफारिश की है, उदाहरण के लिए, सभी cytotoxicity परख में एक डिटर्जेंट के रूप में एक प्रभावी विषाक्त पदार्थ के लिए. खुराक के आधार पर प्रतिक्रिया घटता, अवशोषण के न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों cytotoxicity परख के लिए परिभाषित करने के लिए और बाद में प्रयोगों के लिए मुलाकात की जरूरत है. इसके अलावा प्रोटोकॉल में संशोधन ज्यादातर लागू रसायनों और ब्याज के समापन पर निर्भर करते हैं । अघुलनशील या अत्यधिक प्रतिक्रियाशील रसायनों की प्रयोज्यता सीमित है. DMSO के लिए उच्चतम विलायक एकाग्रता 1% तक सीमित है । उच्च सांद्रता इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस तरह के IL-8 के रूप में समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस, के स्पष्ट रिलीज में परिणाम हो सकता है । दूसरी ओर, इस्तेमाल उत्तेजना अपेक्षाकृत कमजोर हो सकता है । इस मामले में, ऊतक की मात्रा प्रति अच्छी तरह से दो से चार स्लाइस से बढ़ाया जा सकता है । यह दृष्टिकोण 24 एच व्यवहार्यता को सीमित करता है ।
मानव PCLS की एक प्रमुख सीमा है कि जर्मनी में वे केवल रोगग्रस्त मानव फेफड़ों की सामग्री से तैयार किया जा सकता है । रोगियों जो सर्जरी से गुजरना सामान्य रूप से कर रहे हैं ५० साल और फेफड़ों के कैंसर से पीड़ित रोगियों के ८०% कर रहे हैं या धूम्रपान करने वालों के लिए इस्तेमाल किया. रोगियों की दवा, जैसे ग्लुकोकोर्तिकोइद, भी मानव ऊतक का उपयोग कर प्रयोगों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. इसलिए, यह करने के लिए आवश्यक है: i) सकारात्मक संदर्भ के द्वारा प्रत्येक प्रयोग मांय व्यवहार्यता, कार्यशीलता, और व्यक्तिगत ऊतक की संवेदनशीलता की पुष्टि, और द्वितीय) पार से स्वस्थ, गैर रोगग्रस्त, मध्यम आयु फेफड़ों के ऊतकों का उपयोग कर परिणामों को मांय प्रयोगशाला जानवरों (गैर मानव रहनुमाओं जैसे cynomolgus और, यदि संभव हो तो, माउस, चूहा, गिनी पिग) । बेहतर रोग ऊतक के विकृति स्कोर, प्रयोगात्मक परिणामों को बेहतर. भारी रोगग्रस्त ऊतक शायद ही इस्तेमाल किया जा सकता है और बहुत बार सीमित व्यवहार्यता, अपर्याप्त कम या अत्यंत उच्च cytokine स्तर, बैक्टीरियल या फंगल संक्रमण, और कम ब्रोन्कोकन्सट्रिक्शन से पता चलता है । दाता से दाता भिन्नता प्रयोगशाला जानवरों से प्राप्त परिणामों के साथ तुलना में अधिक है, मनुष्यों की व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता को दर्शाती है. यह है, तथापि, नहीं एक सीमा सामांय में; जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, अंय देशों में (जैसे, अमेरिका) यह मृतक अंग प्रत्यारोपण के लिए अस्वीकार कर दिया दाताओं से स्वस्थ फेफड़ों को प्राप्त करने के लिए संभव है । ऊतक की जवाबदेही अच्छी तरह से तीव्र जोखिम प्रयोगों में ४८ एच करने के लिए पहली बार के लिए वर्णित किया गया है । व्यवहार्यता और ऊतक की कार्यक्षमता संस्कृति के कई दिनों के बाद या-८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के बाद कम है । यह संस्कृति मानव फेफड़े के ऊतकों के लिए लगभग 14 दिनों के लिए संभव है । व्यवहार्यता इस समय के दौरान जारी है; हालांकि, परिवर्तनशीलता में वृद्धि, के रूप में अच्छी तरह से कई कोशिका आबादी की कार्यक्षमता की हानि के रूप में, जैसे मैक्रोफेज, ऊतक में मनाया जाता है, mitogens के जवाब में सीमित cytokine रिलीज में जिसके परिणामस्वरूप. कुछ अंतिमबिंदु के लिए एक और सीमा ऊतक में agarose की उपस्थिति है, बाधा, उदाहरण के लिए, आरएनए के उच्च गुणवत्ता वाले और पर्याप्त मात्रा में अलगाव31 या बाद में प्रवाह cytometry के लिए एकल सेल निलंबन की तैयारी और कोशिकाओं की phenotyping. संभावना एकल सेल प्रतिक्रियाओं और कार्यक्षमता में यंत्रवत अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए इस प्रकार सीमित है ।
Organotypic ऊतक मॉडल, जैसे मानव PCLS, बुनियादी और गैर नैदानिक अनुसंधान पर एक उच्च प्रभाव को माना जाता है । मानव फेफड़ों की सामग्री एक जैविक संरचना है जो बारीकी से सामांय अंग वास्तुकला को दर्शाता है । यह उदाहरण के लिए शामिल हैं, आवासीय वायुकोशीय और दमा उपकला कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं, fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, तंत्रिका तंतुओं, और मैक्रोफेज. ऊतक व्यवहार्य है और कोशिकाओं को कई उत्तेजनाओं का जवाब । तंत्रिका तंतुओं, हालांकि कटौती, स्थानीय रूप से सक्रिय किया जा सकता है, टर्मिनल पलटा प्रतिक्रियाओं के लिए अग्रणी14. नतीजतन, इस पूर्व vivo मॉडल संभावना सेलुलर जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रदान करता है, रक्षा प्रतिक्रियाओं, cytokine संकेतन, और सेल सतह मार्करों की प्रेरण । तकनीक, संवर्धन में कई सुधार, और अंतिमबिंदु के सत्यापन शोधों विज्ञान में मानव PCLS के उपयोग की अनुमति देते हैं । भविष्य के दृष्टिकोण के उदाहरण हैं: i) मानव फेफड़ों के ऊतकों में नए लक्ष्यों के सत्यापन, ii) जोखिम के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन, उदाहरण के लिए, रसायनों के लिए, ड्रग्स, नैनोकणों, आदि, iii) प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ फेफड़ों के ऊतकों की पूरकता, ऐसे के रूप में T-लिम्फोसाइटों, iv) आणविक पैटर्न की पहचान और संशोधन, उदाहरण के लिए, श्वसन संवेदीकरण, रोग उत्प्रेरण पदार्थ, या सक्रिय यौगिकों रास्ते बाधा के लिए जोखिम के बाद; इसके अलावा, v) airway remodeling और vi) न्यूरॉन विनियमन३२. वैज्ञानिक क्षेत्र PCLS के साथ इन वर्तमान और भविष्य के दृष्टिकोण में रुचि है । इसके अलावा, विभिंन घटनाओं है कि इस तरह के क्रायो के रूप में PCLS तकनीक में सुधार करने में मदद मिलेगी की एक किस्म,20संरक्षण, और ऊतक सांस लेने या यांत्रिक के दौरान ऊतक के प्राकृतिक आंदोलन की नकल करने के लिए३३ खींच वेंटिलेशन.
अंय 3d मॉडल के साथ तुलना में मानव PCLS का प्रमुख लाभ प्रतिरक्षा कोशिकाओं और तंत्रिका तंतुओं की उपस्थिति है । प्रयोग भी माउस, चूहा, और गैर मानव रहनुमाओं, जो पशु प्रजातियों कि अभी भी औषध विज्ञान और विषविज्ञान में सबसे अधिक बार उपयोग किया जाता है में प्रदर्शन किया जा सकता है । मानव फेफड़ों के ऊतकों की जटिलता मानव के लिए पशु से परिणाम के अनुवाद का समर्थन करता है और इन विट्रो में से vivo मेंकरने के लिए । श्वसन संवेदीकरण की पहचान के लिए मौजूदा वैकल्पिक परख के संदर्भ में, मानव PCLS बहुत जटिल हैं और एक सेल प्रतिक्रियाओं में अंतर्दृष्टि की अनुमति नहीं है । फिर भी, माइक्रोस्कोपी और फ्लो cytometry सेलुलर प्रतिक्रियाओं के बारे में जानकारी दे सकता है, अगर सही सेलुलर मार्कर संयोजन में प्रयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, apoptosis, परिगलन, या intracellular मार्करों के साथ. वहां परख जो मांय किया गया है और सूचना के लिए श्वसन संवेदीकरण की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है प्रकाशित कर रहे हैं । हालांकि, एकल सेल परख पर अपने सभी फायदों के साथ PCLS के उपयोग में अग्रिमों अर्थ में एक मूल्यवान योगदान है कि तकनीक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में वाटसन एट अल द्वारा वर्णित कर रहे हैं । ३४ वे एक उच्च प्रवाह जांच परख विकसित करने के लिए murine क्रायो में airway विषाक्तता की भविष्यवाणी PCLS संरक्षित । उनके लघुकृत ९६-well PCLS प्रारूप के साथ, वे murine लेवेज द्रव में इसी तरह के readouts का पता लगाया, एक व्यवहार्य उच्च प्रवाह परख PCLS बना रही है ।
The authors have nothing to disclose.
हम उसके पूर्व के लिए लैन Lauenstein शुक्रिया अदा करना चाहूंगा मानव PCLS के साथ जोखिम मूल्यांकन के लिए वैकल्पिक परीक्षण रणनीतियों के बारे में काम करते हैं । अनुसंधान के कुछ 6वें फ्रेमवर्क प्रोग्राम सेंस के भीतर यूरोपीय आयोग से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था-आईटी-IV “उपंयास परीक्षण रणनीतियों के लिए इन विट्रो एलर्जी कारकों के आकलन के लिए” ।
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm | A. Hartenstein (Leipzig, Germany) | SS04 | |
Syringe | Faust Lab Science (Klettgau, Germany) | 9.410 050 | |
Coring tools | custom-made | custom-made | |
Trimming Blade Handle (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205530001 | |
Trimming Blades (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205500000 | |
Microtome: Tissue Slicer | Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) | 303400-ADPT | Krumdieck Tissue Slicer (MD6000) |
Microtome blade | Wilkinson Sword (Solingen, Germany) | ENR-4027800011506 | |
Tissue culture dishes | Sigma (München, Germany) | Z666246-420EA | |
Cell strainer filter (100 µm Nylon) | Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) | BD352360 | |
Inoculation loop | Copan Diagnostics (Murrieta, USA) | CD176S01 | |
TPP Tissue culture plates 24wells | Sigma (München, Germany) | Z707791-126EA | |
Cassette | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 1000957 | |
Nunc MaxiSorp flat-bottom | Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) | 44-2404-21 | |
Nunc MicroWell 96-Well | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 260836 | |
Confocal Microscope | Zeiss (Jena, Germany) | Confocal LSM Meta 510 | |
Image rendering software | Bitplane AG (Zürich, Switzerland) | IMARIS 7.6 | |
LSM Image Browser | Zeiss (Jena, Germany) | ||
Multiwell-Reader | Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) | Tecan infinite F200Pro | Plate Reader |
Plate shaker | Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) | KM-2 Akku | |
BenchMark ULTRA | Ventana Medical Systems (Tucson, USA) | Automated IHC/ISH slide staining system | |
Assays | |||
Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche (Basel, Switzerland) | 11644807001 | |
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche (Basel, Switzerland) | 11644793001 | |
Microscopical vitality staining | Invitrogen (Carlsbad, USA) | L-3224 | LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit |
BCA Protein Assay | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 23225 | |
ELISA assay kit | R & D systems | various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) | DuoSet |
Reagents | |||
Agarose, low gelling temperature | Sigma (München, Germany) | A9414-100G | |
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) | Sigma (München, Germany) | E2888-500ML | |
Penicillin and streptomycin | Lonza (Verviers, Belgium) | 17-602E | |
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) | Gibco (Darmstadt, Germany) | 11039-047 | Culture medium |
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) | Lonza (Verviers, Belgium) | BE17-513F | Buffer solution |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma (München, Germany) | A9647-500G | |
Detergent | Sigma (Saint Louis, USA) | X100-100ML | Triton X-100 |
Washing buffer | Merck (Darmstadt Germany) | 524653 | 0.05% Tween 20 in PBS |