Summary
3 r 原則の観点から動物実験に代わる方法として呼吸モデルが進化しています。呼吸器系物質のリスク評価の特に適切な試金の不足があります。ここでは、浮遊物質の評価のための肺癌精密カット スライスの使用について述べる。
Abstract
広範な多様性呼吸器疾患には、基になるメカニズムを理解し、新しい治療法の開発を有効にする適切なモデル システムが必要があります。さらに、新規物質の登録には、損なわれて、たとえば、職場で個人のリスクを避けるために適切なテスト システムで適切なリスク評価が必要です。このようなリスク評価は、動物実験で通常行なわれます。3 r 原則、動物実験に対する懐疑論からみた精密カット肺のスライス (PCL) など、人間の代替方法を進化しています。本稿では、ヘキサクロロ白金酸アンモニウム (HClPt) などの低分子物質の免疫調節の可能性を研究する人間の PCL のex vivo法について説明します。生存率およびローカル呼吸器炎症、サイトカインやケモカインの変えられた分泌測定エンドポイントが含まれます。プロ炎症性サイトカイン、腫瘍壊死因子アルファ (TNF-α) およびインターロイキン 1 α (il-1) 有意に増加した人間 PCL HClPt の毒性濃度への露出の後。PCL の技術は、過去十年にわたって大幅に最適化されています、にもかかわらず、免疫調節のテストのための適用はまだ開発中です。したがって、ここで示された結果、予備、にもかかわらず、彼らは呼吸の研究の貴重なツールとして人間の PCL の可能性を示します。
Introduction
上部と下部気道の感染症、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患 (COPD) 職業性喘息アレルギー喘息など呼吸器疾患の上昇、世界的な健康負担1,2を表しています。適切なテスト システムは、適切な物質のテスト、開発に加え、これらの疾患の基になる基本的なメカニズムのいくつかを識別するために必要。基礎研究と前臨床試験の医薬品開発は生体外でまたは生体内での試金で得られた結果を重視します。これらの試金、ただし、その制限3があります。まず、生体外の試金分離と隣接する組織や臓器から削除されたひと細胞を活用し、こうしてもはや対話または他の細胞3によって保護されることができます。第二に、動物モデルは人間生理学および生化学的相違4の違いのために変換で可能多くの場合です。これらの制限を最小限にするために 3 r のコンテキストで (交換、洗練、削減) 原則5、新しい代替モデルが常に進化しています。
PCL などの代替 3 D 人体モデルは、生体外で人間ベースのと複雑な動物体内モデル間のリンクです。PCL は、上気道6内にあるすべての関連するセル型の機能的多様性を反映しています。さらに、PCL の技術単一動物または人間のティッシュのドナーから正確な厚さのいくつかの薄いスライスの再現可能な準備という利点があります。これは、により、濃度の違いと同様に、内部統制や薬をテストするために。
フィッシャーらによって 1994 年に寒天培地充てんひと肺のスライスの最初の導入以来7スライスと肺組織の培養技術が大幅に改善されました。クリスチャン ・ マーティンらさらに化学的および薬理学的アプリケーション8のこの技術を改善しています。当社グループは、2007 年にクリスチャン ・ マーティンがこの手法に導入されました。それ以来、研究における PCL の適用テスト、免疫学的には、気道9,10と血管収縮11などの機能的反応の薬理学的12,13, から広がった毒性7のいくつかの研究所で様々 な種でテストします。例えば、Schlepützら14種差の気道反応を調査し、比較末梢ニューロン活性化電気刺激 (EFS) かマウス、カプサイシン、ラット、モルモット、羊、マーモセット、人間。彼らは神経を介した気道攣縮の明瞭な別のパターンを用意する様々 な種を発見、よく使用される実験動物 (マウス、ラット) は常に人間の応答を反映しないことを締結します。肺毒性の試験のため、この文脈で、ヘスらの動物の数を減らすこと15吸入曝露実験のための前のヴィヴォ代わりとしてラット PCL の事前検証。この多中心性の事前検証の研究は有望な結果と PCL を使用して 2 つの予測モデルの開発で起因しました。
また、基礎研究は、PCL は16、初期のアレルギー反応の17、およびウイルス感染応答18,19カルシウムを明らかにする使用されています。技術の進歩は継続してさらなる進歩が検討されています。たとえば、フィールドは保存と凍結するティッシュの再利用によって人間の組織の利益を増加しています。Rosnerら説明凍結融解気道の刺激による契約能力を保持するマウスの PCL の技術: したがって、テクニックは、実行可能なとさらなる組織のまま、制限された時間ウィンドウを延ばしますアッセイは、時間をかけて同じドナー20に適用できます。これらの研究の進歩、ブラザーズクエイらに加え21は最近人間 PCL で職業性喘息における潜在的な増感剤としての役割を果たす可能性がありますさまざまな化学物質のリスク評価を行った
高分子分画法22や23低分子量 (低分子) の物質への暴露による職業性喘息、その症状は、気流閉塞と気道過敏性、アレルギー性の喘息と同様 (など、白金化合物) 職場の作業環境。低分子エージェントは、皮膚を形成する高感作の可能性があるし、キャリア蛋白質21バインドします。新規分画法や低分子化学物質の登録に関する彼らの推定感作性の潜在的なin vitroとin vivoのリスク評価が必要です (e.g。、OECD ガイドライン 429)24。テストを使用して、潜在的な推定の感作を決定しかし、もともと設計されていた呼吸増感剤のリスク評価のため連絡先作いくつか合同物質25 の小さなサブセットをするようだが.ブラザーズクエイらによる作業は、推定接触または肺増21のリスク評価のための代替のテスト戦略を開発する欧州連合プロジェクト Sens-it-iv の一部として設計されました。このプロジェクトのためには、代替テスト ツールとして人間の PCL のユーザビリティ テストに焦点を当てた。したがって、免疫調節エンドポイント (例えば、生存率およびサイトカイン分泌) のセットは、プラチナの低分子化合物などの化学物質の刺激や炎症性の可能性を決定するのに選択だった。ブラザーズクエイらすべて呼吸増; に適用できる一般的なパターンが見つかりませんしかし、自分の仕事は、最近公開されたプロトコル26基礎を提供しました。
要約すると、準備と人間の PCL のそれに続く露出のためここで提示されたプロトコルは潜在的な肺毒性の評価および/または呼吸の開発に関与するかもしれない免疫調節物質の有用なメソッドを提供します。職業性喘息などの疾患。
Protocol
人間の PCL の実験を世界医師会の倫理コードに従って実行し、(ここに示す模範的な PCL 実験は、ハノーファーの倫理委員会で承認されたローカル倫理委員会の承認する必要医学部;番号 2701-2015)。ひと肺材料の使用する書面によるインフォームド コンセントは、すべてのドナー患者やその近親者から必要です。本稿に記載されている結果は、肺癌患者から受けた組織のほとんどがあった年齢別、性別、病歴と切除の原因のドナーから切片が得られました。のみ無料の腫瘍組織は、実験に使用されました。
1. 一般人間 PCL やそれに続く化学物質曝露の準備
注: 2 人は、肺を埋める必要があります。A 型肝炎と B の最新の予防接種記録をお勧めします。患者は c 型肝炎と HIV の肺移植の前に定期的に上映されます。結核菌とアクティブな感染を診断された、あるいは疑われた場合肺を拒否する必要があります。それにもかかわらず、すべての新鮮なひと肺組織とそれから派生したサンプルとして扱われなければならない潜在的感染症及び対応する保護対策が必要 (粒子フィルター マスク (FFP2)、保護メガネ、手袋) の労働安全を確保するため、スタッフ。60-90 分を要します。
- 人間の肺の葉の厳守を確認します。
注: 胸膜に涙は、組織の均一な充填を防ぎます。ひと肺材料は、切除の日からする必要があります。アガロース氷の上でそれを充填する前に室温 (RT) で約 2 時間の記憶期間が許されます。このプロトコルで使用する組織は、切除を受けた患者から取得されます。死亡例からはありません。組織は、氷の上に格納されている場合、それを充填する前に RT に暖かい事前 agarose がすぐに重合するそれ以外の場合、均一な充填はできません。
注意: は、白衣、手袋、キャップ、マスクの 2 つのペアと安全メガネのペアから成る防護服にネイティブのひと由来の材料との接触のすべての人を置くことを確認します。ひと由来の材料は、感染の危険性です。 - 低ゲルの agarose の 7.5 グラムの重量を量るし、bi 蒸留水 250 mL を加えます。Agarose を溶けるまで電子レンジでアガロースを沸騰させます。Agarose の溶融とゲル化点によって、およその 40 ° C に冷やしてください。
注: いくつかのフラスコが必要、葉のサイズに応じて。 - 事前にウォーム アップし、37 ° C で培 (材料表)
注: agarose が熱すぎる培養液中のビタミンが有効性を失われ、細胞が破損しています。媒体/アガロース溶液の温度は、37 ° C 以下が、ゲル化のプロセスは開始し、肺の均一な充填を損ないます。37 の ° C から 39 ° C の温度範囲のみをお勧めします。 - 範囲内で開始する前に必要なすべての材料を配置: 5-10 クランプ、約 1 m の長さ、(例えば、50 mL の) 適切な注射器の柔軟なカテーテル、カテーテルや氷を入れたアイス ボックスへの接続をフィッティングします。
- シリコン チューブを挿入することで気管・主気管支を cannulate し、クランプの組織圧搾一緒にシリコン チューブと一緒にオフつまんなくチューブに平行を指向にクランプしています。シリコン チューブ内執着、充填処理中に抜け出すことができないことを確認します。クランプと他のすべての気管支、血管と傷害を閉じて、充填処理中に漏るしているアガロースことができません。
- ビーカーに培と 3% 低ゲルの agarose の相当量を混ぜます。50 mL の注射器を使用して肺に混合物を植え付けます。培地で注射器を補充する前に、クランプは、指や気泡、アガロースの逆流を避けるためにクランプでカテーテルをシャット ダウンします。それは十分に膨脹させたまで肺葉, 肺区域を記入します。慎重に触れる側の肺胸膜胸膜は、でも、ハードにする必要があります。
注: 肺葉, 肺区域のサイズによってアガロース/メディア ソリューションの 2 または 3 L までが必要になります。 - 単一の標本内のいくつかの気管支の場合各気管支の 1.5 1.6 の手順を繰り返します。
- 植え付け agarose の量に応じて、20-40 分のゲルに agarose の重合のための氷に肺を置きます。ハードやクール、その重合が完了を示すかどうかを確認、それ以外の場合は、待ちますいくつか両側胸膜を慎重にタッチします。病理が肺のスライスを切り、それらのサンプルを取るし、輸送のため氷の上肺材料を格納できるようにします。
- ひと肺組織を 3-5 cm のスラブに鋭いナイフでカットします。
注: は、シャープネスを確保するためすべての肺の新しいブレードを使用します。 - 400 mL の冷たいアールの平衡塩溶液 (EBSS) で組織スライサーを埋めます。すぐに最寄りの直径のコアリング ツールを使って半自動ドライバーを使用して肺のスラブからの円筒形のティッシュのコアをカット (例えば、8 mm; 10 mm)。
注: この直径はマシンの内部ティッシュ ホルダーの直径に相当する必要があります。 - 所望の厚さ値に肺のスライスの厚さを調整します。
注: 約 250 μ m の厚さは、PCL の実験では使用されます。組織スライサーのメーカーでは、スライス厚の検証のための組織スライスの厚さゲージをお勧めします。また、全取り付ける染色共焦点顕微鏡と組み合わせて Brismarらによって説明するように、スライス厚を決定する使用できます。27 - 組織スライサーのティッシュ ホルダーにティッシュのコアを転送します。組織のコアの上に重量 (ティッシュ ホルダーの一部) を置きます。組織スライサーの腕の速度と刃の速度を 6 に設定します。組織のコアを PCL にスライスを開始します。
- 500 mL の市販ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) の補足: 栄養混合物 F-12 DMEM/F12 (1:1) (10,000 単位/mL) ペニシリンとストレプトマイシン (10,000 μ g/mL) 5 ml。冷蔵庫に生殖不能の条件の下で数日間培養培地を保存します。あらかじめ媒体の必要量のみを温めます。
注: ペニシリンは 37 ° C で長期間保管した場合不活性化します。血清組成変化バッチからフェノール赤などの色素は、アッセイに干渉できる血清、色素フリーの培養培地を使用します。 - 25 mL 冷たい培養培地のシャーレ (100 × 15 mm) を入力します。媒体は、ガラス シリンダーのクランプを開いて、ビーカーに組織スライサー外に排水する必要があります。アプリケータ (例えば、接種ループ) を使用して、スライスをビーカーから培地をシャーレに転送します。インキュベーター (37 ° C、5% CO2、湿度 100%) にペトリ皿を置きます。洗浄の手順を実行する前にウォーム アップ的に許可します。
注: すべてそれ以上の手順は、無菌条件下で実行されます。 - シャーレ、PCL を洗浄するためにセル ストレーナーを配置します。完全にセル ストレーナーを 10 mL の血清ピペットで培を削除し、37 ° C に予め温めておいた新鮮な媒体の 25 mL を追加します。このステップは、3 - 4 回 30 分毎を繰り返します。
注: セルのストレーナーは、スライスへの損傷を避けるために、ピペットに吸い込まれてからスライスを防ぎます。 - ウェルあたり 2 つのスライスを 500 μ L の培地の最低 24 ウェル培養プレートに肺のスライスを慎重に転送します。物質 (3.1 3.4 の手順を参照してください)、肺組織を公開など、37 ° C、5% CO2で 24 時間。
注: 転送のため、接種ループを使用して、組織の損傷を防ぐためにループにスライスのフロートを聞かせて好ましく。十分な新鮮な媒体の不足だけは切片の細胞死を誘導すると、スライスのさらに分離する必要はありません。スライスすることができます重複または井戸に互いに接触: 組織の生存率に影響を与えません。 - 少なくとも 24 時間の定着剤 (例えば10% ホルムアルデヒド) とプラスチック フラスコにすべて残留ひと由来の材料を入れ、処分プロセスでこれを焼きます。
注意: ホルムアルデヒドは有毒である、フードの下でこの手順を実行します。
2 PCL の組織学的解析
- 2 つのフォーム パッドを固定液に浸漬と生検カセットを準備 (e.g。、4% 緩衝ホルムアルデヒド)。生検カセットに泡パッドの間 PCL を置き、すぐに組織を固定液に転送します。修正 4% で一晩組織は、ホルムアルデヒドをバッファリングします。
- キシレン (3 x 1 h) と標準的な病理組織学プロトコルに従って流動パラフィン (3 x 1 h) 洗濯後脱水エタノール (70%、90%、100%、100%、100%、100%)、各 1 時間のサンプルで埋め込むパラフィンの組織を処理します。
- 埋め込み型に、PCL を転送します。接種ループを使用します。流動パラフィンに PCL ティッシュを埋め込みます。パラフィン ブロックを鋳造金型で組織を均等に配置することを確認します。
- フラットとも面まで回転式ミクロトームで、PCL を含む組織ブロックをカットします。所望の厚さの切片を取る (e.g。、4 μ m)、全体の PCL までそれらを個別に連続した番号でコーティングされたガラス スライド (通常 25-30 節を取ることができる) を配置することが行われました。
- オリエンテーションのためのヘマトキシリンとエオシン染色 (H & E) と単一のガラス スライド (すべての 8-10 のセクション) を染色します。(最初と最後の 8 セクションは通常完全な) 方向スライドに基づいて実験のためのセクションを選択します。
注: (省略可能) 保存用液体パラフィンで長期貯蔵までスライドを浸すことができます。
3. 物質の溶液の調製
注: 作業ソリューションと使用直前にコントロールを準備します。
注意: 安全上の注意に従って物質を処理または潜在的に有害、不明な場合、日常的な安全上の注意に従ってください。
- 直接培地の水溶性物質を溶解します。不溶または難溶性の化学物質、物質溶解度に応じて適切な溶剤で物質を溶解する最初。限られた水容解性の物質 (< 0.1 mg/mL) DMSO やエタノールで、たとえば、解散することができます。非毒性溶剤濃度あらかじめ滴定法により決定してください。解決中に希釈されたときから沈殿しない物質であることを確認します。
注: HClPt/ナトリウム ・ ラウレス硫酸塩 (SLS) ソリューションを用意しています。 - 物質で原液を 100 倍準備培養液や溶剤で必要な最高濃度の。12.5 mg HClPt と 34.4 mg SLS を比較検討し、培地 1 mL 中の化学物質を溶解することにより原液を準備します。
注: これらの化学物質に必要な溶剤はありません。 - 予め温めておいた培地で 1: 100 の最終希釈を準備します。溶媒を以前に使用した場合このアプローチはすべての物質濃度の同じ最終的な溶媒濃度の結果します。
- PCL の標準治療の最終的な溶媒の濃度 (例えば3.3 の手順に記載されている 1%) を使用します。[結果] セクションに記載されている化学物質に必要な溶剤コントロールがありませんでした。
4 細胞毒性の試金のための正と負の参照
- すべての実行可能性の試金のためには、次の次の正と負のコントロールを準備します。
- 組織制御: 細胞培養条件 (37 ° C、5% CO2、湿度 100%) で 24 時間の未処理の PCL の参照としてのみ培地の PCL をインキュベートします。
- 車両の制御 (必要に応じて): PCL の参照のみの車両として最終的な溶媒濃度と PCL を孵化させなさい (手順 3.4 参照) 培養条件 (37 ° C、5% CO2、湿度 100%) で 24 時間。
- 肯定的な制御: 4 ° C で 1 時間の緩衝液 1% 洗剤と PCL を孵化
注: PCL は無色になると、組織は死んでいます。合計 L-乳酸脱水素酵素 (LDH) は、約 1.9 2.3 (手順 6.1 6.4 参照) の吸収で、上清に決定されます。組織は WST 1 アッセイ用 (5.1 5.5 のステップを参照)、約 0 の吸収。
5. WST-1 によって人間の PCL で化学的に誘発細胞毒性の測定
注: WST 1 アッセイは、ウェルあたり 2 つの PCL と 24 ウェル プレートで実行されます。好ましくは、パラメーターごとに重複を使用し、測定後これらの重複の結果をプールします。
- 開始する前にすぐに媒体の WST 1 試薬を希釈して、実用的なソリューションを準備します。実用的なソリューションの必要量は、24 ウェル プレートの 250 μ L/ウェルです。したがって、1 つの井戸の培地の 225 μ L で試薬を 25 μ l 添加をミックスします。
- 1.16 のステップから PCL のインキュベーション後破棄またはサイトカイン測定や LDH の測定等の試験に上澄みを使用します。残りの組織は、次の手順で使用されます。
- ピペット 250 μ L あたり WST 1 試薬濃度作業のもし、1 h.、PCL が潜伏中に完全に WST 1 試薬に記載されて確認のため CO2を 37 ° C、5% でプレートを孵化させなさい。
- 軌道シェーカー (200 rpm) でプレートを置き、30 のため慎重に振る s WST 1 試薬の混合を徹底したことを確認します。24 ウェル プレートの各ウェルの上澄みから重複に新しいフラット底 96 ウェル プレートとピペット 100 μ L を取る。
- 450 各ウェルの吸光度 nm (参照: 630 nm) マイクロ プレート リーダーを使用しています。630 で吸収を引く 450 から nm nm。これらの値使用されます手順 5.6 で計算)。
注: 細胞毒性評価のための信頼性の高いデータは、実行可能な組織からのみ取得できます。したがって、ヘスらによって公開されたこれらの承認基準15は、各実験で満たす必要があります。これらの条件が満たされていない場合は、実験を繰り返す必要があります。 - 対照媒体の吸収は、0.6、そうでなければ実験を繰り返す必要があります上する必要があります。場合は、データは、この要件を満たすため、組織制御の吸収値を 100% に設定し、組織制御に関連して扱われたサンプルの WST 1 削減を計算します。
6. LDH アッセイ
注: LDH アッセイは、後の潜伏期間の後 100 μ L 培養合計で上清中の 96 ウェル プレートで実行されます。
- テスト エージェントの有無に PCL のインキュベーション後、ステップ 1.16 から上澄みの 50 μ L を取るし、新しい 96 ウェル プレートに重複転送。これは各 24 ウェル プレートの処理から重複を生成します。
- LDH 試薬、アッセイ直前の作業ソリューションを準備します。触媒溶液 (1 mL bidistilled 水に溶解した lyophilisate) 成っている、実用的なソリューションとソリューションの製造元によって提供を染料します。1 つの 96 ウェル プレート、色素溶液の ml の 6.25 触媒溶液の 125 μ L を徹底的に混ぜます。
注意: 直接光にソリューションが公開されません。 - ピペット 50 μ L 各作業ソリューションの清既に含む 50 μ L をよく、暗闇の中で常温に 20 分間プレートを孵化させなさい。さらに混合することが必要です。
- 492 で各ウェルの吸光度 nm (参照: 630 nm) マイクロ プレート リーダーを使用しています。630 で吸収を引く 492 から nm nm。これらの値は、6.5 のステップの計算に使用されます。
注: 細胞毒性評価のための信頼性の高いデータは、実行可能な組織からのみ取得できます。洗剤処理コントロールの吸収は 1 以上にする必要があります。 - 分析手順を 100 %4.1 から肯定的な制御の吸収値を設定し、(すなわち、最大 LDH リリース) 肯定的な制御に関連して扱われたサンプルで LDH リリースを計算します。
7 共焦点レーザー走査顕微鏡 (cLSM) で微細な生存率分析
注: 顕微鏡実行可能性の試金のため通常 250 μ m 厚 PCL の 2 つは 24 ウェル プレートの 250 μ L/ウェルで黒ずんでいます。各スライスは個別に撮影された、さらに重複する必要はありません。
- テスト項目の有無と PCL のインキュベーション後、上澄みを廃棄またはサイトカイン測定または LDH の測定等の試験に使用します。ここで説明されている手順の残りのティッシュを使用します。
- 作業のカルセイン AM とエチジウム ホモ 1 (EthD-1) による希釈培地の 4 μ M の両方の試薬濃度作業を準備します。この目的のため 997 μ L の培養液に 1 μ L カルセイン AM (4 mM) のと EthD-1 (2 mM) の 2 μ L を追加します。このボリュームは、2 つの PCL 4 井戸を染色する必要があります。
注: は、直接光に試薬の暴露を避けます。 - ピペット 250 μ L 各作業希釈のよく、暗闇の中で RT の 45 分の 24 ウェル プレートを孵化させなさい。150 rpm で軌道シェーカーに染色液をティッシュのより良い露出を確保するため潜伏中にプレートを配置します。
- 45 分後に染色液を捨て、暗闇の中で RT で 3-5 分間 150 rpm で握手をして緩衝液を 1 mL と PCL を洗います。この手順を 2 回繰り返します。
- 培地からの蛍光を避けるためにステンド グラスの PCL を含む各ウェルに緩衝液 500 μ L を適用します。微視的評価内生体との少なくとも 2 つのランダムに分散 z スタックを実行します。
- X/0.3 10 を選択する眼のタブをクリックして目的と PCL の表面を見つけるための標準的な光学顕微鏡と cLSM を使用するオンラインをクリックします。眼の設定を終了するオフラインをクリックします。
- [取得] タブをクリックし、蛍光物質の適切なレーザー入れます。
注意: 波長 488 のアルゴン レーザーを使用ポリアニオン性色素カルセインの nm (495 の励起波長 nm)、HeNe レーザー波長 543 nm EthD-1/DNA 複合体の検出 (533 の励起波長 nm)。アルゴン レーザーは、これはレーザー寿命大幅延長と一般的に約 5.7 A、管電流を有効にする最大電流の 30-50% で実行ください。 - 光パスの [取得] タブをクリックして、必要なフィルターおよび実験のためのミラーを設定します。
注: 本研究ではメインの二色性ビームスプリッターで使用されたフィルター ベースのシステム (例えば.、HFT 488/543) 励起と放射光を分離します。この光はさらに二次二色性ビームスプリッター (例えば、NFT 545) に送られます反射ミラーを介して別光から出力サンプル 2 つのチャネル。 - バンド設定を渡すフィルター (例えば、BP 505 530 カルセイン信号と EthD-1/DNA の複雑な信号の BP 560-615) 波長の特定の範囲のみを送信、3 チャンネルにチャンネル 2 にカルセイン信号と EthD-1/DNA の複雑な信号を割り当てます。
- Z スタックをオンにすると、微細なボリュームの上限と下限の制限を設定するします。画面上の対応するレイヤーのライブ表示するライブのボタンを押します。検索鋭い信号と PCL の表面の上下にフォーカスを移動します。
- チャンネル サブセクションをクリックし、チェック ボックスすべてを表示します。ライブ画像の下に対応するチャンネルのボタンを押すことによってテーブルをロックし、チャネル色をアクティブにします。
注: ライブ イメージのブルーの色は、白で高信号が表示され、露出オーバーの信号は赤で表示されます一方、信号は無いが表示されます。 - ライトのコレクションの効率性と光学セクショニングの最善のトレードオフの 1 風通しの良いユニットに赤の EthD 1 チャンネルにピンホールを設定し、カルセイン チャンネルを調整します。白がアクティブ チャネル カラー ロックアップ テーブルをライブ画像で赤くないような利得の検出信号を増やします。
注: マスターの利得は 600 台を超えない。 - 活性化チャネル カラー ロックアップ テーブルをライブ イメージに青色で表示されるように背景を調整するデジタル オフセットを増減させます。
- 多次元取得に Z スタック タブをクリックし、フォーカスを使用して、z 興味を持つ層にシフトします。最初の設定以降の獲得のためのこの位置を保存するキーを押します。ゆっくりとフォーカスを上下に 30 μ m の範囲に達しているし、最後の設定を保存するを押してまで。
- ライブ画像を非アクティブ化し起動実験にイメージングを開始するキーを押しますもう一度Liveをクリックします。
注: 実行可能な組織はポリアニオン性色素カルセインの蛍光性検出されます。死んだ細胞は、EthD 1 と核酸の複合体の形成によって差別されます。
8. 画像のレンダリング
注: イメージ レンダリング ソフトウェアの勧告は、コンピューターする必要があります考慮する、ようにこのプログラムは、適切なハードウェアを必要とします。
- 顕微鏡による生存率は、画像レンダリング ソフトウェアに PCL (セクション 7 を参照) の染色から取得した LSM ファイルを読み込みます。進む前に .ims ファイルとしてそれを保存します。組織制御に関するすべてのパラメーターを設定し、これらのすべてのイメージに適用。それ以降の変更は許可されません。
- (カルセイン染色) 実行可能なティッシュの表面再構成のための音量ボタンを使用 (補足図 1 a)、死んだ細胞核 (補足図 1 H) スポット ボタン。1 つのチャネルをレンダリングするときのスイッチ表示調整ウィンドウ内の他のチャネルを切る。
- 重要な組織のボリュームをレンダリングすることによって開始: 表面のチャネルを設定、全体の画像を処理する、滑らかな係数を 0.5 μ m に設定およびしきい値 (補足図 1 b C) の絶対強度を使用します。青い右矢印を押します。
- 再建されたボリュームの絶対強度のしきい値を調整します。ノイズやバック グラウンド強度を減算する必要があります。表面オーバーレイはグレーで表示され、表面被覆率の精度にする必要があります (図 1 の補足) をチェックします。調整が終わったら、青い右矢印を押します。ほとんどの場合この手順は、設定の計算に必要なです。ソフトウェアは、ボリュームを計算することは場合、は、滑らかな率を増加させます。
- 最後の手順でフィルターを選択します。(補足図 1E) 肺胞腔内マクロファージを除外するサーフェス レンダリングのため (約 10 μ m) で真球度フィルターを使用します。緑の [進む] ボタンを押します。
- 光学出力画像を調整し、.xls ファイルとして統計情報をエクスポートします。容量 (合計) は、詳細な分析 (補足図 1 f G) 使用されます。設定を保存し、同じ cLSM 設定 (補足図 1I) で同じ日に撮影した z スタックのすべてのさらなる解析のために使用します。
- 死んだ細胞核の赤のチャンネル (スポット) を再構築します。ランダムに μ m サーパス ウィンドウのスケーリングのドットのサイズを測定します。ドットサイズです約 5 μ m マークを有効にしてドットのサイズを設定します。各ドットが一度だけカウントされますすべてのドットがマークされているかどうかを確認します。(補足図 1 b H、J) が必要な場合は手動で修正します。青い右矢印を押します。
- プレス プログラム パラメーターに従ってスポットの合計数を計算する/カウントさせる緑色の前方ボタン設定し、.xls ファイル (補足図 1 K, L, M) として、結果をエクスポートします。イメージのグラフィカルな統計分析のために重要な組織のボリューム比率で計算される死んだ細胞の核の数を設定します。
9. 人間 PCL におけるサイトカインとケモカインの測定
注: サイトカイン ・ ケモカインの免疫応答で測定可能と細胞外培養上清中細胞内組織溶解液の培養時間後。ELISA は、100 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートでの重複で測定されます。
- 緩衝液の 495 ml 洗剤 5 mL を混ぜて 1% 中性洗剤溶液を準備します。ソリューションは、数ヶ月間常温保存できます。
- プロテアーゼ阻害薬 (PI) レバレッジの比率で 1% 中性洗剤溶液を混ぜます。必要量によって異なります培養プレート;たとえば、24 ウェル プレートに 500 μ L/ウェルを使用します。よく、洗剤溶液の 499 μ L で円周率の 1 μ L を混在させます。
- PI 溶液 1 μ L でのチューブを用意し、500 μ L の培養上清中にこれらの管を収集します。すぐに 9.2 の手順の準備として、PI を含む 500 μ L 洗剤によって 24 ウェル プレートで媒体を交換します。4 ° C で 24 ウェル プレートを配置することによって、1 h のための組織を溶解させます。組織ライセート新しい管にピペットで移しなさいとさらに詳しい分析まで-80 ° C でこれらのチューブを格納します。
注: ELISA のプロトコルは高いメーカーに依存し、製造元の指示に従う必要があります。標準的な ELISA のプロトコルは、次の説明です。 - 培養上清または製造元の指示に従ってライセート中サイトカイン濃度を測定する elisa 法を実行します。Il-1 や TNF-α を測定する (の希釈は、製造元の指示に従って) キャプチャ抗体の 100 μ L 分注により a96 ウェル プレート、コーティングした一晩インキュベートし、
- Bidistilled 水 1 L に洗浄バッファー タブレットを溶解して洗浄バッファーを準備します。各ウェルに捕獲抗体とピペット 400 μ L 洗浄バッファーを削除します。このボリュームを 3 回交換します。ブロッキング剤 (例えば製造元の指示に従って、緩衝液 1 %bsa) を追加することにより、プレートをブロックします。1 時間室温で孵化させなさい。
注: 標準的な市販 Elisa が組織培養上清またはライセートの 2 x 100 μ L 必要です。サンプルは、一度解凍し使用する前にする必要があります。リリースされたサイトカインのアッセイの感度に応じて測定前サンプルを希釈する必要があります。したがって、アッセイによって提供される試薬のサンプルを希釈します。 - ブロッキング液を削除し、(希釈は、製造元の指示に従って) の標準曲線の希釈サンプルを追加および組織培養上清中の 100 μ L または組織ライセート ステップ 9.3 で収集した重複の 100 μ L。室温 2 時間インキュベートします。
- 各ウェルにサンプルやピペットで移しなさい 400 μ L 洗浄バッファーを削除します。このボリュームを 3 回交換します。ピペット 100 μ L のビオチン標識検出の抗体 (の希釈は、製造元の指示に従って)、室温 2 時間インキュベート
- 各ウェルに抗体とピペット 400 μ L 洗浄バッファーを削除します。このボリュームを 3 回交換します。(希釈は、製造元の指示に従って) 100 μ L/ウェル HRP 標識ストレプトアビジンを追加し、室温で 20 分間インキュベート (製造元の指示を確認してください)。
- 各ウェルにストレプトアビジンとピペット 400 μ L 洗浄バッファーを削除します。このボリュームを 3 回交換します。
- (メーカーによって推奨) 基板の 100 μ L を追加し、暗闇の中で 20 分間インキュベート (製造元の指示を確認してください)。
注: この手順は、光に敏感なです。基板とプレートの光の露出を避けてください。 - 50 μ L ストップ ソリューションの追加によって反作用を停止 (1 M H2SO4)。450 各ウェルの吸光度 nm (参照: 570 nm) マイクロ プレート リーダーを使用しています。570 で吸収を引く 450 から nm nm。
注: 未処理や車両組織コントロールがネガティブ コントロールとして提供します。肺組織の免疫応答を誘導する、陽性対照として適切な刺激 (例えば、100 ng/mL リポ多糖 (LPS)) を使用します。など、24 時間培養液で 100 ng/mL lps ウェルあたり 2 つの PLC と 2 つの井戸をインキュベートし、上澄みと組織ライセート 9.3 の手順で説明するようを収集します。
注: 測定結果を受け入れたが、最高水準の吸収が 1.0 以上の場合それ以外の場合、測定は繰り返される必要があります。標準的な曲線はシグモイド用量-反応曲線のあてはめを従う必要があります。 - サイトカイン濃度 (pg) ステップ 9.11 で elisa 法による決定が組織ライセートの各サンプルで決定総たんぱくに正規化された (セクション 10 を参照してください)。
10. 人間 PCL で総たんぱく量の測定
注: PCL は、総蛋白濃度を測定するために分離する必要があります。ステップ 9.3 から組織溶解液は、このステップに使用されます。アッセイは、重複戻組織ライセートの 25 μ L/ウェルの 96 ウェル フラット プレートで実行されます。
- BSA 2,000 μ g/mL、1,500 μ g/mL、1,000 μ g/mL、750 μ g/mL、500 μ g/mL、250 μ G/ml、125 μ G/ml の濃度で 7 ポイント BSA の標準を準備します。各標準の重複で 25 μ L を適用し、96 ウェル プレート (プレート カバー プレート使用) の空白として 25 μ L 緩衝液を使用します。
- ピペット 25 μ L の各ウェルの 96 ウェル プレートに重複から lysates (ステップ 9.3 を参照)。合計、それぞれを 50 μ l 添加も必要です。試薬 B 1:50 BCA 試薬 A. 希釈 BCA で BCA ソリューションの作業試薬の準備します。96 ウェル プレート使用試薬 B を 400 μ l 添加し、20,000 μ 試薬 a.
- 慎重にピペット 200 μ L 作業試薬を各ウェルに空気の泡を回避するのです。30 の軌道シェーカー (150 rpm) でプレートを置き lysates と作業試薬の適切な混合を確実にプレートにプレート カバー s。暗闇の中で 30 分の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。各ウェル マイクロ プレート リーダーを使用して 540-590 nm の吸収を測定します。
注: 測定結果を受け入れたが、標準的な最高の BSA の吸収が 0.8; 以上の同じ場合それ以外の場合、測定は繰り返される必要があります。標準的な曲線はシグモイド用量-反応曲線のあてはめを従う必要があります。 - 分析のためダミーの減算後 4 パラメーター マルカート式による標準曲線を計算します。標準曲線を用いて未知試料の濃度を計算します。
Representative Results
本研究手法と人間 PCL 準備、ひと肺材料化学的に誘導される免疫調節効果を評価するために工業用物質の 5 濃度にさらされています。肺組織は湛水条件下で公開された 24 時間毒性の恒久的な文化がリリースされた LDH、ミトコンドリア活性染色顕微鏡の生存率の測定により評価しました。さらに、正規化およびプロ炎症性サイトカインの総たんぱく量を測定しました。可能な限り、抑制濃度 (IC) 75 を算出した非リニア シグモイド曲線当てはめによる。肯定的な参照物質は、生得的なサイトカインの細胞毒性および LP の洗剤は、各実行の検証に使用されました。対数的に変換された IC75 値 [μ M] (ログ IC50) は、後続のサイトカインのリリース測定の「刺激」濃度として使用されました。
図 1と図 2は、充填ひと肺材料と人間の PCL の模範的な H & E 染色の手順を表示します。衛生のルーチンの手順は、健康への悪影響を避けるために、取り扱っている物質のひと肺スタッフの安全を確保する必要があります。テクニックには、人材育成と実践が必要です。病理専門医 (上位/下位葉と中央対胸膜) さまざまな地域を区別を経験と対病気健康エリアはひと肺材料の病理学的状態を評価するために必要な。生成された人間 PCL は H & E 染色薄いセクション、病理学者によって再評価可能な準備のために使わなければなりません。この操作により、ユーザーの識別の異なった病気にかかった区域および肺内の場所で練習です。
図 3は、SLS、24 時間培養後人間 PCL で LDH と WST 1 アクティビティの測定結果を示します。0 μ g/mL、SLS で SLS なし未処理ミディアム コントロールは重要な品質コントロールです。洗剤によって組織と比較して LDH の値が 20% 以下でなければならないと > WST 1 試金のための 0.7 吸光度単位。これらの品質管理は、十分な組織性の指標をとしても使用。効果的な有害物質として中性洗剤溶液に向かって人間の組織の応答性は、肯定的な制御として含める必要があります。それは 300-500% 増加になります (> 2.0 の吸光度の単位) 未処理組織と値を比べると LDH の < WST 1 試金のための 0.1 の吸光度単位。SLS 結果、LDH と濃度で 1 WST アッセイの代謝活性の減少の増加によって測定される細胞生存率の用量依存的削減 > 87 μ g/mL。S 状結腸の濃度応答モデルはデータに装着した IC75 または IC50 値を計算することが可能です。サイトカインとケモカインのレベルの濃度を選択するこれらの値を使用、その: 毒性の高い濃度で通常ないまたは減少サイトカインとケモカインのみを検出できます。したがって、非毒性または唯一のわずかに有毒物質濃度 (IC75) はお勧めします。細胞培養上清中の LDH 活性の増加が予想の影響よく応用物質21ここで注意することが重要です。頻繁に LDH の測定は使用される唯一の細胞毒性の試金する場合結果の誤解につながる物質と酵素の活性との間の干渉が発生します。したがって、それは重要で、信頼性が高く、有効な結果を得るためのいくつかの毒性試験を行うことが必要です。また、LDH と WST 1 アッセイの感度は非常に匹敵するそれに言及する必要があります。
図 4PCL の微視的生存画像は効果的な有害物質として洗剤に人体組織の応答性を示します。結果は非常に有用な他の生存率のデータを確認するがこれは追加の機器が必要です。毒性は、カルセイン陽性組織 EthD 1 陽性細胞核と比較しての評価によって視覚的に評価されます。実質内でランダムに選択されたセグメント一般的にで抑え比較可能なデータは、気道や血管は避けるべきである、大きな空洞が結果をシフト可能性があります。私たちの経験から、上記の微細な設定、1.5 × 106と 5 x 106 μ m3管理組織の間の平均容積を測定します。値は、肺材料品質、PCL 品質とも肺組織ドナーの疾患によって異なります。にもかかわらず、ひと肺組織の生存率は、ドナーの間で異なります、実行可能な組織と比較して死んだ細胞核数は組織コントロールの 15% を超えない。死んだ細胞の核が主に組織のコントロールに存在する場合ただし、実験を放棄すべき。
図 5は、人間の肺組織に HClPt と SLS の免疫調節作用の代表的なデータを表示します。炎症性サイトカイン il-1 や TNF α が炎症の暴露後炎症性プロセスの始まりを示すバイオ マーカー刺激物質。両方のサイトカインは、elisa 法により測定しました。細胞の il-1 1,000 pg/mL と上記のレベルに達したに対し、細胞の il-1 は人間 PCL は、通常低です。細胞の il-1 の減少は継続的な細胞プロセスを示し、人間 PCL の化学物質への暴露後に観察が主。組合で組織を刺激すると場合、そのような自然免疫系の活性化肯定的な治療管理、誘導 il-1 のほとんどは 24 h 後細胞内のみ検出することができます。対照的に、LPS 刺激による TNF-α の分泌は細胞外主に測定できます。LPS などの適したの肯定的な制御の使用法の妥当性を示しています。HClPt (32、64、125 μ g/mL) の 3 つの濃度または 24 h. サイトカイン分泌の細胞外および細胞内サイトカインの和として求めたの SLS (1、10 μ g/mL) の 2 つの濃度にさらされた人間の PCL、研究方法と図 5に示すように、総蛋白濃度に正規化されました。BCA アッセイは、通常、総たんぱく量の定量に使用、しかし、それはまた物質の毒性を反映していることをここで言及する価値があります。したがって、サイトカイン データの正規化、毒性の高い濃度で総たんぱく量を使用できません。Il-1 分泌大幅 263 ± 38 pg ・ mg から 887 ± 216 頁/mg と TNF α の 263 ± 38 pg ・ mg から mg に増加 1,160 ± 286 pg/(図 5A, B)。また、LPS 誘導性の il-1 や TNF-α の分泌が刺激されない組織制御と比較して表示されます。組合など、病原体関連分子パターンによる炎症性サイトカインの誘導手法の有効性を示す、免疫調節効果を調査する人間の PCL を使用する場合を使用するを強くお勧めします。HClPt と SLS のデータの詳細についてを参照してください研究ラウエンスタインらによって21
図 1: ひと肺材料の充填のためのプロシージャです。人間の肺は切除後すぐに用意しています。肺は、一貫性のある充填アガロースと充填時突然 agarose 重合を避けるために室温で保存する必要があります。肺は、主気管支や気管支 (A & B気管支へのクローズ アップ) に最適なビューに広がる葉を水平方向に配置されます。気管支が柔軟なシリコーン チューブを cannulated、(C) のクランプで固定します。組織内充填手順とアガロース重合後、は、訓練を受けた病理医は、肺を 3-5 cm 厚 (D) についてのスライスにカットします。これらのスライスから (Øなど、8 mm) の円筒形のティッシュのコアは、コアリング ツール (E) を用意しています。これらのティッシュのコアは、PCL は、正常な細胞の培養条件 (E) の下でインキュベーション用培地充てんシャーレに転送されますすぐに組織スライサーでカットされます。後、いくつかの洗浄のステップ、PCL は、リリースされたセル メディエーター (F) 残留細胞の残骸を削除する (例えば、よく 500 μ L 中につき 2 つの PCL と 24 ウェル プレート) の細胞培養皿に転送されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: H & E 染色によって人間の PCL の状態の定量します。肺腫瘍をドナーから調製したこの画像で PCL 示します歯槽の実質とそのまま肺末梢気道 (*) と概要 (A) の血管 (矢印)。高倍率で気道そのまま繊毛呼吸上皮 (矢印) (B)、多数の赤血球 (矢印) (C)、毛細血管を含む実行可能な肺胞と並んでそのまま肺胞構造と肺胞マクロファージ (CD68 免疫) を含む歯槽スペース (D) は、そのまま血管内皮細胞 (CD31 免疫) と血管だけでなく、(E) を観察することができます。のみ無料の腫瘍組織は、肉眼的病変部が表示されていない理由である PCL に使われました。その他の肺疾患、肺気腫などのドナーから調製した PCL と対照をなしてまたは線維化、肺胞の構造は中断されず、外側のボーダー、準備手順可能性がありますに、PCL はほつれ少しだけ。スケール バーは、それぞれ 1,000 μ m (A) および 50 μ m (B-E) を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 酵素培養液中に LDH の漏れ (A) と染付 WST 1 (B) 評価代謝酵素活性の喪失によって人間の PCL で SLS 毒性の定量測定します。人間 PCL は、SLS の濃度の増加にさらされました。S 状結腸濃度応答モデルは、IC75 または IC50 値 (細胞生存率の 25%、50% 低減阻害濃度) が計算される (右図) をすることができますので、その後データを装着しました。データを提示する ± SEM を意味 n = 3-5。492 で LDH アッセイの吸光度を測定した nm (参照 630 nm) と 450 の WST 1 試金の nm (630 で参照 nm)。データが合わせられ、ブラザーズクエイらから変更21この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 人間の PCL の三次元顕微鏡による染色とイメージ レンダリングの代表的なイメージです。ライブの組織制御と洗剤、効果的な有害物質として組織の応答性を示すカルセイン AM と人間 PCL (黄色)、EthD 1 の染色後 (赤)。30 μ m のスタックは 10 × 対物 (A) で撮影され、(B) を表示しました。スケール バーは、100 μ m 励起波長 488 nm と 543 nm、発光フィルター BP 505 550 nm と LP 560 nm を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ヘキサクロロ白金酸アンモニウム (HClPt)-24 時間暴露後人間 PCL に il-1 や TNF-α の分泌を誘発します。PCL は、3 つの濃度 (32 μ G/ml、64 μ g/mL、および HClPt の 125 μ G/ml) と SLS の 2 つの異なる濃度 (1 μ g/mL と 10 μ G/ml) にさらされました。Il-1 α (A) と TNF α (B) の細胞外および細胞内を elisa 法により決定され、総たんぱく量を正規化します。法の妥当性を示す自然免疫系、LPS の肯定的な活性化は、細胞内 il-1 α (A) の総たんぱく量に正規化された細胞の TNF-α (B) リリースの参照として表示されます。± SEM を意味するようにデータが表示されます *p < 0.05 と * * *p < 0.001;HClPt と SLS: n = 9、il-1組合: n = 5、TNF α組合: n = 技術重複 (マンホイットニー検定) 4。この図は、ブラザーズクエイらから変更されています。21この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: レンダリング ソフトウェアを使用して染色顕微鏡の存続のイメージの詳細な計算処理します。カルセイン染色可能な組織 (A-G、 I) の表面のレンダリングおよびエチジウム ホモ染色細胞核 (Hのスポット検出にアップロードした LSM 画像の画像解析のステップ バイ ステップの操作手順J-M)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 2: ひと肺組織の染色顕微鏡による生存率の計算画像解析の概要。実行可能な組織 (黄色) (B-私) 表面のレンダリングによって分析し、スポット検出 (J-P) で死んだ細胞核 (赤) を認めた。スナップショット モードはイメージ (Q) をエクスポートする使用しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
当研究室で人間の PCL の技術が定評です。本稿では、この手法とその肺組織体外の物質の毒性試験の説明を与えます。一般に、定量化可能な範囲の定義、推定変動と実験の妥当性を保証する品質管理関連アッセイを設定するこの手法が求める必要がありますを使用する任意の研究室。可能な標準的な手順をたとえば、各エンドポイントは、例えばサンプルを含む正あたり 2 ~ 3 技術的複製の最低 3 つ生体ドナー (個々 の実行) の最低で、細胞毒性アッセイを繰り返すできると否定的な参照。研究者は、アッセイの一貫性の向上、測定の変動を最小限に抑えるために訓練する必要があります。
肺組織の物質の免疫調節効果を評価するために頻繁に使用されるエンドポイントが含まれて細胞毒性には測定 (例えば、LDH アッセイ、WST 1 アッセイ、アッセイを染色顕微鏡) 別の試金を使用して、放出アッセイ、同様に発現プロファイルおよび乳歯メソッド6細胞集団における変化の特性評価の変更点さらに、人間の PCL に転送することも、こうして前に細胞の構成をより詳細に把握を提供可能性がありますマウスの PCL28の肺樹状細胞などの細胞の可視化を記述する技術があると推定の細胞毒性物質投与。
この基本的なプロトコルおよびひと肺切片の作製技術は出版物29によく記載されている技術に匹敵します。一言で言えば、臓器材料は、切除や移植の手術を受けるにした肺ガンなど生活にかかわる慢性疾患に苦しむ患者から取得されます。研究は、倫理委員会で承認されなければなりません。患者の情報に基づいた書面による同意が必要です。クリニック ・研究所間のワークフローを設定する重大な問題は、通信、およびインタ フェースとインフラストラクチャ双方のサイト間の定義が必要です。ひと肺材料が直接切除組織の実行可能性を維持するために処理されます。老いも若き肺と肺の健康と病気、人間 PCL ここで説明する手法を適用できることを言及する価値があります。たとえば、米国で、事故で死んだまたはその臓器移植拒否されている健康なドナーからの肺を得ることが可能です。
プロトコルの最初の重要なステップは、気道や周囲実質アガロース溶液のインフレです。この手順以降のスライス処理手順の非常に柔らかい組織を固めるため必要です。病気の背景に基づくひと肺材料の品質は、ここで重要です。そのまま胸膜と丸い突出部だけを入力できます。気管支に近い末期腫瘍充填プロセスを防ぐ。ひと由来の材料を膨らませる前にアガロース溶液の温度が徹底的にチェックします。あまりにも多くの血または他液体 (分泌物) 人間の内部肺組織 agarose の望ましくない希釈になります、重合プロセスに影響を与えます。肺組織のインフレと氷の agarose のゲル化後、肺は 200 に 300 μ m の厚みの部分にカットされます。組織の一貫性は非常に重要な問題です。組織が柔らかすぎる場合は、同じセクションのスライスは難しいです。設定各ドナーは、ドナー間のスライスの厚みが異なる場合があります同じミクロトーム、個々 のための条件、膨張時の変化プロセスを各肺の場合でも。組織の不均質の充填は、スライスの厚さになります。測定してスライスの厚さを標準化するのではなく、総たんぱく量の測定は肺のスライス厚を直接監視する使用できます。いくつかの末期疾患を妨げるスライス プロセス;例えば血管、肺高血圧症と線維組織で非常に厚くなった血液は組織シリンダーのスライスはほとんど可能、ミクロトームの刃は非常に頻繁に交換する必要があるので、硬いことができます。
人間の PCL と集中洗浄手順の準備の後、細胞の残骸を削除する必要ありリリース酵素、組織実験29のためのセクションを使用できます。人間 PCL は正常な細胞培養条件下で培養した、たとえば、化学物質、薬、またはリポ多糖にさらされます。(不明) 感染による PCL の時折の汚染はひと肺材料の文化で特別な問題です。組織培養感染症を示す必要があります破棄され、機器を徹底的に消毒する必要があります。空間的な分離の準備のため、一方で使用される実験室場所と養殖と一方、交差感染を避けるために役立ちます。機器に関してミクロトーム、リークが発生し、六角ネジの緩みは、モーターの損傷とブレードの動きの停止につながる可能性があります。スライサーのすべての部分はステンレス スチール製し、酸化し乾いていない場合だからすぐにクリーニングを変更します。機器の問題を克服するためには、少なくとも 1 つのバックアップ デバイスを持っている必要があります。
前の出版物、アガロースを洗い流されることが報告し、集中的な準備の後の手順を洗浄中に削除されています。実際には、これは不可能です、agarose を削除できません。Agarose の完全な除去は、それは、組織を破壊する高温で再溶融する必要があります。肺胞や気道のアガロースは、記載されているエンドポイントとは干渉しません。他のエンドポイントは、アガロースの存在に影響されるかもしれません (「制限」も参照)。非常に新鮮なティッシュ セクションを準備する必要がありますは、組織性は文化の重要な問題と強調します。気道攣縮は生存率の有効なパラメーターではありません。周囲実質; の実行可能性を確認する、少なくとも 2 つまたは 3 つの独立した細胞毒性アッセイを使用してお勧めします実験30でチェックする必要があります。細胞毒性試験の品質管理は、不十分な組織性の指標となります。したがって、すべての細胞毒性の試金に洗剤など効果的な有害物質に、たとえば、組織の対応を評価することをお勧めします。用量反応曲線に基づく、吸収の最小値と最大値は細胞毒性の試金のために定義する必要があり、その後の実験のために会った。プロトコルにさらに変更はほとんど応用化学薬品および興味のエンドポイントに依存します。不溶性か反応性の高い化学薬品の適用性が限定されます。DMSO の最も高い溶媒濃度は 1% に制限されます。高濃度は使用できますが、IL-8 などの炎症性サイトカインの顕著なリリースがあります。その一方で、使用される刺激は比較的弱い可能性があります。この場合、2 つのウェルあたり 4 つのスライスから組織の量を増やすことができます。このアプローチは、24 h に生存率を制限します。
人間の PCL の主要な制限は、ドイツでのみできる病気の人間の肺の材料からです。手術を受ける患者は、通常 50 歳以上と肺癌患者の 80% は、または喫煙をするために使用します。、糖質コルチコイドなどの患者の薬はヒト組織を用いた実験の結果に影響を与えることができます。したがって、それは不可欠です: i) 生存率、機能、および個々 の組織の感度を確認する肯定的な参照によって各実験を検証し、ii) クロス-検証結果から健康、非病気にかかった、中年期の肺組織を使用実験動物 (カニクイザルなどヒト以外の霊長類と、可能であれば、マウス、ラット、モルモット)。病気の組織の病理スコアの改善実験結果より。重く病気にかかったティッシュはほとんど使用することができます、非常に頻繁に示す制限生存率、不十分に低いまたは非常に高いサイトカイン、細菌や真菌の感染症およびより少ない気道攣縮。ドナー-ドナーの変化は、人間の個々 の変動を反映した実験動物から得られた結果と比較してください。これは、制限では、ただし、ありません一般的;前述のように他の国 (例えば米国) 移植拒否死亡したドナーからの健康な肺を得ることが可能です。組織の応答性は、急性暴露実験では 48 時間までの最初にも記載されています。文化の多くの日後または-80 ° C で保存後生存率と組織の機能が減少します。約 14 日間までの文化ひと肺組織することが可能です。この時に続けている生存率ただし、マイトジェン限られたサイトカイン放出の結果変動だけでなく、組織内のマクロファージなど、いくつかの細胞集団の機能の損失の増加が観察されます。いくつかのエンドポイントの別制限 RNA31の高品質かつ十分な量の分離または後続のフローサイトメトリー用単一細胞懸濁液の準備を妨げる組織の agarose の存在であると細胞の表現型解析。単一細胞の反応と機能機械論的洞察を得るために可能性、限定です。
人間の PCL などの脊髄組織モデルの基礎研究・非臨床研究に大きな影響を持つと見なされます。ひと肺材料は、器官の正常アーキテクチャを密接に反映する生物学的組成を持ちます。それは、たとえば、住宅および気管支肺胞上皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、神経線維、マクロファージに含まれます。組織実行可能であり、細胞はいくつかの刺激に応答します。ただし、神経線維、カット、ローカルでアクティブにできるターミナルの反射応答14に 。その結果、この前のヴィヴォモデル細胞の自然免疫応答、防御反応、サイトカイン シグナル伝達、およびセル表面のマーカーの誘導を検討する可能性を提供しています。技術、培養、およびエンドポイントの検証にいくつかの改善は、並進科学で人間の PCL の使用を許可します。将来のアプローチの例としては、: i) 検証の新しいターゲットひと肺組織、暴露後免疫応答の評価 ii) たとえば、化学薬品、医薬品、ナノ粒子、等iii) 免疫細胞と肺組織の補充などT リンパ球、iv) として識別および呼吸感、病気を誘発する物質、または経路の阻害活性化合物への曝露後などの分子パターンの変更さらに、v) 気道リモデリングと vi) 神経調節32。科学の分野は、PCL のこれらの現在および将来のアプローチに興味があります。また、低温保存20、および組織または機械的呼吸時に組織の自然な動きを模倣する33のストレッチなど、PCL の技術を改善するのに役立ちます別の開発のさまざまながあります。換気。
他の 3 D モデルと比較して人間の PCL の主な利点は、免疫細胞や神経線維の存在です。実験は、マウス、ラット、および薬理学および毒物学で最もよく使用されるまだ動物の種は、ヒト以外の霊長類でも実行できます。ひと肺組織の複雑さは、人間を動物と体外体内から結果の翻訳をサポートしています。呼吸器系の増感剤の識別のため既存の代替アッセイのコンテキスト、人間 PCL は非常に複雑であり、単一細胞応答への洞察を許可しません。まだ、顕微鏡とフローサイトメトリーは右細胞のマーカーで使用した場合の組み合わせで、たとえば、アポトーシスや壊死、細胞内マーカー細胞応答に関する情報を与える可能性があります。公開されたアッセイ検証と呼吸器系の増感剤の識別のために使用されていると報告があります。ただし、ワトソンらによる記述で、単一セルの試金上のすべての利点と PCL の使用の進歩高スループットス クリーニングの手法が使える意味で貴重な貢献を作っている34彼らはマウスの低温保持 PCL で気道毒性を予測する高スループット スクリーニング アッセイを開発しました。小型 96 ウェル PCL 形式を彼らは PCL 可能の高スループット試金を作るマウス肺胞のような読み出しを検出しました。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。フラウンホーファー項目は、バイオ テクノロジー、製薬、化学、化粧品産業に代わって受託研究を実行する応用研究のための独立した公共の非営利研究組織です。研究所の資金調達は、国内および国際的公共事業から来ています。
Acknowledgments
Lan ラウエンスタイン人間 PCL とリスク評価のための代替のテスト戦略に関する彼女の前の仕事のために感謝したいと思います。研究の一部は、6番目のフレームワーク プログラム SENS-IV「新規アレルゲンのIn Vitro評価テスト戦略」内で欧州委員会からの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon hose 3.0 x 5.0 mm | A. Hartenstein (Leipzig, Germany) | SS04 | |
| Syringe | Faust Lab Science (Klettgau, Germany) | 9.410 050 | |
| Coring tools | custom-made | custom-made | |
| Trimming Blade Handle (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205530001 | |
| Trimming Blades (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205500000 | |
| Microtome: Tissue Slicer | Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) | 303400-ADPT | Krumdieck Tissue Slicer (MD6000) |
| Microtome blade | Wilkinson Sword (Solingen, Germany) | ENR-4027800011506 | |
| Tissue culture dishes | Sigma (München, Germany) | Z666246-420EA | |
| Cell strainer filter (100 µm Nylon) | Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) | BD352360 | |
| Inoculation loop | Copan Diagnostics (Murrieta, USA) | CD176S01 | |
| TPP Tissue culture plates 24wells | Sigma (München, Germany) | Z707791-126EA | |
| Cassette | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 1000957 | |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom | Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) | 44-2404-21 | |
| Nunc MicroWell 96-Well | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 260836 | |
| Confocal Microscope | Zeiss (Jena, Germany) | Confocal LSM Meta 510 | |
| Image rendering software | Bitplane AG (Zürich, Switzerland) | IMARIS 7.6 | |
| LSM Image Browser | Zeiss (Jena, Germany) | ||
| Multiwell-Reader | Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) | Tecan infinite F200Pro | Plate Reader |
| Plate shaker | Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) | KM-2 Akku | |
| BenchMark ULTRA | Ventana Medical Systems (Tucson, USA) | Automated IHC/ISH slide staining system | |
| Assays | |||
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche (Basel, Switzerland) | 11644807001 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche (Basel, Switzerland) | 11644793001 | |
| Microscopical vitality staining | Invitrogen (Carlsbad, USA) | L-3224 | LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit |
| BCA Protein Assay | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 23225 | |
| ELISA assay kit | R & D systems | various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) | DuoSet |
| Reagents | |||
| Agarose, low gelling temperature | Sigma (München, Germany) | A9414-100G | |
| Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) | Sigma (München, Germany) | E2888-500ML | |
| Penicillin and streptomycin | Lonza (Verviers, Belgium) | 17-602E | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) | Gibco (Darmstadt, Germany) | 11039-047 | Culture medium |
| Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) | Lonza (Verviers, Belgium) | BE17-513F | Buffer solution |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma (München, Germany) | A9647-500G | |
| Detergent | Sigma (Saint Louis, USA) | X100-100ML | Triton X-100 |
| Washing buffer | Merck (Darmstadt Germany) | 524653 | 0.05% Tween 20 in PBS |
References
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