על רקע העיקרון 3Rs, מודלים הנשימה חלופות מחקרים שנעשו בבעלי חיים כמו מתפתחים. במיוחד עבור הערכת סיכונים מחומרים בדרכי הנשימה, יש מחסור של מבחני המתאים. כאן, אנו מתארים את השימוש אמבריולוגיה דיוק-לחתוך פרוסות להערכה לחומרים הנישאים באוויר.
מחלות נשימה בתוך המגוון הרחב שלהם צריכים מערכות מודל המתאים כדי להבין את המנגנונים שבבסיס ולאפשר התפתחות חדשה הרפוי. בנוסף, רישום של חומרים חדשים דורש הערכת סיכונים המתאים עם מערכות בדיקה נאותה כדי למנוע את הסיכון של אנשים שייפגעו, לדוגמה, סביבת העבודה. הערכות סיכונים כאלה נערכים בדרך כלל במחקרים שנעשו בבעלי חיים. לאור עיקרון 3Rs, ספקנות הציבור נגד ניסויים בבעלי חיים, אנושי שיטות אלטרנטיביות, כגון ריאות דיוק-לחתוך פרוסות (PCLS), יש כבר מתפתח. המאמר הנוכחי מתאר שמחוץ הטכניקה של האדם PCLS ללמוד את הפוטנציאל immunomodulatory של חומרים נמוך משקל מולקולרי, כגון אמוניום hexachloroplatinate (HClPt). נקודות קצה נמדד כוללים הכדאיות דלקת בדרכי הנשימה מקומית, מסומן על ידי שינו הפרשת ציטוקינים ו נוגדנים. ציטוקינים פרו-דלקתיים, נמק הגידול גורם אלפא (TNF-α), אלפא אינטרלוקין 1 (IL-1α) היו גדל באופן משמעותי ב- PCLS אנוש לאחר חשיפה ריכוז רעיל המשנה של HClPt. אף-על-פי הטכניקה של PCLS הותאם באופן משמעותי במהלך העשורים האחרונים, את תחולתן לבדיקה של immunomodulation נמצא עדיין בפיתוח. לכן, התוצאות המובאות כאן הן ראשוניות, למרות שהם ולהראות את הפוטנציאל של PCLS האנושי ככלי חשוב במחקר הנשימה.
מחלות בדרכי הנשימה כגון אסטמה אלרגית, אסטמה תעסוקתית, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), אמפיזמה, זיהומים של דרכי הנשימה העליונים והתחתונים בעלייה, מייצגים1,בעול2בריאות ברחבי העולם. מערכות בחינה מתאימים נדרשים, על מנת לזהות חלק המנגנונים הבסיסיים שבבסיס מחלות אלו, בנוסף לפיתוח ולבדיקה של חומרים המתאימים. מחקר בסיסי, כמו גם פיתוח תרופות פרה מתמקדים תוצאות זכו מבחני במבחנה או ויוו . מבחני אלה, אולם, יש את המגבלות שלהם3. ראשית, מבחני במבחנה לנצל תאים אנושיים היו מבודדים, הסרת רקמות סמוכות או איברים, ולכן הם כבר לא מסוגלים לקיים אינטראקציה עם או להיות מוגן על ידי תאים אחרים3. שנית, מודלים בעלי חיים הם לעתים קרובות אינם לתרגום לבני עקב הבדלים פיזיולוגיה פערים הביוכימי4. כדי למזער את המגבלות האלה, ולא בהקשר של 3Rs (החלפת, עידון, הפחתת) עקרון5, מודלים חלופיים חדשים מתפתחים כל הזמן.
מודלים חלופיים. מרקמות תלת-ממד, כגון PCLS, הן קישור בין מבוסס-אדם במבחנה ומודלים מורכבים בעלי חיים ויוו . PCLS משקפים את הטרוגניות פונקציונלי עם כל סוגי תאים רלוונטיים נוכח ב- במערכת הנשימה6. בנוסף, הטכניקה PCLS יש את היתרון של הכנה לשחזור של מספר פרוסות דקות של עובי מדויק מתורם יחיד ברקמות בעלי חיים או אדם. זה מאפשר פקד פנימי, כמו גם ריכוזים שונים או סמים כדי להיבדק.
מאז כניסתה הראשונה של פרוסות מלא אגר אמבריולוגיה בשנת 1994 על ידי פישר. et al. 7 הטכניקה עבור פריסה וגזירה culturing של רקמת הריאה שופרה משמעותית. כריסטיאן מרטין. et al. שיפור טכניקה זו עבור יישומים כימי, תרופתי נוסף8. הקבוצה שלנו הוצג על טכניקה זו על ידי כריסטיאן מרטין ב- 2007. מאז, היישום של PCLS במחקר התרחבה בדיקות של תפקודי התגובות, כגון דרכי הנשימה9,10 ו- vasoconstriction11, חיסונית, תרופתי12,13, ובדיקות רעילות7 מינים שונים של מספר מעבדות. למשל, Schlepütz. et al. 14 נחקרו דרכי הנשימה תגובות על הבדלים בין המינים, לעומת הפעלת הנוירון היקפיים או על ידי גירוי בשדה חשמלי (EFS) או על ידי קפסאיצין בעכברים, עכברושים, שרקנים, כבשים, מרמוסטיים ואת בני האדם. הם מצאו את המינים השונים שיש דפוסים ברורים, אך שונה של bronchoconstriction בתיווך עצב, הגיע למסקנה כי חיות מעבדה נפוץ (עכברים וחולדות) אינן משקפות תמיד התגובה האנושית. לבדיקת רעילות ריאות וכדי להפחית את מספר בעלי חיים בהקשר זה, הס. et al. 15 תוקף מראש עכברוש PCLS חלופה שמחוץ עבור מחקרי רעילות אינהלציה. מחקר אימות מראש multicentric זה הניב התפתחות שני מודלים של חיזוי באמצעות PCLS עם תוצאות מבטיחות.
יתר על כן, במחקר בסיסי, שימשו PCLS להבהיר סידן איתות16תגובות אלרגיות מוקדם17, זיהום נגיפי תגובות18,19. הטכנולוגית המתמשכת, להיות נידונות להתקדמות נוספת. לדוגמה, השדה היא הגדלת היתרון של רקמה אנושית על ידי אחסון חוזר של רקמות קפוא. . רוזנר ואח תיאר טכניקה של הקפאה והפשרה PCLS מאתר ששומרת את היכולת של דרכי הנשימה חוזה על גירוי של: לכן, הטכניקה מאריך את חלון זמן מוגבל שבתוכו רקמות נשארו קיימא, ולא כל כך רחוק מבחני ניתן ליישם לאורך זמן התורם אותו20. בנוסף ההתפתחויות הללו מחקר, Lauenstein. et al. 21 חקר לאחרונה הערכת סיכונים של כימיקלים שונים עשויים לשמש לרגישות פוטנציאליים לאסתמה תעסוקתית ב PCLS האנושית.
אסטמה תעסוקתית, הסימפטומים שלו הם שיבוש זרימת אוויר hyperresponsiveness דרכי הנשימה, בדומה אסטמה אלרגית, הנגרמת כתוצאה מחשיפה גבוהה משקל מולקולרי (HMW)22 או נמוך משקל מולקולרי (LMW) חומרים23 (למשל , תרכובות פלטינה) בסביבת העבודה. סוכני LMW יש פוטנציאל גבוה רגישות עולה כאשר ויוצרים haptens, לאגד המוביל חלבונים21. רישום של כימיקלים HMW או LMW חדש דורש הערכת סיכונים בתוך חוץ גופית ו ויוו בנוגע שלהם בשם רגישות עולה פוטנציאליים (למשל., ה-OECD מנחה 429)24. המבחנים לקביעת רגישות עולה בשם פוטנציאל, עם זאת, לא נועדו במקור עבור הערכת סיכונים של לרגישות בדרכי הנשימה, אך עבור קשר לרגישות, אבל נראה שיש כמה חפיפה עבור קבוצת משנה קטנה של חומרים25 . העבודה על-ידי. Lauenstein et al. תוכנן במסגרת הפרויקט האיחוד האירופי סנס-it-iv, לפתח אסטרטגיות אלטרנטיביות בדיקה להערכת הסיכון של איש קשר בשם או ריאות לרגישות21. עבור פרויקט זה, התמקדנו בדיקת השימושיות של PCLS האנושי ככלי בדיקה חלופית. לכן, קבוצת הקצה immunomodulatory (למשל, הכדאיות, ציטוקינים הפרשת) נבחר כדי לקבוע את הפוטנציאל מטרד או דלקתיות של חומרים כימיים, כגון תרכובות LMW פלטינה. Lauenstein et al. . מצאו שום דפוס כללי זה יכול לחול על כל לרגישות בדרכי הנשימה; עם זאת, העבודה שלהם סיפקה את היסודות עבור פרוטוקולים שפורסמו לאחרונה26.
לסיכום, פרוטוקול המובאת כאן עבור הכנה וחשיפה עוקבות של האדם PCLS מספק שיטה מועילה עבור הערכת פוטנציאל רעיל ריאות ו/או חומרים immunomodulatory, אשר יכול להיות מעורב בפיתוח של מערכת הנשימה מחלות, כמו אסטמה תעסוקתית.
טכניקת PCLS האנושית היא מבוססת היטב במעבדה שלנו. המאמר הנוכחי נותן תיאור של טכניקה זו והשימוש בה לבדיקת רעילות של חומרים בתוך הריאות לרקמות שמחוץ. באופן כללי, בכל מעבדה באמצעות שטכניקה זו צריך לחפש כדי להגדיר וזמינותו של הקשורים ההגדרה של טווחים לכימות, הערכה של variabilities, פקדים איכות המבטיח תוקפו של הניסוי. נהלי אפשרי יכול להיות, לדוגמה, לחזור על כל נקודת קצה, למשל, וזמינותו cytotoxicity, במינימום של שלושה תורמים ביולוגיים (הרצפים בודדים) עם מינימום של שלושה טכני משכפל לפי המדגם כולל חיובי, הפניות שלילי. צוות המעבדה בקיצור כדי להגדיל את עקביות assay ולצמצם את השתנות וזמינותו.
נקודות קצה נעשה שימוש תכוף כדי להעריך את ההשפעות immunomodulatory של חומרים על רקמת הריאה כוללים cytotoxicity מדידות באמצעות מבחני שונות (למשל, LDH assay, וזמינותו WST-1, מיקרוסקופיים מכתים assay), שחרור ציטוקינים מבחני, באותה מידה כמו שינוי פרופיל ביטוי ואפיון של שינויים באוכלוסיות התאית על ידי שיטות immunohistopathological6. יתר על כן, קיימות טכניקות המתארת את הפריט החזותי של תאים, כמו ריאות תאים דנדריטים, מאתר PCLS28 ניתן להעביר גם PCLS אנושי, ובכך עשוי לספק מפורט יותר תובנות ההרכב הסלולר לפני, לאחר טיפול עם חומרים ציטוטוקסיות בשם.
זה פרוטוקול בסיסי טכניקה להכנה סעיפים רקמת הריאה האנושי הוא להשוות טכניקות שהיו שמתואר היטב פרסומים29. בקיצור, החומר איבר מתקבל מחולים הסובלים מסכן חיים מחלות כרוניות כגון סרטן ריאות, שיש להם לעבור ניתוח כריתה או השתלת. הלימודים תאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית. דרושה הסכמה בכתב מושכלת של המטופלים. הגדרת זרימת עבודה בין הקליניקה והמעבדה הוא נושא קריטי ודורש תקשורת, והגדרת ממשקים ותשתיות בין שני האתרים. אמבריולוגיה חומר יש להיות מעובד באופן ישיר לאחר כריתה כדי לשמר את יכולת הקיום של הרקמה. ראוי להזכיר כי יכול להיות מיושם בטכניקה המתוארת כאן עבור PCLS האנושי הריאות צעירים ומבוגרים כאחד, בריאים וחולים הריאות. בארצות הברית, למשל, זה אפשרי להשיג הריאות של תורמי איברים בריאים שמתו בתאונות או איזה איברים שנדחו על השתלת.
השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול הוא אינפלציה של דרכי הנשימה, parenchyma שמסביב עם פתרון agarose. שלב זה יש צורך לחזק את הרקמות מאוד עבור ההליך עם פרוסות עוקבות. איכות החומרים אמבריולוגיה, על רקע מחלה, הוא קריטי כאן. יכול להיות מלא רק אונות עם קרום הריאות תקין. גידולים בשלב הסופי סמפון לפעמים למנוע את תהליך מילוי. לפני ניפוח החומר האנושי, הטמפרטורה של הפתרון agarose יש להיבדק ביסודיות. דם רב מדי (או אחרים נוזלים, exudates) בתוך האדם רקמת הריאה תגרום לדילול רצויה agarose, ישפיע הדבר על תהליך הפילמור. לאחר האינפלציה של רקמת הריאה, ג’לי של agarose על הקרח, הריאות נחתכים למקטעים של 200 עד 300 עובי מיקרומטר. עקביות של הרקמה הוא נושא מאוד קריטי. אם הרקמה רכה מדי, עם פרוסות של חלקים שווים קשה. גם אם אותו מיקרוטום פרמטרים מוגדרים עבור כל תורם, עובי הפרוסות בין תורמים עשויות להשתנות, התנאים אמורים בודדים ושינויים במהלך ניפוח לעבד עבור כל ריאה. מילוי inhomogeneous של הרקמה יביא פרוסה שונים בעוביים. במקום מדידה אחידות בעובי של פרוסות, מדידה של תכולת החלבון הכולל ניתן לפקח באופן עקיף ריאות פרוסה עוביים. כמה מחלות סופנית והריאליות ולהקשות על תהליך חיתוך; למשל, הדם כלי הם מאד מעובה יתר לחץ דם ריאתי, רקמות שהותירה יכול להיות כל כך נוקשות חותך גלילי רקמה אפשרית כמעט וזה הלהב מיקרוטום צריך להחליף לעיתים קרובות.
לאחר הכנת האדם PCLS, אינטנסיבי שוטף צעדים, אשר נחוצים להסיר שאריות תאים, שוחררה אנזימים, רקמות מקטעים יכול לשמש עבור ניסויים29. PCLS האנושי תרבותי בתנאים התרבות תאים נורמליים, חשוף, לדוגמה, כימיקלים, תרופות או lipopolysaccharides. זיהום מזדמן של PCLS עקב זיהומים (לא ידוע) הוא עניין מיוחד בתרבות של חומר אמבריולוגיה. חייב להיות מושלך בתרביות רקמה מציג זיהומים, חייבים להיות נקיים ביסודיות הציוד. הפרדה מרחבית בין מקומות מעבדה המשמש להכנת מצד אחד culturing מצד עשוי לעזור כדי להימנע קרוס-זיהומים. לגבי הציוד, האזמל הקטן עלול לדלוף, ברגים hex רופף עלול להוביל נזק מנוע ולהפסיק תנועת להב. לא כל חלק בפורס עשוי פלדת אל-חלד, אז זה נישחק אם לא יבש מיד לשנות ניקוי. כדי להתגבר על בעיות ציוד, ייתכן צורך התקן גיבוי אחד לפחות.
בפרסומים קודמים, agarose יש כבר דיווחו על מנת להישטף והוציאו במהלך שטיפת צעדים לאחר הכנה אינטנסיבית. למעשה, הדבר אינו אפשרי, לא ניתן להסיר את agarose. הסרה מלאה של agarose, זה צריך להיות מומסת מחדש בטמפרטורות גבוהות, אשר יהרוס את הרקמה. Agarose alveoli ואת דרכי הנשימה אינה מפריעה הקצה המתואר. נקודות הקצה האחרות עלול להיות מושפע הנוכחות של agarose (ראה גם מגבלות). הצורך להכין את מקטעי רקמת טרייה יש להדגיש, כמו רקמות הכדאיות הוא נושא קריטי בתרבות. Bronchoconstriction הוא לא פרמטר חוקי עבור הכדאיות. מומלץ להשתמש לפחות שניים או שלושה מבחני cytotoxicity עצמאית לבדיקת הכדאיות של parenchyma שמסביב; יש להיבדק בכל ניסוי30. פקדים איכות במבחני cytotoxicity לשמש אינדיקטורים של רקמות לא מספיקות הכדאיות. לכן, מומלץ להעריך את יכולת התגובה של הרקמה, לדוגמה, לחומר רעיל יעיל כמו חומר ניקוי של כל מבחני cytotoxicity. בהתבסס על עקומות מנה-תגובה, ערכי המינימום והמקסימום של ספיגת צריכה להיות מוגדרת עבור מבחני cytotoxicity ופגשתי לניסויים הבאים. שינויים ותיקונים נוספים בפרוטוקול תלויים בעיקר כימיקלים יישומית ואת נקודות הקצה של ריבית. תחולתה של כימיקלים לא מסיסים או תגובתי מוגבל. הריכוז הגבוה ביותר של דימתיל סולפוקסיד ממס מוגבל ל- 1%. ריכוז גבוה יכול לשמש אך עלולה במהדורה בולטת של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כמו IL-8. מצד שני, הגירוי נעשה שימוש עשויה להיות חלשה יחסית. במקרה זה, ניתן להגדיל את כמות הרקמה בין 2 ל 4 פרוסות לכל טוב. גישה זו מגבילה את הכדאיות ל 24 שעות.
מגבלה עיקרית של PCLS האנושי הוא כך בגרמניה הם יכולים רק להיות מוכן מחומר אמבריולוגיה נגועים. חולים שעברו ניתוח בדרך כלל שגילם 50 שנה, 80% של חולים הסובלים מסרטן ריאות או נהג להיות מעשנים. התרופה של חולים, כגון glucocorticoids, יכול גם להשפיע על התוצאה של הניסויים באמצעות רקמה אנושית. לכן, זה הכרחי: i) לאמת את כל הניסוי על-ידי הפניות החיוביות אימות הכדאיות פונקציונליות, ורגישות של הרקמה בודדים, ולאמת ii) צלב-התוצאות תוך שימוש רקמת ריאה בריאה, שאינם נגועים, בגיל העמידה חיות מעבדה (פרימטים אנושיות כגון cynomolgus ו, במידת האפשר, עכבר, חולדה, קביה). טוב יותר את הציון פתולוגיה של רקמה חולה, יותר התוצאות ניסיוני. רקמות חולות בכבדות. בקושי יכול לשמש, לעתים קרובות הופעות מוגבל הכדאיות, רמות ציטוקינים כראוי נמוך או גבוה מאוד, חיידקי או פטרייתי דלקות bronchoconstriction פחות. וריאציה התורם-כדי-תורם גבוה יותר לעומת התוצאות המתקבל חיות מעבדה, המשקף ההשתנות בודדים של בני אדם. זו אינה, עם זאת, מגבלה באופן כללי; כפי שהוזכר לעיל, במדינות אחרות (למשל, ארה ב) ניתן להשיג בריאות של תורמי איברים המת נדחה על השתלת. ההיענות של הרקמה תואר טוב הראשון עד 48 שעות בניסויים חשיפה אקוטית. הכדאיות והפונקציונליות של הרקמה מופחתת לאחר ימים רבים של תרבות או לאחר אחסון ב- 80 ° c זה אפשרי רקמת הריאה האנושי תרבות עבור עד 14 ימים בערך. הכדאיות ממשיכה בתקופה זו; עם זאת, עלייה השתנות, כמו גם לאובדן פונקציונליות מספר אוכלוסיות תאים, כגון מקרופאגים, בתוך הרקמה הוא ציין, וכתוצאה מכך במהדורה מוגבלת ציטוקין בתגובה mitogens. מגבלה נוספת עבור נקודות קצה מסוימים היא הנוכחות של agarose בתוך הרקמה, הפרעה, לדוגמה, הבידוד של כמויות מספיקות ובאיכות גבוהה של רנ א31 או הכנת המתלים תא בודד עבור cytometry זרימה עוקבות, phenotyping של תאים. אפשרות לקבל תובנות מכניסטית תא בודד תגובות ופונקציונליות ובכך הוא מוגבל.
מודלים של רקמת Organotypic, כגון PCLS האנושי, נחשבים יש השפעה גבוהה על מחקר בסיסי וקליני הלא. אמבריולוגיה חומר יש קומפוזיציה ביולוגי המשקף היטב את הארכיטקטורה איבר נורמלי. הוא מכיל, לדוגמה, מגורים מכתשי ובסימפונות בתאי אפיתל תאי שריר חלק, fibroblasts, תאי אנדותל, סיבי עצב, מקרופאגים. הרקמה ברות ביצוע ולא התאים מגיבים לגירויים מספר. עצבים סיבים, למרות לחתוך, יכול להיות מקומי מופעל, המוביל אל מסוף תגובות רפלקס14. כתוצאה מכך, מודל זה שמחוץ מציעה את האפשרות ללמוד תגובות מערכת החיסון התאית מולדת, תגובות הגנה, ציטוקינים איתות, אינדוקציה של סמני פני שטח התא. מספר שיפורים בטכניקה culturing, אימות של נקודות קצה מאפשרים את השימוש PCLS אנושי במדע translational. דוגמאות של גישות עתידיות הן: i) אימות של חדש מטרות ברקמת אמבריולוגיה, ii) הערכה של תגובות חיסוניות לאחר החשיפה, לדוגמה, כימיקלים, תרופות, חלקיקים, וכדומה, iii) תוספת של רקמת הריאה עם תאים חיסוניים, כזה כמו לימפוציטים, iv) זיהוי ושינוי דפוסים מולקולרית, לדוגמה, לאחר חשיפה לרגישות בדרכי הנשימה, חומרים גרימת המחלה או חומרים פעילים עיכוב מסלולים; יתר על כן, v) שיפוץ דרכי הנשימה ו- vi) העצבית תקנה32. השדה ‘ מדעי ‘ מעוניינת הגישות הללו הווה ועתיד, יחד עם PCLS. בנוסף, ישנם מגוון של פיתוחים שונים שיעזרו לשפר את הטכניקה PCLS, כגון שימור הקפאה-20, ורקמות מתיחה33 לחקות את התנועה הטבעית של הרקמה במהלך הנשימה או מכני אוורור.
היתרון העיקרי של האדם PCLS לעומת שאר דגמי תלת-ממד הוא הנוכחות של תאים חיסוניים, סיבי עצב. ניתן גם לבצע ניסויים ב עכבר, חולדה, קופים, המהווים מיני בעלי חיים המשמשים עדיין לרוב וטוקסולוגיה. המורכבות של רקמת הריאה אנושי תומך את התרגום של תוצאות מן החיה האדם ומן במבחנה ויוו. בהקשר של מבחני אלטרנטיביים הקיימים לצורך זיהוי לרגישות בדרכי הנשימה, PCLS אנושיים מורכבים ביותר, ואינם מאפשרים תובנות תגובות תא בודד. ובכל זאת, מיקרוסקופיה וזרימה cytometry עשוי לתת מידע אודות תגובות הסלולר, אם סמן נכון הסלולר משמש בשילוב, לדוגמה, אפופטוזיס, נמק או סמני תאיים. ישנם מבחני שפורסמו אשר היה מאומת לדווח שימשו לצורך זיהוי לרגישות בדרכי הנשימה. עם זאת, ההתקדמות בשימוש של PCLS עם כל היתרונות שלהם על מבחני מתא בודד עושים תרומה משמעותית במובן כך שניתן להשתמש בטכניקה להקרנה תפוקה גבוהה, כפי שתואר על ידי ווטסון. ואח 34 הם פיתחו וזמינותו תפוקה גבוהה ההקרנה לחזות דרכי הנשימה רעילות PCLS מאתר נשמר-הקפאה. עם פורמט PCLS ולמחקר שלהם 96-ובכן, הם גילו המפרט דומה בנוזל שטיפה מאתר, שהופך PCLS assay ריאלי של תפוקה גבוהה.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות Lan Lauenstein על עבודתה מראש לגבי אסטרטגיות אלטרנטיביות בדיקה להערכת הסיכון עם PCLS האנושי. כמה המחקר נתמך על ידי מענק של הנציבות האירופית תוכנית המסגרתה 6 סנס-IT-IV “הרומן אסטרטגיות בדיקה להערכת במבחנה של אלרגנים”.
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm | A. Hartenstein (Leipzig, Germany) | SS04 | |
Syringe | Faust Lab Science (Klettgau, Germany) | 9.410 050 | |
Coring tools | custom-made | custom-made | |
Trimming Blade Handle (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205530001 | |
Trimming Blades (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205500000 | |
Microtome: Tissue Slicer | Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) | 303400-ADPT | Krumdieck Tissue Slicer (MD6000) |
Microtome blade | Wilkinson Sword (Solingen, Germany) | ENR-4027800011506 | |
Tissue culture dishes | Sigma (München, Germany) | Z666246-420EA | |
Cell strainer filter (100 µm Nylon) | Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) | BD352360 | |
Inoculation loop | Copan Diagnostics (Murrieta, USA) | CD176S01 | |
TPP Tissue culture plates 24wells | Sigma (München, Germany) | Z707791-126EA | |
Cassette | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 1000957 | |
Nunc MaxiSorp flat-bottom | Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) | 44-2404-21 | |
Nunc MicroWell 96-Well | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 260836 | |
Confocal Microscope | Zeiss (Jena, Germany) | Confocal LSM Meta 510 | |
Image rendering software | Bitplane AG (Zürich, Switzerland) | IMARIS 7.6 | |
LSM Image Browser | Zeiss (Jena, Germany) | ||
Multiwell-Reader | Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) | Tecan infinite F200Pro | Plate Reader |
Plate shaker | Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) | KM-2 Akku | |
BenchMark ULTRA | Ventana Medical Systems (Tucson, USA) | Automated IHC/ISH slide staining system | |
Assays | |||
Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche (Basel, Switzerland) | 11644807001 | |
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche (Basel, Switzerland) | 11644793001 | |
Microscopical vitality staining | Invitrogen (Carlsbad, USA) | L-3224 | LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit |
BCA Protein Assay | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 23225 | |
ELISA assay kit | R & D systems | various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) | DuoSet |
Reagents | |||
Agarose, low gelling temperature | Sigma (München, Germany) | A9414-100G | |
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) | Sigma (München, Germany) | E2888-500ML | |
Penicillin and streptomycin | Lonza (Verviers, Belgium) | 17-602E | |
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) | Gibco (Darmstadt, Germany) | 11039-047 | Culture medium |
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) | Lonza (Verviers, Belgium) | BE17-513F | Buffer solution |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma (München, Germany) | A9647-500G | |
Detergent | Sigma (Saint Louis, USA) | X100-100ML | Triton X-100 |
Washing buffer | Merck (Darmstadt Germany) | 524653 | 0.05% Tween 20 in PBS |