Summary
鉴于3Rs 原则, 呼吸道模型作为动物研究的替代品正在演变。特别是对于呼吸物质的风险评估, 缺乏适当的化验方法。在这里, 我们描述了使用人的精密切割肺切片评估机载物质。
Abstract
呼吸道疾病在其广泛的多样性需要适当的模型系统, 以了解的基础机制, 并使新疗法的发展。此外, 新物质的登记需要适当的风险评估和适当的测试系统, 以避免个人受到伤害的风险, 例如在工作环境中。这种风险评估通常是在动物研究中进行的。鉴于3Rs 原则和公众对动物实验的怀疑, 人类的替代方法, 如精密切割肺切片 (PCLS) 已经在进化。本文介绍了人体 PCLS 的体外技术, 研究了 hexachloroplatinate 铵 (HClPt) 等低分子量物质的免疫调节电位. 测量终点包括生存能力和局部呼吸道炎症, 其特征是细胞因子和趋化因子的分泌改变。在暴露于 HClPt 亚毒性浓度后, 人 PCLS 的促炎细胞因子、肿瘤坏死因子α (TNF α) 和白细胞介素1α (IL-1α) 显著增加。尽管 PCLS 技术在过去几十年里已经得到了极大的优化, 但它对免疫测试的适用性仍在发展之中。因此, 在这里提出的结果是初步的, 尽管它们显示了人类 PCLS 作为呼吸研究的宝贵工具的潜力。
Introduction
诸如过敏性哮喘、职业性哮喘、慢性阻塞性肺病 (COPD)、肺气肿和上、下呼吸道感染等呼吸系统疾病正在上升, 并代表着全球卫生负担1,2。除了开发和测试适当的物质外, 还需要适当的测试系统, 以便查明这些疾病所依据的一些基本机制。基础研究和临床前药物开发侧重于在体外或体内化验中获得的结果。然而, 这些化验有其局限性3。首先,体外检测利用被隔离和从相邻组织或器官中移除的人体细胞, 因而不再能够与其他细胞进行交互或受其他单元的保护3。其次, 由于生理学和生物化学上的差异4, 动物模型往往不能翻译为人类。为了最大限度地减少这些限制, 并在 3Rs (替换、细化、缩减) 原则5的上下文中, 新的替代模型将不断演变。
另一种人类3D 组织模型, 如 PCLS, 是基于人的体外和复杂动物体内模型之间的链接。PCLS 反映的功能异质性与所有相关细胞类型存在于呼吸道6。此外, PCLS 技术有优势, 可重复制备几个薄切片精确厚度从一个动物或人类组织捐赠者。这允许内部控制, 以及不同浓度或药物的测试。
自第一次引进琼脂填充的人肺切片在1994年由费舍尔et 等。7肺组织切片和培养技术已大为改善。基督教马丁et 等。改进了此技术, 用于进一步的化学和药理应用8。我们的小组在2007年被基督徒马丁介绍了这项技术。从那时起, PCLS 在研究中的应用从对功能响应的测试中扩展, 如气道9、10和血管收缩11、免疫学、药理12、13、和毒理学7测试在不同的物种在几个实验室。例如, Schlepütz et 。14研究了不同物种差异的气道反应, 并通过电场刺激 (EFS) 或小鼠、大鼠、豚鼠、绵羊、绒猴和人类的辣椒素来比较周围神经元活化。他们发现不同的物种有不同的神经介导的支气管收缩, 并得出结论, 通常使用的实验动物 (老鼠和老鼠) 并不总是反映人类的反应。为肺毒性试验和减少动物的数量在这种情况下, 赫斯et 等。15预验证的鼠 PCLS 作为吸入毒性研究的前体替代品。这一癌多中心预验证研究导致了两个预测模型的发展, 使用 PCLS, 有希望的结果。
此外, 在基础研究中, PCLS 已被用来阐明钙信号16, 早期过敏反应17, 病毒感染反应18,19。目前正在进行技术进展, 正在探讨进一步的进展。例如, 该领域正在通过冷冻组织的储存和再利用来增加人体组织的益处。Rosner et . 描述了一种冷冻和解冻小鼠 PCLS 的技术, 它保留了气道在刺激时的收缩能力: 因此, 该技术延长了有限的时间窗口, 在其中组织仍然可行, 从而进一步可以将检测时间应用到同一捐助者20。除了这些研究进展之外, Lauenstein et 。21最近调查了各种化学品的风险评估, 这些化学物质可能会成为人类 PCLS 职业性哮喘的潜在敏。
职业性哮喘, 其症状是气流阻塞和气道高反应性, 类似于过敏性哮喘, 是由接触高分子量 (蛋白) 22 或低分子量 (LMW)物质23(如在工作环境中的、铂化合物)。LMW 剂在形成分子半抗原和绑定到载体蛋白时具有很高的敏化电位21。新的高分子量或 LMW 化学物质的注册需要体外和体内风险评估, 关于它们所假定的敏化电位 (e., 经合组织准则 429)24。然而, 用于确定所假定的敏化电位的测试最初不是为呼吸敏的风险评估而设计的, 但对于接触敏来说, 尽管似乎有某种物质的一个小子集的一致性25.Lauenstein et . 的工作是作为欧洲联盟项目的一部分而设计的, 目的是制定可供选择的接触或肺敏21风险评估的替代测试策略。对于这个项目, 我们专注于测试人类 PCLS 的可用性作为一种替代测试工具。因此, 选择了一套免疫调节端点 (例如、生存能力和细胞因子分泌) 来确定化学物质的刺激性或炎症电位, 如 LMW 铂化合物。Lauenstein et . 没有发现可应用于所有呼吸道敏的一般模式;但是, 它们的工作为最近发布的协议26提供了基础。
总之, 在这里提出的准备和随后暴露的人类 PCLS 提供了一个有用的方法来评估潜在的肺毒性和/或免疫调节物质可能参与发展呼吸道疾病, 如职业性哮喘。
Protocol
人类 PCLS 的实验必须按照世界医学协会的道德准则进行, 并由地方伦理委员会批准 (这里所示的模范 PCLS 实验是由汉诺威地方伦理委员会批准的。医学院;2701-2015 号)。所有捐献者或其近亲都需要书面知情同意使用人肺材料。本手稿中所述的结果与不同年龄、性别、病史和切除原因的捐献者组织切片获得, 但大多数接受的组织来自肺癌患者。只有无肿瘤组织被用于实验。
1. 人类 PCLS 的一般准备和随后对化学品的接触
注: 两人需补肺。建议提供最新的 A 型肝炎和乙肝疫苗接种记录。患者在肺移植前例行筛查 HCV 和 HIV 病毒。如果诊断或怀疑患有结核分枝杆菌的活动感染, 应拒绝使用肺。然而, 所有新鲜的人肺组织和从它提取的样品必须被对待作为潜在传染性和相应的保护措施必须采取 (微粒过滤器面具 (FFP2), 防护眼镜, 手套) 保证职业安全员工。过程需要 60-90 分钟。
- 确认人肺叶的完整性。
注: 胸膜中的泪可防止组织的均匀充填。人肺材料必须从切除之日起。贮存期约2小时室温 (RT) 之前, 填补它与琼脂糖在冰上耐受。我们在这个协议中使用的组织是从接受切除手术的病人那里得到的。它不是从已故的病人。如果该组织已储存在冰上, 预先预热到 RT, 然后再填充, 否则琼脂糖将立即聚合, 没有均匀灌装将是可能的。
注意: 确保所有与当地人类材料接触的人都穿上防护服, 包括实验室大衣、两副手套、帽子、面罩和一副安全眼镜。人体材料具有潜在的传染性。 - 重7.5 克的低凝胶琼脂糖, 并添加到250毫升的双蒸馏水。在微波炉中煮沸琼脂糖, 直到琼脂糖溶解。冷却它到大约40°c, 取决于琼脂糖的熔化和胶凝点。
注: 需要几个烧瓶, 这取决于裂片的大小。 - 预热并保持培养基 (材料表) 在摄氏37摄氏度。
注: 如果琼脂糖太热, 培养基中的维生素会失去功效, 细胞会受损。如果培养基/琼脂糖溶液的温度低于37摄氏度, 胶凝过程将开始并损害肺的均匀充填。仅温度范围的37°c 到39°c 推荐。 - 在开始之前将所有必需的材料放置在所需的范围内: 5-10 夹子, 大约 1 m 长度的灵活的导管, 适当的注射器 (例如, 50 毫升) 适合与导管的连接, 并且一个装满冰的冰盒。
- Cannulate 气管/主支气管插入硅胶管并将其固定在平行于管的夹钳上, 使钳夹与硅胶管一起挤压组织, 而不将其捏紧。验证硅胶管是否固定在内, 在灌装过程中不能溜出。关闭所有其他支气管, 血管和损伤与夹子, 以便没有琼脂糖可能漏出在灌装过程中。
- 在烧杯中混合3% 低凝胶琼脂与培养基的等效体积。用50毫升的注射器将混合物注入肺部。在用培养基填充注射器之前, 钳夹用手指或钳封住导管, 以避免气泡和琼脂糖回流。把肺瓣填满, 直到它完全充气。小心地触摸侧面的肺部胸膜;胸膜应该是坚硬的。
注: 根据肺瓣的大小, 可要求2或3升琼脂糖/中等溶液。 - 重复步骤 1.5-1.6 为每个支气管的情况下, 几个支气管在一个单一的标本。
- 将肺放在冰上, 以凝胶的聚合为 20-40 分钟, 这取决于注入琼脂糖的数量。仔细接触几面的胸膜, 检查它是硬的还是凉的, 表明聚合是完整的, 否则继续等待。让病理学家将肺切成薄片, 取标本, 将肺材料储存在冰上进行运输。
- 用锋利的刀子将人肺组织切成 3-5 厘米的石板。
注: 使用新刀片, 每肺, 以确保锐度。 - 用400毫升冰冷的厄尔平衡盐溶液 (EBSS) 填充组织切片器。用一个半自动螺丝刀将圆柱形的组织芯从肺部板上切开, 用一个具有优选直径的取心工具 (例如, 8 毫米; 10 毫米)。
注: 此直径必须与机器内的组织支架直径相等。 - 将肺切片的厚度调整为所需的厚度值。
注: 在 PCLS 实验中通常使用大约250µm 的厚度。组织切片器的制造商推荐他们的组织切片厚度表来验证切片厚度。另外, 全装染色结合共焦显微术可用于确定切片厚度, 如 Brismar et . 所述。27 - 将组织芯转移到组织切片器的组织支架中。把重量 (部分的组织持有人) 放在组织核心的顶端。在组织切片器上设置臂速度和刀片速度为6。开始把组织核心切成 PCLS。
- 补充500毫升商用 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM): 营养混合物 F-12 DMEM/F12 (1:1) 与5毫升的青霉素 (1万单位/毫升) 和链霉素 (1万µg/毫升)。在冰箱的无菌条件下贮存培养基数天。预热只需要介质的体积。
注: 青霉素将被灭活, 如果保持在37摄氏度长的时间。使用无血清和无染料培养基, 因为血清成分的变化从批次到批次和染料, 如酚红色, 可以干扰化验。 - 用25毫升冰冷培养基填充培养皿 (100 x 15 毫米)。介质应从组织切片器中排出, 通过打开玻璃筒的夹钳进入烧杯。使用施药器 (例如, 接种回路) 将从烧杯中的切片转移到培养皿中。将培养皿放入孵化器 (37 °c, 5% CO2, 100% 湿度)。允许介质在洗涤步骤前预热。
注意: 所有进一步的步骤都是在无菌条件下进行的。 - 把一个细胞过滤器放进培养皿里洗 PCLS。通过细胞过滤器完全去除培养基与10毫升血清吸管, 并添加25毫升37°c 预热新鲜培养基。重复此步骤 3-4 次每30分钟。
注: 细胞过滤器防止切片被吸入吸管, 以避免对切片的任何损害。 - 将肺切片小心地转移到一个24井培养板中, 其中至少有500µL 培养基, 每条井两片。将肺组织暴露在物质上 (见步骤 3.1-3.4),例如, 24 h 在37摄氏度, 5% CO2。
注: 对于转移, 最好使用接种循环, 让切片漂浮到循环, 以防止组织损害。不需要进一步分离切片, 因为只有缺乏足够的新鲜培养基会诱发细胞死亡的组织切片。切片可以在井中互相重叠或相互接触: 这对组织的生存能力没有影响。 - 将所有剩余的人体材料放入一个带有固定剂的塑料瓶中 (例如, 10% 缓冲甲醛), 至少24小时, 并在处置过程中烧掉。
注意: 甲醛是有毒的, 在罩下执行此步骤。
2. PCLS 的组织学分析
- 用两个泡沫垫浸泡在固定体中 (e. g, 4% 缓冲甲醛) 制备活检盒。将 PCLS 放在活检盒中的泡沫垫之间, 并立即将组织转移到固定液中。用4% 缓冲的甲醛固定组织过夜。
- 在乙醇 (70%、90%、100%、100%、100%、100%) 中, 用脱水样品处理石蜡嵌入的组织, 然后分别在二甲苯 (1 x 3 h) 和液体石蜡 (1 x 3 h) 中洗涤, 按标准的病理组织学规程。
- 将 PCLS 转移到嵌入模具中。使用接种循环。在液体石蜡中嵌入 PCLS 组织。在铸造石蜡块时, 一定要把组织均匀地放在模具中。
- 用旋转切片切开含有 PCLS 的组织块, 直到它有平坦甚至表面。取所需厚度的串行部分 (e. g, 4 µm), 分别放置在连续编号的镀膜玻璃幻灯片上 (通常可采用 25-30 节), 直到整个 PCLS 处理完毕。
- 着色单玻片 (每 8-10 节) 与苏木精和红红染色 (H & E) 为取向。根据方向幻灯片为实验选择节 (第一个和最后8个部分通常不完整)。
注: (可选) 用于长时间贮存, 可将滑块浸在液体石蜡中以保存。
3. 制备物质溶液
注: 在使用前应立即准备工作解决方案和控制。
注意: 根据安全指示处理物质, 如果不知道, 可能有害, 并遵循常规安全预防措施。
- 直接在培养基中溶解水溶性物质。对于不溶性或不易溶解的化学物质, 首先根据物质溶解度将物质溶解于适当的溶剂中。水溶解度有限的物质 (< 0.1 毫克/毫升) 可以溶解, 例如, 在亚砜或乙醇。非毒性溶剂浓度应预先测定。在稀释成培养基时, 要确保物质不会沉淀出溶液。
注: HClPt 和 laureth 硫酸钠 (SLS) 溶液的制备。 - 在培养基或溶剂中所需最高浓度的100倍处制备物质库存溶液。重12.5 毫克 HClPt 和34.4 毫克 SLS, 并通过溶解化学物质在1毫升培养基中制备库存溶液。
注: 这些化学品不需要溶剂。 - 在预热培养基中准备最后稀释1:100。在使用溶剂之前, 这种方法会导致所有物质浓度的最终溶剂浓度相同。
- 使用最后的溶剂浓度 (如步骤3.3 所述的例如, 1%) 进行 PCLS 的参考治疗。结果部分提到的化学品不需要进行溶剂控制。
4. 细胞毒性测定的阳性和阴性参考文献
- 对于所有可行性化验, 准备以下积极和消极的控制:
- 组织控制: 培养培养基中的 PCLS 在细胞培养条件下仅为24小时未治疗 PCLS 的参考 (37 °c, 5% CO2, 100% 湿度)。
- 车控制 (如果需要): 孵化 PCLS 以最后的溶剂集中作为参考为 PCLS 仅处理与车 (参见步骤 3.4) 为 24 h 在细胞培养条件 (37 °c, 5% CO2, 100% 湿气)。
- 积极控制: 孵化 PCLS 与1% 洗涤剂在缓冲液1小时在4摄氏度。
注意: 如果 PCLS 变成无色, 组织就死了。l-乳酸脱氢酶 (LDH) 在上清液中测定, 吸收约 1.9-2.3 (见步骤 6.1-6.4)。该组织用于 WST-1 化验 (见步骤 5.1-5.5), 吸收约0。
5. WST-1 法测定人 PCLS 中化学诱导的细胞毒性
注: WST-1 试验是在24井板上进行的, 每井两 PCLS。最好对每个参数使用重复项, 并在测量后将这些重复项的结果汇集在一起。
- 在启动前立即稀释 WST-1 试剂, 准备工作溶液。所需的工作溶液量是一个24井板的250µL/井。因此, 混合25µL 的试剂与225µL 的培养基为一井。
- PCLS 从步骤1.16 孵化后, 丢弃或使用上清液进行细胞因子测量或其他试验, 如 LDH 测定。其余的组织用于下一步。
- 吸管250µL 的工作浓度的 WST-1 试剂每井和孵化板在37°c 和 5% CO2 1 h. 确保 PCLS 在孵化过程中完全由 WST-1 试剂覆盖。
- 将盘子放在一个轨道振动筛上 (200 rpm), 并在三十年代仔细摇动以确保 WST-1 试剂的彻底混合。取一个新的平底96井板和吸管100µL 在重复从每个井的24井板。
- 用微板块读取器测量每个井在 450 nm (参考: 630 nm) 的吸收。减去吸收在630毫微米从450毫微米。这些值将用于步骤5.6 中的计算)。
注: 只有在可行的组织中才能获得可靠的细胞毒性评估数据。因此, 这些验收标准由赫斯等。每个实验中都应满足15的需要。如果不符合这些标准, 则应重复试验。 - 对未经处理的培养基控制的吸收应在0.6 以上, 否则应重复试验。如果数据符合这一要求, 将组织控制的吸收值设置为 100%, 并计算与组织控制有关的治疗样品的 WST-1 减少。
6. 乳酸脱氢酶测定
注: 乳酸脱氢酶测定是在96井板中进行的, 在潜伏期后总共有100µL 培养上清液。
- 在 PCLS 或没有检测剂孵化后, 从步骤1.16 中取50µL, 并将其复制到新的96井板中。这将产生重复从每个处理好的24井板。
- 在化验前立即准备乳酸脱氢酶试剂的工作溶液。工作解决方案包括催化剂溶液 (lyophilisate 溶解在1毫升 bidistilled 水) 和染料溶液由制造商提供。对于一个96井板, 彻底混合125µL 的催化剂溶液与6.25 毫升的染料溶液。
注意: 不要将解决方案暴露在直接光线下。 - 吸管50µL 的工作解决方案, 在每个井已经包含了50µL 的上清和孵化的板块20分钟在 RT 在黑暗中。不需要进一步混合。
- 用微板块读取器测量每个井在 492 nm (参考: 630 nm) 的吸收。减去吸收在630毫微米从492毫微米。这些值将用于步骤6.5 中的计算。
注: 只有在可行的组织中才能获得可靠的细胞毒性评估数据。吸收洗涤剂处理的控制应超过1。 - 为分析, 将正控制的吸收值从步骤4.1 设置为 100%, 并计算与正控制 (即, 最大 LDH 释放) 有关的待处理样本中的 LDH 释放量。
7. 共聚焦激光扫描显微镜 (cLSM) 显微生存能力测定
注: 对于显微生存能力检测, 两个正常的 250-µm 厚 PCLS 染色250µL/井24井板。由于每个切片都是单独映像的, 因此不需要再重复。
- 在 PCLS 或无试验项目孵化后, 丢弃上清液或用于细胞因子测量或其他试验, 如 LDH 测定。请使用其余的组织来说明这里描述的过程。
- 准备 calcein 和溴 homodimer 1 (EthD-1) 的工作稀释, 并在培养基中使用4µM 的两种试剂的工作浓度。为此, 添加1µL 的 calcein (4 毫米) 和2µL EthD-1 (2 毫米) 到997µL 培养基。这卷是需要4井染色与两个 PCLS 每个。
注意: 避免接触到直接光的试剂。 - 吸管250µL 的工作稀释在每个井和孵化24井板45分钟在 RT 在黑暗中。在孵化过程中, 将盘子放在 150 rpm 的轨道振动筛上, 以确保组织更好地接触染色液。
- 45分钟后, 丢弃染色液, 用1毫升缓冲液清洗 PCLS, 并在黑暗中在 RT 上以 150 rpm 为 3-5 分钟进行抖动。重复此步骤两次。
- 将500µL 的缓冲液应用于含染色 PCLS 的每一井, 以避免培养基中的自体荧光。对于显微评估, 至少执行两个随机分布的 z 栈与 cLSM。
- 点击眼睛标签选择 10 x/0.3 目标, 并点击在线使用 cLSM 作为一个标准的光显微镜, 以找到 PCLS 的表面。单击 "脱机" 退出 "眼部" 设置。
- 点击采集标签, 打开合适的激光显影。
注: 我们使用了一个波长为 488 nm 的氩激光器, 用于聚阴离子染料 calcein (495 nm 的激发波长) 和 HeNe 激光器, 波长为 543 nm, 用于检测 EthD-1/DNA 复合体 (533 nm 的激发波长)。氩激光器一般应运行在最大电流的 30-50%, 使管电流的约 5.7 a, 因为这延长了激光寿命显着。 - 单击获取选项卡下的光路径, 并为实验设置必要的筛选器和镜像。
注: 在本研究中, 采用基于过滤器的系统与主分色光束分配器 (e. g, 高频 488/543) 分离激发和发射光。通过反射镜, 这盏灯被定向到二次分色分束器 (例如, 测试 545), 以进一步将从样品中发出的光分离成两个通道。 - 设置带通滤波器 (例如, bp 505-530 用于 calcein 信号和 bp 560-615 EthD-1/DNA 复杂信号), 仅传输一定范围的波长, 并将 calcein 信号分配给信道2和 EthD-1/DNA 复杂信号到通道3。
- 检查 Z 堆栈框, 以设置微观体积的上下限。按 "实时" 按钮可查看屏幕上相应图层的实时视图。向上或向下移动焦点以发现 PCLS 的表面带有尖锐的信号。
- 单击通道小节并选中全部显示框。按下现场图像下方相应通道的按钮, 并激活通道颜色, 锁定表。
注: 在现场图像中的蓝色将表明没有信号, 而高信号将出现在白色和过度曝光的信号将出现在红色。 - 将红色 EthD-1 通道的针孔设置为1通风单元, 以便在光收集和光学切片效率之间进行最佳权衡, 并相应调整 calcein 通道。增加检测到的增益信号, 使其在带有激活通道颜色锁定表的实时图像中显示为白色而不是红色。
注: 主增益不应超过600单位。 - 增加或减少数字偏移量, 以调整背景, 使其在带有激活通道颜色锁定表的实时图像中以蓝色显示。
- 在多维获取下单击 z 堆栈选项卡, 并使用焦点移到感兴趣的 z 层。按设置优先以保存此位置以供以后获取。将焦点缓慢地向上或向下移动, 直到达到30µm 的范围, 然后按设置最后保存。
- 再次单击实时以停用实时图像, 然后按开始实验开始成像。
注意: 聚阴离子染料 calcein 的荧光检测可存活组织。死细胞被 EthD-1 和核酸的复杂形成所歧视。
8. 图像渲染
注意: 图像渲染软件的计算机推荐必须考虑到, 因为这个程序需要适当的硬件。
- 加载从 PCLS 的微观生存能力染色获得的 LSM 文件 (参见7节) 到图像渲染软件中。在继续之前将其保存为. ims 文件。设置组织控件上的所有参数, 并将其应用于所有图像。不允许进行进一步的更改。
- 使用 "音量" 按钮进行有效组织的表面重建 (calcein 染色) (辅助图 1A) 和死细胞核的斑点按钮 (补充图 1H)。呈现一个通道时, 在 "显示调整" 窗口中关闭其他通道。
- 从渲染生命组织的体积开始: 设置曲面的通道, 处理整个图像, 将平滑因子设置为0.5 µm, 并使用绝对强度阈值 (辅助图 1B, C)。按蓝色正向箭头。
- 调整重建体积的绝对强度阈值;应减去噪声和背景强度。表面叠加显示为灰色, 应检查表面覆盖的准确性 (辅助图 1D)。完成调整后, 按蓝色正向箭头。大多数情况下, 此步骤是计算设置所必需的。如果软件不能计算体积, 增加平滑系数。
- 在最后一步中, 选择一个筛选器。使用球形过滤器 (约10µm) 进行表面渲染, 滤除肺泡空间中的巨噬细胞 (补充图 1E)。按绿色正向按钮。
- 光学上调整输出图像和导出统计信息作为. xls 文件。总容积 (总和) 将用于进一步分析 (补充图 1F, G)。保存设置并使用相同的 cLSM 设置 (辅助图 1I) 在同一天进行的所有 z 堆栈的进一步分析。
- 重建死细胞核的红色通道 (斑点)。在超越窗口中随机测量µm 缩放的点大小;网点大小约为5µm. 标记启用并设置点大小。检查是否所有点都被标记, 每个点只计算一次。如果需要, 请手动更正 (补充图1B、H、J)。按蓝色正向箭头。
- 按 "绿色前向" 按钮, 让程序根据设置的参数计算/计数总斑点数, 并将结果导出为. xls 文件 (补充图1K、L、M)。对于图像的图形或统计分析, 将计算出的死细胞核的数量与生命组织的体积比例进行了比较。
9. 人 PCLS 中细胞因子和趋化因子的测定
注: 细胞因子和趋化因子免疫应答可在培养时间后 extracellularly 在组织裂解物中的培养基上清和 intracellularly 中测定。ELISA 是以重复的96井板和100µL。
- 通过将5毫升洗涤剂与495毫升的缓冲液混合, 制备1% 洗涤剂溶液。该解决方案可以在 RT 中存储几个月。
- 将1% 洗涤剂溶液与蛋白酶抑制剂 (PI) 混合, 比例为1:500。所需数量取决于培养板;例如, 使用500µL/井的24井板。对于一个井, 混合1µL 的 PI 与499µL 洗涤剂溶液。
- 用1µL 的 PI 溶液制备管, 在这些试管中收集500µL 的培养上清液。立即更换24井板中的介质, 用500µL 洗涤剂溶液, 其中含有 PI, 如步骤9.2 所准备。溶解组织为 1 h 通过放置24井板在4°c。吸管的组织裂解在一个新的管和存储这些管在-80 °c, 直到进一步分析。
注: ELISA 协议高度依赖制造商和制造商的指示应遵循。下面介绍了标准 ELISA 协议。 - 根据制造商的指示, 执行 ELISA 测量上清或裂解液中的细胞因子水平。为了测量 IL-1α和 TNF α, a96-well 板吹打100µL 的捕获抗体 (稀释遵循制造商的指示) 和孵化过夜在 RT。
- 在1升 bidistilled 水中溶解洗涤缓冲片, 准备洗涤缓冲器。删除捕获抗体和吸管400µL 洗涤缓冲区到每个井。更换此卷三次。根据制造商的说明, 在缓冲区解决方案中添加阻塞解决方案 (例如, 1% BSA) 来阻止该板块。在 RT 中孵育1小时。
注: 标准商用 ELISAs 需要 2 x 100 µL 的组织上清或裂解。样品应解冻一次, 并在使用之前。根据检测的敏感性和释放的细胞因子, 样品必须在测量之前稀释。因此, 在化验所提供的试剂中稀释样品。 - 删除阻塞解决方案, 并添加稀释样品的标准曲线 (稀释遵循制造商的指示) 和100µL 组织上清或100µL 组织裂解在重复收集在步骤9.3。在 RT 中孵化2小时。
- 将样品和吸管400µL 洗涤缓冲器放入每个井中。更换此卷三次。吸管100µL 生物素化检测抗体 (稀释遵循制造商的指示) 和孵化2小时的 RT。
- 去除抗体和吸管400µL 洗涤缓冲器入每个井。更换此卷三次。添加100µL/井标记的链亲和素 (稀释遵循制造商的指示) 和孵化20分钟的 RT (检查制造商的指示)。
- 将链亲和素和吸管400µL 洗涤缓冲器放入每个井中。更换此卷三次。
- 添加100µL 的基体 (制造商推荐) 和孵化20分钟在黑暗中 (检查制造商的指示)。
注意: 此步骤是光敏的。避免对承印物和板材进行轻曝光。 - 通过添加50µL 停止解决方案 (1 M H2, 所以4) 停止反应。用微板块读取器测量每个井在 450 nm (参考: 570 nm) 的吸收。减去吸收在570毫微米从450毫微米。
注: 未经治疗和/或车辆组织控制作为阴性控制。为了诱发肺组织的免疫应答, 应使用适当的刺激 (例如, 100 的脂多糖 (LPS)) 作为阳性对照。在培养基中培养两个 PLCS 的两个井, 以100的脂多糖 (例如, 24 小时), 收集上清和组织裂解液, 如步骤9.3 所述。
注: 如果最高标准的吸收量等于或高于 1.0, 则接受实测结果;否则, 测量需要重复。标准曲线应遵循 sigmoidal 剂量-响应曲线拟合。 - 在步骤9.11 中, ELISA 测定的细胞因子浓度 (pg) 归一化成每样组织裂解物中测定的总蛋白质含量 (见10节)。
10. 人体 PCLS 中总蛋白含量的测定
注意: PCLS 需要裂解来测量总的蛋白质浓度。步骤9.3 中的组织裂解物用于此步骤。该检测是在一个扁平的96井板与25µL/井的组织裂解, pipetted 重复。
- 准备一个7点 bsa 标准, bsa 浓度为2000µg/毫升, 1500 µg/毫升, 1000 µg/毫升, 750 µg/毫升, 500 µg/毫升, 250 µg/毫升, 125 µg/毫升。对每个标准应用25µL, 并在96井板上使用25µL 缓冲液作为空白 (使用板盖板)。
- 吸管25µL 的裂解物 (参见步骤 9.3) 从每个井在重复入96井板材。总共需要50µL 的井。通过稀释1:50 中的能比试剂 a 的方法, 制备出工作试剂。对于96井板使用400µL 试剂 B 和2万µL 试剂 a。
- 仔细吸管200µL 的工作试剂, 以避免气泡。三十年代将盘子放在轨道振动筛 (150 rpm) 上, 以确保裂解物和工作试剂的适当混合, 并在盘子上盖上一板。在黑暗中孵化37摄氏度的盘子30分钟。使用微板块读取器测量每个井在 540-590 nm 上的吸收量。
注: 如果吸收最高的 BSA 标准等于或高于 0.8, 则接受测量结果;否则, 测量需要重复。标准曲线应遵循 sigmoidal 剂量-响应曲线拟合。 - 为了进行分析, 用4参数马夸特方程计算了空白后的标准曲线。使用标准曲线拟合计算未知样品的蛋白质浓度。
Representative Results
利用目前的研究方法, 制备了人体 PCLS, 并暴露在五种工业物质浓度下, 对人肺材料的化学诱导免疫调节作用进行了评估。肺组织暴露在水淹条件下, 为24小时的永久性培养, 通过测定乳酸脱氢酶、线粒体活性和显微活性染色来评估其毒性。此外, 测定了规范化和促炎性细胞因子的总蛋白含量。只要可能, 用非线性 sigmoidal 曲线拟合计算抑制浓度 (IC) 75 值。阳性参考物质, 细胞毒性的洗涤剂和 LPS 的先天细胞因子反应, 用于验证每一个运行。对数转化的 IC75 [µM] 值 (日志 IC50) 被用作 "刺激性" 浓度的后续细胞因子释放测量。
图 1和图 2显示了填充人体肺材料的过程和人体 PCLS 的模范 H & E 染色。必须遵循例行的卫生程序, 以避免对健康的不利影响, 确保处理人肺材料的工作人员的安全。该技术需要人员培训和实践。有经验的病理学家区分不同的区域 (上部/下部裂片和胸膜下对更中央) 和患病的与健康的区域是需要评估人肺材料的病理状态。所生成的人体 PCLS 应用于制备 H & E 染色薄切片, 可由病理学家重新评估。该程序帮助用户获得的做法, 以辨别不同的疾病地区和地点在肺部。
图 3显示了 PCLS 在使用 SLS 孵化24小时后, 人体内乳酸脱氢酶和 WST-1 活性的测量结果。不加 sls 的未经治疗的培养基控制, 显示在0µg/毫升 sls, 是一个重要的质量控制。与洗涤剂-裂解组织和 > 0.7 WST-1 测定的吸光度单位相比, LDH 的值应低于20%。这些质量控制也作为组织生存能力不足的指标。人体组织对洗涤剂溶液的反应, 作为一种有效的有毒物质, 必须包括在积极的控制中。与未经处理的组织和价值 < 0.1 吸光度单位相比, 乳酸脱氢酶 300-500% (> 2.0 吸光度单位) 的增加, WST-1 化验。SLS 导致了剂量依赖性降低细胞的生存能力, 通过增加乳酸脱氢酶和减少代谢活动的 WST-1 化验在浓度 > 87 µg/毫升。对数据进行了乙状结肠浓度响应模型的拟合, 从而可以计算 IC75 或 IC50 值。这些值随后可用于选择细胞因子和趋化因子水平的浓度: 在剧毒浓度, 通常没有或只减少细胞因子和趋化因子可以检测。因此, 建议使用无毒或仅轻微毒性浓度 (IC75)。必须指出的是, 在细胞培养上清液中 LDH 活性的预期增加通常受应用物质21的影响。频繁地, 干扰发生在物质和酵素活动之间, 如果 LDH 化验是使用的唯一的细胞毒性试验, 导致对结果的误解。因此, 进行几种细胞毒性检测, 获得可靠有效的结果是非常重要和必要的。此外, 应该提到, 乳酸脱氢酶和 WST-1 测定的敏感性是高度可比的。
在图 4中, PCLS 的显微生存性图像表明人体组织对洗涤剂的反应是一种有效的有毒物质。这些结果对于确认其他生存能力数据非常有用, 但这需要额外的设备。通过对 calcein 阳性组织与 EthD-1-positive 细胞核的评价, 可以直观地评估毒性效应。在实质中随机选择的片段通常导致可比数据, 而气管或血管应避免, 因为较大的腔可能会改变结果。根据我们的经验和上面描述的显微设置, 测量了控制组织的 1.5 x 106和 5 x 10 6 µm 3之间的平均音量。其价值取决于肺材料质量、PCLS 质量以及肺组织捐献者的疾病。尽管人肺组织的生存能力在捐献者中有所不同, 但与活组织相比, 死细胞核的数量不应超过组织控制的15%。然而, 如果死细胞核主要存在于组织控制中, 则应放弃实验。
图 5显示了 HClPt 和 SLS 对人肺组织免疫调节作用的代表性数据。促炎性细胞因子 IL-1α和 TNF α是炎症的标志物, 表明在接触刺激物质后炎症过程的开始。用 ELISA 法测定两种细胞因子。细胞外 IL-1α通常是低的人 PCLS, 而胞内 IL-1α达到 1000 pg/毫升和以上水平。细胞内 IL-1α的减少表明正在进行的细胞毒性过程, 而且大部分是在人类 PCLS 接触到化学物质之后观察到的。如果组织的刺激与 LPS, 一个活化剂的先天免疫系统, 并作为这样的积极治疗控制, 那么大多数诱导 IL-1α只能检测 intracellularly 后24小时。与此相反, LPS 刺激诱发的 TNF α分泌物主要可以测量 extracellularly。使用适当的积极控制, 如 LPS, 证明了方法的有效性。利用目前的研究方法, 人类 PCLS 暴露在三浓度的 HClPt (32, 64, 125 µg/毫升) 或两个浓度的 SLS (1 和10µg/毫升) 为 24 h. 细胞因子分泌被确定为细胞外和细胞因子的总和按照图 5中的描述对总蛋白质浓度进行规范化。在这里值得一提的是, 在蛋白质含量测定中一般都采用了综合体分析法, 但也反映了物质诱导的细胞毒性。因此, 在剧毒浓度下, 总蛋白含量不能用于细胞因子数据的规范化。IL-1α分泌量显著增加, 从 263 38 pg/毫克到 887 @ 216 pg/毫克和 TNF α从 263 @ 38 pg/毫克到 1160 @ 286 pg/毫克 (图 5A, B)。此外, 与静态组织控制相比, LPS 诱导的 IL-1α和 TNF α分泌物。由病原体相关的分子模式诱导炎症细胞因子, 如 LPS, 证明了方法的有效性, 并强烈建议使用时, 与人类 PCLS 研究免疫调节作用。有关 HClPt 和 SLS 数据的详细信息, 请参阅 Lauenstein et的研究。21
图 1: 填充人肺材料的过程.人肺在切除后立即准备好。肺应贮存在室温下, 以保持琼脂糖的一致充填, 避免在灌装过程中出现突然的琼脂糖聚合。肺位于水平位置, 裂片在主支气管或支气管 (A & B用于支气管特写) 上展开, 以获得最佳视图。支气管是空心的灵活的硅胶管和固定钳 (C)。在充填过程和琼脂糖聚合组织后, 训练有素的病理学家将肺部切成 3-5 厘米厚度的切片 (D)。从这些切片圆柱形的组织核心 (Ø例如, 8 毫米) 是用取心工具 (e) 准备的。这些组织核心被切开与组织切片器入 PCLS, 立刻被转移入培养基填充培养皿为孵化在正常细胞培养情况下 (E)。在几个洗涤的步以后 PCLS 转移入细胞培养板材 (例如, 24 井板材以二 PCLS 每井和500µL 媒介) 去除残余的细胞残骸和释放的细胞调解人 (F)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 用 H & E 染色法测定人体 PCLS 的健康状况.该图像中的 PCLS 是由一个由肺肿瘤的捐献者准备的, 它显示了完整的肺组织, 有肺泡实质, 周围气道 (**) 和血管 (箭头) 在概述 (a)。在更高的放大率, 传导呼吸道与完整的纤毛呼吸上皮 (箭头) (B), 一个完整的肺泡结构内衬有活力的 pneumocytes, 包括毛细血管与许多红细胞 (箭头) (C),肺泡腔内含有肺泡巨噬细胞 (CD68 免疫组化) (D), 以及具有完整内皮 (CD31 免疫组化) (E) 的血管可以观察到。只有无肿瘤组织被用于 PCLS, 这就是为什么没有宏观病变区域是可见的。与其他肺部疾病 (如肺气肿或纤维化) PCLS 准备的不同, 肺泡结构没有中断, PCLS 只在外侧有轻微的磨损, 很可能是由于准备步骤。缩放条形图分别指示1000µm (A) 和50µm (BE)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 测定 PCLS 中 SLS 的细胞毒性, 并以酶乳酸激酶的渗漏为培养基 (A), 并以染料 WST-1 (B) 评定代谢酶活性的损失.人类 PCLS 暴露在增加的 SLS 浓度。一个乙状结肠浓度反应模型随后被安装到数据, 因此 IC75 或 IC50 价值 (抑制浓度在25% 和50% 减少细胞生存能力) 可以被计算 (正确的数字)。数据显示为平均值, 即扫描电镜, n = 3-5。乳酸脱氢酶测定的吸光度测定为 492 nm (参考 630 nm) 和 WST-1 化验 450 nm (参考在 630 nm)。数据已从 Lauenstein et . 中进行了调整和修改。21请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 三维显微染色和人 PCLS 图像渲染的代表性图像.活体组织控制和组织对洗涤剂的反应, 作为一种有效的有毒物质, 显示后, 人 PCLS 与 calcein AM (黄色) 和 EthD-1 (红色) 染色。使用10X 目标 (a) 和呈现 (B) 的30µm 堆栈。刻度条指示100µm. 励磁波长488毫微米和543毫微米, 发射过滤器 BP 505-550 毫微米和 LP 560 毫微米。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: hexachloroplatinate 铵 (HClPt) 诱导的 IL-1α和 TNF-α分泌在人类 PCLS 后24小时暴露.PCLS 暴露在三浓度 (32 µg/毫升, 64 µg/毫升, 125 µg/毫升) HClPt 和两种不同浓度 (1 µg/毫升和10µg/毫升) 的 SLS。细胞外和胞内 IL-1α (A) 和 TNF α (B) 由 ELISA 和规范化的总蛋白含量决定。为了表明该方法的有效性, 本发明的阳性活化剂为细胞内 IL-1α (a) 和胞外 TNF α (B) 释放的一个参考, 对总蛋白含量进行规范化。数据显示为平均值, * SEM, *p < 0.05 和 ***p < 0.001;HClPt 和 SLS: n = 9, IL-1αlps: n = 5, TNF-αLPS: n = 4 在技术重复 (曼-惠特尼测试)。此数字已从 Lauenstein et . 中进行了修改。21请单击此处查看此图的较大版本.
补充图 1: 使用渲染软件对显微生存能力染色图像进行详细的计算处理.为 calcein 染色的可行组织 (A-G, I) 和斑点检测溴 homodimer 染色细胞核 (H,) 进行图像分析的分步操作过程J-M)。请单击此处查看此图的较大版本.
补充图 2: 人体肺组织显微生存能力染色的计算图像分析概述.可存活组织 (黄色) 通过表面渲染 (BI) 和检测到死细胞核 (红色) 进行了现场检测 (J-P)。快照模式用于导出图像 (Q)。请单击此处查看此图的较大版本.
Discussion
人类 PCLS 技术在实验室中得到了很好的确立。本文介绍了该技术及其在肺组织中药物毒性检测中的应用前体。一般情况下, 任何使用此技术的实验室都应寻求建立可量化范围、多变性估计以及保证实验有效性的质量控制的检测相关定义。例如, 可能的标准程序可能是重复每个端点,例如, 细胞毒性试验, 至少有三个生物捐助者 (个体运行), 每个样本至少有三个技术复制, 其中包括阳性和否定引用。应培训实验室人员以提高化验的一致性, 并尽量减少化验的变异性。
经常用于评估物质对肺组织免疫调节作用的端点包括使用不同化验方法的细胞毒性测量 (例如、LDH 测定法、WST-1 法、显微染色法)、细胞因子释放测定以及表达式的变化和细胞群变化的特征通过 immunohistopathological 方法6。此外, 还有一些技术描述细胞的可视化, 如肺树突状细胞, 在小鼠 PCLS28 , 也可以转移到人类 PCLS, 从而可以提供更详细的洞察细胞组成之前和经过治疗后, 假定细胞毒性物质。
这一基本协议和技术, 为人类肺组织切片的准备是可比的技术, 已在出版物中很好地描述29。简而言之, 器官材料是从患有生命威胁的慢性疾病如肺癌的患者获得的, 他们必须接受手术切除或移植。这些研究必须得到当地伦理委员会的批准。需要病人的书面同意。在临床和实验室之间建立工作流是一个关键问题, 需要沟通, 并定义两个站点之间的接口和基础结构。人肺材料必须在切除后直接处理, 以保持组织的生存能力。值得一提的是, 这里描述的人类 PCLS 技术可以应用于年轻和年老的肺部和健康和患病的肺部。例如, 在美国, 有可能从健康器官捐献者那里获得肺部, 他们死于事故或器官被拒绝移植。
该协议的第一个关键步骤是气道的膨胀和周围的实质与琼脂糖溶液。这一步是必要的, 以巩固非常柔软的组织为后续切片过程。基于疾病背景的人肺材料的质量在这里是至关重要的。只有有完整胸膜的裂片才能填满。支气管附近的终末期肿瘤有时会阻止充填过程。在膨化人体材料之前, 必须对琼脂糖溶液的温度进行彻底检查。人体肺组织内过多的血液 (或其他液体、分泌物) 会导致琼脂糖的稀释, 并会影响聚合过程。在肺组织膨胀和琼脂糖凝胶凝固后, 肺被切成200到300µm 厚度的部分。组织的一致性是一个非常关键的问题。如果组织太软, 切片相等的部分是困难的。即使为每个捐献者设置相同的切片参数, 由于每个肺的充气过程中的个别条件和变化, 捐赠者之间的切片厚度也可能有所不同。组织的非均匀充填会导致不同的切片厚度。而不是测量和标准化的切片厚度, 测量总蛋白含量可用于间接监测肺部切片厚度。几种终末期病害阻碍切片过程;例如, 肺动脉高压中血管极度加厚, 纤维化组织可能如此僵硬, 几乎不可能切片组织钢瓶, 切片刀片需要经常更换。
在准备人体 PCLS 和密集洗涤步骤, 这是必要的清除细胞碎片和释放酶, 组织切片可用于实验29。人类 PCLS 在正常细胞培养条件下培养, 例如, 暴露于化学药品、药物或脂多糖。PCLS 由于 (未知) 感染而偶尔受到的污染是人肺材料培养中的一个特殊问题。组织培养显示感染必须丢弃, 设备必须彻底消毒。一方面用于准备的实验室场所和培养的空间分离可能有助于避免交叉感染。对于设备, 切片可能泄漏, 松动的六角螺钉可能导致马达损坏和停止叶片运动。切片机的每一部分都不是用不锈钢制成的, 所以如果不干, 就会氧化, 立即改变清洁。为了克服设备问题, 可能需要至少有一个备份设备。
在以前的出版物中, 据报告琼脂糖在准备后的密集洗涤步骤中被洗掉并除去。事实上, 这是不可能的, 琼脂糖不能被删除。为了完全去除琼脂糖, 它需要在高温下重新熔化, 这将破坏组织。肺泡和呼吸道的琼脂糖不会干扰所描述的端点。其他端点可能会受到琼脂糖存在的影响 (也请参见限制)。需要强调的是, 要准备非常新鲜的组织切片, 因为组织的可行性是文化中的一个关键问题。支气管收缩不是有效的生存参数。我们建议至少使用三种独立的细胞毒性检测来检查周围的软组织是否可行;必须在每个实验30中检查此项。细胞毒性检测的质量控制是组织生存能力不足的指标。因此, 建议评估组织的反应性, 例如, 对一种有效的有毒物质, 例如所有细胞毒性化验中的洗涤剂。基于剂量-反应曲线, 需要定义最小和最大吸收值为细胞毒性化验, 并满足随后的实验。对议定书的进一步修改主要取决于应用的化学品和利益端点。不溶性或高活性化学品的适用性有限。甲基亚砜的最高溶剂浓度限制在1%。更高的浓度可以使用, 但可能导致明显释放的促炎性细胞因子, 如 IL-8。另一方面, 使用的刺激措施可能相对较弱。在这种情况下, 组织的数量可以增加四切片每井。这种方法限制了24小时的生存能力。
人类 PCLS 的一个主要限制是, 在德国, 它们只能从患病的人肺材料中制备。接受手术的病人通常是50岁以上, 80% 的患肺癌的病人是或曾经是吸烟者。药物的病人, 如糖皮质激素, 也可以影响实验结果, 使用人体组织。因此, 重要的是: i) 验证每个实验的积极参考验证的可行性, 功能性和敏感性的个别组织, 第二) 交叉验证结果使用健康, 非病, 中年肺组织从实验动物 (非人类灵长类, 如猕猴, 如有可能, 老鼠, 老鼠, 豚鼠)。病变组织病理评分越好, 实验结果越好。严重患病的组织几乎无法使用, 而且往往显示有限的生存能力, 低或极高的细胞因子水平, 细菌或真菌感染, 少支气管收缩。捐助者对捐助者的变化比实验动物获得的结果更高, 反映了人类个体的变异性。然而, 这不是一般的限制;如上所述, 在其他国家 (例如, 美国) 有可能获得健康肺从已故器官捐赠者拒绝为移植。在急性暴露实验中, 组织的反应性已被很好地描述为第一至48小时。组织的生存能力和功能在许多天的文化或贮藏后减少-80 摄氏度。可以将人类肺组织培养长达14天。在这段时间内继续生存下去;然而, 观察到组织中一些细胞数量的变化, 以及一些体细胞群的功能丧失, 导致细胞因子释放的 mitogens。对某些端点的另一个限制是在组织中存在琼脂糖, 妨碍例如, 分离高质量和足够数量的 RNA31或为随后的流式细胞术制备单细胞悬浮液和细胞的分型。因此, 有可能获得对单细胞反应和功能的机械洞察力是有限的。
脊髓组织模型, 如人类 PCLS, 被认为对基础和非临床研究有很大的影响。人肺材料具有生物学成分, 密切反映正常的器官结构。它包含, 例如, 居住的肺泡和支气管上皮细胞, 平滑肌细胞, 成纤维细胞, 内皮, 神经纤维和巨噬细胞。组织是可行的, 细胞对几种刺激反应。神经纤维, 虽然被切开, 可以局部激活, 导致终端反射反应14。因此, 此前体模型提供了研究细胞先天免疫应答、防御应答、细胞因子信号传递和细胞表面标记诱导的可能性。对端点的技术、培养和验证的一些改进使人类的 PCLS 在平移科学中得以应用。未来方法的例子有: i) 确认人体肺组织中的新靶点 (ii.) 对暴露后的免疫应答进行评估, 例如化学品、药物、纳米微粒、等, iii) 补充免疫细胞的肺组织, 如作为 T 淋巴细胞 iv.) 鉴定和修饰分子模式, 例如, 暴露于呼吸道敏、诱发疾病的物质或抑制通路的活性化合物后;此外, v) 气道重塑和 vi) 神经元调节32。科学领域对这些当前和未来的方法感兴趣与 PCLS。此外, 有各种不同的发展, 将有助于改善 PCLS 技术, 如冷冻保存20和组织伸展33 , 以模拟在呼吸或机械组织的自然运动通风。
与其他3D 模型相比, 人类 PCLS 的主要优势是免疫细胞和神经纤维的存在。实验也可以在老鼠, 老鼠, 和非人类灵长类动物, 这是仍然使用最经常在药理学和毒理学。人肺组织的复杂性支持从动物到人的结果的翻译和从体外到体内。在现有的用于鉴定呼吸道敏的替代化验中, 人类 PCLS 非常复杂, 不允许对单细胞反应进行深入的研究。然而, 显微镜和流式细胞术可能提供有关细胞反应的信息, 如果正确的细胞标记结合使用, 例如, 与凋亡, 坏死, 或细胞内标记。已公布的化验结果已证实, 并报告已用于鉴定呼吸道敏。然而, 使用 PCLS 的进展及其所有的优势超过单细胞化验, 是作出了宝贵的贡献, 在这个意义上, 该技术可以用于高通量筛选, 如沃森et 等. 所述。34他们开发了高通量筛选法来预测小鼠冷冻保存 PCLS 的气道毒性。由于其小型化的96井 PCLS 格式, 他们发现了类似的读数在小鼠灌洗液, 使 PCLS 一个可行的高通量检测。
Disclosures
作者没有什么可透露的。夫琅的项目是一个独立的公共非营利研究机构的应用研究, 执行合同研究代表生物技术, 制药, 化工, 和化妆品行业。该研究所的经费来自国家和国际公共项目。
Acknowledgments
我们要感谢兰 Lauenstein 为她的前期工作, 与其他测试策略的风险评估与人类 PCLS。其中一些研究得到欧洲委员会在 6th框架计划中的一笔赠款的支持, 这是对过敏原的体外评估的新的测试策略。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon hose 3.0 x 5.0 mm | A. Hartenstein (Leipzig, Germany) | SS04 | |
| Syringe | Faust Lab Science (Klettgau, Germany) | 9.410 050 | |
| Coring tools | custom-made | custom-made | |
| Trimming Blade Handle (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205530001 | |
| Trimming Blades (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205500000 | |
| Microtome: Tissue Slicer | Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) | 303400-ADPT | Krumdieck Tissue Slicer (MD6000) |
| Microtome blade | Wilkinson Sword (Solingen, Germany) | ENR-4027800011506 | |
| Tissue culture dishes | Sigma (München, Germany) | Z666246-420EA | |
| Cell strainer filter (100 µm Nylon) | Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) | BD352360 | |
| Inoculation loop | Copan Diagnostics (Murrieta, USA) | CD176S01 | |
| TPP Tissue culture plates 24wells | Sigma (München, Germany) | Z707791-126EA | |
| Cassette | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 1000957 | |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom | Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) | 44-2404-21 | |
| Nunc MicroWell 96-Well | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 260836 | |
| Confocal Microscope | Zeiss (Jena, Germany) | Confocal LSM Meta 510 | |
| Image rendering software | Bitplane AG (Zürich, Switzerland) | IMARIS 7.6 | |
| LSM Image Browser | Zeiss (Jena, Germany) | ||
| Multiwell-Reader | Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) | Tecan infinite F200Pro | Plate Reader |
| Plate shaker | Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) | KM-2 Akku | |
| BenchMark ULTRA | Ventana Medical Systems (Tucson, USA) | Automated IHC/ISH slide staining system | |
| Assays | |||
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche (Basel, Switzerland) | 11644807001 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche (Basel, Switzerland) | 11644793001 | |
| Microscopical vitality staining | Invitrogen (Carlsbad, USA) | L-3224 | LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit |
| BCA Protein Assay | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 23225 | |
| ELISA assay kit | R & D systems | various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) | DuoSet |
| Reagents | |||
| Agarose, low gelling temperature | Sigma (München, Germany) | A9414-100G | |
| Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) | Sigma (München, Germany) | E2888-500ML | |
| Penicillin and streptomycin | Lonza (Verviers, Belgium) | 17-602E | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) | Gibco (Darmstadt, Germany) | 11039-047 | Culture medium |
| Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) | Lonza (Verviers, Belgium) | BE17-513F | Buffer solution |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma (München, Germany) | A9647-500G | |
| Detergent | Sigma (Saint Louis, USA) | X100-100ML | Triton X-100 |
| Washing buffer | Merck (Darmstadt Germany) | 524653 | 0.05% Tween 20 in PBS |
References
- D'Amato, G., et al. Climate change, air pollution and extreme events leading to increasing prevalence of allergic respiratory diseases. Multidiscip Respir Med. 8 (1), 12 (2013).
- Pawankar, R., et al. State of world allergy report 2008: allergy and chronic respiratory diseases. World Allergy Organ J. 1 (6), Suppl 4-17 (2008).
- Hartung, T., Daston, G. Are in vitro tests suitable for regulatory use. Toxicol Sci. 111 (2), 233-237 (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460 (7252), 208-212 (2009).
- Balls, M., Straughan, D. W. The three Rs of Russell & Burch and the testing of biological products. Dev Biol Stand. 86, 11-18 (1996).
- Sewald, K., Braun, A. Assessment of immunotoxicity using precision-cut tissue slices. Xenobiotica. 43 (1), 84-97 (2013).
- Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Hum Exp Toxicol. 13 (7), 466-471 (1994).
- Ressmeyer, A. R., et al. Characterisation of guinea pig precision-cut lung slices: comparison with human tissues. Eur Respir J. 28 (3), 603-611 (2006).
- Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (10), 1219-1228 (2015).
- Koziol-White, C. J., et al. Inhibition of spleen tyrosine kinase attenuates IgE-mediated airway contraction and mediator release in human precision cut lung slices. British journal of pharmacology. 173 (21), 3080-3087 (2016).
- Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. J Vis Exp. (83), e50970 (2014).
- Lamb, D. J., et al. Bl 1002494, a Novel Potent and Selective Oral Spleen Tyrosine Kinase Inhibitor, Displays Differential Potency in Human Basophils and B Cells. J Pharmacol Exp Ther. 357 (3), 554-561 (2016).
- Leus, N. G., et al. HDAC 3-selective inhibitor RGFP966 demonstrates anti-inflammatory properties in RAW 264.7 macrophages and mouse precision-cut lung slices by attenuating NF-kappaB p65 transcriptional activity. Biochem Pharmacol. 108, 58-74 (2016).
- Schleputz, M., et al. Neurally mediated airway constriction in human and other species: a comparative study using precision-cut lung slices (PCLS). PLoS One. 7 (10), 47344 (2012).
- Hess, A., et al. Prevalidation of the ex-vivo model PCLS for prediction of respiratory toxicity. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 32, 347-361 (2016).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. Acetylcholine-induced calcium signaling and contraction of airway smooth muscle cells in lung slices. J Gen Physiol. 119 (2), 187-198 (2002).
- Wohlsen, A., et al. The early allergic response in small airways of human precision-cut lung slices. Eur Respir J. 21 (6), 1024-1032 (2003).
- Wu, W., et al. Innate immune response to H3N2 and H1N1 influenza virus infection in a human lung organ culture model. Virology. 396 (2), 178-188 (2010).
- Zmora, P., et al. Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS One. 12 (5), 0176597 (2017).
- Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (5), 876-881 (2014).
- Lauenstein, L., et al. Assessment of immunotoxicity induced by chemicals in human precision-cut lung slices (PCLS). Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 28 (4), 588-599 (2014).
- Wild, L. G., Lopez, M. Occupational asthma caused by high-molecular-weight substances. Immunol Allergy Clin North Am. 23 (2), 235-250 (2003).
- Di Stefano, F., et al. Occupational asthma due to low molecular weight agents. Int J Immunopathol Pharmacol. 17 (2), Suppl 77-82 (2004).
- Buonsante, V. A., Muilerman, H., Santos, T., Robinson, C., Tweedale, A. C. Risk assessment's insensitive toxicity testing may cause it to fail. Environ Res. 135, 139-147 (2014).
- Boverhof, D. R., et al. Respiratory sensitization and allergy: current research approaches and needs. Toxicol Appl Pharmacol. 226 (1), 1-13 (2008).
- Johansson, H., Albrekt, A. S., Borrebaeck, C. A., Lindstedt, M. The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 27 (3), 1163-1169 (2013).
- Brismar, H., Patwardhan, A., Jaremko, G., Nyengaard, J. Thickness estimation of fluorescent sections using a CSLM. Journal of Microscopy. 184 (2), 106-116 (1996).
- Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells. J Vis Exp. (122), (2017).
- Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 246 (3), 107-115 (2010).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Niehof, M., et al. RNA isolation from precision-cut lung slices (PCLS) from different species. BMC Res Notes. 10 (1), 121 (2017).
- De Proost, I., et al. Purinergic signaling in the pulmonary neuroepithelial body microenvironment unraveled by live cell imaging. FASEB J. 23 (4), 1153-1160 (2009).
- Davidovich, N., Chhour, P., Margulies, S. S. Uses of Remnant Human Lung Tissue for Mechanical Stretch Studies. Cell Mol Bioeng. 6 (2), 175-182 (2013).
- Watson, C. Y., et al. Screening for Chemical Toxicity Using Cryopreserved Precision Cut Lung Slices. Toxicol Sci. 150 (1), 225-233 (2016).
