Med tanke på 3R-principen utvecklas respiratorisk modeller som alternativ till djurförsök. Särskilt för riskbedömning av respiratoriska ämnen finns det en brist på lämpliga analyser. Här, beskriver vi användning av mänsklig precision-cut lung skivor för bedömningen av luftburna ämnen.
Sjukdomar i andningsorganen i sin bred mångfald behöver lämplig modellsystem att förstå bakomliggande mekanismer och möjliggöra utveckling av nya läkemedel. Registrering av nya ämnen kräver dessutom lämplig riskbedömning med tillräcklig testning system för att undvika risken för individer som skadas, till exempel i arbetsmiljön. Sådana riskbedömningar utförs vanligtvis i djurstudier. Med tanke på 3R-principen och allmänna skepsis mot djurförsök, har mänskliga alternativa metoder, såsom precision-cut lung skivor (avgiften), utvecklats. Detta dokument beskriver ex vivo tekniken av mänskliga avgiften att studera immunmodulerande potential av låg molekylär vikt ämnen, såsom ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Uppmätta slutpunkter inkluderar livskraft och lokala respiratorisk inflammation, märkt av förändrad utsöndring av cytokiner och chemokiner. Pro-inflammatoriska cytokiner, tumör nekros faktor alfa (TNF-α) och interleukin 1 alpha (IL-1α) ökade betydligt i mänskliga avgiften efter exponering för en sub toxisk koncentration av HClPt. Även om tekniken att avgiften har optimerats väsentligt under de senaste decennierna, är dess tillämplighet för testning av immunmodulering fortfarande under utveckling. Därför är de resultat som presenteras här preliminära, även om de visar potentialen för mänskliga avgiften som ett värdefullt verktyg i respiratorisk forskning.
Respiratoriska sjukdomar såsom allergisk astma, astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol), emfysem och infektioner i de övre och nedre luftvägarna är på uppgång och representerar en världsomspännande hälsa börda1,2. Lämplig testsystem krävs för att identifiera några av de grundläggande mekanismerna bakom dessa sjukdomar, förutom utveckling och testning av lämpliga ämnen. Såväl grundforskning som preklinisk läkemedelsutveckling är inriktade på resultat som uppnås i in vitro- eller in-vivo analyser. Dessa analyser, har dock sina begränsningar3. För det första, in vitro- analyser utnyttja mänskliga celler som var isolerade och bort från angränsande vävnad eller organ och är således inte längre kunna interagera med eller skyddas av andra celler3. För det andra är djurmodeller ofta inte översättningsbara till människor på grund av skillnader i fysiologi och biokemiska skillnader4. För att minimera dessa begränsningar och inom ramen för 3R (replacement, förfining, minskning) princip5, nya alternativa modeller utvecklas hela tiden.
Alternativa mänsklig 3D vävnad modeller, såsom avgiften, är en länk mellan mänskliga-baserade in vitro- och komplexa djur i vivo modeller. AVGIFTEN speglar den funktionella heterogeniteten med alla relevanta celltyper som finns i luftvägarna6. Dessutom har avgiften tekniken fördelen av reproducerbar förberedelse av flera tunna skivor av exakt tjocklek från en enstaka djurs eller människors vävnadsgivare. Detta gör en intern kontroll samt olika koncentrationer eller droger för att testas.
Sedan det första införandet av agar-fyllda mänskliga lung skivor 1994 av Fisher et al. 7 tekniken för skivning och odling av lungvävnad har förbättrats avsevärt. Christian Martin o.a. har förbättrat denna teknik för ytterligare kemiska och farmakologiska program8. Vår grupp introducerades till denna teknik av Christian Martin 2007. Sedan dess har breddats tillämpningen av avgiften i forskningen från testning av funktionella svaren, såsom luftvägarna9,10 och vasokonstriktion11, till immunologiska, farmakologiska12,13, och toxikologiska7 provning i olika arter i flera laboratorier. Exempelvis Schlepütz o.a. 14 undersökte luftvägarna Svaren för arter skillnader och jämfört perifera neuron aktivering av elektriskt fält stimulering (EFS) eller av kapsaicin hos möss, råttor, marsvin, fåren, silkesapor och människor. De Funna arterna ha distinkta men olika mönster av nerv-medierad bronkkonstriktion och drog slutsatsen att de vanliga försöksdjur (möss och råttor) inte alltid återspeglar den mänskliga reaktionen. För lungcancer toxicitetstestning och att minska antalet djur i detta sammanhang Hess o.a. 15 verifieras före råtta avgiften som ex vivo alternativ för inandning toxicitetsstudier. Denna multicentric Förvalidering studie resulterade i utvecklingen av två prediktionsmodeller med avgiften med lovande resultat.
Dessutom i grundforskning använts avgiften för att belysa calcium signalering16, tidiga allergiska reaktioner17och virusinfektion Svaren18,19. Tekniska utvecklingen pågår och ytterligare framsteg utforskas. Exempelvis ökar fältet nyttan av mänsklig vävnad med lagring och återanvändning av fryst vävnad. Rosner et al. beskrivs en teknik av frysning och upptining murina avgiften som bevarar möjligheten för luftvägarna att kontraktet vid stimulering: därför tekniken förlänger begränsade tidsramen inom vilken vävnader förbli livskraftig, och så vidare analyser kan appliceras över tid till samma givare20. Utöver dessa forskningsframsteg, Lauenstein o.a. 21 undersökte nyligen riskbedömning av olika kemikalier som kan fungera som potentiellt sensibiliserande för yrkesrelaterad astma i mänskliga avgiften.
Yrkesrelaterad astma, vars symtom är luftvägsobstruktion och luftvägarna hyperreaktivitet, liknande till allergisk astma, framkallas av exponering för hög molekylvikt (HMW)22 eller låg molekylär vikt (LMW) ämnen23 (t.ex. , platina föreningar) i arbetsmiljö. LMW agenter har en hög sensibilisering potentiella när bildar haptener och binda till transportören proteiner21. Registrering av nya HMW eller LMW kemikalier krävs in vitro och i vivo riskbedömning avseende deras förmodade sensibilisering potentiella (t.ex., OECD: S riktlinje 429)24. De tester som används för att bestämma den förmodade sensibilisering potentiella, men utformades ursprungligen inte för riskbedömning av luftvägarna sensibiliserande, men för kontakt sensibiliserande, även om det verkade finnas vissa kongruens för en liten delmängd av ämnen25 . Arbetet av Lauenstein et al. utformades som en del av projektet Europeiska unionen Sens-it-iv, att utveckla alternativa teststrategier för riskbedömning av förmodad kontakt eller lung Sensibilisatorer21. För detta projekt fokuserade vi på testning användbarheten av mänskliga avgiften som en alternativ testverktyg. En uppsättning immunmodulerande endpoints (t.ex., viabilitet och cytokin sekretion) valdes därför att bestämma den irriterande eller inflammatorisk potentialen av kemikalier, såsom LMW platina föreningar. Lauenstein et al. fann inga allmänna mönster som skulle kunna tillämpas på alla luftvägarna sensibiliserande; deras arbete gav dock grunden för nyligen publicerade protokoll26.
Sammanfattningsvis ger det protokoll som presenteras här för förberedelser och efterföljande exponering av mänskliga avgiften en bra metod för utvärdering av potentiellt lung-toxiska och/eller immunmodulerande ämnen som kan vara inblandade i utvecklingen av andningsorganen sjukdomar, såsom astma.
Den mänskliga avgiften-tekniken är väl etablerad i vårt laboratorium. Detta dokument ger en beskrivning av denna teknik och dess användning för toxicitetstester av ämnen i lunga vävnad ex vivo. I allmänhet med något laboratorium med hjälp av denna teknik bör sträva efter att ställa in ett test definition av kvantifierbara spänner, uppskattning av variabilitet och kvalitetskontroller garanterar giltigheten av experimentet. Möjliga standardförfaranden kan vara, till exempel att upprepa varje slutpunkt, t.ex., cytotoxicitet analysen, i minst tre biologiska givare (individuella körningar) med ett minimum av två till tre tekniska replikat per prov, inklusive positiva och negativa referenser. Laboratoriepersonal ska vara tränad att öka analysens konsekvens och minimera assay variabilitet.
Slutpunkter som ofta används för att bedöma immunmodulerande effekter av substanser på lungvävnad inkluderar cytotoxicitet mätningar med olika analyser (t.ex., LDH assay, WST-1 analys, mikroskopiska färgning assay), cytokinfrisättning analyser, såväl som förändringar i uttryck profil och karakterisering av förändringar i cellulära populationer av immunohistopathological metoder6. Dessutom finns det tekniker som beskriver visualisering av celler, såsom pulmonell dendritiska celler, i murina avgiften28 som kan också överföras till mänskliga avgiften och kan därmed ge mer detaljerad inblick i den cellulära sammansättningen före och efter behandling med förmodad cytotoxiska substanser.
Denna grundläggande protokoll och teknik för beredning av mänskliga lungan vävnadssnitt är jämförbar med tekniker som har varit väl beskrivet i publikationer29. Kort sagt, erhålls orgel materialet från patienter som lider av live-hotande kroniska sjukdomar såsom lungcancer, som måste genomgå kirurgi för resektion eller transplantation. Studierna måste godkännas av den lokala etiska kommittén. Patientens informerade samtycke krävs. Ställa in ett arbetsflöde mellan klinik och laboratorium är en kritisk fråga och kräver kommunikation och definitionen av gränssnitt och infrastruktur mellan båda platserna. Mänskliga lungan material måste behandlas direkt efter resektion att bevara livskraften i vävnaden. Det är värt att nämna att den teknik som beskrivs här för mänskliga avgiften kan användas till både unga och gamla lungor och friska och sjuka lungor. I USA, till exempel är det möjligt att få lungorna från friska organdonatorer som dött i olyckor eller vars organ har förkastats för transplantation.
Ett första viktigt steg i protokollet är inflationen av luftvägarna och omgivande parenkymet med agarosgelelektrofores lösning. Detta steg är nödvändigt att stelna mycket mjukdelar för efterföljande skivning förfarandet. Kvaliteten på mänskliga lungan material, baserat på sjukdom bakgrund, är avgörande här. Endast lober med intakt lungsäcken kan fyllas. Slutstadiet tumörer nära luftrör hindra ibland påfyllningen. Innan blåsa mänskligt material, har temperaturen av agaros lösningen kontrolleras noggrant. För mycket blod (eller andra vätskor, exudat) inuti människan lungvävnad oönskad utspädning av agaros och kommer att påverka de polymerisation processen. Efter inflation av lungvävnad och gelbildande av agaros på is, är lungorna skuren i sektioner med 200 till 300 µm tjocklek. Konsekvens av vävnad är en mycket viktig fråga. Om vävnaden är för mjuk, är skivning av lika delar svårt. Även om samma mikrotomen parametrar ställs in för varje givare, tjockleken på skivorna mellan givarna kan variera, på grund av enskilda villkor och förändringar under den blåsa bearbeta för varje lunga. Inhomogena fyllning av vävnaden kommer att resultera i olika segment tjocklekar. Istället för mätning och standardisera tjockleken på skivor, kan mätning av totala proteinhalten användas för att indirekt övervaka lung segment tjocklekar. Flera slutstadiet sjukdomar hindra skivning processen; t.ex.blod fartyg är extremt förtjockad i pulmonell hypertension och fibrotisk vävnad kan vara så stel att skivning av vävnad cylindrar är knappast möjligt och mikrotomen bladet behöver bytas ofta.
Efter beredning av mänskliga avgiften och intensiv tvättning steg, som är nödvändigt att ta bort cellfragment och släppt enzymer, vävnad sektioner kan användas för experiment29. Mänskliga avgiften är odlade under normal cell kultur förhållanden och utsatta, exempelvis kemikalier, läkemedel eller lipopolysackarider. Tillfällig kontamination av avgiften på grund av (okänd) infektioner är ett specialnummer i kultur av mänskliga lungan material. Vävnadskulturer som visar infektioner måste kasseras och utrustningen desinficeras grundligt. Rumsliga avskiljandet mellan laboratorium platser används för beredning å ena och odling kan däremot bidra till att undvika cross-infektioner. Mikrotomen kan läcka när det gäller utrustningen, och lös hex skruvarna kan leda till motoriska skador och stopp av bladets rörelse. Inte varje del av utsnittet är gjord av rostfritt stål och så det oxiderar om inte torkas omedelbart ändra rengöring. För att övervinna utrustning problem, kan det vara nödvändigt att ha minst en backup-enhet.
I tidigare publikationer, har agaros rapporterat att tvättas och tas bort under intensiv tvättning steg efter beredning. I själva verket är detta inte möjligt, Agarens kan inte tas bort. För fullständig borttagning Agarens måste det vara åter smält vid höga temperaturer, vilket skulle förstöra vävnaden. Agarens i alveolerna och luftvägarna stör inte beskrivs slutpunkterna. Andra effektmått kan påverkas av närvaron av agaros (se även begränsningar). Behovet av att förbereda mycket fräsch vävnadssnitt har betonas, eftersom vävnad bärkraft är en kritisk fråga i kultur. Bronkokonstriktion är inte en giltig parameter för livskraft. Vi rekommenderar att du använder minst två eller tre oberoende cytotoxicitet analyser för att kontrollera livskraft omgivande parenkymet; Detta måste kontrolleras i varje experiment30. Kvalitetskontroller i cytotoxicitet analyser fungera som indikatorer på otillräcklig vävnaden livskraft. Därför är det rekommenderat att bedöma lyhördheten av vävnad, till exempel i en effektiv giftigt ämne såsom ett rengöringsmedel i alla cytotoxicitet analyser. Baserat på dos-responskurvor, lägsta och högsta värden av absorption måste definieras för cytotoxicitet analyser och träffades för efterföljande experiment. Ytterligare ändringar av protokollet beror främst på de tillämpa kemikalierna och ändpunkterna av intresse. Tillämpligheten av olöslig eller mycket reaktiva kemikalier är begränsad. Den högsta lösningsmedel koncentrationen för DMSO är begränsad till 1%. Högre koncentrationer kan användas men kan leda till uttalad frisättning av proinflammatoriska cytokiner, såsom IL-8. Däremot, kan den stimulans som används vara relativt svag. I detta fall kan mängden vävnad ökas från två till fyra skivor per brunn. Detta synsätt begränsar livskraft till 24 h.
En stor begränsning av mänskliga avgiften är att i Tyskland de kan endast framställas från sjuka människors lung material. Patienter som opereras är normalt äldre än 50 år och 80% av patienter som lider av lungcancer är eller brukade vara rökare. Medicinering av patienter, såsom glukokortikoider, kan också påverka resultatet av experiment med mänsklig vävnad. Därför är det viktigt att: (i) validera varje experiment av positiva referenser att kontrollera livskraft, funktionalitet och känsligheten hos de enskilda vävnaden, och ii) kors-validera resultaten med friska, icke-sjuka, medelålders lungvävnad från försöksdjur (icke-mänskliga primater såsom cynomolgus och, om möjligt, mus, råtta, marsvin). Ju bättre de patologi poängen av sjuka vävnad, desto bättre de experimentella resultaten. Kraftigt sjuk vävnad kan knappast användas och mycket ofta visar begränsad bärkraft, cytokin som otillräckligt låga eller mycket höga nivåer, bakterie-eller svampinfektioner och mindre bronkokonstriktion. Givare-till-givare variation är högre jämfört med resultat från försöksdjur, återspeglar den individuella variationen av människor. Detta är dock inte en begränsning i allmänhet. som nämnts ovan, i andra länder (t.ex., USA) är det möjligt att få friska lungor från avlidna organdonatorer Förkastat för transplantation. Lyhördhet av vävnad har beskrivits väl för första upp till 48 h i akut exponering experiment. Livskraft och funktionalitet av vävnad reduceras efter många dagar av kultur eller efter lagring vid-80 ° C. Det är möjligt att kultur mänsklig lungvävnad för upp till ca 14 dagar. Lönsamheten fortsätter under denna tid; dock observeras en ökad variabilitet, samt en förlust av funktioner av flera cellpopulationer, såsom makrofager, i vävnaden, vilket leder till begränsad cytokinfrisättning svar på mitogena substanser. En annan begränsning för vissa endpoints är förekomsten av agaros i vävnaden, hinder, till exempel isolering av hög kvalitet och tillräckliga mängder RNA31 eller utarbetandet av encelliga suspensioner för efterföljande flödescytometri och fenotypning av celler. Möjligheten att få mekanistiska insikter i enskild cell svaren och funktionalitet är således begränsad.
Organotypic vävnad modeller, såsom mänskliga avgiften, anses ha en hög inverkan på grundläggande och icke-klinisk forskning. Mänsklig lunga material har en biologisk sammansättning som nära återspeglar den normala orgel-arkitekturen. Det innehåller exempelvis bostäder alveolära och bronkial epitelceller, glatta muskelceller, fibroblaster, endotelceller, nervtrådar och makrofager. Vävnaden är livskraftig och celler svarar på flera stimuli. Nervskada fibrer, även om skär, kan aktiveras lokalt, vilket leder till terminal reflex svar14. Följaktligen, ex vivo modellen erbjuder möjligheten att studera cellulära medfödda immunsvar, försvar svaren, cytokin signalering och induktion av cell yta markörer. Flera förbättringar i teknik, odling och validering av slutpunkter tillåta användning av mänskliga avgiften i translationell forskning. Exempel på framtida strategier är: i) validering av nya mål i mänsklig lungvävnad, ii) bedömning av immunsvar efter exponering, exempelvis kemikalier, läkemedel, nanopartiklar, etc., iii) tillskott av lungvävnad med immunceller, sådana som T-lymfocyter, iv) identifiering och ändring av molekylära mönster, till exempel efter exponering för luftvägarna sensibiliserande, sjukdomsframkallande ämnen eller aktiva föreningar att hämma utbildningsvägar. Dessutom v) luftvägarna remodeling och vi) neuronala förordning32. Det vetenskapliga fältet är intresserad dessa nuvarande och framtida strategier med avgiften. Dessutom finns det en mängd olika utvecklingar som hjälper till att förbättra den avgiften tekniken, såsom cryo-bevarande20och vävnad stretching33 för att efterlikna den naturliga rörelsen av vävnad under andning eller mekaniska ventilation.
Den stora fördelen med mänskliga avgiften jämfört med andra 3D-modeller är förekomsten av immunceller och nervfibrer. Experiment kan också utföras i mus, råtta och icke-mänskliga primater, som är de djurarter som fortfarande används oftast i farmakologi och toxikologi. Komplexiteten i mänsklig lungvävnad stöder översättning av resultat från djur till människa och från in vitro- in vivo. Inom ramen för befintliga alternativa analyser för identifiering av luftvägarna sensibiliserande, mänskliga avgiften är mycket komplexa och Tillåt inte insikter i enskild cell svaren. Ännu, mikroskopi och flöde flödescytometri kan ge information om cellulära svar, om just cellulära markören används i kombination, till exempel med apoptos, nekros eller intracellulära markörer. Det finns publicerade analyser som har validerats och rapporteras till har använts för identifiering av luftvägarna sensibiliserande. Dock gör framsteg inom användning av avgiften med alla sina fördelar över enskild cell analyser ett värdefullt bidrag i den meningen att tekniken kan användas för high-throughput screening, som beskrivs av Watson et al. 34 de utvecklat en high-throughput screening test för att förutsäga luftvägarna toxicitet i murina cryo-bevarade avgiften. Med deras miniatyriserade 96 brunnar avgiften format upptäckt de liknande utläsningar i murina lavage vätska, att göra avgiften en genomförbar hög genomströmning-analysen.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Lan Lauenstein för hennes före arbete angående alternativa teststrategier för riskbedömning med mänskliga avgiften. Några av forskningen stöddes av ett bidrag från Europeiska kommissionen inom det 6: e ramprogrammet SENS-IT-IV ”roman testning strategier för In Vitro -bedömning av allergener”.
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm | A. Hartenstein (Leipzig, Germany) | SS04 | |
Syringe | Faust Lab Science (Klettgau, Germany) | 9.410 050 | |
Coring tools | custom-made | custom-made | |
Trimming Blade Handle (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205530001 | |
Trimming Blades (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205500000 | |
Microtome: Tissue Slicer | Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) | 303400-ADPT | Krumdieck Tissue Slicer (MD6000) |
Microtome blade | Wilkinson Sword (Solingen, Germany) | ENR-4027800011506 | |
Tissue culture dishes | Sigma (München, Germany) | Z666246-420EA | |
Cell strainer filter (100 µm Nylon) | Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) | BD352360 | |
Inoculation loop | Copan Diagnostics (Murrieta, USA) | CD176S01 | |
TPP Tissue culture plates 24wells | Sigma (München, Germany) | Z707791-126EA | |
Cassette | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 1000957 | |
Nunc MaxiSorp flat-bottom | Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) | 44-2404-21 | |
Nunc MicroWell 96-Well | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 260836 | |
Confocal Microscope | Zeiss (Jena, Germany) | Confocal LSM Meta 510 | |
Image rendering software | Bitplane AG (Zürich, Switzerland) | IMARIS 7.6 | |
LSM Image Browser | Zeiss (Jena, Germany) | ||
Multiwell-Reader | Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) | Tecan infinite F200Pro | Plate Reader |
Plate shaker | Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) | KM-2 Akku | |
BenchMark ULTRA | Ventana Medical Systems (Tucson, USA) | Automated IHC/ISH slide staining system | |
Assays | |||
Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche (Basel, Switzerland) | 11644807001 | |
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche (Basel, Switzerland) | 11644793001 | |
Microscopical vitality staining | Invitrogen (Carlsbad, USA) | L-3224 | LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit |
BCA Protein Assay | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 23225 | |
ELISA assay kit | R & D systems | various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) | DuoSet |
Reagents | |||
Agarose, low gelling temperature | Sigma (München, Germany) | A9414-100G | |
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) | Sigma (München, Germany) | E2888-500ML | |
Penicillin and streptomycin | Lonza (Verviers, Belgium) | 17-602E | |
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) | Gibco (Darmstadt, Germany) | 11039-047 | Culture medium |
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) | Lonza (Verviers, Belgium) | BE17-513F | Buffer solution |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma (München, Germany) | A9647-500G | |
Detergent | Sigma (Saint Louis, USA) | X100-100ML | Triton X-100 |
Washing buffer | Merck (Darmstadt Germany) | 524653 | 0.05% Tween 20 in PBS |