Met het oog op het 3V-principe, respiratoire modellen als alternatieven voor dierproeven evolueren. Met name voor risico-evaluatie van respiratoire stoffen is er een gebrek aan adequate tests. Hier beschrijven we het gebruik van menselijke precisie-cut Long segmenten voor de beoordeling van airborne stoffen.
Aandoeningen van de luchtwegen in hun brede verscheidenheid moeten passende modelsystemen om te begrijpen van de onderliggende mechanismen en ontwikkeling van nieuwe therapeutics. Bovendien, vereist registratie van nieuwe stoffen adequate risico-evaluatie met adequate testen systemen om het risico van natuurlijke personen worden geschaad, bijvoorbeeld in het arbeidsmilieu te bevorderen. Deze risicobeoordelingen worden meestal uitgevoerd in dierstudies. Met het oog op het 3V-principe en de openbare scepsis tegen dierproeven, hebben menselijke alternatieve methoden, zoals precisie-cut Long segmenten (Thuiskopieerheffingen), zich ontwikkeld. De huidige paper beschrijft de ex vivo -techniek van menselijke Thuiskopieerheffingen te bestuderen van het potentieel van de immunomodulerende van laag-moleculair-gewicht stoffen, zoals ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Gemeten eindpunten zijn levensvatbaarheid en lokale respiratoire ontsteking, gekenmerkt door veranderde afscheiding van cytokines en chemokines. Pro-inflammatoire cytokines, tumor necrose factor alpha (TNF-α) en interleukine 1 alpha (IL-1α) werden aanzienlijk verhoogd in menselijke Thuiskopieerheffingen na blootstelling aan een sub giftige concentratie van HClPt. Hoewel de techniek van Thuiskopieerheffingen is in de afgelopen decennia aanzienlijk geoptimaliseerd, is de toepasbaarheid ervan voor het testen van immunomodulatie nog in ontwikkeling. Daarom zijn de resultaten die hier gepresenteerd voorronde, hoewel ze het potentieel van menselijke Thuiskopieerheffingen als een waardevol instrument in respiratoir onderzoek weergeven.
Respiratoire aandoeningen zoals allergisch astma, beroepsastma, chronische obstructieve longziekte (COPD), emfyseem en infecties van de bovenste en onderste luchtwegen zijn over de opkomst en vertegenwoordigen een wereldwijde gezondheid last1,2. Geschikte testsystemen zijn nodig, om enkele van de fundamentele mechanismen die ten grondslag liggen aan deze ziekten, naast de ontwikkeling en het testen van geschikte stoffen identificeren. Fundamenteel onderzoek evenals preklinische Geneesmiddelenontwikkeling zijn gericht op resultaten die opgedaan in in vitro of in vivo tests. Deze tests, hebben echter hun beperkingen3. Ten eerste, in vitro testen gebruik maken van menselijke cellen die zijn geïsoleerd en verwijderd uit de aangrenzende weefsels of organen en zijn dus niet langer kunnen communiceren met of door andere cellen3worden beschermd. Ten tweede, dierlijke modellen zijn vaak niet worden vertaald voor de mens als gevolg van verschillen in fysiologie en biochemische verschillen4. Oog op het minimaliseren van deze beperkingen, en in het kader van de 3V (vervanging, verfijning, vermindering) principe5, nieuwe alternatieve modellen zijn voortdurend in ontwikkeling.
Alternatieve menselijk weefsel van 3D modellen, zoals Thuiskopieerheffingen, zijn een link tussen mens-gebaseerde in vitro en complexe dieren in vivo modellen. Thuiskopieerheffingen weerspiegelen de functionele heterogeniteit met alle relevante celtypes aanwezig in de luchtwegen6. Bovendien, heeft de Thuiskopieerheffingen techniek het voordeel van reproduceerbare voorbereiding van enkele dunne plakjes van exacte dikte van een enkele menselijke of dierlijke weefsel donor. Dit kan een interne controle evenals verschillende concentraties of drugs om te worden getest.
Sinds de eerste introductie van menselijke longen agar gevulde segmenten in 1994 door Fisher et al. 7 de techniek voor het snijden en het kweken van longweefsel heeft aanzienlijk verbeterd. Christian Martin et al. Deze techniek voor verdere chemische en farmacologische toepassingen8verbeterd. Onze fractie was ingevoerd om deze techniek door Christian Martin in 2007. Sindsdien, is de toepassing van Thuiskopieerheffingen in onderzoek van testen van functionele reacties, zoals airway9,10 en vasoconstrictie11, op immunologische, farmacologische12,13, uitgebreid en toxicologische7 testen in verschillende soorten in verschillende laboratoria. Bijvoorbeeld, Schlepütz et al. 14 airway Responsie voor soorten verschillen onderzocht en vergeleken perifere neuron activering elektrisch veld stimulatie (EFS) of door capsaïcine in muizen, ratten, cavia’s, schapen, zijdeaapjes en mens. Ze vond de verschillende soorten hebben verschillende maar verschillende patronen van zenuw-gemedieerde bronchoconstrictie en concludeerde dat de gebruikte proefdieren (muizen en ratten) niet altijd met de menselijke reactie overeen komen. Voor het testen van de toxiciteit van de Long en aan het verminderen van het aantal dieren in dit verband, Hess et al. rat Thuiskopieerheffingen 15 vooraf gevalideerd als ex vivo alternatief voor onderzoek naar toxiciteit bij inademing. Deze multicentrische pre valideringsonderzoek geresulteerd in de ontwikkeling van twee voorspellingsmodellen Thuiskopieerheffingen met veelbelovende resultaten.
Bovendien, bij het basisonderzoek, Thuiskopieerheffingen zijn gebruikt ophelderen van calcium signalering16, vroege allergische reacties17en18,19van de reacties van de virale infectie. Technische vooruitgang is een voortdurend en verdere vooruitgang worden onderzocht. Het veld bijvoorbeeld toeneemt het voordeel van menselijk weefsel met de opslag en het hergebruik van bevroren weefsel. Rosner et al. beschreef een techniek van bevriezen en ontdooien lymfkliertest Thuiskopieerheffingen die het vermogen van de luchtwegen bewaart te contracteren op stimulatie: dus de techniek verlengt het venster van de beperkte tijd waarbinnen weefsels levensvatbare, en zo verder blijven testen kunnen na verloop van tijd worden toegepast op de dezelfde donor20. Naast deze onderzoek vooruitgang, Lauenstein et al. 21 onderzocht onlangs risicobeoordeling van verschillende chemische stoffen die als potentiële sensibilisatoren voor beroepsastma in menselijke Thuiskopieerheffingen fungeren kunnen.
Beroepsastma, waarvan symptomen luchtstroom obstructie en luchtwegen hyperresponsiveness, vergelijkbaar met allergisch astma zijn, wordt veroorzaakt door blootstelling aan hoog-moleculair-gewicht (HMW)22 of laag-moleculair-gewicht (LMW) stoffen23 (bv , platina verbindingen) in de omgeving van de werkplek. LMW agenten een potentiële hoge overgevoeligheid bij het vormen van haptens en binden aan vervoerder eiwitten21. Registratie van nieuwe HMW of LMW chemicaliën vereist in vitro en in vivo risico-evaluatie met betrekking tot hun vermeende sensibilisatie potentiële (bv., OESO-richtsnoer 429)24. De tests gebruikt om te bepalen van de vermeende sensibilisatie potentiële, echter waren oorspronkelijk niet bedoeld voor risicobeoordeling van respiratoire allergenen, maar voor contact sensibilisatoren, hoewel er leek te zijn sommige congruentie voor een kleine ondergroep van stoffen25 . Het werk van Lauenstein et al. werd ontworpen als onderdeel van het project van de Europese Unie Sens-it-iv, voor de ontwikkeling van alternatieve testmethoden voor risico-evaluatie van vermeende contactpersoon of Long sensibilisatoren21. Voor dit project zijn we gericht op het testen van de bruikbaarheid van menselijke Thuiskopieerheffingen als een alternatieve testen hulpmiddel. Daarom werd een aantal immunomodulerende eindpunten (bijvoorbeeld, de levensvatbaarheid en cytokine secretie) geselecteerd voor het bepalen van de irriterende of inflammatoire potentieel van chemicaliën, zoals LMW platina verbindingen. Lauenstein et al. vond geen algemene patroon dat kan worden toegepast op alle respiratoire allergenen; hun werk evenwel de Stichting voor de onlangs gepubliceerde protocollen26.
Kortom voorziet het protocol gepresenteerd hier voor voorbereiding en latere blootstelling van menselijke Thuiskopieerheffingen een nuttige methode evaluatie van potentieel Long-toxisch en/of immunomodulerende stoffen die kunnen worden betrokken bij de ontwikkeling van respiratoire ziekten, zoals beroepsastma.
De menselijke Thuiskopieerheffingen techniek is goed ingeburgerd in ons laboratorium. Het huidige artikel geeft een beschrijving van deze techniek en het gebruik ervan voor toxiciteitstests voor stoffen in het Long weefsel ex vivo. In het algemeen, gerelateerde een laboratorium met behulp van die deze techniek streven moet naar het instellen van een bepaling definitie van de kwantificeerbare bereiken, schatting van de variabiliteiten en kwaliteitscontroles garanderen de geldigheid van het experiment. Mogelijke standaard procedures zou kunnen worden, bijvoorbeeld, te herhalen van elk eindpunt, bijvoorbeeldde bepaling van de cytotoxiciteit, in een minimum van drie biologische donoren (individuele sessies) met een minimum van twee tot drie technische duplo’s per monster inclusief positieve en negatieve verwijzingen. Laboratoriumpersoneel moeten worden opgeleid om assay samenhang en minimaliseren assay variabiliteit.
Eindpunten vaak gebruikt ter beoordeling van de immunomodulerende effecten van stoffen op longweefsel omvatten cytotoxiciteit metingen met behulp van verschillende tests (bv, LDH assay, WST-1 assay, microscopische kleuring assay), cytokine versie testen, zo goed als wijzigingen in expressie profiel en karakterisering van veranderingen van cellulaire populaties door immunohistopathological methoden6. Verder zijn er technieken beschrijven de visualisatie van de cellen, zoals pulmonaire dendritische cellen, in lymfkliertest Thuiskopieerheffingen28 die ook kunnen worden overgedragen aan menselijke Thuiskopieerheffingen en kan dus meer gedetailleerde inzicht geven in de cellulaire samenstelling vóór en na behandeling met vermeende cytotoxische stoffen.
Deze basisprotocol en techniek voor bereiding van menselijke longen weefselsecties is vergelijkbaar met technieken die goed beschreven in publicaties29zijn geweest. Kortom, wordt het orgel materiaal verkregen van patiënten met chronische ziekten zoals longkanker, live-bedreigende die operatie voor resectie of transplantatie ondergaan. De studies moeten worden goedgekeurd door de lokale ethische commissie. Patiënten geïnformeerde schriftelijke toestemming is vereist. Opzetten van een workflow tussen kliniek en laboratorium is een kritieke kwestie en vereist communicatie, en de definitie van interfaces en infrastructuur tussen beide sites. Menselijke longen materiaal moet direct na resectie voor het behoud van de levensvatbaarheid van het weefsel worden verwerkt. Het is vermeldenswaard dat de hier beschreven voor menselijke Thuiskopieerheffingen techniek kan worden toegepast, zowel jonge als oude longen en longen van gezonde en zieke. In de VS, bijvoorbeeld, is het mogelijk te krijgen van de longen van gezonde orgaandonoren die stierf in ongelukken of wier organen voor transplantatie hebben verworpen.
De eerste kritieke stap in het protocol is inflatie van de luchtwegen en de omringende parenchym met agarose oplossing. Deze stap is noodzakelijk om te stollen het zeer zacht weefsel voor de vervolgprocedure snijden. De kwaliteit van menselijke longen materiaal, gebaseerd op de achtergrond van de ziekte, is hier essentieel. Alleen lobben met intact borstvlies kunnen worden ingevuld. Einde-fase tumoren in de buurt van de bronchiën is soms voorkomen dat de vulling-proces. Voor het oppompen van het menselijk materiaal, moet de temperatuur van de agarose oplossing grondig gecontroleerd worden. Teveel bloed (of andere vloeistoffen, exsudaat) binnen de menselijke longweefsel zal resulteren in ongewenste verdunning van agarose en beïnvloedt de polymerisatie-proces. Longen zijn na inflatie van het longweefsel en geleermiddelen van agarose op ijs, snijd in secties van 200 tot 300 µm dikte. Samenhang van het weefsel is een zeer kritieke kwestie. Als het weefsel te zacht is, is het moeilijk om snijden van gelijke secties. Zelfs als het dezelfde microtoom parameters worden ingesteld voor elke donor, de dikte van de plakjes tussen donoren kan variëren, moeten afzonderlijke voorwaarden wijzigingen tijdens het opblazen proces en voor elke Long. Inhomogene vullen van het weefsel zal resulteren in verschillende segment diktes. In plaats van meten en standaardisering van de dikte van de plakjes, kan meting van het totale eiwitgehalte worden gebruikt voor niet indirect controle Long segment diktes. Diverse eind-fase ziekten belemmeren de segmenteringshulplijnen proces; bijvoorbeeld, kunnen bloed vaartuigen zijn uiterst verdikt in pulmonale hypertensie en fibrotische weefsel zo stijf dat snijden van weefsel cilinders nauwelijks mogelijk is en de microtoom blade moet vaak worden vervangen.
Na de voorbereiding van menselijke Thuiskopieerheffingen en intensief wassen stappen, die nodig zijn om te verwijderen cel puin en vrijgegeven enzymen, weefsel secties kunnen worden gebruikt voor experimenten29. Menselijke Thuiskopieerheffingen zijn gekweekt onder normale cel kweekomstandigheden en blootgesteld, bijvoorbeeld aan chemische stoffen, drugs of lipopolysacchariden. Incidentele verontreiniging van Thuiskopieerheffingen als gevolg van de (onbekende) infecties is een themanummer in de cultuur van de menselijke longen materiaal. Weefselcultures tonen infecties moeten worden weggegooid en de apparatuur moet grondig worden ontsmet. Ruimtelijke scheiding tussen laboratorium plaatsen gebruikt voor bereiding aan de ene kant en kweken kan aan de andere kant bijdragen tot het vermijden van cross-infecties. Met betrekking tot de apparatuur, de microtoom kan gaan lekken en losse hex schroeven kunnen leiden tot motor schade en stop van blade beweging. Niet elk deel van de slicer is gemaakt van roestvrij staal, en zo zal het oxideren als niet gedroogd onmiddellijk veranderen schoonmaken. Om te overwinnen problemen met apparatuur, het mogelijk moet ten minste één back-upapparaat.
In eerdere publicaties, is agarose gemeld te worden uitgewassen en tijdens intensieve wassen stappen na bereiding verwijderd. In feite, dit is niet mogelijk, de agarose kan niet worden verwijderd. Voor volledige verwijdering van het agarose moet het opnieuw gesmolten bij hoge temperaturen, die zou het vernietigen van het weefsel. De agarose in longblaasjes en airways interfereert niet met de beschreven eindpunten. Andere eindpunten kunnen worden beïnvloed door de aanwezigheid van agarose (Zie ook beperkingen). De noodzaak om te bereiden zeer verse weefselsecties dient benadrukt te worden, zoals weefsel levensvatbaarheid een kritieke kwestie in cultuur is. Bronchoconstrictie is geen geldige parameter voor leefbaarheid. We raden ten minste twee of drie onafhankelijke cytotoxiciteit testen om te controleren van de levensvatbaarheid van de omringende parenchym; Dit moet worden gecontroleerd in elke experiment30. Kwaliteitscontroles in cytotoxiciteit testen dienen als indicatoren van ontoereikend weefsel levensvatbaarheid. Daarom is het aangeraden om te beoordelen van het reactievermogen van het weefsel, bijvoorbeeld om een effectieve giftige stof zoals een detergent in alle tests van de cytotoxiciteit. Gebaseerd op de dosis / respons-curven, minimale en maximale waarden van absorptie moeten worden gedefinieerd voor het testen van de cytotoxiciteit en voldaan voor latere experimenten. Verdere wijzigingen in het protocol is meestal afhankelijk van de toegepaste chemische stoffen en de eindpunten van belang. De toepasselijkheid van onoplosbare of zeer reactieve chemicaliën is beperkt. De hoogste concentratie oplosmiddel DMSO is beperkt tot 1%. Hogere concentraties kunnen worden gebruikt, maar kunnen leiden tot uitgesproken versie van pro-ontsteking cytokinen, zoals IL-8. Aan de andere kant, misschien de stimulus gebruikt wel relatief zwak. In dit geval, kan de hoeveelheid weefsel worden verhoogd van twee naar vier sneetjes per putje. Deze aanpak beperkt de levensvatbaarheid tot 24 h.
Een belangrijke beperking van menselijke Thuiskopieerheffingen is dat in Duitsland zij kunnen alleen bereid worden uit zieke menselijke longen materiaal. Patiënten die operatie ondergaan zijn meestal ouder dan 50 jaar en 80% van de patiënten die lijden aan longkanker of gebruikt als rokers. Medicatie van patiënten, zoals glucocorticoïden, kan ook invloed op de resultaten van experimenten met behulp van menselijk weefsel. Het is daarom essentieel om: i) elk experiment te valideren door positieve referenties verifiëren van levensvatbaarheid, functionaliteit en gevoeligheid van de individuele weefsel en ii) kruis-valideren de resultaten met behulp van gezonde, niet-zieke, middelbare leeftijd longweefsel uit proefdieren (niet-menselijke primaten zoals cynomolgus en, indien mogelijk, muis, rat, cavia). Hoe beter de score voor pathologie van het zieke weefsel, des te beter de experimentele resultaten. Zwaar zieke weefsel kan nauwelijks worden gebruikt en heel vaak blijkt beperkte levensvatbaarheid, onvoldoende lage of zeer hoge cytokine niveaus, bacteriële of schimmel infecties en minder bronchoconstrictie. Donor-naar-donor variatie is hoger in vergelijking met de resultaten van de proefdieren, als gevolg van de individuele variabiliteit van de mens. Dit is echter niet een beperking in het algemeen; zoals hierboven vermeld, in andere landen (bijvoorbeeldde VS) is het mogelijk om te verkrijgen van gezonde longen van overleden orgaandonoren verworpen voor transplantatie. Reactievermogen van het weefsel is goed beschreven voor de eerste tot 48u in acute blootstelling experimenten. Levensvatbaarheid en de functionaliteit van het weefsel is verminderd na vele dagen van cultuur of na de opslag in-80 ° C. Het is mogelijk om cultuur menselijke longweefsel voor tot ongeveer 14 dagen. Levensvatbaarheid blijft gedurende deze tijd; echter, een toename van de variabiliteit, evenals een verlies van functionaliteit van verschillende cel populaties, zoals macrofagen, in het weefsel wordt waargenomen, wat resulteert in beperkte cytokine release in reactie op mitogenen. Een andere beperking voor aantal eindpunten is de aanwezigheid van agarose in het weefsel, belemmeren, bijvoorbeeld, de isolatie van hoge kwaliteit en toereikende hoeveelheden RNA31 of de voorbereiding van eencellige schorsingen voor latere stroom cytometry en fenotypering van cellen. De mogelijkheid om inzichten te krijgen mechanistische in eencellige reacties en functionaliteit is dus beperkt.
Organotypic weefsel modellen, zoals menselijke Thuiskopieerheffingen, worden beschouwd als een hoge impact hebben op fundamenteel en niet-klinische onderzoek. Menselijke longen materiaal heeft een biologische samenstelling die aansluit bij de normale orgel-architectuur. Het bevat, bijvoorbeeld, residentiële alveolaire en bronchiale epitheliale cellen, zachte spiercellen, fibroblasten, endotheliale cellen, zenuwvezels en macrofagen. Het weefsel is levensvatbaar en cellen reageren op verschillende stimuli. Zenuwen van vezels, hoewel knippen, lokaal kan worden geactiveerd, wat leidt tot terminal reflex reacties14. Bijgevolg biedt dit model ex vivo de mogelijkheid te bestuderen van cellulaire aangeboren immuunresponsen, defensie reacties, cytokine signalering en inductie van oppervlakte markeringen in een cel. Enkele verbeteringen in de techniek, kweken en validatie van eindpunten staan het gebruik van menselijke Thuiskopieerheffingen in translationeel wetenschap. Voorbeelden van toekomstige benaderingen zijn: i) validering van nieuwe doelstellingen in menselijke longweefsel, ii) beoordeling van immuunresponsen na blootstelling, bijvoorbeeld aan chemische stoffen, drugs, nanodeeltjes, enz., iii) suppletie van longweefsel met immune cellen, dergelijke Als T-lymfocyten, iv) identificatie en wijziging van moleculaire patronen, bijvoorbeeld, na blootstelling aan respiratoire allergenen, ziekte-inducerende stoffen of actieve verbindingen remming van trajecten; Bovendien, v) het remodelleren van de luchtwegen en vi) neuronale verordening32. Het wetenschappelijke veld is geïnteresseerd in deze huidige en toekomstige benaderingen met Thuiskopieerheffingen. Daarnaast zijn er een verscheidenheid van verschillende ontwikkelingen die helpen zullen om de Thuiskopieerheffingen techniek, zoals cryo-behoud20en weefsel dat zich uitstrekt van33 om na te bootsen de natuurlijke beweging van het weefsel tijdens de ademhaling of mechanische ventilatie.
Het grote voordeel van menselijke Thuiskopieerheffingen vergeleken met andere 3D-modellen is de aanwezigheid van immuuncellen en zenuwvezels. Experimenten kunnen ook worden uitgevoerd in de muis, rat en niet-menselijke primaten, die de diersoorten die nog vaak in de farmacologie en toxicologie gebruikt worden. De complexiteit van menselijke longweefsel ondersteunt de vertaling van de resultaten van dier naar mens en van de in vitro in vivo. In het kader van bestaande alternatieve tests voor de identificatie van respiratoire allergenen, menselijke Thuiskopieerheffingen zijn zeer complex en inzicht in één cel reacties niet toestaan. Nog, misschien microscopie en stroom cytometry geven informatie over cellulaire reacties, als de rechts cellulaire markering wordt gebruikt in combinatie, bijvoorbeeld met apoptosis, necrose of intracellulaire markeringen. Er zijn gepubliceerde testen die zijn gevalideerd en gemeld te zijn gebruikt voor de identificatie van respiratoire allergenen. Echter, de vooruitgang in het gebruik van Thuiskopieerheffingen met alle hun voordelen ten opzichte van eencellige testen zijn levert een waardevolle bijdrage in die zin dat de techniek kan worden gebruikt voor high-throughput screening, zoals beschreven door Watson et al. 34 ontwikkelden ze een high-throughput screening test te voorspellen airway toxiciteit in lymfkliertest cryo-bewaard Thuiskopieerheffingen. Met hun verkleinde 96-Wells Thuiskopieerheffingen formaat ontdekt ze soortgelijke uitlezingen in lymfkliertest lavage vloeistof, maken van Thuiskopieerheffingen een haalbaar high-throughput assay.
The authors have nothing to disclose.
Wij wil Lan Lauenstein bedanken voor haar pre werk met betrekking tot alternatieve testmethoden voor risico-evaluatie met menselijke Thuiskopieerheffingen. Een deel van het onderzoek werd gesteund door een subsidie van de Europese Commissie binnen de 6th kader programma SENS-IT-IV “Roman testen strategieën voor In Vitro beoordeling van allergenen”.
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm | A. Hartenstein (Leipzig, Germany) | SS04 | |
Syringe | Faust Lab Science (Klettgau, Germany) | 9.410 050 | |
Coring tools | custom-made | custom-made | |
Trimming Blade Handle (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205530001 | |
Trimming Blades (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205500000 | |
Microtome: Tissue Slicer | Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) | 303400-ADPT | Krumdieck Tissue Slicer (MD6000) |
Microtome blade | Wilkinson Sword (Solingen, Germany) | ENR-4027800011506 | |
Tissue culture dishes | Sigma (München, Germany) | Z666246-420EA | |
Cell strainer filter (100 µm Nylon) | Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) | BD352360 | |
Inoculation loop | Copan Diagnostics (Murrieta, USA) | CD176S01 | |
TPP Tissue culture plates 24wells | Sigma (München, Germany) | Z707791-126EA | |
Cassette | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 1000957 | |
Nunc MaxiSorp flat-bottom | Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) | 44-2404-21 | |
Nunc MicroWell 96-Well | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 260836 | |
Confocal Microscope | Zeiss (Jena, Germany) | Confocal LSM Meta 510 | |
Image rendering software | Bitplane AG (Zürich, Switzerland) | IMARIS 7.6 | |
LSM Image Browser | Zeiss (Jena, Germany) | ||
Multiwell-Reader | Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) | Tecan infinite F200Pro | Plate Reader |
Plate shaker | Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) | KM-2 Akku | |
BenchMark ULTRA | Ventana Medical Systems (Tucson, USA) | Automated IHC/ISH slide staining system | |
Assays | |||
Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche (Basel, Switzerland) | 11644807001 | |
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche (Basel, Switzerland) | 11644793001 | |
Microscopical vitality staining | Invitrogen (Carlsbad, USA) | L-3224 | LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit |
BCA Protein Assay | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 23225 | |
ELISA assay kit | R & D systems | various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) | DuoSet |
Reagents | |||
Agarose, low gelling temperature | Sigma (München, Germany) | A9414-100G | |
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) | Sigma (München, Germany) | E2888-500ML | |
Penicillin and streptomycin | Lonza (Verviers, Belgium) | 17-602E | |
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) | Gibco (Darmstadt, Germany) | 11039-047 | Culture medium |
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) | Lonza (Verviers, Belgium) | BE17-513F | Buffer solution |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma (München, Germany) | A9647-500G | |
Detergent | Sigma (Saint Louis, USA) | X100-100ML | Triton X-100 |
Washing buffer | Merck (Darmstadt Germany) | 524653 | 0.05% Tween 20 in PBS |