Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Sitotoksik değerlendirilmesi ve insan hassas kesim akciğer dilimleri maddelerin etkileri Immunomodulatory

doi: 10.3791/57042 Published: May 9, 2018
* These authors contributed equally

Summary

3Rs prensibi içinde görüş-in seçimli-e doğru hayvan çalışmaları olarak solunum modelleri gelişmektedir. Özellikle solunum maddelerin risk değerlendirmesi için uygun deneyleri eksikliği vardır. Burada, biz insan hassas kesim akciğer dilimleri hava maddelerin değerlendirilmesi için nasıl kullanılacağını açıklar.

Abstract

Onların geniş çeşitlilik solunum hastalıkları uygun model sistemleri temel mekanizmaları anlamak ve yeni tedavi gelişimi etkinleştirmek gerekir. Ayrıca, kayıt, yeni maddelerin uygun risk değerlendirmesi bireylerin, örneğin, çalışma ortamında zarar riskini önlemek için yeterli test sistemleri ile gerektirir. Bu tür risk değerlendirmeleri genellikle hayvan çalışmaları yapılmaktadır. 3Rs prensip ve hayvan deneyleri karşı kamu şüphecilik içinde görüş-in gibi hassas kesim akciğer dilimleri (PCLS), insan alternatif yöntemler gelişen. Mevcut kağıt amonyum hexachloroplatinate (HClPt) gibi düşük moleküler ağırlıklı maddeler immunomodulatory potansiyelini çalışmaya insan PCLS ex vivo teknik anlatılmaktadır. Ölçülen bitiş noktaları canlılığı ve yerel solunum inflamasyon, sitokinler ve kemokinler değişmiş salgılanmasını tarafından işaretlenmiş bulunmaktadır. Pro-inflamatuar sitokinlerin, tümör nekroz faktör alfa (TNF-α) ve İnterlökin 1 alfa (IL-1α) anlamlı bir artış içinde insan PCLS HClPt alt toksik konsantrasyon maruz kaldıktan sonra. PCLS tekniği önemli ölçüde son on yıl içinde optimize edilmiş olsa bile, immunomodulation test için onun uygulanabilirliği hala gelişme olduğunu. İnsan PCLS potansiyel değerli bir araç solunum araştırmada gösteriyorlar olsa bile bu nedenle, burada sunulan ön, sonuçlarıdır.

Introduction

Alerjik astım, mesleki astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), Amfizem ve üst ve alt solunum yolları enfeksiyonları gibi solunum yolu hastalıkları artmaktadır ve dünya çapında sağlık yük1,2temsil eder. Uygun test sistemleri, bazı uygun maddelerden test ve geliştirme ek olarak bu hastalıkların altında yatan temel mekanizmaları belirlemek için gereklidir. Temel araştırma yanı sıra preklinik ilaç geliştirme vitro veya vivo içinde deneyleri elde sonuçları üzerinde duruldu. Bu deneyleri, ancak, kendi sınırlamaları3var. İlk olarak, vitro deneyleri izole ve bitişik doku veya organ kaldırılması insan hücreleri kullanmak ve böylece artık ile etkileşim veya diğer hücreleri3tarafından korunuyor edebiliyoruz. İkinci olarak, hayvan modelleri insan fizyolojisi ve biyokimyasal farklılıkları gidermek4farklılıklar nedeniyle çevrilebilir değildir. Bu sınırlamalar, en aza indirmek için ve 3Rs bağlamında (değiştirme, arıtma, azaltma) ilke5, yeni alternatif modeller sürekli gelişen.

Alternatif insan 3D doku modelleri, PCLS gibi insan tabanlı vitro ve karmaşık hayvan vivo içinde modelleri arasında bir bağlantı vardır. PCLS solunum yolu6' mevcut tüm ilgili hücre tipleri ile fonksiyonel heterojenite yansıtır. Ayrıca, PCLS teknik birkaç ince dilimler kesin kalınlıkta bir tek hayvan veya insan doku donörden tekrarlanabilir hazırlanması bir avantaja sahiptir. Bu bir iç kontrol yanı sıra farklı konsantrasyonlarda izin verir veya test edilecek uyuşturucu.

İnsan akciğer agar dolu dilimleri Fisher ve ark. tarafından 1994 yılında ilk giriş beri 7 dilimleme ve akciğer dokusunun kültür için teknik önemli ölçüde geliştirilmiştir. Christian Martin vd. Bu teknik daha fazla kimyasal ve farmakolojik uygulamaları8için iyileştirilmiştir. Grubumuz bu teknik için 2007 yılında Christian Martin tarafından kullanılmaya başlandı. O zamandan beri PCLS uygulama araştırma fonksiyonel tepkileri, gibi hava yolu9,10 ve vazokonstriksiyona11, immünolojik, farmakolojik12,13test dan genişletmiştir, ve toksikolojik7 çeşitli türlerin birkaç laboratuarlarında test. Örneğin, Schlepütz vd. 14 hava yolu yanıt türler farklılıklar için araştırdık ve periferik nöron harekete geçirmek elektrik alanı stimülasyon (EFS) veya kapsaisin farelerde, sıçanlar, karşılaştırıldığında eskiden şiling şimdi pigs, koyun, marmosets ve insanlar. Sinir-aracılı bronchoconstriction farklı ama farklı desenler için çeşitli türler bulundu ve yaygın olarak kullanılan Laboratuvar hayvanlarının (fare ve sıçanlar) her zaman insan yanıt yansıtmaz sonucuna vardı. Akciğer toksisite test etmek ve bu bağlamda, Hess vd. hayvanlarda sayısını azaltmak için 15 sıçan PCLS inhalasyon toksisite araştırmaları için ex vivo alternatif olarak önceden doğrulanmış. PCLS umut verici sonuçlar ile kullanarak iki tahmin modelleri geliştirilmesi çok merkezli bu ön doğrulama çalışma sonuçlandı.

Ayrıca, temel araştırma, PCLS16, erken Alerjik yanıt-e doğru17ve viral enfeksiyon yanıt-e doğru18,19sinyal kalsiyum aydınlatmak için kullanılmıştır. Teknik ilerleme devam ediyor ve daha da ileri incelenmiştir. Örneğin, alan insan dokusu yararına depolama ve yeniden donmuş doku tarafından artmaktadır. Rosner ve ark. açıklanan donma ve solunum yolları stimülasyon sözleşme yeteneğini korur fare PCLS çözme tekniği: Bu nedenle, sınırlı bir süre pencerenin içinde doku kalır uygun ve çok daha fazla teknik uzatır deneyleri zamanla aynı donör20' ye uygulanır. Ek olarak bu araştırma gelişmeler, Lauenstein vd. 21 son zamanlarda insan PCLS mesleki astım için potansiyel sensitizers olarak hareket çeşitli kimyasal risk değerlendirmesi araştırıldı.

Mesleki astım belirtileri olan hava akımı tıkanma ve hava yolu hyperresponsiveness, Alerjik astım için benzer, yüksek molekül ağırlıklı (HMW)22 veya düşük molekül ağırlıklı (LMW) maddeler23 maruz kalma tarafından indüklenen (Örneğin , Platin bileşikleri) işyeri ortamında. LMW ajanlar anhidridler oluşturan yüksek Sensitizasyonu potansiyel var ve taşıyıcı proteinler21' e bağlanın. Yeni HMW veya LMW kimyasalların kayıt gerektiren içinde in vitro ve in vivo risk değerlendirmesi ile ilgili potansiyel onların sözde Sensitizasyonu (örn., OECD kılavuz 429)24. Olsa orada görünüyordu bazı uyum için küçük bir alt kümesi maddeler25 potansiyel, sözde Sensitizasyonu belirlemek için kullanılan testler ancak, aslında solunum sensitizers, risk değerlendirmesi, ama iletişim sensitizers için tasarlanmamıştır . Lauenstein ve ark. eseri Sens-BT-IV, Avrupa Birliği projesi kapsamında risk değerlendirmesi sözde temas veya akciğer sensitizers21için alternatif test stratejileri geliştirmek için tasarlanmıştır. Bu proje için biz insan PCLS kullanılabilirlik alternatif bir test aracı olarak test üzerinde duruldu. Bu nedenle, immunomodulatory bitiş noktaları (örneğin, canlılık ve sitokin salgısının) bir dizi LMW Platin bileşikleri gibi kimyasal maddelerin tahriş edici veya inflamatuar potansiyelini belirlemek üzere seçildi. Lauenstein için tüm solunum sensitizers uygulanabilir genel yok desen bulundu vd. ; Ancak, işlerini Vakfı kısa bir süre önce protokolleri26için sağlanan.

Özetle, burada hazırlık ve insan PCLS sonraki maruz kalma için sunulan Protokolü potansiyel akciğer toksik değerlendirilmesi ve/veya solunum gelişiminde dahil immunomodulatory maddeler için yararlı bir yöntem sağlar Mesleki astım gibi hastalıkların.

Protocol

İnsan PCLS ile deneyler ve Etik kod dünya tıp Derneği göre gerçekleştirilen gerekir (burada gösterilen örnek PCLS deneyler Hannover yerel Etik Komitesi tarafından onaylanan yerel Etik Komitesi tarafından onaylanmış Tıp Fakültesi; sayı 2701-2015). Tüm donör hastalar veya onların en yakın akrabasını yazılı Onam insan akciğer malzeme kullanımı için gereklidir. Akciğer kanseri muzdarip hastaların çoğu alınan doku olmasına rağmen bu el yazması açıklanan sonuçlar farklı yaş, cinsiyet, tıbbi geçmiş ve rezeksiyon, nedeninin bağışçılardan doku dilimleri ile elde edilmiştir. Sadece tümör ücretsiz doku deneyler için kullanıldı.

1. genel insan PCLS ve sonraki kimyasallara maruz hazırlanması

Not: Bir akciğer doldurmak için iki kişi gerekir. Hepatit A ve B için bir güncel aşı kaydı önerilir. Hastaların rutin HCV ve HIV için önce akciğer nakli ekranlı. Aktif enfeksiyon ile Mycobacterium tüberküloz tanısı veya şüpheli, akciğer reddetti. Potansiyel bulaşıcı ve karşılık gelen koruyucu önlemler alınmalıdır gibi (parçacık Filtre maskeleri (FFP2), koruyucu gözlük, eldiven) iş güvenliği sağlamak için yine de, tüm taze insan akciğer dokusu ve ondan türeyen örnekleri tedavi edilmelidir personel. Yordamı 60-90 dakika sürer.

  1. İnsan Akciğer lobu intactness doğrulayın.
    Not: Bir gözyaşı plevra içinde homojen dolgu dokusunun önler. İnsan akciğer malzeme rezeksiyon günden beri olması gerekir. Yaklaşık 2 saat oda sıcaklığında buz üzerinde özel ile doldurma önce (RT) dönemlerinde depolama tolere edilir. Bu protokol için kullandığımız doku rezeksiyon uygulanan hastalardan elde edilir. Ölen hastalar değil. Doku buz üzerinde depolanan, o RT için sıcak doldurmadan önce önceden, aksi takdirde özel hemen polimerize ve homojen hiçbir dolgu mümkün olacaktır.
    Dikkat: tüm kişiler ile temas yerel insan malzeme önlük, eldiven, şapka, yüz maskesi iki çift ve koruyucu gözlük bir çift oluşan koruyucu giyim üzerine koymak emin olun. Potansiyel bulaşıcı insan malzemedir.
  2. Düşük gelling özel 7,5 gr ağırlığında ve 250 mL için bi distile su ekleyin. Özel eriyene kadar özel bir mikrodalga kaynatın. Yaklaşık 40 ° c, özel erime ve jelleşme noktası bağlı olarak sakin ol.
    Not: Birkaç şişe LOB boyutuna bağlı olarak gerekli değildir.
  3. Önceden ısıtmak ve 37 ° C'de kültür orta (Tablo reçetesi) tutmak
    Not: özel çok sıcak ise, vitaminler kültür ortamında etkinliğini kaybeder ve hücreleri zarar görür. Orta/özel çözüm sıcaklığı 37 ° C altında ise, jelleşme süreci başlatmak ve homojen dolum akciğerin zarar verir. Sadece 37 ° C-39 ° C sıcaklık aralığı önerilir.
  4. Ulaşmak içinde başlamadan önce tüm gerekli malzemeleri yer: 5-10 kelepçeler, esnek kateter uzunluğu yaklaşık 1 m, uygun bir şırınga (örneğin, 50 mL) kateter ve buz dolu bir buz kutusu bağlantısı uydurma.
  5. Silikon tüp ekleyerek trake/ana bronş cannulate ve böylece kelepçe dokusunun birlikte silikon tüp kapalı pinching olmadan sıkıyor bir kelepçe ile düşünüp tüp paralel odaklı. Silikon tüp içinde sabitlenmiş ve doldurma işlemi sırasında kayma değil emin olun. Hiçbir özel doldurma işlemi sırasında kaçak böylece diğer tüm bronşlar, kan damarları ve yaralanmalar kelepçeler ile kapatın.
  6. %3 özel düşük gelling eşdeğer hacmi kültür orta bir ölçek ile karıştırın. Karışımı bir 50 mL şırınga kullanarak akciğer aşılamak. Orta şırınga dolum önce kelepçe sonda parmak ya da hava kabarcıkları ve özel reflü önlemek için bir kelepçe ile kapatın. Akciğer lobu tam şişirilmiş dolduramazsınız. Dikkatle tarafında akciğer plevra dokunmak; plevra hatta ve sert olmalıdır.
    Not: Akciğer lobu boyutuna bağlı olarak, özel/orta çözüm 2 veya 3 litre kadar gerekli olabilir.
  7. Tek bir örnek içinde birkaç bronşlar durumunda her bronş için 1,5-1,6 adımları yineleyin.
  8. Akciğer aşılanan özel miktarına bağlı olarak 20-40 min için jel için özel polimerizasyon için buz koymak. Dikkatli bir şekilde sert ve serin, o polimerizasyon tam olduğunu belirten olup olmadığını kontrol edin, aksi halde Microsoft® için birkaç iki plevra dokun. Patolog akciğer dilimler halinde kesip, onların örnekleri almak ve ulaşım için buzda akciğer malzeme depolamak.
  9. İnsan Akciğer doku 3-5 cm döşeme keskin bir bıçak ile kesmek.
    Not: her akciğer için yeni bir bıçak netlik sağlamak için kullanın.
  10. Doku dilimleyici 400 mL buz gibi Earle ün dengeli tuz solüsyonu ile (EBSS) doldurun. Hemen kes silindirik doku çekirdek yarı otomatik bir tornavida ambara bir tercih edilen çapı aracıyla ile akciğer plaka dışında (örneğin, 8 mm; 10 mm).
    Not: Bu Çapı makine içinde doku tutucu çapını eşdeğer olması gerekir.
  11. İstenilen Kalınlık değeri akciğer dilimlere kalınlığını ayarla.
    Not: Yaklaşık 250 µm kalınlığında PCLS deneylerde kullanılan yaygın. Doku dilimleyici üreticisi kendi doku dilim kalınlığı ölçüm dilim kalınlığı doğrulanması için önerir. Alternatif olarak, Bütün-mount confocal mikroskobu ile kombine boyama dilim kalınlığı Brismar vd tarafından açıklandığı gibi belirlemek için kullanılabilir 27
  12. Doku çekirdek doku dilimleyici doku tutucu aktarın. Ağırlık (doku tutucu parçası) doku çekirdek üstüne koy. Kol hız ve bıçak hızı 6 için doku dilimleyici ayarlayın. Doku çekirdek PCLS Dilimleme başlatın.
  13. 500 mL, piyasada bulunan Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) ek: Besin karışımı F-12 DMEM/F12 (1:1) 5 mL penisilin (10.000 adet/mL) ve streptomisin (10.000 µg/mL) ile. Kültür orta birkaç gün buzdolabında steril koşullarda saklayın. Orta sadece gerekli hacmi önceden ısıtmak.
    Not: Penisilin 37 ° C'de uzun süre devam ederse inaktive. Serum kompozisyon toplu iş toplu değişir ve boya, fenol kırmızısı gibi kullanım serum ve boya-özgür kültür orta, deneyleri ile etkileyebilir.
  14. Petri kabına (100 x 15 mm) 25 mL buz gibi kültür orta ile doldurun. Orta cam silindir kelepçe açarak doku dilimleyici içine bir ölçek dışarı drene. Dilimleri bir aplikatör (örneğin, aşılama loop) kullanarak kültür orta ile Petri çanak içine bir ölçek aktarmak. Petri kabına bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO2, %100 nem) koy. Orta adımları yıkama önce ısınmak için izin.
    Not: Tüm daha fazla adımlar steril koşullarda gerçekleştirilir.
  15. Bir hücre süzgeç PCLS yıkamak için Petri kabına yerleştirin. Tamamen bir 10 mL serolojik pipet ile Kültür Orta hücre süzgeç aracılığıyla kaldırın ve 37 ° C Önceden ısıtılmış taze Orta 25 mL ekleyin. Bu 3 - 4 kez her 30 dakika tekrarlayın.
    Not: Dilimleri dilimleri için herhangi bir zarar görmemesi için pipet, içine sucked hücre süzgeç engel olur.
  16. Akciğer dilimleri dikkatle 500 µL kültür ortamı Yani başına iki dilim için en az 24-şey kültür plaka içine aktarın. (Bkz: adımları 3.1-3,4) maddeler, akciğer dokusu açığa örneğin, 37 ° c, % 5 CO224 h için.
    Not: Transfer, tercihen bir aşı döngü kullanın ve doku hasarı önlemek için döngü üzerine dilimler float izin. Sadece yeterli taze orta sıkıntısı dokusu dilimlerin hücre ölümüne neden gibi başka hiçbir ayrım dilimleri gerekli. Dilimler üst üste veya diğer her kuyuda touch: Bu doku canlılığı üzerinde herhangi bir etkisi vardır.
  17. Bir plastik şişe ile bir sabitleştirici (örneğin, % 10 arabelleğe alınmış formaldehit) en az 24 saat için tüm insan malzeme koymak ve elden çıkarma işleminde yak bunu.
    Uyarı: Toksik formaldehit, bir başlık altında bu adımı gerçekleştirin.

2. histolojik PCLS analizi

  1. Sabitleştirici batırılmış iki köpük yastıkları ile biyopsi kaset hazırlamak (örn., % 4 arabelleğe alınmış formaldehit). Yer PCLS köpük pedler biyopsi kaset ve hemen arasında doku sabitleştirici çözüm aktarın. Düzeltme doku % 4 geceleme formaldehit arabelleğe alınmış.
  2. Doku örnekleri etanol (% 70, % 90'ı, % 100, % 100, % 100, % 100) her biri, 1 h için dehydrating tarafından katıştırma parafin için çamaşır Ksilen (3 x 1 h) ve Sıvı parafin (3 x 1 h) göre standart histopatoloji protokolleri takip işlemek.
  3. PCLS gömme bir kalıba aktarın. Bir aşı döngü kullanın. PCLS doku içinde Sıvı parafin gömün. Doku eşit zaman parafin blok döküm kalıp içinde yerleştirmek emin olun.
  4. Düz ve düz bir yüzeye sahiptir kadar döner bir microtome ile PCLS içeren doku blok kesme. İstediğiniz kalınlıkta seri bölümlerini almak (örn., 4 µm), onları tek tek üzerinde art arda kaplamalı cam slayt (genellikle 25-bölümleri alınabilir 30) numaralı kadar bütün PCLS yerleştirerek işlenmiştir.
  5. Tek cam slaytlar (her 8-10 bölümleri) Hematoksilen ve Eozin leke (H & E) Oryantasyon ile leke. Bölüm (ilk ve son 8 bölüm genellikle eksik) yönlendirme slaytlarda dayalı deneme için seçin.
    Not: (İsteğe bağlı) uzun süreli depolama için slaytlar korunması için Sıvı parafin içinde batırılmış olabilir.

3. maddeler için çözümler hazırlanması

Not: çalışma çözümleri ve denetimleri kullanımdan hemen önce hazırlayın.

Dikkat: Güvenlik yönergelerine göre maddeler işlemek veya bilinmiyorsa, potansiyel olarak zararlı olarak ve rutin güvenlik önlemleri izleyin.

  1. Suda çözünen maddelerin doğrudan kültür orta geçiyoruz. Çözünmez veya kötü çözünür kimyasallar için ilk madde madde çözünürlük bağlı olarak uygun çözücüler içinde geçiyoruz. Sınırlı su çözünürlük maddelerle (< 0.1 mg/mL), örneğin, DMSO veya etanol içinde çözünmüş. Non-toksik çözelti konsantrasyonları titrasyon tarafından önceden tespit edilmelidir. Yasaklayarak çözüm orta seyreltilmiş varken dışarı çökelti değil emin olun.
    Not: HClPt ve sodyum laureth sülfat (SLS) çözümleri hazırlanır.
  2. Madde stok Solutions'da 100-fold hazırlamak istediğiniz en yüksek konsantrasyon kültür orta veya çözücü. 12.5 mg HClPt ve 34,4 mg SLS tartmak ve 1 mL kültür ortamında kimyasallar çözülerek hisse senedi çözümleri hazırlayın.
    Not: Hiçbir solvent bu kimyasallar için gereklidir.
  3. 1: 100 Önceden ısıtılmış orta son seyreltme hazırlayın. Solvent önceden kullanılması durumunda bu yaklaşım tüm madde konsantrasyonu için aynı son çözelti konsantrasyonu sonuçlanmaktadır.
  4. Son çözelti konsantrasyonu (örneğin, %1 3.3. adımda açıklandığı gibi) PCLS başvuru tedavisi için kullanın. Solvent kontrol sonuçları bölümünde açıklanan kimyasallar için gerekli oldu.

4. olumlu ve olumsuz başvurular sitotoksisite deneyleri için

  1. Tüm canlılığı deneyleri için aşağıdaki pozitif ve negatif kontrolleri hazırlayın:
    1. Doku kontrol: PCLS kültür ortamında yalnızca bir referans olarak hücre kültür koşulları (37 ° C, % 5 CO2, %100 nem) 24 h için tedavi edilmezse PCLS için kuluçkaya.
    2. Araç kontrol (gerekirse): araç ile sadece PCLS için bir referans kabul PCLS son çözelti konsantrasyonu ile kuluçkaya (bkz. Adım 3.4) hücre kültür koşulları (37 ° C, % 5 CO2, %100 nem) 24 h için.
    3. Pozitif kontrol: PCLS 4 ° C'de 1 h için arabellek çözümde % 1 deterjan ile kuluçkaya
      Not: Doku PCLS renksiz hale gelirse, öldü. Toplam L-laktat dehidrogenaz (karaciğer) süpernatant, yaklaşık 1.9-2.3 (6.1 6.4 adımlara bakın) bir emme ile belirlenir. Doku WST-1 tahlil için kullanılır (bkz: adımlar 5.1-5.5), yaklaşık 0 bir emme ile.

5. kimyasal kaynaklı sitotoksisite WST-1 tahlil tarafından insan PCLS içinde ölçümü

Not: WST-1 tahlil bir 24-şey plaka başına iyi iki PCLS ile gerçekleştirilir. Tercihen, çoğaltmaları her parametre için kullanmak ve bu yinelemeleri sonuçlarını ölçüm sonra havuz.

  1. Çalışma çözüm hemen başlamadan önce Orta WST-1 reaktif sulandrarak hazırlayın. Gerekli çalışma çözüm 250 µL/iyi bir 24-şey plaka miktarıdır. Bu nedenle, 25 µL reaktif bir kuyu kültür ortamının 225 µL karıştırın.
  2. Adım 1.16 kuluçka PCLS, sonra atın veya süpernatant sitokin ölçümleri veya karaciğer tahlil gibi diğer testler için kullanın. Kalan doku bir sonraki adım için kullanılır.
  3. Damlalıklı 250 µL WST-1 reaktif çalışma konsantrasyon iyi ve 37 ° C ve % 5 CO2 1 h. PCLS tam olarak kuluçka sırasında WST-1 reaktif tarafından karşılanmaktadır sağlamak için plaka kuluçkaya.
  4. Plaka bir orbital Çalkalayıcı (200 devir/dakika) yerleştirin ve dikkatli bir şekilde sallamak için 30 s ayrıntılı WST-1 reaktif karıştırma sağlamak için. Yeni bir düz-alt 96-şey plaka ve damlalıklı 100 µL yinelenen süpernatant her şey 24-şey plaka almak.
  5. 450 her kuyuda emilimini ölçmek nm (başvuru: 630 nm) bir Mikroplaka okuyucu kullanarak. 630 emme çıkarma nm den 450 nm. Bu değerler için adım 5.6 hesaplamada kullanılacak).
    Not: Yalnızca canlı dokudan sitotoksisite değerlendirmesi için güvenilir veri elde edilebilir. Bu nedenle, bu kabul edilebilirlik kriterleri Hess vd tarafından Yayınlandı 15 her deneyde sağlanmalıdır. Bu kriterler karşılanmazsa, deneme yinelenmelidir.
  6. Tedavi edilmemiş orta kontrol emilimini deneme yinelenmelidir aksi takdirde 0,6 olmalıdır. Verileri bu gereksinimi karşılamıyorsa, doku denetiminin emilimini değerini % 100 olarak ayarlarsanız ve doku kontrolü ile ilgili olarak tedavi örnekleri WST-1 azalma hesaplayın.

6. karaciğer tahlil

Not: Karaciğer tahlil sonrası kuluçka süresinden sonra bir 96-şey plaka 100 µL kültür toplamda süpernatant ile gerçekleştirilir.

  1. PCLS veya test aracıları olmadan kuluçka sonra adım 1.16 süpernatant 50 µL almak ve yeni bir 96-şey plaka çoğaltmaları aktar. Bu her birinden bir 24-şey tabak iyi tedavi çoğaltmaları oluşturur.
  2. Karaciğer reaktif hemen önce tahlil çalışma çözüm hazırlamak. Katalizör çözüm (1 mL bidistilled suda lyophilisate) çalışma çözüm oluşur ve boya üreticisi tarafından sağlanan çözüm. Bir 96-şey plaka için katalizör çözüm 125 µL 6.25 mL boya çözeltisi ile iyice karıştırın.
    Dikkat: çözüm ışık doğrudan maruz bırakmayın.
  3. Damlalıklı 50 µL çalışma çözüm her şey zaten içeren 50 µL süpernatant ve karanlıkta RT, 20 dk plaka kuluçkaya. Daha fazla karıştırma gereklidir.
  4. 492 her kuyuda emilimini ölçmek nm (başvuru: 630 nm) bir Mikroplaka okuyucu kullanarak. 630 emme çıkarma nm üzerinden 492 nm. Bu değerler için adım 6.5 hesaplamada kullanılır.
    Not: Yalnızca canlı dokudan sitotoksisite değerlendirmesi için güvenilir veri elde edilebilir. Deterjan tedavi kontrol emilimini 1 olmalıdır.
  5. Analiz için adım %4.1 100 olarak olumlu denetim emilimini değerini ayarlayın ve pozitif kontrolü (Yani, en fazla karaciğer yayın) ile ilgili olarak tedavi örnekleri karaciğer sürümde hesaplayın.

7. mikroskobik canlılığı tahlil Confocal lazer tarama mikroskop (cLSM) ile

Not: mikroskobik canlılığı tahlil için iki normal 250 µm kalınlığında PCLS 250 µL/kuyuda bir 24-şey plaka lekeli. Her dilimin ayrı ayrı görüntüsü gibi daha fazla yineleme yok gereklidir.

  1. Veya test öğeleri olmadan kuluçka PCLS, sonra süpernatant atmak veya sitokin ölçümleri veya karaciğer tahlil gibi diğer testler için kullanabilirsiniz. Kalan doku burada açıklanan yordamı kullanın.
  2. Çalışma seyreltme calcein-AM ve etidyum homodimer 1, (EthD-1) 4 µM kültür ortamda her iki reaktif bir çalışma konsantrasyonu ile hazırlayın. Bu amaçla, calcein-AM (4 mM) 1 µL ve EthD-1 (2 mM) 2 µL 997 µL kültür ortamına ekleyin. Bu birimin iki PCLS ile 4 kuyu leke için gereklidir.
    Not: ışık doğrudan reaktifleri yay.
  3. Damlalıklı 250 her çalışma seyreltme µL iyi ve karanlıkta, RT 45 dk 24-şey plaka kuluçkaya. Plaka bir orbital Çalkalayıcı 150 devirde daha iyi doku maruz boyama çözüm sağlamak için kuluçka sırasında yerleştirin.
  4. 45 dakika sonra boyama çözüm atmak ve PCLS RT, 3-5 dk içinde belgili tanımlık karanlık için 150 rpm'de sallayarak aracılığıyla 1 mL tampon solüsyon ile yıkayın. Bu iki kez tekrarlayın.
  5. Tampon çözeltinin 500 µL kültür ortamdan autofluorescence önlemek için lekeli PCLS içeren her şey için geçerlidir. Mikroskobik değerlendirmesi için en az iki rastgele dağıtılmış z yığınlarının bir cLSM ile gerçekleştirme.
  6. 10 X / 0.3 seçmek için oküler sekmesini tıklatın amaç ve Online cLSM PCLS yüzeyine bulmak için standart bir ışık mikroskobu kullanmak için tıklayın. Oküler ayarı çıkmak için çevrimdışı ' ı tıklatın.
  7. Satın alma sekmesinde tıklatın ve fluorophores için uygun lazerler açmak.
    Not: Biz bir argon lazer dalga boyu 488 ile kullanılan nm polyanionic boya calcein için (uyarma dalga boyu 495 nm) ve Helene lazer dalga boyu 543 ile nm EthD-1/DNA karmaşık tespiti (uyarma dalga boyu 533 nm). Bu önemli ölçüde lazer ömür boyu uzatır gibi argon lazer genellikle 30-%50 yaklaşık 5,7 A, tüp mevcut etkinleştirmek için maksimum akım olarak çalıştırmalısınız.
  8. Işık yolunu altında satın alma sekmesini tıklatın ve gerekli filtreleri ve aynalar deneme için ayarlayın.
    Not: Bu da çalışmanın, filtre tabanlı bir sistem ile bir ana dikroik kiriş splitter kullanıldı (örn., HFT 488/543) uyarma ve emisyon ışık ayıran. Bu ışık için ikincil dikroik ışın splitter (örneğin, NFT 545) daha fazla yönlendirilir yansıtan bir ayna aracılığıyla ayrı ışık örnek iki kanal içine yayılan.
  9. Grup kurma geçmek dalga boylarında yalnızca belirli bir Aralık iletmek ve 2 kanal için calcein sinyal ve EthD-1/DNA karmaşık sinyal Kanal 3 atama filtreler (örneğin, BP 505-530 calcein sinyal ve BP 560-615 EthD-1/DNA karmaşık sinyal için).
  10. Mikroskobik birim için üst ve alt sınırları ayarlamak için Z-yığınlar kutuyu kontrol et. Bir canlı karşılık gelen katmanın ekranda görmek için canlı düğmesine basın. Odağı bul PCLS keskin bir sinyal ile yüzeyi aşağı veya yukarı taşıma.
  11. Kanalları alt'ı tıklatın ve Tümünü gösterkutusunu işaretleyin. Karşılık gelen kanal canlı görüntü altında düğmesine basarak ve bir tabloyu kilitlemek ve kanal renk etkinleştirin.
    Not: Canlı görüntü mavi renkte ise yüksek sinyal beyaz olarak görünür ve pozlanmış bir sinyal-ecek gözükmek içinde kırmızı sinyal yok olduğunu gösterir.
  12. İğne deliği ve sondaj kırmızı EthD-1 kanal için 1 havadar birimi için ışık toplama verimliliğini ve optik kesit arasındaki en iyi dengelemeyi ayarlayın ve calcein kanal buna göre ayarlayın. Öyle ki beyaz ama aktif kanal renk tıkanabilir tablosu ile canlı resimdeki kırmızı değil görünüyor kazanç tespit edilen sinyal artırmak.
    Not: Ana kazanç 600 adet aşmaması gerekir.
  13. Öyle ki aktif kanal renk tıkanabilir tablosu ile canlı resimde mavi görünen arka plan ayarlamak için dijital ofset azaltabilir veya artırabilirsiniz.
  14. Çok boyutlu edinme altında Z-yığın sekmesini tıklatın ve odak için ilgi bir z-katman fonksiyonunu kullanın. Bu pozisyon daha sonra satın alma için kaydetmek için Ayarla ilk basın. Yavaş yavaş bir dizi 30 µm ulaşıldı ve kaydetmek için Ayarla son basın kadar odağı yukarı veya aşağı kaydır.
  15. Bir kez daha canlı görüntü devre dışı bırakmak ve Deneme başlatmak görüntüleme başlamak için tuşuna basın için Live üzerinde'yı tıklatın.
    Not: Uygun doku polyanionic boya calcein floresan tespit edilmiştir. Ölü hücreleri EthD-1, nükleik asitler ve karmaşık oluşumu tarafından ayrımcılığa.

8. görüntü işleme

Not: Bu program uygun donanım gerektirir gibi görüntü işleme yazılımı bilgisayar tavsiyesi dikkate alınması gerekir.

  1. Mikroskobik canlılığı PCLS (bkz. Bölüm 7) görüntü işleme yazılımı boyama üzerinden alınan LSM dosya yükleyin. Devam etmeden önce .ims dosyası olarak kaydedebilirsiniz. Doku denetimi üzerindeki tüm parametreleri ayarlayın ve bunları tüm görüntüleri uygulayın. Başka bir değişikliğe izin verilmez.
  2. Ses düğmesi kullanım için uygun doku (calcein boyama) yüzey yeniden (ek şekil 1A) ve ölü hücre çekirdeği (ek şekil 1 H) için noktalar düğme. Bir kanal işleme sırasında ekran ayarlaması penceresi diğer kanalda kapatın.
  3. Başlamak çok önemli doku hacmi render: yüzey kanal ayarla, tüm görüntüyü işlemek, pürüzsüz faktörünü 0,5 µm ayarlayın ve mutlak yoğunluğu için eşik (ek şekil 1B, C) kullanın. Mavi ileri ok tuşuna basın.
  4. Yeniden oluşturulan birimin mutlak yoğunluğu eşik ayarlayın; gürültü ve arka plan yoğunluğu düşülen. Yüzey kaplaması gri renkle gösterilir ve yüzey kapsama doğruluğunu olmalıdır (ek şekil 1 d) kontrol ettim. Ayarlamayı tamamladıktan sonra mavi ileri ok tuşuna basın. Çoğu zaman ayarları hesaplanması için bu adım gereklidir. Yazılım birim hesaplamak mümkün değilse, pürüzsüz faktörü artar.
  5. Son adımda, bir filtre seçin. Makrofajlar (ek şekil 1E) alveoler uzayda filtrelemek için küresellik filtresiyle (yaklaşık 10 µm) yüzey işleme için kullanın. Yeşil İleri düğmesine basın.
  6. Optik çıkış görüntü ayarlama ve istatistik .xls dosyaları olarak dışa aktarın. Toplam hacim (miktar) daha ayrıntılı bir çözümleme için (ek şekil 1F, G) kullanılır. Ayarları kaydetmek ve z-yığınlar aynı gün aynı cLSM ayarlarla (ek şekil 1I) alınan tüm daha fazla analiz için bunları kullanın.
  7. Ölü hücre çekirdeği için kırmızı kanalı (noktalar) yeniden. Rastgele surpass pencere ölçeklendirme µm nokta boyutunda ölçün; nokta boyutu yaklaşık 5 µm. Mark Enable ve nokta boyutunu ayarlayın. Bütün noktalar işaretlenir ve her nokta yalnızca bir kez sayılır mı diye bak. El ile (ek şekil 1B, H, J) gerekirse düzeltin. Mavi ileri ok tuşuna basın.
  8. Basın noktaların parametrelere göre toplam sayısını hesaplamak/sayısı programının çalışmasına yeşil ileri düğmesi ayarla ve sonuç (Ek şekil 1 K, L, M) .xls dosyası olarak verin. Resim Grafik veya istatistiksel analiz için hayati doku hacmi oranında hesaplanan ölü hücre çekirdeği sayısını ayarlayın.

9. ölçüm sitokinler ve kemokinler insan PCLS içinde

Not: Sitokin ve Kemokin bağışıklık yanıtı extracellularly kültür süpernatant ve intracellularly doku lysates kuluçka süre sonra ölçülebilir. ELISA çoğaltmaları bir 96-şey plaka 100 µL/kuyu ile ölçülür.

  1. Deterjan 5 mL 495 mL tampon çözeltisi ile karıştırılarak % 1 deterjan solüsyonu hazırlayın. Çözüm RT için birkaç ay depolanabilir.
  2. % 1 deterjan solüsyonu 1:500 oranında, proteaz inhibitörü (PI) karıştırın. Gerekli kültür plaka üzerinde bağlıdır; Örneğin, 500 µL/iyi bir 24-şey plaka için kullanın. Bir şey için PI sayısının 1 µL deterjan solüsyonu 499 µL ile karıştırın.
  3. PI çözüm 1 µL tüplerini hazırlayın ve kültür bu tüplerde süpernatant 500 µL toplamak. 9.2. adımda hazırlanan PI içeren 500 µL deterjan solüsyonu tarafından 24-şey plaka ortamda yerini alması. 4 ° C'de 24-şey plaka yerleştirerek doku 1 h için koşullar Damlalıklı yeni bir tüp içinde lysate doku ve daha fazla analiz kadar bu tüpler-80 ° C'de depolayın.
    Not: ELISA Protokolü son derece üretici firmaya bağlı ve üreticinin talimatlarına uyulmalıdır. Standart bir ELISA protokol aşağıda açıklanmıştır.
  4. ELISA sitokin düzeyleri süpernatant veya üreticinin yönergelerine göre lysate ölçmek için gerçekleştirin. IL-1α ve TNF-α ölçmek için kat a96-şey plaka yakalama antikor pipetting 100 µL tarafından (izleyin seyreltme için üreticinin yönergelerini) ve gecede RT. kuluçkaya
  5. Çamaşır arabellek 1 L bir çamaşır arabellek tablet çözülerek bidistilled su hazırlamak. Yakalama antikor ve damlalıklı 400 µL çamaşır arabellek her kuyuya kaldırın. Bu birimi üç kez değiştirin. Plaka engelleme çözüm (örneğin, arabellek çözümünde, üreticinin yönergelerine göre % 1 BSA) ekleyerek engellemek. RT 1 h için kuluçkaya.
    Not: Standart ticari olarak mevcut ELISAs 2 x 100 µL doku süpernatant veya lysate gerektirir. Örnekler bir kez çözdürülen ve sadece kullanım önce olmalıdır. Yayımlanan sitokin testin duyarlılığı bağlı olarak, örnekleri ölçümleri önce seyreltilmiş gerekir. Bu nedenle, reaktif tahlil tarafından sağlanan örnekte oranında seyreltin.
  6. Engelleme çözümü kaldırmak ve (izleyin seyreltme için üreticinin yönergelerini) seyreltilmiş örnekleri için standart eğri Ekle ve doku süpernatant 100 µL veya doku lysate adım 9,3 toplanan çoğaltmaları 100 µL. Dik 2 h için kuluçkaya
  7. Örnekleri ve damlalıklı 400 µL çamaşır arabellek her kuyuya kaldırın. Bu birimi üç kez değiştirin. Damlalıklı 100 µL biotinylated algılama antikor (izleyin seyreltme için üreticinin yönergelerini) ve RT. 2 h için kuluçkaya
  8. Antikor ve damlalıklı 400 µL çamaşır arabellek her kuyuya kaldırın. Bu birimi üç kez değiştirin. HRP etiketli streptavidin 100 µL/kuyu Ekle (izleyin seyreltme için üreticinin yönergelerini) ve RT, 20 dk için kuluçkaya (üretici yönergelerine bakın).
  9. Streptavidin ve damlalıklı 400 µL çamaşır arabellek her kuyuya kaldırın. Bu birimi üç kez değiştirin.
  10. (Üretici tarafından önerilen) substrat 100 µL ekleyin ve 20 dakika içinde belgili tanımlık karanlık kuluçkaya (üretici yönergelerine bakın).
    Not: Bu bir ışığa duyarlı adımdır. Substrat ve plaka ışık maruz kaçının.
  11. Reaksiyon 50 µL durmak eriyik ekleyerek durdurmak (1 M H2SO4). 450 her kuyuda emilimini ölçmek nm (başvuru: 570 nm) bir Mikroplaka okuyucu kullanarak. 570 emme çıkarma nm den 450 nm.
    Not: Tedavi edilmezse ve/veya araç doku denetimleri negatif denetimleri hizmet. Akciğer dokusunda bir bağışıklık yanıtı ikna etmek için olumlu bir denetim olarak uygun stimülasyon (örneğin, 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS)) kullanın. İki wells ile 100 ng/mL LPS kültür ortamında iyi başına iki PLC'ler ile örneğin, 24 h için kuluçkaya ve süpernatant ve doku 9,3 adımda anlatıldığı gibi lysate toplamak.
    Not: yüksek standart emilimini eşit veya daha ileri 1.0 ise ölçüm sonuçları, kabul edilir; Aksi takdirde ölçümün yinelenmesi gerekir. Standart eğri sigmoidal doz-yanıt eğri uydurma takip etmelidir.
  12. Sitokin konsantrasyonları (pg) tarafından ELISA 9,11. adımda belirlenen toplam protein içerik doku her örneği lysate belirlenen normalleştirilmiş (bkz. Bölüm 10).

10. insan PCLS toplam Protein içeriği ölçümü

Not: PCLS toplam protein konsantrasyonu ölçmek için lysed gerekiyor. Adım 9,3 doku lysates bu adım için kullanılır. Tahlil çoğaltmaları pipetted bir düz 96-şey plaka 25 µL/iyi lysate, doku ile gerçekleştirilir.

  1. 7-nokta BSA standart 2000 µg/mL, 1.500 µg/mL, 1000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL ve 125 µg/mL BSA konsantrasyonları ile hazırlayın. Her standart çoğaltmaları 25 µL uygulayabilir ve 25 µL arabellek çözüm boş bir 96-şey tabakta (kullanım bir tabak bir tabak kapak ile) olarak kullanabilirsiniz.
  2. Damlalıklı 25 (bkz. adım 9,3) lysates gelen çoğaltmaları 96-şey plaka içine her kuyuya µL. Toplamda, her 50 µL de gereklidir. BCA çözüm sulandrarak BCA tarafından çalışma reaktif Reaktif B 1:50 de BCA Reaktif A. hazırlamak 96-şey plaka için Reaktif B 400 µL kullanıp 20.000 µL Reaktif A.
  3. Dikkatle damlalıklı 200 µL hava kabarcıkları kaçınarak çalışma reaktif her kuyuya. 30 için bir orbital Çalkalayıcı (150 devir/dakika) tabağa yerleştirin s plaka kapak tabağa koy ve uygun lysates ve çalışma reaktif karıştırma emin olmak. Plaka için karanlıkta 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya. 540-590 nm Mikroplaka okuyucu kullanarak her kuyuda emilimini ölçmek.
    Not: Standart yüksek BSA emilimini eşit veya daha ileri 0,8 ise ölçüm sonuçları, kabul edilir; Aksi takdirde ölçümün yinelenmesi gerekir. Standart eğri sigmoidal doz-yanıt eğri uydurma takip etmelidir.
  4. Analiz için bir 4-parametre Marquardt denklem boş çıkarma sonra kullanarak standart eğri hesaplamak. Bilinmeyen örnekleri protein konsantrasyonları uygun standart eğri kullanarak hesaplar.

Representative Results

Mevcut araştırma yöntemi ile insan PCLS hazırlanan ve beş insan akciğer malzeme kimyasal olarak indüklenen immunomodulatory etkileri değerlendirmek için endüstriyel maddeler konsantrasyonları maruz. 24 h toksisite için kalıcı kültür tarafından yayımlanan karaciğer, mitokondrial faaliyet ve mikroskobik canlılığı boyama ölçüm değerlendirildi gibi Akciğer doku batık koşullar altında maruz kalmış. Buna ek olarak, normalleştirme ve pro-inflamatuar sitokinlerin için toplam protein içeriği ölçülür. Mümkün olduğunda, inhibitör konsantrasyon (IC) 75 değerler doğrusal olmayan sigmoidal eğri uydurma tarafından hesaplanır. Olumlu referans maddeler, doğuştan gelen sitokin yanıt için sitotoksisite ve LPS için deterjan her çalışması doğrulamak için kullanılmıştır. Logaritmik olarak dönüştürülmüş IC75 [µM] değerleri (günlük IC50) sonraki sitokin yayın ölçülerini "tahriş edici" konsantrasyonları kullanılmıştır.

Şekil 1 ve Şekil 2 insan akciğer malzeme ve örnek H & E boyama insan PCLS doldurma yordamı gösterir. Rutin hijyenik prosedürleri sağlık üzerinde olumsuz etkileri önlemek ve insan akciğer malzeme işleme personel güvenliği sağlamak için takip edilmesi gerek. Teknik personel eğitimi ve pratik gerektirir. Deneyimli farklı bölgeleri (üst/alt LOB ve subpleural karşı daha fazla orta) ayırt patologlar ve hastalıklı karşı sağlıklı alanları insan akciğer malzeme patolojik durumunu değerlendirmek için ihtiyaç vardır. Oluşturulan insan PCLS H & bir patolog tarafından yeniden değerlendirilebilir E lekeli ince bölümler hazırlanması için kullanılmalıdır. Bu yordamı kullanıcıların ayrımcılık farklı hastalıklı alanlarda ve akciğerlerin içindeki konumları pratikte elde yardımcı olur.

Şekil 3 karaciğer ve WST-1 etkinliği için ölçüm sonuçları 24 saat kuluçka SLS ile sonra insan PCLS sunar. SLS, 0 µg / mL SLS, gösterilen olmadan tedavi edilmezse orta kontrol önemli bir kalite kontrol var. Değerleri için karaciğer deterjan lysed doku ile karşılaştırıldığında % 20 altında olması gerektiğini ve > WST-1 tahlil için 0.7 Absorbans birimleri. Bu kalite denetimleri de yetersiz doku canlılığı göstergeleri olarak hizmet. İnsan dokusu deterjan solüsyonu doğru yanıt olarak etkili bir toksik madde pozitif kontrol olarak dahil edilmelidir. 300-500 oranında bir artış yol açmalıdır (> 2.0 Absorbans birimleri) karaciğer değerleri ve tedavi edilmezse doku ile karşılaştırıldığında, < 0.1 Absorbans birimleri WST-1 tahlil için. SLS sonuçlandı karaciğer ve metabolik aktivite, bir düşüş WST-1 tahlil konsantrasyonlarda artış tarafından ölçülen hücre canlılık doz bağımlı azalma > 87 µg/mL. Böylece IC75 veya IC50 değerleri hesaplamak olası bir sigmoid konsantrasyon-yanıt modeli veri için takıldı. Bu değerler daha sonra konsantrasyonları sitokin ve Kemokin düzeyleri için seçmek için kullanılabilir: yüksek derecede toksik konsantrasyonlarda genellikle Hayır veya yalnızca azalmış sitokinler ve kemokinler tespit. Bu nedenle, toksik olmayan ya da sadece biraz toksik konsantrasyonları (IC75) tavsiye edilir. Burada karaciğer aktivite süpernatant hücre kültüründe beklenen artış kez uygulanan madde21tarafından etkilendiğini unutmamak önemlidir. Sık sık, parazit türleri karaciğer tahlil kullanılan tek sitotoksisite tahlil olsaydı sonuçların yanlış yorumlanmasına yol önde gelen madde ve enzim aktivitesi arasında meydana gelir. Böylece, önemli ve güvenilir ve geçerli sonuçlar elde etmek için birkaç sitotoksisite deneyleri gerçekleştirmek gerekli olur. Ayrıca, karaciğer ve WST-1 deneyleri duyarlılığını son derece karşılaştırılabilir belirtilmelidir.

Şekil 4' te, PCLS görüntülerini mikroskobik canlılığı yanıt için deterjan etkili bir toksik madde olarak insan dokusunun göstermektedir. Sonuçları diğer canlılığı veri onaylamak çok yararlıdır, ama bu ek donanım gerektirir. Toksik etkileri görsel olarak değerlendirilmesi EthD 1 pozitif hücre çekirdeği için karşılaştırıldığında calcein pozitif doku tarafından değerlendirilir. Airways veya kan damarları kaçınılmalıdır ise daha büyük boşluklar sonuçları kayabilir gibi parankimi içinde rasgele seçilmiş parçaları genellikle karşılaştırılabilir veri içinde sonuçlanır. Bizim deneyim ve yukarıda açıklanan mikroskobik ayarları ile bir ortalama hacmi 1.5 x 106 ve 5 x 106 µm3 kontrol doku arasında ölçülür. Değerleri akciğer malzeme kalitesi, PCLS kalite ve aynı zamanda Akciğer doku donör hastalık bağlıdır. İnsan Akciğer doku canlılığı bağışçılar arasında değişir de, uygun doku ile karşılaştırıldığında ölü hücre çekirdeği sayısı %15 doku denetiminin aşmaması gerekir. Ancak, ölü hücre çekirdeği doku denetiminde ağırlıklı olarak varsa, deneme terk.

Şekil 5 insan akciğer dokusu üzerinde HClPt ve SLS immunomodulatory etkisi için temsilcisi verileri görüntüler. IL-1α ve TNF-α pro-inflamatuar sitokinlerin biyolojik inflamasyon, inflamatuar işlemlerin başında uzun süre maruz gösteren çoğu maddeler uyarıcı. Her iki sitokinler ELISA tarafından ölçüldü. Hücre dışı IL-1α insan PCLS içinde genellikle düşük ise hücre içi IL-1α 1000 pg/mL ve üzerinde düzeyleri ulaşır. Hücre içi IL-1α bir düşüş devam eden sitotoksik süreçleri - gösterir ve çoğunlukla kimyasallara maruz kalma insan PCLS sonra görülmektedir. Doku LPS ile uyarılır, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ve bu nedenle bir aktivatör olumlu tedavi kontrol, o zaman bağlı IL-1α çoğunu sadece intracellularly 24 saat sonra tespit edilebilir. Buna ek olarak, TNF-α salgı LPS stimülasyon tarafından indüklenen esas olarak extracellularly ölçülebilir. LPS gibi uygun bir olumlu denetim geçerlilik bir yöntemin kullanımı gösterilmiştir. Mevcut araştırma yöntemi ile insan PCLS HClPt (32, 64 ve 125 µg/mL) üç konsantrasyonları veya iki konsantrasyonları SLS (1 ile 10 µg/mL) için 24 h salgısı hücre içi ve hücre dışı sitokinler toplamı olarak belirlendi sitokin sinin şekil 5' te gösterildiği gibi toplam protein konsantrasyonları için normalleştirilmiş. Sanki burada kayda değer BCA tahlil genellikle toplam protein içeriği belirlenmesi için kullanılır, ancak, aynı zamanda madde kaynaklı sitotoksisite yansıtır. Dolayısıyla, yüksek derecede toksik konsantrasyonları sitokin veri normalleştirme için toplam protein içeriği kullanılamaz. IL-1α salgılanmasını önemli ölçüde 263 ± 38 pg/mg 887 ± 216 pg/mg ve TNF-α için 263 ± 38 pg/mg 1,160 ± 286 pg/mg (şekil 5A, B) artar. Ayrıca, IL-1α ve TNF-α salgı LPS kaynaklı bir unstimulated doku denetimi ile karşılaştırıldığında sunulmaktadır. Pro-inflamatuar sitokinlerin LPS gibi patojen ilişkili moleküler desenleri tarafından indüksiyon bir yöntem geçerliliğini gösterir ve insan PCLS ile çalışırken immunomodulatory etkilerini araştırmak için kullanılması önerilir. HClPt ve SLS veriler üzerinde daha fazla ayrıntı için lütfen çalışma odasına Lauenstein vd tarafından bakın. 21

Figure 1
Resim 1 : İnsan akciğer dolgu yordamı. İnsan akciğer rezeksiyonu hemen sonra hazırlanır. Akciğer tutarlı dolum ile özel ve ani özel polimerizasyon dolum sırasında önlemek için oda sıcaklığında saklanmalıdır. Akciğer yatay olarak, ana bronş veya bronşlar (A & B closeup bronş Tarih için) en iyi bir görünüm için yayılmış loblar ile yer alıyor. Bronşlar esnek silikon tüp ile cannulated ve kelepçeler ile (C) sabit. Doldurma prosedürü ve özel polimerizasyon sonra doku, eğitimli patologlar dilimleri hakkında 3-5 cm kalınlıkta (D) akciğer oyulmuş. Bu dilimler silindirik doku çekirdek (Ø örneğin, 8 mm) bir ambara aracı (E) ile hazırlanır. Bu doku çekirdek içine orta dolu Petri yemekler normal hücre kültür koşullar (E) altında kuluçka için hemen transfer PCLS içine bir doku dilimleyici kesilir. Birkaç yıkama adım PCLS arta kalan hücre artıkları ve serbest bırakılan hücre arabulucu (F) kaldırmak için hücre kültür tabak (örneğin, iyi ve 500 µL orta başına iki PCLS ile 24-şey plaka) içine aktarıldıktan sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : H & E boyama tarafından insan PCLS Sağlık durumunun belirlenmesi. Bir donör akciğer tümörü ile hazırlanan bu resim PCLS olduğu gibi Akciğer doku alveoler parankimi ile periferik gösterir airways (*) ve kan damarlarının (ok uçları)(a)genel bakış. Yüksek büyütme oranında airways sağlam siliyer solunum epitel (ok) (B), bir kılcal ile çok sayıda eritrositler (ok) (C), dahil olmak üzere uygun pneumocytes ile kaplı bozulmamış bir alveoler yapı ile iletken alveoler alanlarda alveoler makrofajlar (CD68 immünhistokimya) içeren (D), kan damarları ile sağlam endotel (CD31 immünhistokimya) yanı sıra (E) görülebilir. Sadece tümör ücretsiz doku yok macroscopically hastalıklı alanlarda görünür olmasıdır PCLS için kullanıldı. PCLS aksine bağış diğer akciğer hastalıkları amfizem gibi ile hazırlanan veya fibrozis, alveoler yapı değil bozulur ve PCLS sadece biraz dış yatılı, hazırlık adımları nedeniyle büyük olasılıkla, yıpranmış. Ölçek çubuklar 1000 µm(a)ve 50 µm (B-E), anılan sıraya göre gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : İnsan PCLS, SLS tarafından indüklenen sitotoksisite belirlenmesi ölçülen kültür orta içine karaciğer enzim kaçağı (A) ve kaybı metabolik enzim aktivitesinin boya WST-1 (B) ile değerlendirildi. İnsan PCLS SLS konsantrasyonları artan maruz bırakıldı. Böylece IC75 veya IC50 değerleri (inhibitör konsantrasyonu hücre canlılığı % 25 ve % 50 azalma) hesaplanan (doğru rakamlar) bir sigmoid konsantrasyon-yanıt modeli veri için daha sonra takıldı. Veri ± SEM, demek gibi sunulmaktadır n = 3-5. Karaciğer testin Absorbans 492 ölçülen nm (başvurusu, 630 nm) ve WST-1 testin 450 nm (başvurusu, 630 nm). Verinin adapte ve Lauenstein vd. 21 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : İnsan PCLS üç boyutlu mikroskobik boyama ve resim render temsilcisi görüntülerini. Canlı doku denetim ve doku için deterjan, etkili bir toksik madde olarak yanıt calcein AM ile insan PCLS (sarı) ve EthD-1 boyama sonra (kırmızı) gösterilir. 30 µm yığınları 10 X amacı(a)ile alınan ve (B) işlenir. Ölçek çubuğu 100 µm. uyarma dalga boylarında 488 nm ve 543 nm, emisyon filtreleri BP 505-550 nm ve LP 560 nm gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Amonyum hexachloroplatinate (HClPt)-24 h maruz kaldıktan sonra insan PCLS içinde IL-1α ve TNF-α salgı indüklenen. PCLS üç konsantrasyonları (32 µg/mL, 64 µg/mL ve 125 µg/mL HClPt) ve iki farklı konsantrasyonlarda (1 µg/mL ve 10 µg/mL) SLS maruz kalmışlar. Hücre içi ve hücre dışı IL-1α(a)ve TNF-α (B) ELISA tarafından belirlenen ve toplam protein içeriği için normalleştirilmiş. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin LPS, olumlu bir aktivatör yönteminin geçerliliğini göstermek için hücre içi IL-1α(a)ve toplam protein içeriği için normalleştirilmiş ekstraselüler TNF-α (B) yayın için bir referans olarak gösterilir. Veri ± SEM, demek gibi sunulmaktadır *p < 0,05 ve ***p < 0,001; HClPt ve SLS: n = 9, IL-1αLPS: n = 5, TNF-αLPS: n 4'te teknik çoğaltmaları (Mann-Whitney testi) =. Bu rakam Lauenstein ve ark. değiştirildi 21 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Supplementary Figure 1
Ek şekil 1: ayrıntılı hesaplama işleme görüntü işleme yazılımı kullanarak boyama mikroskobik canlılık için. Yüzey işleme uygun doku (A-G, ben) calcein lekeli ve etidyum homodimer lekeli hücre çekirdeği (H, nokta tespiti için karşıya yüklenen LSM görüntülerin görüntü analizi için adım adım yordam çalışma J-M). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Supplementary Figure 2
Ek Şekil 2: sayısal görüntü analizi mikroskobik canlılığı insan akciğer dokusunun boyama bakış. Uygun doku (sarı) yüzey işleme tarafından (B-ben) analiz edildi ve ölü hücre çekirdeği (kırmızı) nokta algılama (J-P) tarafından tespit edildi. Anlık görüntü modu (Q) görüntü vermek için kullanıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

İnsan PCLS bizim laboratuvarda iyi kurulmuş bir tekniktir. Mevcut kağıt bu tekniği ve akciğer doku ex vivomaddelerin toksisite testleri için kullanımı bir açıklamasını verir. Genel olarak, bu teknik bir tahlil ayarlamak için aramak gerekir kullanarak herhangi bir laboratuvar ölçülebilir aralıkları tanımını, tahmin variabilities ve kalite deneme geçerliliğini garanti denetimlerin ilgili. Mümkün Standart prosedürler olabilir, örneğin, her bir son nokta, örneğin, sitotoksisite tahlil üç biyolojik bağış (bireysel metinler) en az iki ya da üç teknik çoğaltır pozitif de dahil olmak üzere örnek başına en az yinelenecek ve negatif başvurular. Laboratuar personeli tahlil tutarlılığını artırmak ve tahlil değişkenlik en aza indirmek için eğitim.

Sık akciğer dokusu üzerinde maddeler immunomodulatory etkilerini değerlendirmek için kullanılan bitiş noktaları dahil sitotoksisite farklı deneyleri (örneğin, karaciğer tahlil, WST-1 tahlil, tahlil boyama mikroskobik) kullanarak ölçüleri, sitokin yayın deneyleri, de gibi değişiklikleri ifade profil ve immunohistopathological yöntemleri6hücresel nüfus değişiklikleri karakterizasyonu. Ayrıca, orada da insan PCLS için transfer edilebilir ve böylece daha önce hücresel kompozisyon gösteren daha ayrıntılı bilgilere sağlayabilir fare PCLS28 , pulmoner dendritik hücreleri gibi hücrelerin görselleştirme açıklayan teknikleri ve sözde sitotoksik maddelerle tedaviden sonra.

Bu temel Protokolü ve insan Akciğer doku bölümleri hazırlanması için teknik yayınlar29de tarif edilmiştir teknikleri karşılaştırılabilir. Kısacası, organ malzeme cerrahi rezeksiyon veya nakli geçmesi gibi akciğer kanseri, kronik hastalıkların canlı tehdit eden acı hastalar elde edilir. Çalışmalar yerel Etik Komitesi tarafından onaylanmış olması gerekir. Hastaların bilinçli yazılı izni gereklidir. Bir iş akışı arasında klinik ve laboratuar kurma kritik bir konudur ve iletişim ve arabirimleri ve her iki site arasında altyapı tanımını gerektirir. Doğrudan rezeksiyon canlılığı doku korumak için sonra işlenmek üzere insan akciğer malzeme vardır. İnsan PCLS için burada açıklanan tekniği hem genç ve yaşlı akciğerler ve sağlıklı ve hastalıklı akciğer uygulanabilir kayda değer olduğunu. Örneğin, ABD'de, kazalarda ölen veya kimin organ nakli için reddedilmiştir sağlıklı organ bağış akciğerler elde etmek mümkündür.

İlk kritik adım protokolündeki airways ve özel çözüm ile çevredeki parankimi enflasyon olduğunu. Bu adım sonraki Dilimleme yordam için çok yumuşak doku kuvvetlendirmek gereklidir. Hastalık özgeçmişlerine dayalı insan akciğer malzeme kalitesi ve burada önemlidir. Sadece loblar sağlam plevra ile doldurulabilir. Bronş yakınındaki son aşama tümörler bazen doldurma işlemi önlemek. İnsan malzeme şişirme önce özel çözüm sıcaklığını iyice kontrol edilmesi gerekiyor. Çok fazla kan (veya diğer sıvıları, exudates) insan içinde Akciğer doku özel istenmeyen seyreltme içinde neden olur ve polimerizasyon süreci etkileyecektir. Enflasyon akciğer dokusunun ve özel buz üzerinde gelling sonra akciğerler 200-300 µm kalınlık bölümlere kesilir. Tutarlılık dokusunun çok kritik bir konudur. Doku çok yumuşak ise, eşit bölüme Dilimleme zordur. Aynı microtome parametreleri her donör, bağışçılar arasında dilim kalınlığı değişebilir için ayarlanır, nedeniyle bireysel koşullar ve Şişirme sırasında değişiklikleri her akciğer için işlenmesi halinde bile. İnhomogeneous dolgu dokusunun farklı dilim kalınlıklarda neden olur. Ölçme ve dilim kalınlığı standartlaştırılması yerine toplam protein içeriği ölçümü dolaylı olarak akciğer dilim kalınlıkları izlemek için kullanılabilir. Dilimleme işlemi birkaç son aşama hastalıkları engel; örneğin, kan damarları son derece pulmoner hipertansiyon ve fibrotik doku kalınlaşmış-ebilmek var olmak çok sert doku silindir Dilimleme pek mümkün ve microtome bıçak çok sık değiştirilmesi gerekir.

İnsan PCLS ve adımları yıkama yoğun hazırlanması sonra hangi hücre artıkları kaldırmak için gerekli ve enzimler, doku bölümleri deneyler29için kullanılabilir serbest. İnsan PCLS normal hücre kültür koşullar altında kültürlü ve, örneğin, kimyasallar, uyuşturucu veya lipopolisakkaritler maruz. PCLS ara sıra kirlenme (bilinmeyen) enfeksiyonlar nedeniyle kültür insan akciğer malzemenin özel bir sorundur. Doku enfeksiyonları gösterilen kültürler atılmalıdır ve ekipman iyice dezenfekte gerekir. Bir yandan hazırlık için kullanılan Laboratuvar yerleri ve kültür arasında kayma ayrılık diğer taraftan çapraz-enfeksiyonları önlemek için yardımcı olabilir. İle ilgili ekipman, microtome kaçak ve gevşek onaltılık vida motor hasar ve bıçak hareketi durdurmak için neden olabilir. Dilimleyici her parçası paslanmaz çelikten imal edilmiştir ve çok o okside değil kurutulmuş Eğer hemen temizlik alter. Donanım sorunları aşmak için en az bir yedek aygıtı gerekli olabilir.

Önceki yayınlarda, özel yıkanması bildirdi ve yoğun adımları hazırlık sonra yıkama sırasında kaldırıldı. Aslında, bu mümkün değildir, özel kaldırılamaz. Özel tamamen kaldırılması için doku yok edeceğini yüksek sıcaklıklarda yeniden erimiş olması gerekir. Alveoller ve havayolları özel tarif bitiş noktaları ile karışmaz. Diğer bitiş noktaları özel varlığı ile etkilemiş (Ayrıca bkz: sınırlamalar). Doku canlılığı kültür kritik bir konu olduğu gibi vurguladı çok taze doku bölümleri hazırlamak için ihtiyaç vardır. Bronchoconstriction canlılık için geçerli bir parametre değil. Çevredeki parankimi canlılığı kontrol etmek için en az iki ya da üç bağımsız sitotoksisite deneyleri kullanmanızı öneririz; Bunun her deneme30' u kontrol edilmesi gerekiyor. Sitotoksisite deneyleri kalite denetimlerde yetersiz doku canlılığı göstergeleri olarak hizmet vermektedir. Bu nedenle, tüm sitotoksisite deneyleri bir deterjan gibi etkili bir toksik madde dokusunun, örneğin, yanıt verme becerisini değerlendirmek için önerilir. Doz-yanıt eğrileri üzerinde bağlı olarak, minimum ve maksimum değerleri emme sitotoksisite deneyleri için tanımlanmış olması gerekir ve sonraki deneyler için bir araya geldi. Protokol daha fazla değişiklikler çoğunlukla uygulamalı kimyasallar ve bitiş noktaları ilgi bağlıdır. Çözünmez ya da büyük ölçüde reaktif kimyasallar uygulanabilirliği sınırlıdır. DMSO için en yüksek çözücü konsantrasyonu % 1'e sınırlıdır. Daha yüksek konsantrasyonlarda kullanılabilir ancak belirgin serbest bırakmak-in Il-8 gibi pro-inflamatuar sitokinlerin neden olabilir. Öte yandan, kullanılan uyarıcı nispeten zayıf olabilir. Bu durumda, 2-iyi başına dört dilim doku miktarı artırılabilir. Bu yaklaşım 24 h canlılığı sınırlar.

Bir büyük insan PCLS Almanya'da onlar sadece hastalıklı insan akciğer malzemeden hazırlanabilir olduğunu kısıtlamasıdır. Hastalar ameliyat normalde 50 yaşından büyük ve akciğer kanseri muzdarip hastaların % 80'i ya da sigara içenler eskiden. Gibi sebepler, hastaların ilaç da insan dokusu kullanarak deneyler sonucu etkileyebilir. Bu nedenle, için esastır: doğrulamak i) her deney canlılığı, işlevsellik ve bireysel doku hassasiyeti doğrulama olumlu referanslar ve II) çapraz doğrulamak sağlıklı, hastalıklı olmayan, orta yaş akciğer dokusundan kullanarak sonuçları Laboratuvar hayvanlarının (cynomolgus gibi insan dışı primatlar ve mümkünse, fare, sıçan, eskiden şiling şimdi domuz). Hastalıklı dokuların daha iyi patoloji puanı daha iyi deneysel sonuçlar. Ağır hastalıklı doku-ebilmek var olmak kullanılmış çok zor ve çok sık gösterir canlılığı, yeterli ölçüde düşük veya çok yüksek sitokin düzeyleri, bakteriyel veya mantar enfeksiyonları ve daha az bronchoconstriction sınırlı. Donör donör varyasyon daha yüksek insanlar bireysel çeşitliliği yansıtan laboratuvar hayvanlardan elde edilen sonuçlar karşılaştırılır. Bu, ancak, bir sınırlama genel değildir; gibi yukarıda, diğer ülkelerde (örneğin, ABD) sağlıklı akciğerler nakli için reddetti vefat eden organ bağış elde etmek mümkündür. Yanıt dokusunun de akut maruz kalma deneylerde 48 h ilk kadar tarif edilmiştir. Canlılığı ve işlevselliği doku kültürünün birçok gün sonra veya depolama-80 ° C'de sonra azalır Kültür insan Akciğer doku için yaklaşık 14 gün kadar mümkündür. Canlılık bu süre içinde devam ediyor; Ancak, sınırlı sitokin yayın mitogens karşılık olarak sonuçlanan değişkenlik yanı sıra doku makrofajlar gibi birkaç hücre popülasyonlarının işlevsellik kaybı bir artış görülmektedir. Bir bitiş noktası için başka sınırlama dokusunda, örneğin, RNA31 yüksek kaliteli ve yeterli miktarda yalıtım veya tek hücre süspansiyonlar hazırlanması için sonraki Akış Sitometresi engelleyen özel varlığıdır ve hücre fenotipleme. Mekanik yorumlara tek hücreli yanıt ve işlevselliği elde etmek için olasılık böylece sınırlıdır.

Organotypic doku modelleri, insan PCLS gibi temel ve klinik olmayan araştırma üzerinde yüksek bir etkisi olarak kabul edilir. İnsan akciğer malzeme normal organ mimarisi en benzer biçimde yansıtan bir biyolojik kompozisyon vardır. Bu, örneğin, konut alveoler ve bronş epitel hücreleri, düz kas hücreleri, fibroblastlar, endotel hücreleri, sinir lifleri ve makrofajlar içerir. Uygun doku ve hücreler çeşitli uyaranlara cevap. Sinir lifleri, her ne kadar yerel olarak aktif, terminal refleks yanıt14' e lider, kes. Sonuç olarak, bu ex vivo model hücresel doğuştan gelen bağışıklık yanıtı, savunma yanıt, sinyal sitokin ve indüksiyon hücre yüzey işaretlerinin çalışma imkanı sunuyor. Birkaç geliştirme tekniği, kültür ve geçerlilik bitiş noktalarının translasyonel bilimde insan PCLS kullanılsın. Gelecekteki yaklaşımlar örnekleri şunlardır: i) doğrulanmasını yeni hedefler insan akciğer dokusunda, bağışıklık yanıtı pozlama sonra bir değerlendirme II) Örneğin, kimyasallar, ilaçlar, nano tanecikleri, vb, III) takviyesi ile bağışıklık hücreleri, akciğer dokusunun böyle T-lenfositleri, IV) olarak kimlik ve solunum sensitizers, hastalık-inducing maddeler veya aktif bileşikler yollar; inhibe maruz kaldıktan sonra örneğin, moleküler kalıplarının değiştirilmesi Ayrıca, v) hava yolu remodeling ve VI) nöronal Yönetmeliği32. Bilimsel alan bu mevcut ve gelecekteki yaklaşımları PCLS ile ilgileniyor. Buna ek olarak, PCLS tekniği cryo-koruma20ve nefes alma sırasında veya mekanik doku doğal hareketini taklit etmek için33 uzanan doku gibi geliştirmek için yardımcı olacaktır farklı gelişmeler çeşitli vardır Havalandırma.

İnsan PCLS diğer 3D modelleri ile karşılaştırıldığında en büyük avantajı bağışıklık hücreleri ve sinir lifleri varlığıdır. Deneyler, fare, sıçan ve hala en sık Farmakoloji ve toksikoloji kullanılır hayvan türü olan insan dışı primatlar da gerçekleştirilebilir. İnsan Akciğer doku karmaşıklığı sonuçları hayvan insana ve vitro vivo içindeiçin çeviri destekler. Solunum sensitizers tanımlanması için varolan alternatif deneyleri bağlamında insan PCLS çok karmaşıktır ve tek hücre yanıt anlayışlar izin vermez. Henüz, doğru hücresel işaretçiyi birlikte, örneğin, Apoptozis, nekroz veya hücre içi işaretleri ile kullanılırsa mikroskobu ve Akış Sitometresi hücresel yanıt hakkında bilgi verebilir. Doğrulanmış ve solunum sensitizers tanımlanması için kullanılan rapor yayımlanmış deneyleri vardır. Ancak, tek hücreli deneyleri kendi avantajları PCLS kullanımıyla gelişmeler değerli katkıları teknik yüksek üretilen iş tarama için kullanılabilir anlamda Watson ve ark. tarafından açıklandığı gibi yapıyoruz 34 onlar fare cryo korunmuş PCLS hava yolu toksisite tahmin etmek için bir yüksek-den geçerek tarama tahlil geliştirilmiştir. Minyatür onların 96-şey PCLS biçimiyle, PCLS uygun bir yüksek-den geçerek tahlil yapma fare lavaj sıvı içinde benzer sonuçlar tespit etmişler.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok. Fraunhofer madde bir bağımsız devlet kar amacı gütmeyen araştırma uygulamalı araştırma, biyoteknoloji, ilaç, kimya ve kozmetik sanayi adına sözleşme araştırma organizasyondur. Enstitüsü finansman ulusal ve uluslararası kamu projelerden gelir.

Acknowledgments

Lan Lauenstein insan PCLS ile risk değerlendirmesi için alternatif test stratejileri ile ilgili ön onun iş için teşekkür etmek istiyorum. Bazı araştırma bir hibe 6inci çerçeve programı SENS-BT-IV "Roman test stratejileri alerjenler Vitro değerlendirilmesi için" içinde Avrupa Komisyonu tarafından desteklenen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm A. Hartenstein (Leipzig, Germany) SS04
Syringe Faust Lab Science (Klettgau, Germany) 9.410 050
Coring tools custom-made custom-made
Trimming Blade Handle (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205530001
Trimming Blades (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205500000
Microtome: Tissue Slicer Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) 303400-ADPT Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)
Microtome blade Wilkinson Sword (Solingen, Germany) ENR-4027800011506
Tissue culture dishes Sigma (München, Germany) Z666246-420EA
Cell strainer filter (100 µm Nylon) Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) BD352360
Inoculation loop Copan Diagnostics (Murrieta, USA)  CD176S01
TPP Tissue culture plates 24wells Sigma (München, Germany) Z707791-126EA
Cassette Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 1000957
Nunc MaxiSorp flat-bottom Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) 44-2404-21
Nunc MicroWell 96-Well  Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 260836
Confocal Microscope Zeiss (Jena, Germany) Confocal LSM Meta 510
Image rendering software Bitplane AG (Zürich, Switzerland) IMARIS 7.6
LSM Image Browser Zeiss (Jena, Germany)
Multiwell-Reader Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) Tecan infinite F200Pro Plate Reader
Plate shaker Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) KM-2 Akku
BenchMark ULTRA Ventana Medical Systems (Tucson, USA) Automated IHC/ISH slide staining system
Assays
Cell Proliferation Reagent WST-1 Roche (Basel, Switzerland) 11644807001
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche (Basel, Switzerland) 11644793001
Microscopical vitality staining  Invitrogen (Carlsbad, USA) L-3224 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit
BCA Protein Assay Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 23225
ELISA assay kit R & D systems various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) DuoSet
Reagents
Agarose, low gelling temperature  Sigma (München, Germany) A9414-100G
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) Sigma (München, Germany) E2888-500ML
Penicillin and streptomycin Lonza (Verviers, Belgium) 17-602E
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) Gibco (Darmstadt, Germany) 11039-047 Culture medium
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) Lonza (Verviers, Belgium) BE17-513F   Buffer solution
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma (München, Germany) A9647-500G
Detergent Sigma (Saint Louis, USA) X100-100ML Triton X-100
Washing buffer Merck (Darmstadt Germany) 524653  0.05% Tween 20 in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. D'Amato, G., et al. Climate change, air pollution and extreme events leading to increasing prevalence of allergic respiratory diseases. Multidiscip Respir Med. 8, (1), 12 (2013).
  2. Pawankar, R., et al. State of world allergy report 2008: allergy and chronic respiratory diseases. World Allergy Organ J. 1, (6), Suppl 4-17 (2008).
  3. Hartung, T., Daston, G. Are in vitro tests suitable for regulatory use. Toxicol Sci. 111, (2), 233-237 (2009).
  4. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, (7252), 208-212 (2009).
  5. Balls, M., Straughan, D. W. The three Rs of Russell & Burch and the testing of biological products. Dev Biol Stand. 86, 11-18 (1996).
  6. Sewald, K., Braun, A. Assessment of immunotoxicity using precision-cut tissue slices. Xenobiotica. 43, (1), 84-97 (2013).
  7. Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Hum Exp Toxicol. 13, (7), 466-471 (1994).
  8. Ressmeyer, A. R., et al. Characterisation of guinea pig precision-cut lung slices: comparison with human tissues. Eur Respir J. 28, (3), 603-611 (2006).
  9. Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309, (10), 1219-1228 (2015).
  10. Koziol-White, C. J., et al. Inhibition of spleen tyrosine kinase attenuates IgE-mediated airway contraction and mediator release in human precision cut lung slices. British journal of pharmacology. 173, (21), 3080-3087 (2016).
  11. Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. J Vis Exp. (83), e50970 (2014).
  12. Lamb, D. J., et al. Bl 1002494, a Novel Potent and Selective Oral Spleen Tyrosine Kinase Inhibitor, Displays Differential Potency in Human Basophils and B Cells. J Pharmacol Exp Ther. 357, (3), 554-561 (2016).
  13. Leus, N. G., et al. HDAC 3-selective inhibitor RGFP966 demonstrates anti-inflammatory properties in RAW 264.7 macrophages and mouse precision-cut lung slices by attenuating NF-kappaB p65 transcriptional activity. Biochem Pharmacol. 108, 58-74 (2016).
  14. Schleputz, M., et al. Neurally mediated airway constriction in human and other species: a comparative study using precision-cut lung slices (PCLS). PLoS One. 7, (10), 47344 (2012).
  15. Hess, A., et al. Prevalidation of the ex-vivo model PCLS for prediction of respiratory toxicity. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 32, 347-361 (2016).
  16. Bergner, A., Sanderson, M. J. Acetylcholine-induced calcium signaling and contraction of airway smooth muscle cells in lung slices. J Gen Physiol. 119, (2), 187-198 (2002).
  17. Wohlsen, A., et al. The early allergic response in small airways of human precision-cut lung slices. Eur Respir J. 21, (6), 1024-1032 (2003).
  18. Wu, W., et al. Innate immune response to H3N2 and H1N1 influenza virus infection in a human lung organ culture model. Virology. 396, (2), 178-188 (2010).
  19. Zmora, P., et al. Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS One. 12, (5), 0176597 (2017).
  20. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, (5), 876-881 (2014).
  21. Lauenstein, L., et al. Assessment of immunotoxicity induced by chemicals in human precision-cut lung slices (PCLS). Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 28, (4), 588-599 (2014).
  22. Wild, L. G., Lopez, M. Occupational asthma caused by high-molecular-weight substances. Immunol Allergy Clin North Am. 23, (2), 235-250 (2003).
  23. Di Stefano, F., et al. Occupational asthma due to low molecular weight agents. Int J Immunopathol Pharmacol. 17, (2), Suppl 77-82 (2004).
  24. Buonsante, V. A., Muilerman, H., Santos, T., Robinson, C., Tweedale, A. C. Risk assessment's insensitive toxicity testing may cause it to fail. Environ Res. 135, 139-147 (2014).
  25. Boverhof, D. R., et al. Respiratory sensitization and allergy: current research approaches and needs. Toxicol Appl Pharmacol. 226, (1), 1-13 (2008).
  26. Johansson, H., Albrekt, A. S., Borrebaeck, C. A., Lindstedt, M. The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 27, (3), 1163-1169 (2013).
  27. Brismar, H., Patwardhan, A., Jaremko, G., Nyengaard, J. Thickness estimation of fluorescent sections using a CSLM. Journal of Microscopy. 184, (2), 106-116 (1996).
  28. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells. J Vis Exp. (122), (2017).
  29. Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 246, (3), 107-115 (2010).
  30. Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231, (1), 68-76 (2008).
  31. Niehof, M., et al. RNA isolation from precision-cut lung slices (PCLS) from different species. BMC Res Notes. 10, (1), 121 (2017).
  32. De Proost, I., et al. Purinergic signaling in the pulmonary neuroepithelial body microenvironment unraveled by live cell imaging. FASEB J. 23, (4), 1153-1160 (2009).
  33. Davidovich, N., Chhour, P., Margulies, S. S. Uses of Remnant Human Lung Tissue for Mechanical Stretch Studies. Cell Mol Bioeng. 6, (2), 175-182 (2013).
  34. Watson, C. Y., et al. Screening for Chemical Toxicity Using Cryopreserved Precision Cut Lung Slices. Toxicol Sci. 150, (1), 225-233 (2016).
Sitotoksik değerlendirilmesi ve insan hassas kesim akciğer dilimleri maddelerin etkileri Immunomodulatory
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neuhaus, V., Danov, O., Konzok, S., Obernolte, H., Dehmel, S., Braubach, P., Jonigk, D., Fieguth, H. G., Zardo, P., Warnecke, G., Martin, C., Braun, A., Sewald, K. Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (135), e57042, doi:10.3791/57042 (2018).More

Neuhaus, V., Danov, O., Konzok, S., Obernolte, H., Dehmel, S., Braubach, P., Jonigk, D., Fieguth, H. G., Zardo, P., Warnecke, G., Martin, C., Braun, A., Sewald, K. Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (135), e57042, doi:10.3791/57042 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter