Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

تقييم للسآمة للخلايا وإيمونومودولاتوري آثار المواد في شرائح البشرية دقة قطع الرئة

doi: 10.3791/57042 Published: May 9, 2018
* These authors contributed equally

Summary

وفي ضوء مبدأ 3Rs، تتطور نماذج الجهاز التنفسي كبدائل للدراسات الحيوانية. خاصة بالنسبة لتقييم مخاطر المواد الجهاز التنفسي، هناك نقص في فحوصات مناسبة. وهنا يصف لنا استخدام شرائح البشرية دقة قطع الرئة لتقييم المواد المحمولة جوا.

Abstract

أمراض الجهاز التنفسي في تنوعها الواسع بحاجة إلى أنظمة نموذجية ملائمة لفهم الآليات الكامنة وتمكينها من تطوير علاجات جديدة. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب تسجيل المواد الجديدة لتقييم المخاطر المناسبة مع نظم اختبار كافية لتجنب خطر الأفراد يتعرض للأذى، على سبيل المثال، في بيئة العمل. وتجري هذه التقييمات المخاطر عادة في الدراسات الحيوانية. في ضوء مبدأ 3Rs وشكوك الجمهور ضد التجارب على الحيوانات، تطورت البشرية أساليب بديلة، مثل الرئة دقة قطع شرائح (بكلس). تصف هذه الورقة التقنية السابقين فيفو بكلس البشرية لدراسة إمكانات immunomodulatory المواد الوزن الجزيئي المنخفض، مثل هيكساتشلوروبلاتيناتي الأمونيوم (هكلبت). وتتضمن نهايات سلسلة التفاعل المقاسة البقاء والتهاب الجهاز التنفسي المحلية، تميزت بتغيير إفراز السيتوكينات والمستقطبات. السيتوكينات الموالية التحريضية، عامل نخر الورم ألفا (تنف-α)، وانترلوكين 1 ألفا (إيل-1α) وقد زادت كثيرا في بكلس البشرية بعد التعرض لتركيز شبه سامة من هكلبت. على الرغم من أن قد تم تحسين أسلوب بكلس إلى حد كبير على مدى العقود الماضية، لا تزال قابليته لاختبار المرباة التنمية. ولذلك، النتائج المعروضة هنا بيانات أولية، على الرغم من أنها تظهر إمكانات بكلس البشرية كأداة قيمة في أبحاث الجهاز التنفسي.

Introduction

أمراض الجهاز التنفسي مثل الربو التحسسي، الربو المهني وأمراض الرئة انسداد الشعب الهوائية المزمن (COPD)، وانتفاخ الرئة والتهابات في الشعب الهوائية العليا والسفلي في الارتفاع وتمثل1،2أعباء صحية في جميع أنحاء العالم. نظم اختبار مناسبة مطلوبة، بغية التعرف على بعض الآليات الأساسية الكامنة وراء هذه الأمراض، بالإضافة إلى تطوير واختبار المواد المناسبة. وتركز على النتائج المكتسبة في فحوصات في المختبر أو في فيفو البحوث الأساسية، فضلا عن تطوير العقاقير السريري. ومع ذلك، قد هذه الاختبارات، حدود3. أولاً، استخدام الخلايا البشرية التي كانت معزولة وإزالتها من النسيج المجاور أو أجهزة فحوصات في المختبر و، وبالتالي لم تعد قادرة على التفاعل مع، أو أن يحمي الخلايا الأخرى3. وثانيا، غالباً ما لا تكون نماذج حيوانية قابل للترجمة للبشر بسبب الاختلافات في علم وظائف الأعضاء واختلاف البيوكيميائية4. من أجل الحد من هذه القيود، وفي سياق 3Rs (الاستبدال، والصقل، والحد) المبدأ5، نماذج بديلة جديدة تتطور باستمرار.

نماذج بديلة من الأنسجة البشرية ثلاثية الأبعاد، مثل بكلس، ارتباط بين القائم على الإنسان في المختبر ونماذج معقدة الحيوان في فيفو . بكلس تعكس عدم التجانس الوظيفي مع جميع أنواع الخلايا ذات الصلة الموجودة في الجهاز التنفسي6. بالإضافة إلى ذلك، يتميز بتقنية بكلس لاستنساخه بإعداد عدة شرائح رقيقة من سمك الدقيق من مانح واحد من أنسجة الحيوانية أو البشرية. وهذا يتيح رقابة داخلية، فضلا عن تركيزات مختلفة أو المخدرات لفحصها.

منذ عرض شرائح ملء أجار الرئة البشرية الأولى عام 1994 فيشر et al. 7 تقنية لتقطيع واستزراع أنسجة الرئة قد تحسنت إلى حد كبير. مارتن كريستيان et al. وقد تحسنت هذه التقنية لمزيد من التطبيقات الكيميائية والدوائية8. قدم مجموعتنا لهذا الأسلوب مارتن المسيحية في عام 2007. ومنذ ذلك الحين، اتسع نطاق تطبيق بكلس في البحوث من اختبار الاستجابات الوظيفية، مثل النقل الجوي9،10 وتضيق الأوعية11، إلى المناعية،13من الدوائية12،، واختبار السمية7 في الأنواع المختلفة في عدة مختبرات. على سبيل المثال، Schlepütz et al. 14 التحقيق الردود مجرى الهواء لاختلاف الأنواع ومقارنة الخلايا العصبية الطرفية تنشيط تنشيط الحقل الكهربائي (EFS) أو كبخاخات في الفئران، الجرذان، خنازير غينيا، الأغنام، والمراميز، والبشر. العثور على الأنواع المختلفة أنماط متميزة ولكنها مختلفة من برونتشوكونستريكشن العصبية بوساطة، وخلصت إلى أن هذه الحيوانات المختبرية شائعة الاستخدام (الفئران والجرذان) لا تعكس دائماً الاستجابة البشرية. لاختبار السمية الرئة وخفض عدد الحيوانات في هذا السياق، هيس et al. 15 قبل التحقق من الفئران بكلس كبديل السابقين فيفو لدراسات سمية الاستنشاق. وأسفرت هذه الدراسة قبل التحقق من صحة multicentric تطوير اثنين من نماذج التنبؤ باستخدام بكلس مع نتائج واعدة.

وعلاوة على ذلك، قد استخدمت في البحوث الأساسية، بكلس لتوضيح الكالسيوم مما يشير إلى16وأوائل استجابات حساسية17، والعدوى الفيروسية ردود18،19. التقدم التقني الجارية ويجري استكشاف مزيد من التقدم. على سبيل المثال، الحقل هو زيادة الاستفادة الأنسجة البشرية بتخزين وإعادة استخدام الأنسجة المجمدة. رروزنر et al. ووصف تقنية للتجميد والذوبان بكلس مورين أن يحافظ على قدرة الخطوط الجوية للتعاقد على التحفيز: ولذلك الأسلوب الذي يطيل الإطار ضيق الوقت التي تبقى الأنسجة قابلة للحياة، وحتى آخر يمكن تطبيق فحوصات على مر الزمن إلى أن الجهات المانحة نفسها20. وبالإضافة إلى هذه المنجزات البحثية، لوينستين et al. 21 التحقيق مؤخرا تقييم مخاطر المواد الكيميائية المختلفة التي قد تعمل كمحسسات المحتملة للربو المهني في بكلس البشرية.

الربو المهني، الأعراض التي هي عرقلة تدفق الهواء ومجرى الهواء هايبرريسبونسيفينيس، مشابهة للربو التحسسي، هو الناجمة عن التعرض لارتفاع الوزن الجزيئي (حمو)22 أو الوزن الجزيئي المنخفض (LMW) المواد23 (مثلاً ، مركبات البلاتين) في بيئة العمل. وكلاء LMW توعية عالية محتملة عند تشكيل haptens وربط للناقل البروتينات21. يتطلب التسجيل لمواد كيميائية جديدة حمو أو LMW في المختبر و في فيفو تقييم المخاطر فيما يتعلق بتوعيتهم المفترضة المحتملة (على سبيل المثال-، 429 المبدأ التوجيهي في الميدان)24. الاختبارات المستخدمة لتحديد توعية المفترضة المحتملة، ومع ذلك، كانت لا مصممة أصلاً لتقييم المخاطر من مثيرات الجهاز التنفسي، ولكن للاتصال محسسات، على الرغم من أن هناك على ما يبدو بعض التطابق لمجموعة فرعية صغيرة من المواد25 . العمل الذي يقوم به لوينستين et al. صمم كجزء من مشروع الاتحاد الأوروبي Sens-تكنولوجيا المعلومات-رابعا، وضع استراتيجيات اختبار بديلة لتقييم المخاطر للاتصال المفترضة أو الرئة محسسات21. لهذا المشروع، ركزنا على اختبار قابليتها للاستخدام البشري بكلس كأداة اختبار بديلة. ولذلك، تم تحديد مجموعة من immunomodulatory نقاط النهاية (إفرازمثلاًوالجدوى وسيتوكين) لتحديد إمكانات مهيجة أو تحريضية للمواد الكيميائية، مثل مركبات LMW البلاتين. لوينستين et al. ، العثور على لا نمط العامة التي يمكن تطبيقها على جميع محسسات الجهاز التنفسي؛ ومع ذلك، وفر عملهم الأساس للبروتوكولات نشرت مؤخرا26.

في ملخص، ينص البروتوكول على المقدمة هنا لإعداد والتعرض اللاحقة من بكلس البشرية وسيلة مفيدة للتقييم للرئة السمية المحتملة و/أو المواد إيمونومودولاتوري التي يمكن أن تشارك في تطوير الجهاز التنفسي الأمراض، مثل الربو المهني.

Protocol

تجارب مع بكلس البشرية يجب تنفيذها وفقا مدونة قواعد السلوك "الرابطة الطبية العالمية" وأقرته لجنة الأخلاقيات المحلية (التجارب بكلس المثالي هو موضح هنا كانت وافقت عليها اللجنة الأخلاقية المحلية هانوفر كلية الطب؛ رقم 2701-2015). مطلوب الموافقة الخطية لاستخدام المواد الرئة البشرية من جميع الجهات المانحة المرضى أو أقاربهم. تم التوصل إلى النتائج الوارد وصفها في هذه المخطوطة مع شرائح الأنسجة من الجهات المانحة من مختلف الإعمار والجنسين، والتاريخ الطبي والسبب للاستئصال، وأن كان معظم الأنسجة الواردة من المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة. واستخدمت فقط خالية من ورم الأنسجة للتجارب.

1-العامة إعداد بكلس البشرية واللاحقة من التعرض للمواد الكيميائية

ملاحظة: مطلوبة شخصين لملء الرئة. ويوصي بسجل حديثة تطعيم لالتهاب الكبد A و B. يجري فحص المرضى بصورة روتينية لفيروس نقص المناعة البشرية وفيروس التهاب الكبد جيم قبل زرع الرئة. إذا كان تشخيص عدوى نشطة مع بكتريا السل أو يشتبه، ينبغي أن ترفض في الرئة. ومع ذلك، جميع أنسجة الرئة البشرية الطازجة والعينات المستمدة من أنها يجب أن تعامل كما يجب اتخاذ تدابير وقائية يحتمل أن تكون معدية والمقابلة (الجسيمات أقنعة تصفية (FFP2)، والنظارات الواقية، القفازات) لضمان السلامة المهنية الموظفين. الإجراء الذي يستغرق 60-90 دقيقة.

  1. تأكيد إينتاكتنيس الفص الرئة البشرية.
    ملاحظة: يمنع إصابته بتمزق في غشاء الجنب ملء متجانسة من الأنسجة. يجب أن تكون المواد الرئة البشرية ابتداء من يوم الاستئصال. يسمح بفترات تخزين حوالي 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل تعبئته مع [اغروس] على الجليد. يتم الحصول على المرضى الذين يخضعون لاستئصال الأنسجة التي نستخدمها في هذا البروتوكول. ليس من المرضى المتوفين. إذا تم تخزين الأنسجة على الجليد، قبل الحارة إلى RT قبل ملئه وخلاف ذلك سوف بلمرة [اغروس] الفور، ولا ملء متجانسة لن يكون ممكناً.
    تنبيه: تأكد من أن جميع الأشخاص الذين على اتصال بالمواد البشرية الأصلية وضعت على الملابس الواقية التي تتألف من معطف مختبر واثنين من أزواج من القفازات، كاب، قناع الوجه، وزوج من نظارات السلامة. المواد البشرية يحتمل أن تكون معدية.
  2. تزن 7.5 غ] من [اغروس] التبلور منخفضة وإضافته إلى 250 مل الماء المقطر مرتين. يغلي [اغروس] في فرن ميكروويف حتى يذوب في [اغروس]. بارد عليه إلى حوالي 40 درجة مئوية، تبعاً لدرجة الانصهار والتبلور [اغروس].
    ملاحظة: قوارير عدة مطلوبة، تبعاً لحجم الفص.
  3. قبل الحارة والحفاظ الثقافة المتوسطة (جدول المواد) عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: إذا كان [اغروس] حار جداً، الفيتامينات في الأجلين المتوسط والثقافة سوف تفقد فعاليتها وخلايا وسوف يكون معطوباً. إذا كانت درجة حرارة متوسطة/[اغروس] الحل أقل من 37 درجة مئوية، سوف تبدأ عملية التبلور وتنال من ملء متجانسة في الرئة. ويوصي بنطاق درجة حرارة 37 درجة مئوية إلى 39 درجة مئوية فقط.
  4. وضع جميع المواد المطلوبة في متناول اليد قبل البدء: 5-10 والمشابك، قسطرة مرنة من طول 1 متر تقريبا، حقنه مناسبة (مثلاً، 50 مل) من المناسب الاتصال بالقسطرة، وجليد مربع مليئة بالجليد.
  5. كانولاتي القصبات الهوائية القصبة الهوائية ماين بإدخال أنبوب سيليكون وفيكساتينج أنه مع المشبك الموجهة نحو مواز للأنبوب، حيث أن المشبك يعصر الأنسجة معا جنبا إلى جنب مع أنبوب سيليكون دون معسر قبالة. تحقق من أن أنبوب سيليكون هو تركز اهتمامها داخل ولا تنزلق بها أثناء عملية الملء. إغلاق جميع القصبات الهوائية والأوعية الدموية وإصابات مع المشابك، حيث أن [اغروس] لا يمكن أن يتسرب أثناء عملية الملء.
  6. مزيج بحجم يعادل 3% التبلور منخفضة [اغروس] مع ثقافة متوسطة في كوب. غرس المخلوط في الرئة باستخدام حقنه 50 مل. قبل إعادة ملئها المحاقن مع المتوسطة، أغلق المشبك القسطرة مع الأصابع أو المشبك لتجنب فقاعات الهواء وارتداد [اغروس]. ملء الفص الرئة حتى هي مبالغ فيها تماما. عناية لمس الجنب الرئة في الجهة؛ ينبغي أن يكون الجنب بل والثابت.
    ملاحظة: تبعاً لحجم الفص الرئة، حتى ل 2 أو 3 من حل [اغروس] والمتوسطة يمكن أن تكون مطلوبة.
  7. كرر الخطوات من 1.5-1.6 لكل القصبات الهوائية في حالة عدة القصبات داخل عينة واحدة.
  8. وضع الرئة على الجليد البلمرة [اغروس] جل مدة 20-40 دقيقة، اعتماداً على مقدار عميق [اغروس]. عناية لمس الجنب على الجانبين عدة التحقق من ما إذا كان من الثابت وبارد، مما يشير إلى أن البلمرة كاملة، وإلا الاستمرار في الانتظار. فلسوف مقطعة شرائح الرئة الباثولوجيا وأخذ العينات الخاصة بهم وتخزين المواد الرئة على الجليد للنقل.
  9. قطع أنسجة الرئة البشرية إلى ألواح 3-5 سم بسكين حادة.
    ملاحظة: استخدام شفرة جديدة لكل الرئة للتأكد من الحدة.
  10. ملء تقطيع اللحم والأنسجة مع 400 مل إيرل المثلج لحل متوازن الملح (ابس). فورا قطع الأنسجة أسطواني النوى من ألواح الرئة باستخدام مفك شبه الآلي مع أداة المستخدمة لقطر المفضل (مثلاً، 8 مم، 10 مم).
    ملاحظة: يجب أن يكون هذا القطر يساوي قطر حامل مناديل داخل الجهاز.
  11. ضبط سمك شرائح الرئة إلى قيمة سمك المرجوة.
    ملاحظة: يستخدم بسمك حوالي 250 ميكرومتر عادة في التجارب بكلس. الشركة المصنعة لتقطيع اللحم والأنسجة توصي بها "قياس سماكة شريحة الأنسجة" لتحقق سمك الشريحة. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام كل-جبل تلطيخ جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري [كنفوكل] لتحديد سمك الشريحة كما هو موضح بريسمار et al. 27
  12. نقل النوى الأنسجة في الأنسجة حامل لتقطيع الأنسجة. وضع على الوزن (جزء من حامل مناديل) على رأس صلب النسيج. تعيين سرعة الذراع وسرعة النصل إلى 6 في تقطيع الأنسجة. بدء تشريح الأنسجة الأساسية في بكلس.
  13. تكملة 500 مل من النسر المتوسطة تعديل (دميم المتاحة تجارياً دولبيكو): "مزيج المغذيات" F-12 DMEM/F12 (1:1) مع 5 مل من البنسلين (10,000 وحدة/مل) وستربتوميسين (10,000 ميكروغرام/مل). تخزين متوسطة الثقافة لعدة أيام تحت ظروف معقمة في ثلاجة. قبل الحارة فقط المطلوب حجم متوسط.
    ملاحظة: سوف يكون إبطال البنسلين إذا أبقى على 37 درجة مئوية لفترات أطول. استخدام المصل خالية وخالية من صبغة الثقافة المتوسطة، كما يختلف تكوين المصل من دفعة لدفعة والأصباغ، مثل الفينول الحمراء، يمكن أن تتداخل مع فحوصات.
  14. ملء طبق بتري (100 × 15 ملم) مع 25 مل المثلج الثقافة المتوسطة. ينبغي أن ينضب المتوسطة خارج مشرحة الأنسجة في كوب بفتح المشبك الاسطوانة الزجاجية. نقل الشرائح من كوب إلى طبق بتري مع الثقافة المتوسطة باستخدام المحاليل (مثلاً، حلقة التطعيم). وضع طبق بتري حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2، الرطوبة 100 ٪). تسمح وسيلة لالاحماء قبل الغسيل الخطوات.
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات الأخرى تحت ظروف معقمة.
  15. وضع مصفاة خلية في صحن بتري للغسيل بكلس. تماما إزالة المتوسطة الثقافة مع ماصة مصلية 10 مل من خلال مصفاة الخلية وإضافة 25 مل متوسطة جديدة قبل حرارة 37 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة 3-4 مرات كل 30 دقيقة.
    ملاحظة: يمنع مصفاة الخلية الشرائح من الانجرار إلى الماصة، لتجنب أي ضرر للشرائح.
  16. نقل الشرائح الرئة بعناية في لوحة ثقافة 24-جيدا مع حد أدنى من 500 ميليلتر الثقافة المتوسطة شريحتين كل بئر. تعرض أنسجة الرئة للمواد (انظر الخطوات 3.1-3.4)، مثلاً، عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2.
    ملاحظة: للنقل، يفضل استخدام حلقة تطعيم وتعويم شرائح على التكرار الحلقي للحيلولة دون تلف الأنسجة. ويلزم أي فصل المزيد من الشرائح، كما فقط النقص في متوسطة جديدة كافية سوف الحث على موت الخلايا في شرائح الأنسجة. يمكن أن تتداخل مع شرائح أو لمس كل منهما الآخر في البئر: هذا ليس له أي تأثير على صلاحية الأنسجة.
  17. وضع جميع المواد البشرية المتبقية قارورة بلاستيك مع مثبت (مثلاً، 10% مخزنة فورمالدهايد) لمالا يقل عن 24 ح وحرق هذا في عملية التخلص منها.
    تنبيه: فورمالدهايد السامة، وتنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء محرك السيارة.

2-نسيجية تحليل بكلس

  1. إعداد أشرطة الكاسيت خزعة مع اثنين من منصات رغوة غارقة في مثبت (على سبيل المثال-، مخزنة 4% فورمالدهايد). مكان بكلس بين الوسادات الرغوية في كاسيت خزعة وعلى الفور نقل الأنسجة إلى حل مثبت. مخزنة إصلاح الأنسجة بين عشية وضحاها في 4% فورمالدهايد.
  2. عملية النسيج البارافين التضمين بالتجفيف عينات في الإيثانول (70%، 90%، 100%، 100%، 100%، 100%) لكل، 1 ح متبوعاً بالغسيل في زيلين نفط (3 × 1 ح) والبارافين السائل (3 × 1 ح) وفقا للبروتوكولات القياسية الأنسجة.
  3. نقل بكلس إلى العفن تضمين. استخدم حلقة تطعيم. تضمين الأنسجة بكلس في البارافين السائل. تأكد من وضع الأنسجة بالتساوي في القالب عند الصب في كتلة البارافين.
  4. خفض كتلة الأنسجة التي تحتوي على بكلس مع مبضع دوارة حتى لديه سطح مسطح وحتى. تأخذ مقاطع المسلسل للسمك المطلوب (مثلاً.، 4 ميكرومتر)، قد تمت معالجته بوضعها على حدة على التتالي ترقيم الشرائح المغلفة الزجاج (عادة 25-30 يمكن أن تؤخذ الأجزاء) حتى بكلس كله.
  5. وصمة عار الشرائح الزجاجية واحد (كل الأبواب 8-10) مع وصمة الهيماتوكسيلين وويوزين (H & E) للتوجيه. حدد المقاطع للتجربة استناداً إلى اتجاه الشرائح (المقاطع 8 الأولى والأخيرة عادة غير مكتملة).
    ملاحظة: (اختياري) لتخزين طويلة، يمكن انخفضت الشرائح في البارافين السائل للحفاظ على.

3-إعداد حلول للمواد

ملاحظة: إعداد حلول العمل وضوابط مباشرة قبل الاستخدام.

تنبيه: تعامل مع المواد وفقا لتعليمات السلامة، أو إذا كان غير معروف، كما يمكن أن تكون ضارة واتباع احتياطات السلامة الروتينية.

  1. حل المواد للذوبان في الماء مباشرة في الثقافة المتوسطة. للمواد الكيميائية القابلة للذوبان ضعيفة أو غير قابلة للذوبان، أولاً حل المضمون في المذيبات المناسبة تبعاً لقابلية الذوبان في الجوهر. المواد التي لها القابلية للذوبان في المياه المحدودة (< 0.1 مغ/مل) يمكن حله، على سبيل المثال، في [دمس] أو الإيثانول. ينبغي أن يحدد التركيزات المذيبات السامة عدم المعايرة مسبقاً. تأكد من أن المواد لا يعجل من الحل عندما تضعف في المتوسط.
    ملاحظة: يتم إعداد حلول كبريتات (سلس) لاوريث هكلبت والصوديوم.
  2. إعداد مضمون الحلول الأسهم في معززات لأعلى تركيز المطلوب في الثقافة المتوسطة أو المذيبات. وزن 12.5 ملغ هكلبت وملغ 34.4 سلس وإعداد الحلول الأسهم بإذابة المواد الكيميائية في 1 مل الثقافة المتوسطة.
    ملاحظة: مطلوب لا مذيب لهذه المواد الكيميائية.
  3. إعداد إضعاف 1: 100 في متوسط حرارة ما قبل نهائية. في حالة استخدام المذيبات السابقة، نتائج هذا النهج في نفس تركيز المذيبات النهائي لكل مادة تركيزات.
  4. استخدام تركيز المذيبات النهائي (مثلاً، 1% كما هو موضح في الخطوة 3، 3) لمعالجة الإشارة بكلس. وكان أي سيطرة المذيبات المطلوبة للمواد الكيميائية المذكورة في قسم النتائج.

4-مراجع الإيجابية والسلبية لفحوصات سيتوتوكسيسيتي

  1. لجميع فحوصات السلامة، إعداد الضوابط الإيجابية والسلبية التالية:
    1. مراقبة الأنسجة: احتضان بكلس في مستنبت فقط كمرجع لغير المعالجة بكلس على 24 ساعة في ظروف ثقافة الخلية (37 درجة مئوية، 5% CO2، الرطوبة 100 ٪).
    2. التحكم بالسيارة (إذا لزم الأمر): احتضان بكلس مع تركيز المذيبات النهائي كمرجع بكلس تعامل مع السيارة فقط (راجع الخطوة 3، 4) عن 24 ساعة في ظروف ثقافة الخلية (37 درجة مئوية، 5% CO2، الرطوبة 100 ٪).
    3. الرقابة الإيجابية: احتضان بكلس مع المنظفات 1% في المخزن المؤقت الحل ح 1 في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: إذا كان بكلس يصبح عديم اللون، ميت الأنسجة. يتم تحديد مجموع L-لاكتات نازعة (رابطة حقوق الإنسان) في المادة طافية، امتصاص ما يقارب 1.9-2.3 (انظر الخطوات 6، 1-6، 4). يتم استخدام الأنسجة للفحص WST-1 (انظر الخطوات 5.1-5.5)، مع استيعاب من حوالي 0.

5-قياس سيتوتوكسيسيتي التي يسببها كيميائيا في بكلس البشرية بمقايسة WST-1

ملاحظة: يتم إجراء المقايسة WST-1 في لوحة 24-جيدا مع بكلس اثنين كل بئر. ويفضل استخدام تكرارات لكل معلمة وتجميع نتائج هذه التكرارات بعد القياس.

  1. إعداد الحل العامل بتمييع الكاشف WST-1 في المتوسط فورا قبل البدء. المبلغ المطلوب لحل عملي 250 ميليلتر/جيدا من صفيحة 24-جيدا. ولذلك، مزيج من 25 ميليلتر من الكاشف مع 225 ميليلتر من مستنبت لبئر واحدة.
  2. بعد حضانة بكلس من الخطوة 1، 16، تجاهل أو استخدام المادة طافية للقياسات سيتوكين أو اختبارات أخرى مثل المقايسة رابطة حقوق الإنسان. يتم استخدام الأنسجة المتبقية للخطوة التالية.
  3. بيبيت 250 ميليلتر لتركيز عمل الكاشف WST-1 كل جيدا واحتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 حاء 1 ضمان أن بكلس مشمولة تماما الكاشف WST-1 أثناء الحضانة.
  4. وضع اللوحة على شاكر مداري (200 لفة في الدقيقة) واهتز بعناية لمدة 30 ثانية لضمان خلط دقيق للكاشف WST-1. تأخذ لوحة 96-جيدا أسفل شقة جديدة وبيبيت 100 ميليلتر في التكرارات من المادة طافية من كل بئر من لوحة 24-جيدا.
  5. قياس الامتصاص لكل بئر في 450 نانومتر (المرجع: 630 nm) استخدام قارئ ميكروسكوبية. طرح الاستيعاب في 630 نيوتن متر من 450 نانومتر. وسوف تستخدم هذه القيم للعملية الحسابية في الخطوة 5، 6).
    ملاحظة: يمكن الحصول على بيانات موثوقة لتقييم سيتوتوكسيسيتي فقط من الأنسجة قابلة للحياة. ولذلك، هذه معايير القبول التي نشرتها هيس et al. 15 ينبغي أن تتحقق في كل تجربة. في حالة عدم استيفاء هذه المعايير، يجب تكرار هذه التجربة.
  6. ينبغي أن يكون الاستيعاب لعنصر التحكم المتوسطة غير المعالجة أعلاه 0.6، خلاف ذلك ينبغي تكرار هذه التجربة. إذا كانت البيانات تفي بهذا الشرط، تعيين قيمة امتصاص الأنسجة عنصر التحكم إلى 100% وحساب WST-1 الحد من العينات المعالجة فيما يتعلق بمراقبة الأنسجة.

6-رابطة حقوق الإنسان بالانزيم

ملاحظة: يتم إجراء المقايسة رابطة حقوق الإنسان في صفيحة 96-جيدا مع 100 ميليلتر الثقافة طافية في المجموع بعد فترة الحضانة بعد انتهاء.

  1. بعد حضانة بكلس مع أو بدون وكلاء الاختبار، تأخذ 50 ميليلتر من المادة طافية من الخطوة 1، 16 وتحويلها في التكرارات إلى لوحة 96-بئر جديدة. يقوم هذا بإنشاء تكرارات من كل تعامل جيد من لوحة 24-جيدا.
  2. إعداد حل العامل الكاشف رابطة حقوق الإنسان فورا قبل المقايسة. حل العامل يتكون من الحل محفز (ليوفيليساتي المذابة في الماء بيديستيليد 1 مل) وصبغ الحل تم توفيره بواسطة الشركة المصنعة. للوح 96-بئر واحد، مزيج دقيق ميليلتر 125 من حل محفز مع 6.25 مل من محلول صبغة.
    تنبيه: لا تعرض حلاً للضوء المباشر.
  3. بيبيت 50 ميليلتر الحل العامل إلى كل جيدا ميليلتر 50 تحتوي على الفعل من المادة طافية واحتضان لوحة لمدة 20 دقيقة في RT في الظلام. مطلوب إجراء أي خلط.
  4. قياس الامتصاص لكل بئر في 492 نانومتر (المرجع: 630 nm) استخدام قارئ ميكروسكوبية. طرح الاستيعاب في 630 نيوتن متر من 492 شمال البحر الأبيض المتوسط. وسوف تستخدم هذه القيم للعملية الحسابية في الخطوة 6، 5.
    ملاحظة: يمكن الحصول على بيانات موثوقة لتقييم سيتوتوكسيسيتي فقط من الأنسجة قابلة للحياة. ينبغي أن يكون الاستيعاب لمراقبة معاملة المنظفات أكثر من 1.
  5. للتحليل، بتعيين قيمة امتصاص عنصر إيجابي من الخطوة 4، 1% 100 وحساب الإفراج عن رابطة حقوق الإنسان في العينات المعالجة فيما يتعلق بمراقبة إيجابية (أي، الحد الأقصى من الإفراج عن رابطة حقوق الإنسان).

7-المجهري مقايسة البقاء مع مجهر مسح ليزر [كنفوكل] (كلسم)

ملاحظة: للفحص المجهري البقاء، اثنين من بكلس 250-ميكرومتر-سميكة العادية هي الملون في 250 ميليلتر/جيدا من صفيحة 24-جيدا. كما يتم تصويرها كل شريحة على حدة، لا توجد تكرارات إضافية مطلوبة.

  1. بعد حضانة بكلس مع أو بدون عناصر الاختبار، تجاهل المادة طافية أو استخدامه للقياسات سيتوكين أو اختبارات أخرى مثل المقايسة رابطة حقوق الإنسان. استخدام الأنسجة المتبقية للإجراء الموضح هنا.
  2. إعداد إضعاف العامل هوموديمير كالسين-صباحا واثيديوم 1 (اتهد-1) مع تركيز عمل لكل الكواشف 4 ميكرومتر في المتوسط الثقافة. لهذا الغرض، إضافة 1 ميليلتر من كالسين-صباحا (4 مم) و 2 ميليلتر اتهد-1 (2 مم) إلى 997 المتوسطة الثقافة ميليلتر. وحدة التخزين هذه مطلوب لوصمة عار الآبار 4 مع كل اثنين بكلس.
    ملاحظة: تجنب التعرض للمواد الكاشفة الضوء المباشر.
  3. بيبيت 250 ميليلتر لتمييع العمل في كل جيدا واحتضان لوحة 24-جيدا لمدة 45 دقيقة في RT في الظلام. وضع اللوحة على شاكر مداري 150 لفة في الدقيقة أثناء الاحتضان لضمان أفضل من التعرض للأنسجة في حل المصبوغة.
  4. وبعد 45 دقيقة، تجاهل الحل المصبوغة وتغسل بكلس مع 1 مل المخزن المؤقت الحل عن طريق تهتز عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 3-5 دقيقة في RT في الظلام. كرر هذه الخطوة مرتين.
  5. تطبيق 500 ميليلتر من المخزن المؤقت الحل لكل بئر المحتوية على بكلس الملون لتفادي أوتوفلوريسسينسي من الثقافة المتوسطة. لتقييم مجهرية، أداء اثنين على الأقل من مداخن z موزعة عشوائياً مع كلسم.
  6. انقر فوق علامة التبويب العين لاختيار من 10 ×/0.3 الهدف وانقر على الإنترنت لاستخدام كلسم في مجهر خفيفة قياسية للعثور على سطح بكلس. انقر فوق اتصال لإنهاء الإعداد العين.
  7. انقر فوق علامة التبويب اقتناء وتشغيل الليزر مناسب فلوروفوريس.
    ملاحظة: كنا ليزر أرجون مع طول موجه 488 نانومتر كالسين صبغ بوليانيونيك (الطول الموجي الإثارة من 495 نانومتر) وزناد ليزر مع طول موجه 543 نانومتر للكشف عن مجمع اتهد-1/الحمض النووي (الطول الموجي الإثارة من 533 nm). يجب تشغيل ليزر الأرجون عموما في 30-50% من الحد الأقصى الحالي لتمكين حالية أنبوب حوالي 5.7 ألف، كما هذا يطيل عمر الليزر إلى حد كبير.
  8. انقر فوق مسار الضوء تحت علامة التبويب اقتناء وإعداد المرشحات اللازمة ومرايا للتجربة.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، استخدمت نظام يستند إلى عامل التصفية مع مقسم الرئيسي شعاع مزدوج اللون (على سبيل المثال.، HFT 488/543) فصل الضوء الإثارة والانبعاثات. من خلال مرآة تعكس توجه هذا الضوء إلى التقسيم شعاع مزدوج اللون الثانوي (مثلاً، NFT 545) لزيادة منفصلة الضوء المنبعث من العينة في قناتين.
  9. إعداد شريط تمرير عوامل التصفية (مثلاً، BP 505-530 للإشارة كالسين وشركة بريتيش بتروليوم 560-615 إشارة معقدة اتهد-1/الحمض النووي) التي تحيل مجموعة معينة فقط من الأطوال الموجية وتعيين إشارة كالسين لقناة 2 والإشارات المعقدة اتهد-1/الحمض النووي للقناة 3.
  10. تحقق من مربع Z-مداخن لتعيين الحدود العليا والسفلي للحجم المجهري. اضغط على زر لايف لمشاهدة طريقة عرض مباشر من الطبقة المقابلة على الشاشة. نقل التركيز أعلى أو لأسفل إلى العثور على سطح بكلس مع إشارة حادة.
  11. انقر فوق في الجزء الفرعي القنوات وحدد المربع إظهار الكل. تأمين الجدول بالضغط على زر قناة المقابلة تحت الصورة الحية وتنشيط قناة لون.
    ملاحظة: لون أزرق في الصورة الحية سوف تبين أن هناك لا إشارة، في حين سوف تظهر إشارة عالية في الأبيض وسوف تظهر إشارة تعريض باللون الأحمر.
  12. تعيين الثقب للقناة الحمراء اتهد-1 إلى 1 وحدة المشرقة لمفاضلة أفضل بين كفاءة جمع الخفيفة وتمزيقها الضوئية وضبط قناة كالسين تبعاً لذلك. زيادة الكشف عن إشارة من المكسب أن يظهر الأبيض لكن الأحمر لا في صورة حية مع تنشيط قناة لون سجن الجدول.
    ملاحظة: أن المكسب الرئيسي ينبغي أن لا تتجاوز 600 وحدة.
  13. زيادة أو إنقاص الإزاحة الرقمي لضبط الخلفية مثل فإنه يظهر باللون الأزرق في الصورة الحية مع تنشيط قناة لون سجن الجدول.
  14. انقر فوق علامة التبويب المكدس Z تحت "حيازة متعدد الأبعاد" واستخدام التركيز للتحول إلى z-طبقة فائدة. اضغط تعيين أول لحفظ هذا الموقف لاقتناء الأحدث. تحويل التركيز ببطء لأعلى أو لأسفل حتى تم التوصل إلى مجموعة من 30 ميكرومتر واضغط تعيين آخر لحفظ.
  15. انقر فوق على العيش مرة أخرى إلغاء تنشيط الصورة الحية واضغط على بدء التجربة لبدء التصوير.
    ملاحظة: يتم الكشف عن الأنسجة قابلة للتطبيق من خلال الأسفار كالسين صبغ بوليانيونيك. يتعرضون للخلايا الميتة بتشكيل معقد اتهد-1 والأحماض النووية.

8-صورة التقديم

ملاحظة: توصية صورة تقديم البرامج الكمبيوتر يجب أن تؤخذ في الاعتبار، كما يتطلب هذا البرنامج الأجهزة المناسبة.

  1. تحميل الملف LSM المكتسبة من تلطيخ صلاحية مجهرية من بكلس (راجع القسم 7) في صورة تقديم البرامج. احفظه كملف.ims قبل المتابعة. تعيين كافة المعلمات على الأنسجة التحكم عن بعد وتطبيق ذلك على جميع الصور. مسموح بإجراء أية تغييرات إضافية.
  2. استخدم الزر حجم للتعمير سطح الأنسجة قابلة للتطبيق (صبغة كالسين) ("الشكل التكميلية" 1A) والزر البقع لنواة الخلية ميتة (الشكل التكميلي ح 1). عند عرض إحدى القنوات، إيقاف تشغيل القناة الأخرى في إطار تعديل العرض.
  3. ابدأ بتقديم حجم الأنسجة الحيوية: تعيين القناة للسطح ومعالجة الصورة بأكملها، وتعيين عامل السلس إلى 0.5 ميكرومتر واستخدام الكثافة المطلقة لعتبة ("تكميلية الشكل" 1B، ج). اضغط على السهم الأزرق إلى الأمام.
  4. ضبط عتبة الكثافة المطلقة لحجم أعيد بناؤها؛ ينبغي طرح شدة الضوضاء والخلفية. يظهر تراكب السطحية في الرمادي، ويجب أن تكون دقة التغطية السطحية التحقق (تكميلية الشكل 1). بعد الانتهاء من التعديل، اضغط على السهم الأزرق إلى الأمام. معظم الوقت هذه الخطوة غير مطلوبة من أجل حساب إعدادات. إذا كان البرنامج غير قادرة على حساب وحدة التخزين، وزيادة عامل السلس.
  5. في الخطوة الأخيرة، اختيار عامل تصفية. استخدم عامل التصفية كروية (مع حوالي 10 ميكرون) للتقديم السطحية لتصفية الضامة في الفضاء السنخية (1E الشكل التكميلية). اضغط على الزر الأخضر إلى الأمام.
  6. بصريا ضبط الصورة الإخراج والتصدير الإحصاءات كملفات.xls. سيتم استخدام الحجم الإجمالي (sum) لمزيد من التحليل ("تكميلية الشكل" 1F، ز). حفظ الإعدادات واستخدامها لجميع تحليلات أخرى z-مداخن المتخذة في نفس اليوم مع نفس الإعدادات كلسم (1I الشكل التكميلية).
  7. إعادة بناء القناة الحمراء (البقع) لنواة الخلية ميتة. عشوائياً على قياس حجم النقطة في ميكرومتر القياس في إطار تفوق؛ حجم نقطة تقريبا 5 ميكرومتر تمكين العلامة وتعيين حجم نقطة. تحقق ما إذا كان يتم وضع علامة على جميع النقاط ويتم احتساب كل نقطة مرة واحدة فقط. تصحيح يدوياً إذا لزم الأمر ("تكميلية الشكل" 1B, H, J). اضغط على السهم الأزرق إلى الأمام.
  8. اضغط على الزر الأخضر إلى الأمام للسماح للبرنامج حساب/حساب العدد الإجمالي للنقاط وفقا للمعلمات تعيين وتصدير النتيجة كملف.xls (تكميلية الشكل 1 ك، ل، م). لتحليل الصورة البيانية أو الإحصائية تعيين عدد الأنوية المحتسبة خلية ميتة في نسبة إلى حجم الأنسجة الحيوية.

9-قياس السيتوكينات والمستقطبات في بكلس البشرية

ملاحظة: الاستجابة المناعية سيتوكين وتشيموكيني يمكن قياس اكستراسيلولارلي في المادة طافية الثقافة وإينتراسيلولارلي في ليساتيس الأنسجة بعد فترة الحضانة. أليسا يقاس في التكرارات في صفيحة 96-جيدا مع 100 ميليلتر/جيدا.

  1. تحضير حلاً منظفات 1% بخلط 5 مل منظفات مع 495 مل من محلول المخزن المؤقت. ويمكن تخزين الحل في RT لعدة أشهر.
  2. مزيج الحل المنظفات 1% مع مثبط البروتياز (PI) بنسبة 1: 500. ويعتمد المبلغ المطلوب على لوحة الثقافة؛ على سبيل المثال، استخدام 500 ميليلتر/بئر صفيحة 24-جيدا. لبئر واحدة، يخلط 1 ميليلتر بي 499 ميليلتر من المنظفات الحل.
  3. إعداد أنابيب مع 1 ميليلتر من حل بي وجمع 500 ميليلتر للثقافة طافية في هذه الأنابيب. فورا بدلاً من 500 ميليلتر محلول مسحوق الغسيل يحتوي على PI كما أعد الخطوة 9.2 المتوسطة في لوحة 24-جيدا. الأنسجة ح 1 بوضع لوحة 24-جيدا في 4 درجات مئوية. بيبيت الأنسجة في أنبوب جديد وتخزين هذه الأنابيب في-80 درجة مئوية إلى مزيد من التحليل.
    ملاحظة: بروتوكول أليسا يعتمد إلى حد كبير على الشركة المصنعة، وينبغي اتباع إرشادات الشركة المصنعة. ويرد في ما يلي أليسا بروتوكول قياسي.
  4. أداء أليسا لقياس مستويات سيتوكين في طافية أو وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. لقياس 1α إيل وتنف-α، معطف لوحة a96 جيدا قبل بيبيتينج ميليلتر 100 من جسم التقاط (لتمييع اتبع إرشادات الشركة المصنعة)، واحتضان بين عشية وضحاها في الرايت
  5. إعداد المخزن المؤقت للغسيل بتذويب لوح غسيل المخزن مؤقت في 1 لتر مياه بيديستيليد. قم بإزالة جسم التقاط بيبيت 400 ميليلتر الغسيل المخزن المؤقت في كل بئر. قم باستبدال هذا المجلد ثلاث مرات. كتلة اللوحة عن طريق إضافة الحل حظر (مثلاً، 1% جيش صرب البوسنة في الحل المخزن المؤقت، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة). تبني على RT ح 1.
    ملاحظة: تتطلب القياسية المتوفرة تجارياً الساس 2 × 100 ميليلتر من الأنسجة طاف أو ليستي. ينبغي أن تكون العينات المذابة مرة واحدة فقط قبل استخدام. اعتماداً على حساسية المقايسة وعلى سيتوكين المفرج عنهم، يجب أن تضعف العينات قبل القياسات. ولذلك، يضعف العينة في الكاشف تقدمها المقايسة.
  6. إزالة الحل حظر وإضافة عينات المخفف للمنحنى المعياري (لتمييع اتبع إرشادات الشركة المصنعة) ومن 100 ميليلتر من الأنسجة طاف أو 100 ميليلتر من الأنسجة في التكرارات التي تم جمعها في الخطوة 9، 3. احتضانها ح 2 في الرايت
  7. قم بإزالة عينات بيبيت 400 ميليلتر الغسيل المخزن المؤقت في كل بئر. قم باستبدال هذا المجلد ثلاث مرات. بيبيت 100 ميليلتر بيوتينيلاتيد الكشف عن الأجسام المضادة (لتمييع اتبع إرشادات الشركة المصنعة)، واحتضان ح 2 في الرايت
  8. قم بإزالة الأجسام المضادة بيبيت 400 ميليلتر الغسيل المخزن المؤقت في كل بئر. قم باستبدال هذا المجلد ثلاث مرات. إضافة 100 ميليلتر/بئر HRP المسمى ستريبتافيدين (لتمييع اتبع إرشادات الشركة المصنعة)، واحتضان لمدة 20 دقيقة في الرايت (راجع إرشادات الشركة المصنعة).
  9. إزالة ستريبتافيدين وبيبيت 400 ميليلتر الغسيل المخزن المؤقت في كل بئر. قم باستبدال هذا المجلد ثلاث مرات.
  10. إضافة 100 ميليلتر من الركازة (الذي أوصت به الشركة المصنعة)، واحتضان لمدة 20 دقيقة في الظلام (راجع إرشادات الشركة المصنعة).
    ملاحظة: هذه الخطوة حساسة للضوء. تجنب التعرض للضوء للركيزة ولوحة.
  11. وقف رد الفعل بإضافة 50 ميليلتر وقف الحل (م 1 ح2هكذا4). قياس الامتصاص لكل بئر في 450 نانومتر (المرجع: 570 نانومتر) استخدام قارئ ميكروسكوبية. طرح الاستيعاب في 570 نانومتر من 450 نانومتر.
    ملاحظة: دون علاج و/أو عناصر تحكم الأنسجة المركبة بمثابة عناصر سلبية. للحث على استجابة مناعية في أنسجة الرئة، استخدام التحفيز المناسب (مثلاً، 100 نانوغرام/مليلتر lipopolysaccharide (LPS)) كعنصر إيجابي. احتضان بئرين مع اثنين الشركات المحدودة العامة الواحدة وكذلك مع 100 نانوغرام/مليلتر لبس في الثقافة المتوسطة، على سبيل المثال، عن ح 24، وجمع المادة طافية والأنسجة كما هو موضح في الخطوة 9، 3.
    ملاحظة: النتائج المقاسة مقبولة، إذا كان استيعاب أعلى مستوى تساوي أو تفوق 1.0؛ وإلا يحتاج القياس أن يتكرر. ينبغي أن تتبع المنحنى القياسي المناسب منحنى الاستجابة للجرعة سيجمويدال.
  12. يتم تطبيع سيتوكين تركيزات (pg) يحدده أليسا في خطوة 9.11 للمحتوى البروتين مجموع العزم في الأنسجة ليساتي لكل عينة (انظر المادة 10).

10-قياس محتوى البروتين الكلي في بكلس البشرية

ملاحظة: بكلس حاجة إلى أن تفكيك لقياس تركيز البروتين الكلي. وتستخدم ليساتيس الأنسجة من الخطوة 9، 3 لهذه الخطوة. يتم تنفيذ المقايسة في صفيحة شقة 96-جيدا مع 25 ميليلتر/جيدا من الأنسجة ليساتي، بيبيتيد في التكرارات.

  1. إعداد معيار جيش صرب البوسنة 7 نقاط مع تركيزات جيش صرب البوسنة 2,000 ميكروغرام/مل وميكروغرام/مل 1,500، 1,000 ميكروغرام/ملليلتر، 750 ميكروغرام/مل، 500 ميكروغرام/مل، 250 ميكروغرام/مل و 125 ميكروغرام/مل. تطبيق 25 ميليلتر في التكرارات لكل معيار، واستخدام 25 ميليلتر المخزن المؤقت الحل فارغة على لوحة 96-جيدا (استخدام لوحة مع غطاء لوحة).
  2. بيبيت 25 ميليلتر ليساتيس (راجع الخطوة 9.3) من كل بئر في التكرارات في لوحة 96-جيدا. وفي المجموع، 50 ميليلتر من كل كذلك مطلوب. تحضير الكاشف العامل لحل اتفاق التعاون الأساسي من اتفاق التعاون الأساسي تمييع كاشف ب 01:50 في اتفاق التعاون الأساسي كاشف أ لوحة 96-كذلك استخدام 400 ميليلتر من كاشف ب، و 000 20 ميليلتر كاشف أ
  3. عناية بيبيت 200 ميليلتر من الكاشف العامل في كل بئر، تجنب فقاعات الهواء. وضع لوحة على شاكر مداري (150 لفة في الدقيقة) لمدة 30 ثانية لضمان خلط السليم ليساتيس والكاشف العامل، ووضع غطاء لوحة لوحة. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام. قياس الامتصاص لكل بئر في 540-590 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية.
    ملاحظة: نتائج القياس مقبولة، إذا تساوي أو تفوق 0.8؛ امتصاص أعلى جيش صرب البوسنة الموحدة وإلا يحتاج القياس أن يتكرر. ينبغي أن تتبع المنحنى القياسي المناسب منحنى الاستجابة للجرعة سيجمويدال.
  4. لتحليل وحساب المنحنى القياسي باستخدام معادلة ماركوارت 4-معلمة ببعد طرح الفراغ. حساب تركيزات البروتين عينات غير معروفة باستخدام المنحنى القياسي تناسب.

Representative Results

مع أسلوب البحث الحالي، وأعدت بكلس البشرية وتتعرض لخمسة تركيزات المواد الصناعية لتقييم آثار immunomodulatory المستحث كيميائيا في الرئة البشرية المادية. تعرضت أنسجة الرئة تحت ظروف المغمورة كما قيمت الثقافة الدائمة ل h. 24 سمية بقياس صدر رابطة حقوق الإنسان والنشاط mitochondrial وتلطيخ صلاحية مجهرية. وبالإضافة إلى ذلك، تم قياس محتوى البروتين الكلي للتطبيع والسيتوكينات الموالية التحريضية. كلما كان ذلك ممكناً، تم حساب قيم تركيز المثبطة (IC) 75 بملائمة منحنى سيجمويدال غير الخطية. واستخدمت المواد إشارة إيجابية، المنظفات سيتوتوكسيسيتي ولبس للاستجابة سيتوكين الفطرية، للتحقق تشغيل كل. IC75 لها تحول القيم [ميكرومتر] (سجل IC50) استخدمت تركيزات "إزعاج" لقياسات الإفراج عن سيتوكين اللاحقة.

الشكل 1 و الشكل 2 إظهار الإجراء ملء الرئة البشرية المادية وتلطيخ ح & ه المثالية من بكلس البشرية. وقد الإجراءات الصحية الروتينية التي يتعين اتباعها لتجنب الآثار السلبية على الصحة وضمان سلامة الموظفين مناولة المواد الرئة البشرية. يتطلب هذا الأسلوب تدريب الأفراد والممارسة. الأطباء الذين تميز مناطق مختلفة (الفصوص العلوية/السفلية وتحت الجنبة مقابل الوسطى أكثر) من ذوي الخبرة والمريضة مقابل مناطق صحية من أجل تقييم الحالة المرضية للمواد البشرية الرئة. ينبغي أن تستخدم بكلس البشرية التي تم إنشاؤها لإعداد ح & مقاطع رقيقة الملون ه، التي يمكن إعادة تقييمها من قبل أخصائي. يساعد هذا الإجراء على المستخدمين الحصول على الممارسة في تميز مختلف المناطق المريضة والمواقع داخل الرئتين.

ويبين الشكل 3 نتائج قياس لنشاط رابطة حقوق الإنسان و WST-1 في بكلس البشرية بعد حضانة 24 ساعة مع سلس. عنصر التحكم المتوسطة غير المعالجة دون سلس، سيظهر في 0 ميكروغرام/مل وسلس، عنصر تحكم نوعية هامة. قيم ينبغي أن تكون أقل من 20% لرابطة حقوق الإنسان بالمقارنة مع تفكيك المنظفات الأنسجة و > وحدات امتصاص 0.7 للمقايسة WST-1. عناصر التحكم هذه الجودة أيضا بمثابة مؤشرات لبقاء أنسجة غير كافية. القدرة على الاستجابة للأنسجة البشرية نحو حل المنظفات، كمادة سامة فعالة، يجب تضمين كمراقبة إيجابية. ينبغي أن يؤدي إلى زيادة بنسبة % 300-500 (> وحدات امتصاص 2.0) لرابطة حقوق الإنسان بالمقارنة مع الأنسجة غير المعالجة، وفي القيم < 0.1 وحدات امتصاص للمقايسة WST-1. سلس أسفرت عن تخفيض الجرعة تعتمد على بقاء الخلية مقاسا بزيادة في رابطة حقوق الإنسان وانخفاض النشاط الأيضي في مقايسة WST-1 في تركيزات > 87 ميكروغرام/مل. نموذج استجابة تركيز سينية كانت مزودة للبيانات، حيث أنه من الممكن لحساب القيم IC75 أو IC50. هذه القيم يمكن استخدامها فيما بعد لتحديد تركيزات لمستويات سيتوكين وتشيموكيني: بتركيزات عالية السمية، وعادة ما لا أو يمكن الكشف عن انخفاض السيتوكينات والمستقطبات فقط. ولذلك، يوصي بتركيزات سامة قليلاً غير سامة أو فقط (IC75). من المهم أن نلاحظ هنا أن الزيادة المتوقعة في نشاط رابطة حقوق الإنسان في ثقافة الخلية طاف كثيرا ما يتأثر ب تطبيق مادة21. وكثيراً ما تحدث تداخلات بين مضمون وإنزيم النشاط، مما يؤدي إلى سوء تفسير للنتائج إذا كانت المقايسة رابطة حقوق الإنسان الإنزيم سيتوتوكسيسيتي الوحيدة المستخدمة. وهكذا، أنها هامة وضرورية لإجراء عدة فحوصات سيتوتوكسيسيتي للحصول على نتائج موثوقة وصحيحة. وعلاوة على ذلك، تجدر الإشارة إلى أن حساسية لفحوصات رابطة حقوق الإنسان و WST-1 الغاية قابلة للمقارنة.

في الشكل 4، تثبت صلاحية مجهرية صور بكلس استجابة الأنسجة البشرية للمنظفات كمادة سامة فعالة. النتائج مفيدة جداً للتأكد من صلاحية البيانات الأخرى، ولكن هذا يتطلب معدات إضافية. يتم تقييم التأثيرات السمية بصريا بتقييم أنسجة كالسين إيجابية مقارنة بنواة خلية اتهد-1-إيجابية. مقاطع الذي تم اختياره عشوائياً ضمن حمة عموما ينتج بيانات قابلة للمقارنة، بينما ينبغي تجنب الخطوط الجوية أو الأوعية الدموية، كما قد ينتقل تجاويف أكبر النتائج. من تجربتنا ومع إعدادات المجهرية المبينة أعلاه، يقاس حجم متوسط بين 1.5 × 106 و 5 × 106 ميكرومتر3 الأنسجة التحكم. تعتمد القيم على جودة المواد الرئة، ونوعية بكلس، وأيضا على هذا المرض من الجهة المانحة أنسجة الرئة. على الرغم من بقاء أنسجة الرئة البشرية تختلف فيما بين المانحين، ينبغي أن لا يتجاوز عدد نواة الخلية ميتة مقارنة مع أنسجة قابلة للتطبيق 15% من عنصر التحكم الأنسجة. إذا نواة الخلية ميتة موجودة أساسا في مراقبة الأنسجة، ومع ذلك، ينبغي التخلي عن هذه التجربة.

يعرض الرقم 5 بيانات تمثيلية للتأثير إيمونومودولاتوري هكلبت وسلس في أنسجة الرئة البشرية. السيتوكينات الموالية التحريضية إيل-1α وتنف-α هي المؤشرات الحيوية لالتهاب، مما يشير إلى بداية عمليات التهابات بعد التعرض لتحفيز المواد. السيتوكينات على حد سواء قيست بإليزا. 1α إيل خارج الخلية عادة ما تكون منخفضة في بكلس البشرية، بينما 1α إيل داخل الخلايا تصل إلى مستويات 1,000 بيكوغرام/مل فما فوق. يشير إلى العمليات الجارية السامة للخلايا-انخفاضا في إيل-1α داخل الخلايا والملاحظ غالباً بعد التعرض للبشرية بكلس للمواد الكيميائية. إذا كان يتم تحفيز الأنسجة مع لبس، منشط لنظام المناعة الفطرية، وعلى هذا النحو المعاملة الإيجابية التي التحكم، ثم يمكن فقط اكتشاف معظم المستحث إيل-1α إينتراسيلولارلي بعد 24 ساعة. وفي المقابل، يمكن أساسا قياس إفراز تنف-α الناجمين عن طريق تحفيز لبس اكستراسيلولارلي. استخدام عنصر تحكم إيجابية مناسبة، مثل لبس، يوضح صحة الأسلوب. مع أسلوب البحث الحالي، بكلس البشرية قد تعرضت لثلاث تركيزات هكلبت (32 و 64 و 125 ميكروغرام/مل) أو تركيزات اثنين من سلس (1 و 10 ميكروغرام/مل) 24 h. سيتوكين إفراز مصممة كمجموع السيتوكينات خارج الخلية وداخل الخلية وطبعت على تركيزات البروتين الكلي كما هو مبين في الشكل 5. فمن الجدير بالذكر هنا أن المقايسة اتفاق التعاون الأساسي يستخدم عادة لتحديد محتوى البروتين الكلي، بيد أنه يعكس أيضا المستحثة بمادة سيتوتوكسيسيتي. ومن ثم، لا يمكن استخدام محتوى البروتين الكلي لتطبيع البيانات سيتوكين بتركيزات عالية السمية. إفراز 1α إيل زيادة كبيرة من 263 ± 38 جزء من الغرام/mg 887 ± 216 بيكوغرام/mg وتنف-α من 263 ± 38 جزء من الغرام/mg 1,160 ± 286 بيكوغرام/ملغ (الشكل 5أ، ب). وعلاوة على ذلك، يرد إفراز 1α إيل وتنف-α المستحثة بلبس بالمقارنة مع عنصر تحكم أونستيمولاتيد أنسجة. يوضح صحة أسلوب تحريض السيتوكينات الموالية التحريضية بأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات المرض، مثل لبس، وينصح بشدة استخدامها عند العمل مع بكلس البشرية للتحقيق في آثار إيمونومودولاتوري. لمزيد من التفاصيل حول البيانات هكلبت وسلس، يرجى الرجوع إلى الدراسة قبل لوينستين et al. 21

Figure 1
الشكل 1 : إجراءات لتعبئة المواد الرئة البشرية. على استعداد فورا بعد استئصال الرئة البشرية. يجب تخزين الرئة في درجة حرارة الغرفة لملء متسقة مع [اغروس] وتجنب بلمرة المفاجئة [اغروس] أثناء الملء. يتم وضع الرئة أفقياً، مع الفصوص انتشرت لرأي أمثل في القصبات الرئيسية أو القصبات الهوائية (أ و ب المقربة في القصبات الهوائية). القصبات الهوائية مقني مع أنبوب سيليكون مرنة والثابتة مع المشابك (ج). بعد الملء الداخلي و [اغروس] البلمرة في الأنسجة، قطع الأطباء المدربين الرئة إلى شرائح بسماكة 3-5 سم (د). من هذه الشرائح تعد النوى الأنسجة أسطواني (Ø مثلاً، 8 مم) مع أداة المستخدمة (E). يتم قطع هذه النوى الأنسجة مع أنسجة مقسم طريقة عرض إلى بكلس، التي هي نقل فورا إلى أطباق بيتري مملوءة بالمتوسطة للحضانة تحت ظروف ثقافة الخلية العادية (ه). بعد أن يتم تحويل عدة خطوات الغسيل بكلس إلى لوحات ثقافة الخلية (مثل، لوحة 24-جيدا مع بكلس اثنين كل بئر و 500 ميليلتر المتوسطة) لإزالة الحطام المتبقية من الخلية والخلية المفرج عنهم الوسطاء (F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : تحديد الوضع الصحي للبشرية بكلس تلطيخ ح & ه. بكلس في هذه الصورة، أعد من المانحين بورم في الرئة، وتبين أنسجة الرئة سليمة مع حمة السنخية، الطرفية الخطوط الجوية (*)، والأوعية الدموية (رؤوس) في نظرة عامة (A). تكبير أعلى، تقوم الخطوط الجوية مع ظهارة تنفسية عضو سليمة (رؤوس) (ب)، بنية سليمة السنخية اصطف مع بنيوموسيتيس قابلة للتطبيق، بما في ذلك شعري مع العديد من الكريات الحمراء (رؤوس) (ج)، ممنوع السنخية تحتوي على البلاعم السنخية (CD68 إيمونوهيستوتشيميستري) (د)، فضلا عن الأوعية الدموية مع البطانة سليمة (CD31 إيمونوهيستوتشيميستري) يمكن ملاحظتها (E). استخدم فقط خالية من ورم الأنسجة بكلس، الذي السبب في لا مجالات الميكروسكوب المريضة مرئية. على النقيض من بكلس المعدة من الجهات المانحة مع أمراض الرئة الأخرى، مثل انتفاخ الرئة أو التليف، لا تعطل هيكل السنخية وهو إلا قليلاً المتوترة في بكلس على الحدود الخارجية، الأكثر احتمالاً بسبب خطوات إعداد. تبين أشرطة مقياس 1,000 ميكرومتر (A) و 50 ميكرون (به)، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تصميم سيتوتوكسيسيتي الناجمة عن سلس في بكلس البشرية، يقاس بتسرب إنزيم رابطة حقوق الإنسان في الثقافة المتوسطة (A) وخسائر في نشاط إنزيم الأيضي المقررة مع صبغ WST-1 (ب)- بكلس البشرية تتعرض لزيادة تركيزات سلس. في وقت لاحق كانت مزودة نموذج تركيز سينية-استجابة للبيانات، حيث يمكن IC75 أو IC50 القيم (تركيز المثبطة في تخفيض 25% و 50% من بقاء الخلية) المحسوبة (الأرقام الصحيحة). وترد البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة، n = 3-5. تم قياس امتصاص للمقايسة رابطة حقوق الإنسان في 492 شمال البحر الأبيض المتوسط (مرجع في 630 nm) والمقايسة WST-1 450 نانومتر (مرجع في 630 شمال البحر الأبيض المتوسط). بيانات تم تكييفها وتعديلها من لاوينستين et al. 21 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : صور الممثل التقديم تلطيخ وصورة مجهرية ثلاثية الأبعاد للبشرية بكلس. مراقبة الأنسجة الحية واستجابة الأنسجة للمنظفات، كمادة سامة فعالة، وترد بعد تلطيخ بكلس البشرية مع كالسين صباحا (أصفر) واتهد-1 (أحمر). رزمة من 30 [م] مع هدف X 10 (أ) والمقدمة (ب). شريط مقياس يشير إلى 100 ميكرومتر. الإثارة أطوال موجية 488 نانومتر و 543 نانومتر والانبعاثات مرشحات BP 505-550 نانومتر و LP 560 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : هيكساتشلوروبلاتيناتي الأمونيوم (هكلبت)-التي يسببها إفراز 1α إيل وتنف-α في بكلس البشرية بعد التعرض ح 24- بكلس يتعرضون لتركيزات ثلاث (32 ميكروغرام/مل و 64 ميكروغرام/مل و 125 ميكروغرام/مل من هكلبت) وهما تركيزات مختلفة (1 ميكروغرام/مل و 10 ميكروغرام/مل) من سلس. إيل-1α (A) وتنف-α (ب) خارج الخلية وداخل الخلية يحدده أليسا وتطبيع لمحتوى البروتين الكلي. لإظهار صحة الأسلوب يرد منشط إيجابية لنظام المناعة الفطرية، لبس، كمرجع لداخل الخلايا إيل-1α (A) والإفراج عن تنف-α (ب) خارج الخلية، تطبيع لمحتوى البروتين الكلي. وترد البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة، *p < 0.05 و * * *ف < 0.001؛ هكلبت وسلس: n = 9، إيل-1αلبس: n = 5، تنف-αلبس: n = 4 في التكرارات التقنية (اختبار مان-ويتني). وقد تم تعديل هذا الرقم من لوينستين et al. 21 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary Figure 1
التكميلية الرقم 1: المعالجة الحسابية مفصلة للصور المجهرية الصلاحية تلطيخ تقديم البرامج باستخدام- إجراء التشغيل خطوة بخطوة لتحليل الصورة المحملة بصور LSM للتقديم السطح الملون كالسين الأنسجة قابلة للتطبيق (Aز، و أنا) والكشف الموضعي اثيديوم نواة الخلية الملطخة هوموديمير (ح، يم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary Figure 2
التكميلية الرقم 2: نظرة عامة لتحليل الصور الحسابية لتلطيخ صلاحية مجهرية لانسجة الرئة البشرية. الأنسجة قابلة للتطبيق (أصفر) تم تحليلها بواسطة التقديم السطحية (بأنا) وتم الكشف عن نواة الخلية ميتة (أحمر) بالكشف الموضعي (فمني). استخدم وضع لقطة لتصدير الصورة (Q). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

تقنية بكلس البشرية بشكل جيد في المختبر. هذه الورقة وصفاً لهذه التقنية واستخدامها في اختبار السمية للمواد في الرئة الأنسجة السابقين فيفو. وبصفة عامة، أي المختبر باستخدام هذا الأسلوب يجب أن تسعى إلى إعداد فحص المتعلقة بتعريف نطاقات قابلة للقياس الكمي، وتقدير للتقلبات، وضوابط الجودة التي تضمن صحة هذه التجربة. يمكن أن تكون الإجراءات القياسية الممكنة، على سبيل المثال، لتكرار كل نقطة نهاية، مثلاً، الإنزيم سيتوتوكسيسيتي، في الحد أدنى من ثلاث جهات مانحة البيولوجية (يدير الفردية) مع الحد أدنى من اثنين إلى ثلاثة replicates التقنية كل عينة منها إيجابية و إشارات سلبية. وينبغي تدريب موظفي المختبرات زيادة الاتساق المقايسة والحد من تقلب المقايسة.

وتشمل نقاط النهاية التي كثيرا ما تستخدم لتقييم الآثار إيمونومودولاتوري للمواد في أنسجة الرئة سيتوتوكسيسيتي القياسات باستخدام فحوصات مختلفة (مثلاً، مقايسة رابطة حقوق الإنسان، WST-1 المقايسة، تلطيخ الفحص المجهري)، الإفراج عن سيتوكين فحوصات، كذلك كما تغييرات في الشخصية التعبير ووصف التغيرات في السكان الخلوية ب أساليب إيمونوهيستوباثولوجيكال6. وعلاوة على ذلك، هناك تقنيات وصف تصور الخلايا، مثل الخلايا الجذعية الرئوية، في بكلس مورين28 التي يمكن نقلها أيضا إلى بكلس البشرية وقد تقدم وبالتالي أكثر تفصيلاً من التبصر في تكوين الهاتف الخلوي قبل و وبعد العلاج بالمواد السامة للخلايا المفترضة.

هذا البروتوكول الأساسية وتقنية لإعداد مقاطع أنسجة الرئة البشرية قابل للمقارنة إلى التقنيات التي تم وصفها في المنشورات29. وباختصار، يتم الحصول على مواد الجهاز من المرضى الذين يعانون من الأمراض المزمنة التي تهدد العيش مثل سرطان الرئة، الذين يتعين عليهم الخضوع لعملية جراحية لاستئصال أو زرع الأعضاء. الدراسات التي يجب موافقة لجنة الأخلاقيات المحلية. مطلوب المرضى موافقة خطية مستنيرة. إعداد سير عمل بين عيادة ومختبر قضية بالغة الأهمية وتتطلب الاتصال، وتعريف الواجهات والبنية التحتية بين كلا الموقعين. المواد الرئة البشرية لديها بحيث تتم معالجتها مباشرة بعد بتر للمحافظة على سلامة الأنسجة. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تطبيق الأسلوب الموصوفة هنا للبشرية بكلس الرئتين الصغار والكبار على حد سواء والرئتين سليمة ومريضة. في الولايات المتحدة، على سبيل المثال، من الممكن الحصول على الرئتين من الجهات المانحة الجهاز الصحي الذين ماتوا في حوادث أو الأجهزة التي رفضت لزرع الأعضاء.

الخطوة الحاسمة الأولى في البروتوكول هو التضخم للخطوط الجوية ولحمة المحيطة مع الحل [اغروس]. هذه الخطوة ضروري لتقوية الأنسجة اللينة جداً لإجراء تشريح اللاحقة. جودة المواد الرئة البشرية، استناداً إلى خلفية المرض، أمر بالغ الأهمية هنا. يمكن أن تملأ الفصوص فقط مع الجنب سليمة. في بعض الأحيان منع الأورام نهاية مرحلة القرب من القصبات الهوائية عملية ملء. وقد درجة حرارة الحل [اغروس] قبل تضخيم البشرية المادية، التحقق من دقة. الكثير من الدم (أو أخرى سوائل، نتحات) داخل الإنسان أنسجة الرئة سيؤدي إلى إضعاف [اغروس] غير مرغوب فيها وسوف تؤثر على عملية البلمرة. بعد تضخم أنسجة الرئة والتبلور من [اغروس] على الجليد، يتم قطع الرئتين إلى أقسام من 200 إلى 300 ميكرون سمك. تناسق الأنسجة مسألة حرجة للغاية. إذا كانت الأنسجة الناعمة جداً، تشريح أقسام متساوية من الصعب. حتى لو كان نفس مبضع يتم تعيين المعلمات لكل جهة مانحة، سمك الشرائح بين الجهات المانحة قد تختلف، والشروط الواجبة للفرد والتغييرات خلال تضخيم عملية لكل الرئة. سيؤدي إلى ملء متنافرة أنسجة سمك شريحة مختلفة. بدلاً من قياس وتوحيد سمك شرائح، يمكن استخدام قياس محتوى البروتين الكلي لرصد الرئة شريحة سمك غير مباشر. العديد من الأمراض في نهاية مرحلة تعوق عملية تشريح؛ مثلاً، يمكن أن يكون الدم السفن وهي سميكة جداً في ارتفاع ضغط الدم الرئوي، وأنسجة تليفية قاسية حتى أن تشريح الأنسجة اسطوانات يكاد يكون من المستحيل وبليد مبضع يحتاج إلى استبداله في كثير من الأحيان.

بعد إعداد البشرية بكلس وكثافة الغسيل الخطوات، التي تعتبر ضرورية لإزالة الحطام خلية والإفراج عن الإنزيمات، الأنسجة يمكن أن تستخدم المقاطع لتجارب29. بكلس البشرية المزروعة تحت ظروف ثقافة الخلية الطبيعية وعرضه، على سبيل المثال، للمواد الكيميائية، والأدوية، أو ليبوبوليساكتشاريديس. تلوث بكلس أحياناً بسبب الالتهابات (غير معروف) قضية خاصة في ثقافة الرئة البشرية المادية. يجب أن يتم تجاهل الثقافات الأنسجة تظهر الالتهابات وتطهير المعدات يجب أن تكون دقة. الفصل المكاني بين أماكن المختبرات المستخدمة لإعداد من ناحية واستزراع من ناحية أخرى قد يساعد على تجنب الأمراض العابرة. فيما يتعلق بالمعدات، وقد تسرب مبضع، ومسامير عرافة فضفاض قد يؤدي إلى تلف المحرك وتوقف حركة بليد. ليس كل جزء مقسم طريقة العرض مصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ، وحتى أنها سوف أكسدة إذا لم يجف فورا تغيير التنظيف. للتغلب على المسائل المتعلقة بالمعدات، قد يكون من الضروري أن يكون جهاز النسخ الاحتياطي واحد على الأقل.

في المنشورات السابقة، وأفادت بأن تغسل [اغروس]، وأزيلت أثناء الغسيل الخطوات بعد إعداد مكثفة. في الواقع، هذا غير ممكن، لا يمكن إزالة [اغروس]. لإتمام عملية الإزالة من [اغروس]، فإنه يجب أن يكون إعادة ذاب في درجات حرارة عالية، الأمر الذي من شأنه أن يدمر الأنسجة. [اغروس] في الحويصلات الهوائية والخطوط الجوية لا تتداخل مع وصف نقاط النهاية. نقاط النهاية الأخرى التي يحتمل أن تتأثر بالوجود [اغروس] (انظر أيضا القيود). الحاجة إلى إعداد مقاطع الأنسجة الطازجة جداً قد ينبغي التأكيد، كما صلاحية الأنسجة مسألة حاسمة في الثقافة. برونتشوكونستريكشن ليست معلمة صالحة للبقاء. نوصي باستخدام اثنين أو ثلاثة على الأقل من فحوصات سيتوتوكسيسيتي مستقلة للتحقق من صلاحية حمة المحيطة بها؛ وهذا قد يتم إيداعه كل تجربة30. ضوابط الجودة في فحوصات سيتوتوكسيسيتي بمثابة مؤشرات لبقاء أنسجة غير كافية. ولذلك، يوصي بتقييم مدى استجابة الأنسجة، على سبيل المثال، إلى مادة سامة فعالة كمطهر في جميع سيتوتوكسيسيتي فحوصات. استناداً إلى منحنيات الاستجابة للجرعة، تحتاج إلى تعريف لفحوصات سيتوتوكسيسيتي قيم الحد الأدنى والحد الأقصى للاستيعاب واجتمع للتجارب اللاحقة. المزيد من التعديلات للبروتوكول معظمها يعتمد على المواد الكيميائية التطبيقية ونقاط النهاية للفائدة. ويقتصر انطباق المواد الكيميائية غير قابلة للذوبان أو شدة رد الفعل. أعلى تركيز المذيبات ل [دمس] يقتصر على 1%. يمكن استخدام تركيزات أعلى لكن قد تؤدي وضوحاً إطلاق السيتوكينات الموالية التحريضية، مثل إيل-8. من ناحية أخرى، قد يكون الحافز الذي يستخدم ضعيفة نسبيا. وفي هذه الحالة، يمكن زيادة كمية الأنسجة من اثنين إلى أربعة شرائح كل بئر. وهذا النهج يحد من صلاحية إلى ح 24.

قيداً رئيسيا من بكلس البشرية أن في ألمانيا أنها يمكن إلا إعداد من المواد الرئة البشرية المريضة. المرضى الذين خضعوا للجراحة عادة أقدم من سنة 50 و 80 في المائة من المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة أو تستخدم ليكون المدخنون. الدواء للمرضى، مثل الكورتيزون، يمكن أن تؤثر أيضا نتائج تجارب باستخدام الأنسجة البشرية. ولذلك، من الضروري أن: ط) التحقق من صحة كل تجربة بالإشارات الإيجابية التحقق من صلاحية والأداء الوظيفي، وحساسية الأنسجة الفردية، والثاني) عبر--التحقق من صحة النتائج باستخدام أنسجة الرئة صحية، غير مريضة، منتصف العمر من الحيوانات المختبرية (الرئيسيات غير البشرية مثل سينومولوغوس، وإذا أمكن، الماوس، الجرذان، خنزير غينيا). أفضل درجة علم أمراض الأنسجة المريضة، كلما كان ذلك أفضل النتائج التجريبية. لا يمكن استخدام الأنسجة المريضة بشكل كبير ويظهر في كثير من الأحيان محدودة الجدوى ومستويات سيتوكين غير كاف منخفضة أو عالية للغاية، والعدوى البكتيرية أو الفطرية وأقل برونتشوكونستريكشن. مانح إلى تباين أعلى بالمقارنة مع النتائج التي تم الحصول عليها من الحيوانات المختبرية، التي تعكس التغيرات الفردية للبشر. هذا، مع ذلك، لا حد بشكل عام؛ وكما ذكر أعلاه، في بلدان أخرى (مثلالولايات المتحدة) فإنه من الممكن الحصول على الرئتين صحية من الجهات المانحة الجهاز المتوفى رفض لزرع الأعضاء. وصف استجابة الأنسجة لأول ما يصل إلى 48 ساعة في تجارب التعرض الحاد. يتم تخفيض صلاحية والأداء الوظيفي للأنسجة بعد عدة أيام من الثقافة أو بعد التخزين في-80 درجة مئوية. فمن الممكن لانسجة الرئة البشرية الثقافة لتصل إلى حوالي 14 يوما. وما زالت الجدوى خلال هذا الوقت؛ ومع ذلك، يلاحظ زيادة في تقلب، فضلا عن فقدان وظائف عدة خلايا السكان، مثل الضامة، في الأنسجة، أسفر عن إطلاق سراح سيتوكين محدودة ردا على ميتوجينس. وهو قيد آخر لبعض نقاط النهاية الوجود [اغروس] في النسيج، إعاقة، على سبيل المثال، عزل كميات كافية وذات جودة عالية من الحمض النووي الريبي31 أو إعداد تعليق خلية واحدة لقياس تدفق اللاحقة و فينوتيبينج الخلايا. ومن ثم إمكانية اكتساب نظرة ثاقبة آليا إلى استجابات الخلايا المفردة ووظائف محدودة.

وتعتبر نماذج الأنسجة أورجانوتيبيك، مثل بكلس البشرية، أثر ارتفاع على البحوث الأساسية وغير السريرية. المواد الرئة البشرية بتكوين البيولوجي الذي يعكس عن كثب هندسة الجهاز العادي. على سبيل المثال، فإنه يحتوي على سكني الخلايا الظهارية السنخية والشعب الهوائية وخلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية، وخلايا بطانية، الألياف العصبية والضامة. قابلاً للأنسجة والخلايا الاستجابة للمحفزات عدة. العصب الألياف، وبالرغم من أن قطع، يمكن محلياً تفعيلها، مما يؤدي إلى استجابات منعكس المحطة الطرفية14. ونتيجة لذلك، يوفر هذا الطراز السابقين فيفو إمكانية دراسة الاستجابات المناعية الفطرية الخلوية وردود الدفاع، سيتوكين الإشارات والتعريفي لعلامات سطح الخلية. العديد من التحسينات في تقنيات استزراع والتحقق من النتائج النهائية تسمح باستخدام بكلس البشرية في مجال العلوم متعدية الجنسيات. أمثلة للنهج المقبلة: ط) التحقق من جديد يستهدف في أنسجة الرئة البشرية، ثانيا) تقييم الاستجابات المناعية بعد التعرض، على سبيل المثال، للمواد الكيميائية، والمخدرات، وجسيمات نانوية، إلخ، ثالثا) مكملات لانسجة الرئة مع الخلايا المناعية، مثل اللمفاويات T، رابعا) تحديد وتعديل أنماط الجزيئية، على سبيل المثال، بعد التعرض محسسات الجهاز التنفسي، والمواد المسببة المرض، أو المركبات النشطة التي تعوق مسارات؛ وعلاوة على ذلك، الخامس) إعادة عرض مجرى الهواء والسادس)32من اللائحة الخلايا العصبية. الميدان العلمي مهتمة بهذه النهج الحالية والمستقبلية مع بكلس. وبالإضافة إلى ذلك، هناك مجموعة متنوعة من التطورات المختلفة التي سوف تساعد على تحسين أسلوب بكلس، مثل البرد--الحفاظ على20، والأنسجة التي تمتد من33 تقليد الحركة الطبيعية للأنسجة أثناء التنفس أو الميكانيكية التهوية.

والميزة الرئيسية للبشرية بكلس بالمقارنة مع 3D نماذج أخرى هو وجود الخلايا المناعية والألياف العصبية. يمكن أيضا إجراء التجارب في الماوس وفار، والمقدمات غير البشرية، وهي الأنواع الحيوانية التي تزال تستخدم في أغلب الأحيان في علم الصيدلة وعلم السموم. ويدعم الطابع المعقد لانسجة الرئة البشرية ترجمة النتائج من الحيوان إلى الإنسان ومن في المختبر في فيفو. في سياق فحوصات البديلة القائمة للتعرف على محسسات الرئوي، بكلس البشرية معقدة جداً ولا تسمح برؤى في الردود خلية مفردة. حتى الآن، قد تعطي الخلوي المجهري وتدفق المعلومات حول الاستجابات الخلوية، إذا تم استخدام علامة الحق الخلوية في تركيبة، على سبيل المثال، مع علامات داخل الخلايا أو نخر أو المبرمج. وهناك فحوصات المنشورة التي تم التحقق من صحتها وذكرت أنها كانت تستخدم لتحديد هوية الجهاز التنفسي محسسات. غير أن التقدم في استخدام بكلس بجميع مزاياها على فحوصات خلية واحدة هي إسهاما قيماً بمعنى أنه يمكن استخدام هذه التقنية للفرز الفائق، كما وصفها Watson et al. 34 أنها وضعت مقايسة فرز الفائق للتنبؤ بمجرى الهواء سمية في مورين بكلس البرد--الحفاظ على. مع شكلها بكلس 96-جيدا المنمنمة، التي يتم الكشف عنها قراءات مماثلة في سائل الغسل مورين، مما يجعل بكلس مقايسة الفائق ممكناً.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن. البند فراونهوفر منظمة بحثية غير ربحية عامة مستقلة للبحوث التطبيقية وإجراء البحوث التعاقدية بالنيابة عن صناعات التكنولوجيا الحيوية والمستحضرات الصيدلانية والكيميائية ومستحضرات التجميل. ويأتي تمويل المعهد من المشاريع العامة الوطنية والدولية.

Acknowledgments

نود أن نشكر لوينستين Lan لعملها السابق بشأن استراتيجيات الاختبار البديلة لتقييم المخاطر مع بكلس البشرية. وأيد بعض البحوث بمنحه من "المفوضية الأوروبية" ضمن البرنامج الإطاريال 6 SENS-تكنولوجيا المعلومات-رابعا "رواية اختبار استراتيجيات التقييم في المختبر للمواد المسببة للحساسية".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm A. Hartenstein (Leipzig, Germany) SS04
Syringe Faust Lab Science (Klettgau, Germany) 9.410 050
Coring tools custom-made custom-made
Trimming Blade Handle (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205530001
Trimming Blades (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205500000
Microtome: Tissue Slicer Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) 303400-ADPT Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)
Microtome blade Wilkinson Sword (Solingen, Germany) ENR-4027800011506
Tissue culture dishes Sigma (München, Germany) Z666246-420EA
Cell strainer filter (100 µm Nylon) Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) BD352360
Inoculation loop Copan Diagnostics (Murrieta, USA)  CD176S01
TPP Tissue culture plates 24wells Sigma (München, Germany) Z707791-126EA
Cassette Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 1000957
Nunc MaxiSorp flat-bottom Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) 44-2404-21
Nunc MicroWell 96-Well  Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 260836
Confocal Microscope Zeiss (Jena, Germany) Confocal LSM Meta 510
Image rendering software Bitplane AG (Zürich, Switzerland) IMARIS 7.6
LSM Image Browser Zeiss (Jena, Germany)
Multiwell-Reader Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) Tecan infinite F200Pro Plate Reader
Plate shaker Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) KM-2 Akku
BenchMark ULTRA Ventana Medical Systems (Tucson, USA) Automated IHC/ISH slide staining system
Assays
Cell Proliferation Reagent WST-1 Roche (Basel, Switzerland) 11644807001
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche (Basel, Switzerland) 11644793001
Microscopical vitality staining  Invitrogen (Carlsbad, USA) L-3224 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit
BCA Protein Assay Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 23225
ELISA assay kit R & D systems various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) DuoSet
Reagents
Agarose, low gelling temperature  Sigma (München, Germany) A9414-100G
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) Sigma (München, Germany) E2888-500ML
Penicillin and streptomycin Lonza (Verviers, Belgium) 17-602E
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) Gibco (Darmstadt, Germany) 11039-047 Culture medium
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) Lonza (Verviers, Belgium) BE17-513F   Buffer solution
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma (München, Germany) A9647-500G
Detergent Sigma (Saint Louis, USA) X100-100ML Triton X-100
Washing buffer Merck (Darmstadt Germany) 524653  0.05% Tween 20 in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. D'Amato, G., et al. Climate change, air pollution and extreme events leading to increasing prevalence of allergic respiratory diseases. Multidiscip Respir Med. 8, (1), 12 (2013).
  2. Pawankar, R., et al. State of world allergy report 2008: allergy and chronic respiratory diseases. World Allergy Organ J. 1, (6), Suppl 4-17 (2008).
  3. Hartung, T., Daston, G. Are in vitro tests suitable for regulatory use. Toxicol Sci. 111, (2), 233-237 (2009).
  4. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, (7252), 208-212 (2009).
  5. Balls, M., Straughan, D. W. The three Rs of Russell & Burch and the testing of biological products. Dev Biol Stand. 86, 11-18 (1996).
  6. Sewald, K., Braun, A. Assessment of immunotoxicity using precision-cut tissue slices. Xenobiotica. 43, (1), 84-97 (2013).
  7. Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Hum Exp Toxicol. 13, (7), 466-471 (1994).
  8. Ressmeyer, A. R., et al. Characterisation of guinea pig precision-cut lung slices: comparison with human tissues. Eur Respir J. 28, (3), 603-611 (2006).
  9. Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309, (10), 1219-1228 (2015).
  10. Koziol-White, C. J., et al. Inhibition of spleen tyrosine kinase attenuates IgE-mediated airway contraction and mediator release in human precision cut lung slices. British journal of pharmacology. 173, (21), 3080-3087 (2016).
  11. Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. J Vis Exp. (83), e50970 (2014).
  12. Lamb, D. J., et al. Bl 1002494, a Novel Potent and Selective Oral Spleen Tyrosine Kinase Inhibitor, Displays Differential Potency in Human Basophils and B Cells. J Pharmacol Exp Ther. 357, (3), 554-561 (2016).
  13. Leus, N. G., et al. HDAC 3-selective inhibitor RGFP966 demonstrates anti-inflammatory properties in RAW 264.7 macrophages and mouse precision-cut lung slices by attenuating NF-kappaB p65 transcriptional activity. Biochem Pharmacol. 108, 58-74 (2016).
  14. Schleputz, M., et al. Neurally mediated airway constriction in human and other species: a comparative study using precision-cut lung slices (PCLS). PLoS One. 7, (10), 47344 (2012).
  15. Hess, A., et al. Prevalidation of the ex-vivo model PCLS for prediction of respiratory toxicity. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 32, 347-361 (2016).
  16. Bergner, A., Sanderson, M. J. Acetylcholine-induced calcium signaling and contraction of airway smooth muscle cells in lung slices. J Gen Physiol. 119, (2), 187-198 (2002).
  17. Wohlsen, A., et al. The early allergic response in small airways of human precision-cut lung slices. Eur Respir J. 21, (6), 1024-1032 (2003).
  18. Wu, W., et al. Innate immune response to H3N2 and H1N1 influenza virus infection in a human lung organ culture model. Virology. 396, (2), 178-188 (2010).
  19. Zmora, P., et al. Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS One. 12, (5), 0176597 (2017).
  20. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, (5), 876-881 (2014).
  21. Lauenstein, L., et al. Assessment of immunotoxicity induced by chemicals in human precision-cut lung slices (PCLS). Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 28, (4), 588-599 (2014).
  22. Wild, L. G., Lopez, M. Occupational asthma caused by high-molecular-weight substances. Immunol Allergy Clin North Am. 23, (2), 235-250 (2003).
  23. Di Stefano, F., et al. Occupational asthma due to low molecular weight agents. Int J Immunopathol Pharmacol. 17, (2), Suppl 77-82 (2004).
  24. Buonsante, V. A., Muilerman, H., Santos, T., Robinson, C., Tweedale, A. C. Risk assessment's insensitive toxicity testing may cause it to fail. Environ Res. 135, 139-147 (2014).
  25. Boverhof, D. R., et al. Respiratory sensitization and allergy: current research approaches and needs. Toxicol Appl Pharmacol. 226, (1), 1-13 (2008).
  26. Johansson, H., Albrekt, A. S., Borrebaeck, C. A., Lindstedt, M. The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 27, (3), 1163-1169 (2013).
  27. Brismar, H., Patwardhan, A., Jaremko, G., Nyengaard, J. Thickness estimation of fluorescent sections using a CSLM. Journal of Microscopy. 184, (2), 106-116 (1996).
  28. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells. J Vis Exp. (122), (2017).
  29. Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 246, (3), 107-115 (2010).
  30. Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231, (1), 68-76 (2008).
  31. Niehof, M., et al. RNA isolation from precision-cut lung slices (PCLS) from different species. BMC Res Notes. 10, (1), 121 (2017).
  32. De Proost, I., et al. Purinergic signaling in the pulmonary neuroepithelial body microenvironment unraveled by live cell imaging. FASEB J. 23, (4), 1153-1160 (2009).
  33. Davidovich, N., Chhour, P., Margulies, S. S. Uses of Remnant Human Lung Tissue for Mechanical Stretch Studies. Cell Mol Bioeng. 6, (2), 175-182 (2013).
  34. Watson, C. Y., et al. Screening for Chemical Toxicity Using Cryopreserved Precision Cut Lung Slices. Toxicol Sci. 150, (1), 225-233 (2016).
تقييم للسآمة للخلايا وإيمونومودولاتوري آثار المواد في شرائح البشرية دقة قطع الرئة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neuhaus, V., Danov, O., Konzok, S., Obernolte, H., Dehmel, S., Braubach, P., Jonigk, D., Fieguth, H. G., Zardo, P., Warnecke, G., Martin, C., Braun, A., Sewald, K. Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (135), e57042, doi:10.3791/57042 (2018).More

Neuhaus, V., Danov, O., Konzok, S., Obernolte, H., Dehmel, S., Braubach, P., Jonigk, D., Fieguth, H. G., Zardo, P., Warnecke, G., Martin, C., Braun, A., Sewald, K. Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (135), e57042, doi:10.3791/57042 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter