وفي ضوء مبدأ 3Rs، تتطور نماذج الجهاز التنفسي كبدائل للدراسات الحيوانية. خاصة بالنسبة لتقييم مخاطر المواد الجهاز التنفسي، هناك نقص في فحوصات مناسبة. وهنا يصف لنا استخدام شرائح البشرية دقة قطع الرئة لتقييم المواد المحمولة جوا.
أمراض الجهاز التنفسي في تنوعها الواسع بحاجة إلى أنظمة نموذجية ملائمة لفهم الآليات الكامنة وتمكينها من تطوير علاجات جديدة. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب تسجيل المواد الجديدة لتقييم المخاطر المناسبة مع نظم اختبار كافية لتجنب خطر الأفراد يتعرض للأذى، على سبيل المثال، في بيئة العمل. وتجري هذه التقييمات المخاطر عادة في الدراسات الحيوانية. في ضوء مبدأ 3Rs وشكوك الجمهور ضد التجارب على الحيوانات، تطورت البشرية أساليب بديلة، مثل الرئة دقة قطع شرائح (بكلس). تصف هذه الورقة التقنية السابقين فيفو بكلس البشرية لدراسة إمكانات immunomodulatory المواد الوزن الجزيئي المنخفض، مثل هيكساتشلوروبلاتيناتي الأمونيوم (هكلبت). وتتضمن نهايات سلسلة التفاعل المقاسة البقاء والتهاب الجهاز التنفسي المحلية، تميزت بتغيير إفراز السيتوكينات والمستقطبات. السيتوكينات الموالية التحريضية، عامل نخر الورم ألفا (تنف-α)، وانترلوكين 1 ألفا (إيل-1α) وقد زادت كثيرا في بكلس البشرية بعد التعرض لتركيز شبه سامة من هكلبت. على الرغم من أن قد تم تحسين أسلوب بكلس إلى حد كبير على مدى العقود الماضية، لا تزال قابليته لاختبار المرباة التنمية. ولذلك، النتائج المعروضة هنا بيانات أولية، على الرغم من أنها تظهر إمكانات بكلس البشرية كأداة قيمة في أبحاث الجهاز التنفسي.
أمراض الجهاز التنفسي مثل الربو التحسسي، الربو المهني وأمراض الرئة انسداد الشعب الهوائية المزمن (COPD)، وانتفاخ الرئة والتهابات في الشعب الهوائية العليا والسفلي في الارتفاع وتمثل1،2أعباء صحية في جميع أنحاء العالم. نظم اختبار مناسبة مطلوبة، بغية التعرف على بعض الآليات الأساسية الكامنة وراء هذه الأمراض، بالإضافة إلى تطوير واختبار المواد المناسبة. وتركز على النتائج المكتسبة في فحوصات في المختبر أو في فيفو البحوث الأساسية، فضلا عن تطوير العقاقير السريري. ومع ذلك، قد هذه الاختبارات، حدود3. أولاً، استخدام الخلايا البشرية التي كانت معزولة وإزالتها من النسيج المجاور أو أجهزة فحوصات في المختبر و، وبالتالي لم تعد قادرة على التفاعل مع، أو أن يحمي الخلايا الأخرى3. وثانيا، غالباً ما لا تكون نماذج حيوانية قابل للترجمة للبشر بسبب الاختلافات في علم وظائف الأعضاء واختلاف البيوكيميائية4. من أجل الحد من هذه القيود، وفي سياق 3Rs (الاستبدال، والصقل، والحد) المبدأ5، نماذج بديلة جديدة تتطور باستمرار.
نماذج بديلة من الأنسجة البشرية ثلاثية الأبعاد، مثل بكلس، ارتباط بين القائم على الإنسان في المختبر ونماذج معقدة الحيوان في فيفو . بكلس تعكس عدم التجانس الوظيفي مع جميع أنواع الخلايا ذات الصلة الموجودة في الجهاز التنفسي6. بالإضافة إلى ذلك، يتميز بتقنية بكلس لاستنساخه بإعداد عدة شرائح رقيقة من سمك الدقيق من مانح واحد من أنسجة الحيوانية أو البشرية. وهذا يتيح رقابة داخلية، فضلا عن تركيزات مختلفة أو المخدرات لفحصها.
منذ عرض شرائح ملء أجار الرئة البشرية الأولى عام 1994 فيشر et al. 7 تقنية لتقطيع واستزراع أنسجة الرئة قد تحسنت إلى حد كبير. مارتن كريستيان et al. وقد تحسنت هذه التقنية لمزيد من التطبيقات الكيميائية والدوائية8. قدم مجموعتنا لهذا الأسلوب مارتن المسيحية في عام 2007. ومنذ ذلك الحين، اتسع نطاق تطبيق بكلس في البحوث من اختبار الاستجابات الوظيفية، مثل النقل الجوي9،10 وتضيق الأوعية11، إلى المناعية،13من الدوائية12،، واختبار السمية7 في الأنواع المختلفة في عدة مختبرات. على سبيل المثال، Schlepütz et al. 14 التحقيق الردود مجرى الهواء لاختلاف الأنواع ومقارنة الخلايا العصبية الطرفية تنشيط تنشيط الحقل الكهربائي (EFS) أو كبخاخات في الفئران، الجرذان، خنازير غينيا، الأغنام، والمراميز، والبشر. العثور على الأنواع المختلفة أنماط متميزة ولكنها مختلفة من برونتشوكونستريكشن العصبية بوساطة، وخلصت إلى أن هذه الحيوانات المختبرية شائعة الاستخدام (الفئران والجرذان) لا تعكس دائماً الاستجابة البشرية. لاختبار السمية الرئة وخفض عدد الحيوانات في هذا السياق، هيس et al. 15 قبل التحقق من الفئران بكلس كبديل السابقين فيفو لدراسات سمية الاستنشاق. وأسفرت هذه الدراسة قبل التحقق من صحة multicentric تطوير اثنين من نماذج التنبؤ باستخدام بكلس مع نتائج واعدة.
وعلاوة على ذلك، قد استخدمت في البحوث الأساسية، بكلس لتوضيح الكالسيوم مما يشير إلى16وأوائل استجابات حساسية17، والعدوى الفيروسية ردود18،19. التقدم التقني الجارية ويجري استكشاف مزيد من التقدم. على سبيل المثال، الحقل هو زيادة الاستفادة الأنسجة البشرية بتخزين وإعادة استخدام الأنسجة المجمدة. رروزنر et al. ووصف تقنية للتجميد والذوبان بكلس مورين أن يحافظ على قدرة الخطوط الجوية للتعاقد على التحفيز: ولذلك الأسلوب الذي يطيل الإطار ضيق الوقت التي تبقى الأنسجة قابلة للحياة، وحتى آخر يمكن تطبيق فحوصات على مر الزمن إلى أن الجهات المانحة نفسها20. وبالإضافة إلى هذه المنجزات البحثية، لوينستين et al. 21 التحقيق مؤخرا تقييم مخاطر المواد الكيميائية المختلفة التي قد تعمل كمحسسات المحتملة للربو المهني في بكلس البشرية.
الربو المهني، الأعراض التي هي عرقلة تدفق الهواء ومجرى الهواء هايبرريسبونسيفينيس، مشابهة للربو التحسسي، هو الناجمة عن التعرض لارتفاع الوزن الجزيئي (حمو)22 أو الوزن الجزيئي المنخفض (LMW) المواد23 (مثلاً ، مركبات البلاتين) في بيئة العمل. وكلاء LMW توعية عالية محتملة عند تشكيل haptens وربط للناقل البروتينات21. يتطلب التسجيل لمواد كيميائية جديدة حمو أو LMW في المختبر و في فيفو تقييم المخاطر فيما يتعلق بتوعيتهم المفترضة المحتملة (على سبيل المثال-، 429 المبدأ التوجيهي في الميدان)24. الاختبارات المستخدمة لتحديد توعية المفترضة المحتملة، ومع ذلك، كانت لا مصممة أصلاً لتقييم المخاطر من مثيرات الجهاز التنفسي، ولكن للاتصال محسسات، على الرغم من أن هناك على ما يبدو بعض التطابق لمجموعة فرعية صغيرة من المواد25 . العمل الذي يقوم به لوينستين et al. صمم كجزء من مشروع الاتحاد الأوروبي Sens-تكنولوجيا المعلومات-رابعا، وضع استراتيجيات اختبار بديلة لتقييم المخاطر للاتصال المفترضة أو الرئة محسسات21. لهذا المشروع، ركزنا على اختبار قابليتها للاستخدام البشري بكلس كأداة اختبار بديلة. ولذلك، تم تحديد مجموعة من immunomodulatory نقاط النهاية (إفرازمثلاًوالجدوى وسيتوكين) لتحديد إمكانات مهيجة أو تحريضية للمواد الكيميائية، مثل مركبات LMW البلاتين. لوينستين et al. ، العثور على لا نمط العامة التي يمكن تطبيقها على جميع محسسات الجهاز التنفسي؛ ومع ذلك، وفر عملهم الأساس للبروتوكولات نشرت مؤخرا26.
في ملخص، ينص البروتوكول على المقدمة هنا لإعداد والتعرض اللاحقة من بكلس البشرية وسيلة مفيدة للتقييم للرئة السمية المحتملة و/أو المواد إيمونومودولاتوري التي يمكن أن تشارك في تطوير الجهاز التنفسي الأمراض، مثل الربو المهني.
تقنية بكلس البشرية بشكل جيد في المختبر. هذه الورقة وصفاً لهذه التقنية واستخدامها في اختبار السمية للمواد في الرئة الأنسجة السابقين فيفو. وبصفة عامة، أي المختبر باستخدام هذا الأسلوب يجب أن تسعى إلى إعداد فحص المتعلقة بتعريف نطاقات قابلة للقياس الكمي، وتقدير للتقلبات، وضوابط الجودة التي تضمن صحة هذه التجربة. يمكن أن تكون الإجراءات القياسية الممكنة، على سبيل المثال، لتكرار كل نقطة نهاية، مثلاً، الإنزيم سيتوتوكسيسيتي، في الحد أدنى من ثلاث جهات مانحة البيولوجية (يدير الفردية) مع الحد أدنى من اثنين إلى ثلاثة replicates التقنية كل عينة منها إيجابية و إشارات سلبية. وينبغي تدريب موظفي المختبرات زيادة الاتساق المقايسة والحد من تقلب المقايسة.
وتشمل نقاط النهاية التي كثيرا ما تستخدم لتقييم الآثار إيمونومودولاتوري للمواد في أنسجة الرئة سيتوتوكسيسيتي القياسات باستخدام فحوصات مختلفة (مثلاً، مقايسة رابطة حقوق الإنسان، WST-1 المقايسة، تلطيخ الفحص المجهري)، الإفراج عن سيتوكين فحوصات، كذلك كما تغييرات في الشخصية التعبير ووصف التغيرات في السكان الخلوية ب أساليب إيمونوهيستوباثولوجيكال6. وعلاوة على ذلك، هناك تقنيات وصف تصور الخلايا، مثل الخلايا الجذعية الرئوية، في بكلس مورين28 التي يمكن نقلها أيضا إلى بكلس البشرية وقد تقدم وبالتالي أكثر تفصيلاً من التبصر في تكوين الهاتف الخلوي قبل و وبعد العلاج بالمواد السامة للخلايا المفترضة.
هذا البروتوكول الأساسية وتقنية لإعداد مقاطع أنسجة الرئة البشرية قابل للمقارنة إلى التقنيات التي تم وصفها في المنشورات29. وباختصار، يتم الحصول على مواد الجهاز من المرضى الذين يعانون من الأمراض المزمنة التي تهدد العيش مثل سرطان الرئة، الذين يتعين عليهم الخضوع لعملية جراحية لاستئصال أو زرع الأعضاء. الدراسات التي يجب موافقة لجنة الأخلاقيات المحلية. مطلوب المرضى موافقة خطية مستنيرة. إعداد سير عمل بين عيادة ومختبر قضية بالغة الأهمية وتتطلب الاتصال، وتعريف الواجهات والبنية التحتية بين كلا الموقعين. المواد الرئة البشرية لديها بحيث تتم معالجتها مباشرة بعد بتر للمحافظة على سلامة الأنسجة. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تطبيق الأسلوب الموصوفة هنا للبشرية بكلس الرئتين الصغار والكبار على حد سواء والرئتين سليمة ومريضة. في الولايات المتحدة، على سبيل المثال، من الممكن الحصول على الرئتين من الجهات المانحة الجهاز الصحي الذين ماتوا في حوادث أو الأجهزة التي رفضت لزرع الأعضاء.
الخطوة الحاسمة الأولى في البروتوكول هو التضخم للخطوط الجوية ولحمة المحيطة مع الحل [اغروس]. هذه الخطوة ضروري لتقوية الأنسجة اللينة جداً لإجراء تشريح اللاحقة. جودة المواد الرئة البشرية، استناداً إلى خلفية المرض، أمر بالغ الأهمية هنا. يمكن أن تملأ الفصوص فقط مع الجنب سليمة. في بعض الأحيان منع الأورام نهاية مرحلة القرب من القصبات الهوائية عملية ملء. وقد درجة حرارة الحل [اغروس] قبل تضخيم البشرية المادية، التحقق من دقة. الكثير من الدم (أو أخرى سوائل، نتحات) داخل الإنسان أنسجة الرئة سيؤدي إلى إضعاف [اغروس] غير مرغوب فيها وسوف تؤثر على عملية البلمرة. بعد تضخم أنسجة الرئة والتبلور من [اغروس] على الجليد، يتم قطع الرئتين إلى أقسام من 200 إلى 300 ميكرون سمك. تناسق الأنسجة مسألة حرجة للغاية. إذا كانت الأنسجة الناعمة جداً، تشريح أقسام متساوية من الصعب. حتى لو كان نفس مبضع يتم تعيين المعلمات لكل جهة مانحة، سمك الشرائح بين الجهات المانحة قد تختلف، والشروط الواجبة للفرد والتغييرات خلال تضخيم عملية لكل الرئة. سيؤدي إلى ملء متنافرة أنسجة سمك شريحة مختلفة. بدلاً من قياس وتوحيد سمك شرائح، يمكن استخدام قياس محتوى البروتين الكلي لرصد الرئة شريحة سمك غير مباشر. العديد من الأمراض في نهاية مرحلة تعوق عملية تشريح؛ مثلاً، يمكن أن يكون الدم السفن وهي سميكة جداً في ارتفاع ضغط الدم الرئوي، وأنسجة تليفية قاسية حتى أن تشريح الأنسجة اسطوانات يكاد يكون من المستحيل وبليد مبضع يحتاج إلى استبداله في كثير من الأحيان.
بعد إعداد البشرية بكلس وكثافة الغسيل الخطوات، التي تعتبر ضرورية لإزالة الحطام خلية والإفراج عن الإنزيمات، الأنسجة يمكن أن تستخدم المقاطع لتجارب29. بكلس البشرية المزروعة تحت ظروف ثقافة الخلية الطبيعية وعرضه، على سبيل المثال، للمواد الكيميائية، والأدوية، أو ليبوبوليساكتشاريديس. تلوث بكلس أحياناً بسبب الالتهابات (غير معروف) قضية خاصة في ثقافة الرئة البشرية المادية. يجب أن يتم تجاهل الثقافات الأنسجة تظهر الالتهابات وتطهير المعدات يجب أن تكون دقة. الفصل المكاني بين أماكن المختبرات المستخدمة لإعداد من ناحية واستزراع من ناحية أخرى قد يساعد على تجنب الأمراض العابرة. فيما يتعلق بالمعدات، وقد تسرب مبضع، ومسامير عرافة فضفاض قد يؤدي إلى تلف المحرك وتوقف حركة بليد. ليس كل جزء مقسم طريقة العرض مصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ، وحتى أنها سوف أكسدة إذا لم يجف فورا تغيير التنظيف. للتغلب على المسائل المتعلقة بالمعدات، قد يكون من الضروري أن يكون جهاز النسخ الاحتياطي واحد على الأقل.
في المنشورات السابقة، وأفادت بأن تغسل [اغروس]، وأزيلت أثناء الغسيل الخطوات بعد إعداد مكثفة. في الواقع، هذا غير ممكن، لا يمكن إزالة [اغروس]. لإتمام عملية الإزالة من [اغروس]، فإنه يجب أن يكون إعادة ذاب في درجات حرارة عالية، الأمر الذي من شأنه أن يدمر الأنسجة. [اغروس] في الحويصلات الهوائية والخطوط الجوية لا تتداخل مع وصف نقاط النهاية. نقاط النهاية الأخرى التي يحتمل أن تتأثر بالوجود [اغروس] (انظر أيضا القيود). الحاجة إلى إعداد مقاطع الأنسجة الطازجة جداً قد ينبغي التأكيد، كما صلاحية الأنسجة مسألة حاسمة في الثقافة. برونتشوكونستريكشن ليست معلمة صالحة للبقاء. نوصي باستخدام اثنين أو ثلاثة على الأقل من فحوصات سيتوتوكسيسيتي مستقلة للتحقق من صلاحية حمة المحيطة بها؛ وهذا قد يتم إيداعه كل تجربة30. ضوابط الجودة في فحوصات سيتوتوكسيسيتي بمثابة مؤشرات لبقاء أنسجة غير كافية. ولذلك، يوصي بتقييم مدى استجابة الأنسجة، على سبيل المثال، إلى مادة سامة فعالة كمطهر في جميع سيتوتوكسيسيتي فحوصات. استناداً إلى منحنيات الاستجابة للجرعة، تحتاج إلى تعريف لفحوصات سيتوتوكسيسيتي قيم الحد الأدنى والحد الأقصى للاستيعاب واجتمع للتجارب اللاحقة. المزيد من التعديلات للبروتوكول معظمها يعتمد على المواد الكيميائية التطبيقية ونقاط النهاية للفائدة. ويقتصر انطباق المواد الكيميائية غير قابلة للذوبان أو شدة رد الفعل. أعلى تركيز المذيبات ل [دمس] يقتصر على 1%. يمكن استخدام تركيزات أعلى لكن قد تؤدي وضوحاً إطلاق السيتوكينات الموالية التحريضية، مثل إيل-8. من ناحية أخرى، قد يكون الحافز الذي يستخدم ضعيفة نسبيا. وفي هذه الحالة، يمكن زيادة كمية الأنسجة من اثنين إلى أربعة شرائح كل بئر. وهذا النهج يحد من صلاحية إلى ح 24.
قيداً رئيسيا من بكلس البشرية أن في ألمانيا أنها يمكن إلا إعداد من المواد الرئة البشرية المريضة. المرضى الذين خضعوا للجراحة عادة أقدم من سنة 50 و 80 في المائة من المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة أو تستخدم ليكون المدخنون. الدواء للمرضى، مثل الكورتيزون، يمكن أن تؤثر أيضا نتائج تجارب باستخدام الأنسجة البشرية. ولذلك، من الضروري أن: ط) التحقق من صحة كل تجربة بالإشارات الإيجابية التحقق من صلاحية والأداء الوظيفي، وحساسية الأنسجة الفردية، والثاني) عبر–التحقق من صحة النتائج باستخدام أنسجة الرئة صحية، غير مريضة، منتصف العمر من الحيوانات المختبرية (الرئيسيات غير البشرية مثل سينومولوغوس، وإذا أمكن، الماوس، الجرذان، خنزير غينيا). أفضل درجة علم أمراض الأنسجة المريضة، كلما كان ذلك أفضل النتائج التجريبية. لا يمكن استخدام الأنسجة المريضة بشكل كبير ويظهر في كثير من الأحيان محدودة الجدوى ومستويات سيتوكين غير كاف منخفضة أو عالية للغاية، والعدوى البكتيرية أو الفطرية وأقل برونتشوكونستريكشن. مانح إلى تباين أعلى بالمقارنة مع النتائج التي تم الحصول عليها من الحيوانات المختبرية، التي تعكس التغيرات الفردية للبشر. هذا، مع ذلك، لا حد بشكل عام؛ وكما ذكر أعلاه، في بلدان أخرى (مثلالولايات المتحدة) فإنه من الممكن الحصول على الرئتين صحية من الجهات المانحة الجهاز المتوفى رفض لزرع الأعضاء. وصف استجابة الأنسجة لأول ما يصل إلى 48 ساعة في تجارب التعرض الحاد. يتم تخفيض صلاحية والأداء الوظيفي للأنسجة بعد عدة أيام من الثقافة أو بعد التخزين في-80 درجة مئوية. فمن الممكن لانسجة الرئة البشرية الثقافة لتصل إلى حوالي 14 يوما. وما زالت الجدوى خلال هذا الوقت؛ ومع ذلك، يلاحظ زيادة في تقلب، فضلا عن فقدان وظائف عدة خلايا السكان، مثل الضامة، في الأنسجة، أسفر عن إطلاق سراح سيتوكين محدودة ردا على ميتوجينس. وهو قيد آخر لبعض نقاط النهاية الوجود [اغروس] في النسيج، إعاقة، على سبيل المثال، عزل كميات كافية وذات جودة عالية من الحمض النووي الريبي31 أو إعداد تعليق خلية واحدة لقياس تدفق اللاحقة و فينوتيبينج الخلايا. ومن ثم إمكانية اكتساب نظرة ثاقبة آليا إلى استجابات الخلايا المفردة ووظائف محدودة.
وتعتبر نماذج الأنسجة أورجانوتيبيك، مثل بكلس البشرية، أثر ارتفاع على البحوث الأساسية وغير السريرية. المواد الرئة البشرية بتكوين البيولوجي الذي يعكس عن كثب هندسة الجهاز العادي. على سبيل المثال، فإنه يحتوي على سكني الخلايا الظهارية السنخية والشعب الهوائية وخلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية، وخلايا بطانية، الألياف العصبية والضامة. قابلاً للأنسجة والخلايا الاستجابة للمحفزات عدة. العصب الألياف، وبالرغم من أن قطع، يمكن محلياً تفعيلها، مما يؤدي إلى استجابات منعكس المحطة الطرفية14. ونتيجة لذلك، يوفر هذا الطراز السابقين فيفو إمكانية دراسة الاستجابات المناعية الفطرية الخلوية وردود الدفاع، سيتوكين الإشارات والتعريفي لعلامات سطح الخلية. العديد من التحسينات في تقنيات استزراع والتحقق من النتائج النهائية تسمح باستخدام بكلس البشرية في مجال العلوم متعدية الجنسيات. أمثلة للنهج المقبلة: ط) التحقق من جديد يستهدف في أنسجة الرئة البشرية، ثانيا) تقييم الاستجابات المناعية بعد التعرض، على سبيل المثال، للمواد الكيميائية، والمخدرات، وجسيمات نانوية، إلخ، ثالثا) مكملات لانسجة الرئة مع الخلايا المناعية، مثل اللمفاويات T، رابعا) تحديد وتعديل أنماط الجزيئية، على سبيل المثال، بعد التعرض محسسات الجهاز التنفسي، والمواد المسببة المرض، أو المركبات النشطة التي تعوق مسارات؛ وعلاوة على ذلك، الخامس) إعادة عرض مجرى الهواء والسادس)32من اللائحة الخلايا العصبية. الميدان العلمي مهتمة بهذه النهج الحالية والمستقبلية مع بكلس. وبالإضافة إلى ذلك، هناك مجموعة متنوعة من التطورات المختلفة التي سوف تساعد على تحسين أسلوب بكلس، مثل البرد–الحفاظ على20، والأنسجة التي تمتد من33 تقليد الحركة الطبيعية للأنسجة أثناء التنفس أو الميكانيكية التهوية.
والميزة الرئيسية للبشرية بكلس بالمقارنة مع 3D نماذج أخرى هو وجود الخلايا المناعية والألياف العصبية. يمكن أيضا إجراء التجارب في الماوس وفار، والمقدمات غير البشرية، وهي الأنواع الحيوانية التي تزال تستخدم في أغلب الأحيان في علم الصيدلة وعلم السموم. ويدعم الطابع المعقد لانسجة الرئة البشرية ترجمة النتائج من الحيوان إلى الإنسان ومن في المختبر في فيفو. في سياق فحوصات البديلة القائمة للتعرف على محسسات الرئوي، بكلس البشرية معقدة جداً ولا تسمح برؤى في الردود خلية مفردة. حتى الآن، قد تعطي الخلوي المجهري وتدفق المعلومات حول الاستجابات الخلوية، إذا تم استخدام علامة الحق الخلوية في تركيبة، على سبيل المثال، مع علامات داخل الخلايا أو نخر أو المبرمج. وهناك فحوصات المنشورة التي تم التحقق من صحتها وذكرت أنها كانت تستخدم لتحديد هوية الجهاز التنفسي محسسات. غير أن التقدم في استخدام بكلس بجميع مزاياها على فحوصات خلية واحدة هي إسهاما قيماً بمعنى أنه يمكن استخدام هذه التقنية للفرز الفائق، كما وصفها Watson et al. 34 أنها وضعت مقايسة فرز الفائق للتنبؤ بمجرى الهواء سمية في مورين بكلس البرد–الحفاظ على. مع شكلها بكلس 96-جيدا المنمنمة، التي يتم الكشف عنها قراءات مماثلة في سائل الغسل مورين، مما يجعل بكلس مقايسة الفائق ممكناً.
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر لوينستين Lan لعملها السابق بشأن استراتيجيات الاختبار البديلة لتقييم المخاطر مع بكلس البشرية. وأيد بعض البحوث بمنحه من “المفوضية الأوروبية” ضمن البرنامج الإطاريال 6 SENS-تكنولوجيا المعلومات-رابعا “رواية اختبار استراتيجيات التقييم في المختبر للمواد المسببة للحساسية”.
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm | A. Hartenstein (Leipzig, Germany) | SS04 | |
Syringe | Faust Lab Science (Klettgau, Germany) | 9.410 050 | |
Coring tools | custom-made | custom-made | |
Trimming Blade Handle (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205530001 | |
Trimming Blades (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205500000 | |
Microtome: Tissue Slicer | Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) | 303400-ADPT | Krumdieck Tissue Slicer (MD6000) |
Microtome blade | Wilkinson Sword (Solingen, Germany) | ENR-4027800011506 | |
Tissue culture dishes | Sigma (München, Germany) | Z666246-420EA | |
Cell strainer filter (100 µm Nylon) | Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) | BD352360 | |
Inoculation loop | Copan Diagnostics (Murrieta, USA) | CD176S01 | |
TPP Tissue culture plates 24wells | Sigma (München, Germany) | Z707791-126EA | |
Cassette | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 1000957 | |
Nunc MaxiSorp flat-bottom | Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) | 44-2404-21 | |
Nunc MicroWell 96-Well | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 260836 | |
Confocal Microscope | Zeiss (Jena, Germany) | Confocal LSM Meta 510 | |
Image rendering software | Bitplane AG (Zürich, Switzerland) | IMARIS 7.6 | |
LSM Image Browser | Zeiss (Jena, Germany) | ||
Multiwell-Reader | Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) | Tecan infinite F200Pro | Plate Reader |
Plate shaker | Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) | KM-2 Akku | |
BenchMark ULTRA | Ventana Medical Systems (Tucson, USA) | Automated IHC/ISH slide staining system | |
Assays | |||
Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche (Basel, Switzerland) | 11644807001 | |
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche (Basel, Switzerland) | 11644793001 | |
Microscopical vitality staining | Invitrogen (Carlsbad, USA) | L-3224 | LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit |
BCA Protein Assay | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 23225 | |
ELISA assay kit | R & D systems | various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) | DuoSet |
Reagents | |||
Agarose, low gelling temperature | Sigma (München, Germany) | A9414-100G | |
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) | Sigma (München, Germany) | E2888-500ML | |
Penicillin and streptomycin | Lonza (Verviers, Belgium) | 17-602E | |
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) | Gibco (Darmstadt, Germany) | 11039-047 | Culture medium |
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) | Lonza (Verviers, Belgium) | BE17-513F | Buffer solution |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma (München, Germany) | A9647-500G | |
Detergent | Sigma (Saint Louis, USA) | X100-100ML | Triton X-100 |
Washing buffer | Merck (Darmstadt Germany) | 524653 | 0.05% Tween 20 in PBS |