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Immunology and Infection

Bewertung der zytotoxischen und immunmodulatorische Wirkung von Substanzen im menschlichen Precision-Cut Lung Slices

doi: 10.3791/57042 Published: May 9, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Im Hinblick auf die 3R-Prinzips entwickeln sich Atemwege Modelle als Alternativen zum Tierversuch. Vor allem für die Risikobewertung der Atemwege Substanzen ist ein Mangel an entsprechenden Assays. Hier beschreiben wir die Verwendung von menschlichen Lunge präzise geschliffenen Scheiben für die Bewertung von Stoffen in der Luft.

Abstract

Erkrankungen der Atemwege in ihrer Vielfalt brauchen geeignete Modellsysteme, die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen und die Entwicklung neuer Therapeutika zu ermöglichen. Darüber hinaus erfordert die Registrierung von neuen Stoffen angemessene Risikobewertung mit angemessenen Prüfsysteme zur Vermeidung von Einzelpersonen geschädigt, zum Beispiel in der Arbeitsumgebung. Solche Risikobewertungen sind in der Regel in tierexperimentellen Studien durchgeführt. Angesichts des 3R-Prinzips und der öffentlichen Skepsis gegen Tierversuche haben menschliche alternative Methoden, wie Precision-Cut Lung Slices (PCLS) weiterentwickelt. Der vorliegende Beitrag beschreibt die ex-Vivo -Technik der menschlichen PCLS immunmodulatorischen Potenzial von niedrigem Molekulargewicht Stoffe wie Ammonium Hexachloroplatinate (HClPt) zu studieren. Gemessenen Endpunkte umfassen Lebensfähigkeit und lokalen Atemwege Entzündungen, gekennzeichnet durch veränderte Sekretion von Zytokinen und Chemokine. Pro-inflammatorischen Zytokinen, Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF-α) und Interleukin 1 Alpha (IL-1α) wurden nach der Exposition zu einer Sub-toxische Konzentration von HClPt in menschlichen PCLS erheblich gestiegen. Obwohl die Technik des PCLS in den letzten Jahrzehnten erheblich optimiert wurde, ist ihre Anwendbarkeit für die Prüfung von Immunmodulation noch in der Entwicklung. Daher sind die hier vorgestellten Ergebnisse vorläufig, obwohl sie das Potenzial des menschlichen PCLS als ein wertvolles Instrument in der respiratorischen Forschung zeigen.

Introduction

Erkrankungen der Atemwege wie allergisches Asthma, berufliche Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Emphysem und Infektionen der oberen und unteren Atemwege sind auf dem Vormarsch und stellen eine weltweite Gesundheit Last1,2. Geeignete Testsysteme sind erforderlich, um einige der grundlegenden Mechanismen zugrunde liegen diese Krankheiten, neben der Entwicklung und Erprobung von geeigneten Substanzen zu identifizieren. Grundlagenforschung sowie präklinischen Medikamentenentwicklung konzentrieren sich auf Ergebnisse, die in in Vitro oder in Vivo Tests. Diese Tests haben jedoch ihre Grenzen3. Erstens, in-vitro- Tests nutzen menschliche Zellen, die isoliert und aus angrenzenden Gewebe oder Organe entfernt wurden und sind somit nicht mehr in der Lage, mit interagieren oder durch andere Zellen3geschützt werden. Zweitens sind Tiermodellen oft nicht auf den Menschen aufgrund der Unterschiede in der Physiologie und biochemische Unterschiede4übersetzbar. Um diese Einschränkungen zu minimieren und im Rahmen der 3R (Ersatz, Verfeinerung, Reduktion) Prinzip5, neue alternative Modelle werden ständig weiterentwickelt.

Alternative menschliches Gewebe 3D Modelle, wie PCLS, sind ein Bindeglied zwischen Mensch-basierte in-vitro- und komplexe Tier in Vivo Modellen. PCLS reflektieren die funktionelle Heterogenität mit allen relevanten Zelltypen in die Atemwege6vorhanden. Darüber hinaus hat PCLS Technik den Vorteil der reproduzierbaren Vorbereitung mehrere dünne Scheiben präzise Dicke von einem einzigen tierischen oder menschlichen Gewebespender. Dies ermöglicht eine interne Kontrolle sowie verschiedenen Konzentrationen oder Drogen um getestet werden.

Seit der ersten Einführung der menschlichen Lunge Agar gefüllt Scheiben im Jahr 1994 von Fisher Et al. 7 die Technik zum Schneiden und Kultivierung von Lungengewebe ist erheblich verbessert worden. Christian Martin Et al. haben diese Technik für weitere chemischen und pharmakologischen Anwendungen8verbessert. Unsere Gruppe wurde diese Technik von Christian Martin im Jahr 2007 vorgestellt. Seitdem hat die Anwendung des PCLS in der Forschung erweitert, von der Prüfung der funktionellen Reaktionen wie Atemwege9,10 und Vasokonstriktion11, auf immunologische, pharmakologische12,13, und toxikologische7 Tests in verschiedenen Arten in mehreren Labors. Zum Beispiel Schlepütz Et al. 14 Reaktionen der Atemwege für Artenunterschiede untersucht und verglichen periphere Neuron Aktivierung des elektrischen Feldes Stimulation (EFS) oder durch Capsaicin bei Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Schafe, Krallenaffen und Menschen. Sie fanden die verschiedenen Arten haben unterschiedliche, aber unterschiedliche Muster der Nerv-vermittelte Bronchokonstriktion und kam zu dem Schluss, dass die häufig verwendeten Labortieren (Mäuse und Ratten) nicht immer die Antwort der Menschen widerspiegeln. Für Lungenkrebs Toxizitätstests und Verringerung die Zahl der Tiere in diesem Zusammenhang Hess Et Al. 15 vorab bestätigt Ratte PCLS als Alternative ex Vivo für Inhalationsstudien Toxizität. Pre-Validierung multizentrischen Studie führte zur Entwicklung von zwei Vorhersagemodellen PCLS mit vielversprechenden Ergebnissen.

Darüber hinaus wurden in der Grundlagenforschung PCLS zur Signalisierung16, frühe allergische Reaktionen17und Virusinfektion Antworten18,19Kalzium zu erhellen. Technischer Fortschritt ist im Gange und Weiterentwicklungen sind erforscht. Zum Beispiel steigt das Feld den Vorteil des menschlichen Gewebes durch die Speicherung und Wiederverwendung von tiefgefrorenem Gewebe. Rosner Et Al. beschrieben eine Technik von Einfrieren und Auftauen murinen PCLS, die die Fähigkeit der Atemwege nach Stimulation Vertrag bewahrt: die Technik verlängert daher die begrenzte Zeitfenster in dem Gewebe lebensfähig, und so weiter bleiben Assays können im Laufe der Zeit auf die gleichen Spender20angewendet werden. Neben dieser Forschung Fortschritte Lauenstein Et Al. 21 untersucht vor kurzem Risikobewertung von verschiedenen Chemikalien, die als potenzielle Sensibilisatoren für berufliche Asthma in menschlichen PCLS fungieren könnte.

Am Arbeitsplatz Asthma, deren Symptome Luftstrom Obstruktion und hyperreaktivität der Atemwege, ähnlich wie allergisches Asthma sind, wird durch die Einwirkung von hohen Molekulargewicht (HMW)22 oder geringem Molekulargewicht (LMW) Substanzen23 induziert (z.B. , Platin Verbindungen) in der Arbeitsumgebung. LMW-Agenten haben eine hohe Sensibilisierung potenzieller als Haptens bilden und Binden an Carrier-Proteine-21. Registrierung von neuen HMW oder LMW Chemikalien erfordert in Vitro und in Vivo Risikobewertung hinsichtlich ihrer vermeintlichen Sensibilisierung potenzieller (zB., OECD Guideline 429)24. Die Tests zur Ermittlung die vermeintliche Sensibilisierung potenzieller, wurden jedoch ursprünglich nicht für die Risikobewertung der Atemwege Sensibilisatoren konzipiert, sondern für Kontakt Sensibilisatoren, obwohl es schien einige Übereinstimmung für eine kleine Teilmenge von Stoffen25 . Die Arbeit von Lauenstein Et Al. wurde im Rahmen des EU-Projekts Sens-It-iv, alternative Prüfstrategien für die Risikobewertung von vermeintlichen Kontakt oder Lunge Sensibilisatoren21zu entwickeln. Für dieses Projekt konzentrierten wir uns auf die Verwendbarkeit des menschlichen PCLS als eine alternative Testtool getestet. Daher wurde eine Reihe von immunmodulatorischen Endpunkte (z.B., Rentabilität und Zytokin-Sekretion) ausgewählt, die reizend oder entzündlichen Chemikalien wie LMW Platin Verbindungen zu ermitteln. Lauenstein Et Al. fand keine allgemeine Muster, das die alle Atemwege Sensibilisatoren angewendet werden könnte; aber bildete ihre Arbeit die Grundlage für kürzlich veröffentlichten Protokolle26.

Zusammenfassend lässt sich sagen sieht das Protokoll für die Vorbereitung und anschließende Belichtung des menschlichen PCLS hier vorgestellten eine hilfreiche Methode zur Bewertung der potenziell Lunge toxisch und/oder immunmodulatorische Substanzen, die bei der Entwicklung der Atemwege beteiligt sein könnten Krankheiten, wie zum Beispiel am Arbeitsplatz Asthma.

Protocol

Experimente mit menschlichen PCLS müssen nach Dem Code of Ethics der World Medical Association durchgeführt und genehmigt von der lokalen Ethikkommission (die vorbildliche PCLS Experimente gezeigt, hier stimmten mit der lokalen Ethikkommission der Hannover Medical School; Nr. 2701-2015). Schriftliche Einwilligung zur Verwendung von menschlichen Lunge Material ist von allen Spender Patienten oder ihre Angehörigen erforderlich. Die Ergebnisse in diesem Manuskript beschrieben wurden mit Gewebe Scheiben von Spendern der verschiedenen Altersstufen, Geschlechter, Krankengeschichte und Ursache der Resektion, erzielt, obwohl die meisten des Gewebes erhalten wurde von Patienten mit Lungenkrebs. Nur frei von Tumor Gewebe wurde für Experimente verwendet.

1. allgemeine Vorbereitung der menschlichen PCLS und nachfolgende Exposition gegenüber Chemikalien

Hinweis: Um eine Lunge zu füllen sind zwei Personen erforderlich. Eine aktuelle Impfung Rekord für Hepatitis A und B wird empfohlen. Patienten sind vor der Lungentransplantation routinemäßig auf HCV und HIV untersucht. Wenn eine aktive Infektion mit Mycobacterium Tuberculosis diagnostiziert oder vermutet wird, sollte die Lunge abgelehnt werden. Dennoch, alle frischen menschlichen Lungengewebe und Proben daraus abgeleiteten müssen behandelt werden als potenziell infektiöse und entsprechende Schutzmaßnahmen getroffen werden müssen, (Partikel Filtermasken (FFP2), Schutzbrille, Handschuhe), um berufliche Sicherheit der Personal. Der Eingriff dauert 60-90 min.

  1. Bestätigen Sie die Unversehrtheit der menschliche Lungenflügel.
    Hinweis: Ein Riss in der Pleura verhindert homogene Füllung des Gewebes. Menschlichen Lunge Material muss ab dem Tag der Resektion sein. Lagerzeit von ca. 2 h bei Raumtemperatur (RT) vor dem Befüllen mit Agarose auf Eis werden toleriert. Das Gewebe, das wir verwenden Sie in diesem Protokoll wird von Patienten, die eine Resektion erhalten. Es ist nicht von verstorbenen Patienten. Wenn das Gewebe auf Eis gelagert wurde, Vorwärmen, RT vor dem Befüllen, sonst wird die Agarose sofort polymerisieren und keine homogene Füllung wird möglich sein.
    Achtung: Stellen Sie sicher, dass alle Personen, die in Kontakt mit einheimischen Menschenmaterial Schutzkleidung bestehend aus einem Kittel, zwei Paar Handschuhe, Mütze, Gesichtsmaske und ein paar Schutzbrille aufsetzen. Menschenmaterial ist potenziell infektiös.
  2. 7,5 g Low-gelling Agarose wiegen und 250 mL Bi-destilliertes Wasser hinzufügen. Kochen Sie die Agarose in der Mikrowelle, bis die Agarose aufgelöst ist. Auf ca. 40 ° C, je nach Schmelz- und vergelung der Agarose abkühlen lassen.
    Hinweis: Mehrere Fläschchen sind erforderlich, abhängig von der Größe des Lappens.
  3. Wärmen Sie vor und halten Sie das Kulturmedium (Table of Materials) bei 37 ° C.
    Hinweis: Wenn die Agarose zu heiß ist, Vitamine in das Kulturmedium Wirksamkeit verlieren und Zellen beschädigt werden. Wenn die Temperatur des Mediums/Agarose-Lösung unter 37 ° C liegt, wird der Gelier Prozess gestartet und homogene Füllung der Lunge beeinträchtigen. Nur ein Temperaturbereich von 37 ° C auf 39 ° C wird empfohlen.
  4. Legen Sie alle benötigten Materialien in Reichweite vor dem Start: 5-10 Schellen, biegsamen Katheter von ca. 1 m Länge, einer geeigneten Spritze (z.B. 50 mL) passt die Verbindung mit dem Katheter und eine Kühlbox mit Eis gefüllt.
  5. Cannulate der Luftröhre/Main Bronchus durch den Silikonschlauch einfügen und mit einer Klammer fixieren Parallel am Rohr ausgerichtet, damit die Klammer das Gewebe zusammen neben den Silikonschlauch quetscht ohne Kneifen es ab. Stellen Sie sicher, dass der Silikonschlauch innen fixiert ist und nicht während des Füllvorganges verrutschen kann. Schließen Sie alle anderen Bronchien, Blutgefäße und Verletzungen mit Schellen, damit keine Agarose während des Füllvorganges austreten kann.
  6. Vermischen Sie gleichwertigem Umfang von 3 % niedriger Gelier-Agarose mit Nährmedium in einem Becherglas. Das Gemisch in die Lunge, die mit einer 50-mL-Spritze zu vermitteln. Vor dem Nachfüllen der Spritze mit Medium, schließen Klemme den Katheter mit den Fingern oder einer Klemme zur Vermeidung von Luftblasen und Agarose Reflux. Füllen Sie die Lungenflügel, bis es vollständig aufgeblasen ist. Berühren Sie vorsichtig die Lunge Pleura auf der Seite; die Pleura sollte eben und schwer sein.
    Hinweis: Abhängig von der Größe der Lungenflügel, können bis zu 2 oder 3 L Agarose/mittlere Lösung erforderlich sein.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 1,5-1,6 für jedes Bronchus bei mehreren Bronchien in einem einzigen Exemplar.
  8. Die Lunge auf Eis für die Polymerisation von der Agarose für 20-40 min, abhängig von der Menge der eingeflößt Agarose Gel gelegt. Vorsichtig berühren der Pleura auf mehrere Seiten zu überprüfen, ob es ist hart und cool, darauf hinweist, dass die Polymerisation abgeschlossen ist, sonst weiter zu warten. Lassen Sie die Pathologen werden die Lunge in Scheiben schneiden, ihre Proben nehmen und speichern die Lunge Material auf Eis für den Transport.
  9. Schneiden Sie die menschliche Lungengewebe in 3-5 cm Platten mit einem scharfen Messer.
    Hinweis: Verwenden Sie ein neues Blatt für jede Lunge um Schärfe zu gewährleisten.
  10. Füllen Sie die Gewebe-Schneidemaschine mit 400 mL eiskaltes Earle ausgeglichene Salzlösung (EBSS). Zylindrische Gewebe Kerne aus der Lunge-Platten mit einem halbautomatischen Schraubendreher mit einem erbohrte Werkzeug von der bevorzugten Durchmesser sofort schneiden (z.B.8 mm; 10 mm).
    Hinweis: Dieser Durchmesser muss der Durchmesser des Inhabers Gewebe im Inneren der Maschine entsprechen.
  11. Passen Sie die Dicke der Lunge Scheiben auf die gewünschte Dicke Wert.
    Hinweis: Eine Dicke von etwa 250 µm wird häufig in PCLS Experimente verwendet. Der Hersteller des Gewebes Slicers empfiehlt ihre Gewebe Slice Dickenmesser für die Überprüfung der die Scheibendicke. Alternativ kann ganze-Mount Färbung kombiniert mit konfokalen Mikroskopie zur die Scheibendicke herangezogen werden wie beschrieben durch Brismar Et al. 27
  12. Übertragen Sie die Gewebe-Kerne in den Gewebe-Halter des Slicers Gewebe. Setzen Sie das Gewicht (Teil des Inhabers Gewebe) auf den Gewebe-Kern. Stellen Sie Geschwindigkeit und Rotordrehzahl bis 6 auf der Gewebe-Schneidemaschine. Schneiden des Gewebe-Kerns in PCLS zu starten.
  13. 500 mL von im Handel erhältlichen Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzen: Nährstoff-Mischung f-12 DMEM/F12 (1:1) mit 5 mL Penicillin (10.000 Einheiten/mL) und Streptomycin (10.000 µg/mL). Lagern Sie das Kulturmedium für mehrere Tage unter sterilen Bedingungen im Kühlschrank. Wärmen Sie nur das erforderliche Volumen des Mediums vor.
    Hinweis: Penicillin wird inaktiviert werden, wenn über einen längeren Zeitraum bei 37 ° C gehalten. Verwenden Sie Serum frei und Farbstoff Kulturmedium, wie Serum Zusammensetzung von Charge zu Charge variiert und Farbstoffe, wie Phenol-rot, mit Assays beeinträchtigen können.
  14. Füllen Sie eine Petrischale (100 x 15 mm) mit 25 mL eiskaltes Kulturmedium. Medium sollte aus der Gewebe-Hobel in ein Becherglas abgelassen werden, durch das Öffnen der Klemme des gläsernen Zylinders. Übertragen Sie die Scheiben aus einem Becher in der Petrischale mit Kulturmedium mit einem Applikator (z.B. Impfschlinge). Setzen Sie die Petrischale in einen Inkubator (37 ° C, 5 % CO2, 100 % Luftfeuchtigkeit). Lassen Sie das Medium zum Aufwärmen vor dem Waschschritte.
    Hinweis: Alle weiteren Schritte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
  15. Legen Sie eine Zelle Sieb in der Petrischale für das Waschen der PCLS. Vollständig entfernen Sie das Kulturmedium mit einer serologischen 10-mL-Pipette durch die Zelle Sieb und 25 mL 37 ° C vorgewärmte frisches Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 - 4 mal alle 30 Minuten.
    Hinweis: Die Zelle Sieb verhindert, dass die Scheiben, in die Pipette, um Schäden an den Scheiben zu vermeiden gesaugt.
  16. Übertragen Sie die Lunge Scheiben sorgfältig in eine Kultur 24-Well-Platte mit einem Minimum von 500 µL Kulturmedium für zwei Scheiben pro Bohrloch. Aussetzen des Lungengewebes (siehe Schritte 3.1-3.4) Stoffe, z.B.für 24 h bei 37 ° C, 5 % CO2.
    Hinweis: Für die Übertragung, vorzugsweise eine Impfschlinge und lassen des Scheiben-Schwimmers auf die Schleife um Gewebeschäden zu vermeiden. Keine weitere Trennung der Scheiben ist erforderlich, da nur Mangel an ausreichend frisches Medium Zelltod im Gewebe Scheiben induziert wird. Scheiben können sich überlappen oder berühren einander im Brunnen: Dies hat keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit des Gewebes.
  17. Alle menschlichen Restmaterial in eine Plastik Flasche mit einem Fixiermittel (z.B. 10 % gepuffert Formaldehyd) für mindestens 24 h und brennen Sie diese bei der Entsorgung.
    Achtung: Formaldehyd ist giftig, führen Sie diesen Schritt unter einer Haube.

2. histologische Analyse des PCLS

  1. Biopsie-Kassetten mit zwei Schaumstoff-Pads, getränkt in Fixiermittel vorbereiten (zB., 4 % gepuffert Formaldehyd). Legen Sie die PCLS zwischen den Schaumstoff-Pads in der Biopsie-Kassette und sofort übertragen Sie das Gewebe in Fixativ Lösung. Fix das Gewebe über Nacht bei 4 % gepuffert Formaldehyd.
  2. Verarbeiten Sie das Gewebe für Paraffin Einbetten von Dehydratisierung Proben in Ethanol (70 %, 90 %, 100 %, 100 %, 100 %, 100 %) für jeweils 1 h gefolgt von Wäsche in Xylol (3 x 1 h) und flüssiges Paraffin (3 x 1 h) nach standard Histopathologie Protokolle.
  3. Übertragen Sie die PCLS in ein Einbetten von Schimmel. Verwenden Sie eine Impfschlinge. Das PCLS Gewebe in flüssigem Paraffin einbetten. Vergewissern Sie sich, das Gewebe gleichmäßig in der Form statt, wenn der paraffinblock Gießen.
  4. Schneiden Sie den Gewebe-Block mit der PCLS mit rotary Mikrotom, bis es eine flache Oberfläche hat. Schnittserien der gewünschten Dicke zu nehmen (zB., 4 µm), platzieren sie einzeln auf fortlaufend nummeriert beschichtete Glasplatten (in der Regel 25-30 Abschnitte eingenommen werden können) bis die ganze PCLS abgearbeitet wurde.
  5. Färben Sie einzelne Objektträger (alle 8-10 Sektionen) mit Hämatoxylin und Eosin Fleck (H & E) zur Orientierung. Markieren Sie die Abschnitte für das Experiment basierend auf der Ausrichtung-Folien (die erste und letzte 8 Abschnitte sind in der Regel unvollständig).
    Hinweis: (Optional) für längere Lagerung können Folien in flüssigem Paraffin für Erhaltung getaucht werden.

3. Vorbereitung der Lösungen für Stoffe

Hinweis: Bereiten Sie funktionierende Lösungen und Kontrollen unmittelbar vor der Anwendung.

Achtung: Behandeln Stoffe nach Sicherheitshinweise oder, falls nicht bekannt, als potenziell schädlich und Routine Sicherheitsvorkehrungen zu folgen.

  1. Wasserlösliche Substanzen direkt in Kulturmedium auflösen. Für unlösliche oder schlecht löslichen Chemikalien zuerst lösen Sie die Substanz in geeigneten Lösungsmitteln je nach Substanz Löslichkeit. Stoffe mit begrenzten Wasserlöslichkeit (< 0,1 mg/mL) können aufgelöst werden, zum Beispiel in DMSO oder Ethanol. Nicht-toxische Lösungsmittel Konzentrationen sollte durch Titration im Voraus bestimmt werden. Stellen Sie sicher, dass die Stoffe nicht aus der Lösung wenn in Medium verdünnt Niederschlag zu tun.
    Hinweis: HClPt und Natrium Laureth Sulfat (SLS) Lösungen sind bereit.
  2. Bereiten Sie Substanz Stammlösungen bei 100fach der gewünschten höchste Konzentration im Kulturmedium oder Lösungsmittel. 12,5 mg HClPt und 34,4 mg SLS abwägen und Stammlösungen durch Auflösen der Chemikalien in 1 mL Kulturmedium vorzubereiten.
    Hinweis: Keine Lösungsmittel ist für diese Chemikalien erforderlich.
  3. Bereiten Sie eine endgültige Verdünnung von 1: 100 in vorgewärmten Medium. Bei vorheriger Verwendung von Lösungsmittel führt dieser Ansatz die gleichen endgültige Lösungsmittelkonzentration für alle Stoffkonzentrationen.
  4. Verwenden Sie die endgültige Lösungsmittelkonzentration (z. B.1 % wie in Schritt 3.3 beschrieben) für Referenz-Behandlung des PCLS. Keine Lösungsmittel Kontrolle bedurfte es für die Chemikalien, die im Abschnitt "Ergebnisse" erwähnt.

4. positive und Negative Referenzen für Zytotoxizität Assays

  1. Bereiten Sie alle Lebensfähigkeit Assays die folgenden positiven und negativen Kontrollen:
    1. Gewebekontrolle: inkubieren PCLS im Kulturmedium nur als Referenz für unbehandelte PCLS 24 h bei Zelle Kulturbedingungen (37 ° C, 5 % CO2, 100 % Luftfeuchtigkeit).
    2. Fahrzeugkontrolle (falls erforderlich): mit der endgültige Lösungsmittelkonzentration PCLS inkubieren, wie Fahrzeug nur eine Referenz für PCLS behandelt (siehe Punkt 3.4) für 24 h bei Zelle Kulturbedingungen (37 ° C, 5 % CO2, 100 % Luftfeuchtigkeit).
    3. Positive Kontrolle: PCLS mit 1 % Waschmittel in Pufferlösung für 1 h bei 4 ° c inkubieren
      Hinweis: Wenn PCLS farblos geworden, das Gewebe ist tot. Insgesamt L-Lactat-Dehydrogenase (LDH) wird in der Überstand mit einer Absorption von ca. 1,9-2,3 bestimmt (siehe Schritte 6.1-6.4). Das Gewebe wird für das WST-1-Assay verwendet (siehe Schritte 5.1-5.5), mit einer Absorption von etwa 0.

5. Messung der chemisch induzierten Cytotoxizität in menschlichen PCLS von WST-1-Assay

Hinweis: Der WST-1-Test erfolgt in einer 24-Well-Platte mit zwei PCLS pro Bohrloch. Vorzugsweise verwenden Sie Duplikate für jeden Parameter und nach der Messung bündeln Sie die Ergebnisse der diese Duplikate zu.

  1. Bereiten Sie die Arbeitslösung durch Verdünnung der WST-1-Reagenz in Medium unmittelbar vor dem Start. Die erforderliche Menge an funktionierende Lösung ist 250 µL/Well einer 24-Well-Platte. Mischen Sie daher 25 µL des Reagenz mit 225 µL des Kulturmediums für einen Brunnen.
  2. Verwerfen Sie nach der Inkubation des PCLS aus Schritt 1.16 oder des Überstands für Zytokin-Messungen oder andere Tests wie der LDH-Assay. Das restliche Gewebe wird für den nächsten Schritt verwendet.
  3. Pipettieren 250 µL der Konzentration der WST-1 Reagenz pro arbeiten gut und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 für 1 h stellen Sie sicher, dass die PCLS vollständig während der Inkubation der WST-1 Reagenz unterliegen.
  4. Die Platte auf einem Orbitalschüttler (200 u/min) und vorsichtig Schütteln für 30 s, gründliches Mischen der WST-1-Reagenz zu gewährleisten. Nehmen Sie eine neue flach-Boden-96-Well-Platte und pipettieren 100 µL in Duplikate aus der Überstand jede Vertiefung des 24-Well-Platte.
  5. Messen Sie die Absorption von jedem Bohrloch bei 450 nm (Referenz: 630 nm) mit einer Mikrotestplatte Reader. Subtrahieren Sie die Absorption bei 630 nm von 450 nm. Diese Werte werden für die Berechnung im Schritt 5.6 verwendet werden).
    Hinweis: Zuverlässige Daten für Zytotoxizität Bewertung können nur tragfähige Gewebe entnommen werden. Daher diese Akzeptanzkriterien von Hess Et Al. veröffentlicht 15 sollte in jedem Experiment stattgegeben werden. Wenn diese Kriterien nicht erfüllt sind, sollte das Experiment wiederholt werden.
  6. Aufnahme von der unbehandelten mittlere Kontrolle sollte über 0,6, sonst das Experiment wiederholt werden sollte. Wenn die Daten diese Anforderung zu erfüllen, der Absorptionswert des Kontrollstreifens Gewebe auf 100 % eingestellt und berechnen die WST-1 Reduzierung der behandelten Proben in Bezug auf die Gewebe.

(6) LDH-Assay

Hinweis: Die LDH-Assay wird in eine 96-Well-Platte mit 100 µL Kultur insgesamt überstand nach der Post-Inkubationszeit durchgeführt.

  1. Nehmen Sie nach der Inkubation des PCLS mit oder ohne Test-Agents 50 µL des Überstands von Schritt 1.16 und in Duplikate in einer neuen 96-Well-Platte übertragen. Dies erzeugt Duplikate voneinander gut von einer 24-Well-Platte behandelt.
  2. Bereiten Sie die Arbeitslösung LDH Reagenz unmittelbar vor dem Test. Die Arbeitslösung besteht der Katalysator-Lösung (Lyophilisat gelöst in 1 mL Bidistilled Wasser) und Farbstoff Lösung des Herstellers. Mischen Sie für eine 96-Well-Platte mit 6,25 mL Farbstofflösung 125 µL Katalysator-Lösung.
    Achtung: Setzen Sie nicht die Lösung, um direktes Licht.
  3. Pipettieren 50 µL Arbeitslösung in jede gut bereits mit 50 µL des Überstandes und inkubieren Sie die Platte für 20 min bei RT in der Dunkelheit. Keine weiteren mischen ist erforderlich.
  4. Messen Sie die Absorption von jedem Bohrloch bei 492 nm (Referenz: 630 nm) mit einer Mikrotestplatte Reader. Subtrahieren Sie die Absorption bei 630 nm von 492 nm. Diese Werte werden für die Berechnung in Schritt 6.5 verwendet werden.
    Hinweis: Zuverlässige Daten für Zytotoxizität Bewertung können nur tragfähige Gewebe entnommen werden. Aufnahme des Kontrollstreifens Reinigungsmittel behandelt sollte mehr als 1 sein.
  5. Für die Analyse der Absorptionswert der Positivkontrolle vom Schritt 4.1 als 100 % und berechnen Sie die LDH-Veröffentlichung im behandelten Proben im Zusammenhang mit der Positivkontrolle (d.h., maximale LDH-Freisetzung) zu.

(7) mikroskopische Lebensfähigkeit Assay mit Confocal Laser Scanning Mikroskop (cLSM)

Hinweis: Für die mikroskopische Lebensfähigkeit Assay, sind zwei der normalen 250 µm dicken PCLS in 250 µL/Well einer 24-Well-Platte gefärbt. Da jedes Stück einzeln abgebildet ist, sind keine weiteren Duplikate erforderlich.

  1. Nach der Inkubation des PCLS mit oder ohne Prüfpositionen überstand verwerfen oder für Zytokin-Messungen oder andere Tests wie der LDH-Assay verwenden. Verwenden Sie das restliche Gewebe für das hier beschriebene Verfahren.
  2. Bereiten Sie die Arbeiten-Verdünnung von Calcein-AM und Interkalation Homodimer 1 (EthD-1) mit einer Konzentration von Arbeiten der beiden Reagenzien von 4 µM in Kulturmedium. Fügen Sie zu diesem Zweck 1 µL Calcein-AM (4 mM) und 2 µL EthD-1 (2 mM hinzu) 997 µL Kulturmedium. Dieser Band ist erforderlich, 4 Brunnen mit zwei PCLS zu beflecken.
    Hinweis: Vermeiden Sie die Reagenzien für direktes Licht.
  3. Pipettieren 250 µL der Verdünnung arbeiten in jedem gut und inkubieren Sie die 24-Well-Platte für 45 min bei RT in der Dunkelheit. Legen Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler bei 150 u/min, während der Inkubation um bessere Belichtung des Gewebes um die Färbelösung zu gewährleisten.
  4. Verwerfen Sie nach 45 min Die Färbelösung und waschen Sie die PCLS mit 1 mL Pufferlösung durch Schütteln bei 150 u/min für 3-5 min bei RT in der Dunkelheit. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
  5. Gelten Sie 500 µL Pufferlösung in jede Vertiefung mit der gefärbten PCLS um Autofluoreszenz aus Kulturmedium zu vermeiden. Führen Sie für die mikroskopische Beurteilung mindestens zwei zufällig verteilten Z-Stapel mit einem cLSM.
  6. Klicken Sie auf Registerkarte Okular 10 X / 0,3 wählen Ziel und klicken Sie auf Online, um mit dem cLSM als ein standard Lichtmikroskop zu verwenden, um die Oberfläche des PCLS zu finden. Klicken Sie auf Offline auf die okuläre Einstellung zu beenden.
  7. Klicken Sie auf die Registerkarte "Erwerb" und aktivieren Sie die entsprechenden Laser für die Fluorophore.
    Hinweis: Wir verwendeten einen Argonlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm für Die anionisches Farbstoff Calcein (Erregung Wellenlänge von 495 nm) und einem HeNe-Laser mit einer Wellenlänge von 543 nm für die Erkennung des EthD-1/DNA-komplexes (Erregung Wellenlänge von 533 nm). Der Argonlaser sollte in der Regel bei 30-50 % des maximalen Stroms ermöglichen einem Röhrenstrom von rund 5,7 A, laufen, da dies Laser Lebensdauer erheblich verlängert.
  8. Klicken Sie unter der Registerkarte " Erwerb " auf Licht Weg und richten Sie die erforderlichen Filter und Spiegel für das Experiment.
    Hinweis: In der vorliegenden Studie wurde ein Filter-basiertes System mit einem dichroitischen Fernlicht-Splitter verwendet (zB., HFT 488/543) trennt die Anregung und Emission Licht. Durch einen reflektierenden Spiegel, die, dem dieses Licht an den sekundären dichroitischer Strahlteiler (z.B.NFT 545), weitere richtet, emittiert separate das Licht von der Probe in zwei Kanäle.
  9. Einrichten von Band pass Filter (z. B.505-530 BP für das Calcein-Signal und BP 560-615 für das komplexe EthD-1/DNA-Signal), die nur einen bestimmten Bereich von Wellenlängen übertragen und Kanal 3 die Calcein, 2 Kanal und die EthD-1/DNA komplexe Signal zuweisen.
  10. Das Kontrollkästchen Sie Z-Stapel um die Ober- und Untergrenzen für die mikroskopische Lautstärke einzustellen. Drücken Sie die Schaltfläche "Live", eine live-Ansicht der entsprechenden Schicht auf dem Bildschirm zu sehen. Verschieben Sie den Fokus nach oben oder unten finden Sie die Oberfläche des PCLS mit einem starken Signal.
  11. Klicken Sie auf die Kanäle Unterabschnitt und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Alle anzeigen. Lock up der Tabelle durch Drücken auf die Taste des entsprechenden Kanals unter dem live-Bild und die Farbe des Kanals zu aktivieren.
    Hinweis: Eine blaue Farbe in das live-Bild wird angezeigt, dass kein Signal vorhanden ist, während ein high-Signal in weiß erscheint und ein Überbelichtetes Signal wird in rot angezeigt.
  12. Legen Sie das Loch für den roten EthD-1-Kanal auf 1 luftig Einheit für den besten Kompromiss zwischen Effizienz der light Kollektion und optischer Schnitt und anzupassen Sie den Calcein Kanal entsprechend. Erhöhen Sie das detektierte Signal des Gewinns, so dass es weiß, aber nicht im live-Bild mit Karzer Farbtabelle aktivierte Kanal rot erscheint.
    Hinweis: Der Meister Gewinn sollte 600 Einheiten nicht übersteigen.
  13. Erhöhen Sie oder verringern Sie den digital Offset Hintergrund anpassen, so dass er in blau im live-Bild mit Karzer Farbtabelle aktivierte Kanal angezeigt wird.
  14. Klicken Sie auf der Registerkarte Z-Stapel unter multidimensionalen Erwerb und nutzen im Vordergrund, um auf einer Z-Schicht von Interesse zu verlagern. Drücken Sie die Taste Set erste speichern diese Position für den späteren Erwerb. Verschieben Sie den Fokus langsam nach oben oder unten, bis eine Reihe von 30 µm erreicht wurde und drücken Sie Set letzten speichern.
  15. Klicken Sie auf Live wieder zu deaktivieren das live-Bild und drücken auf Start Experiment die Bildgebung zu starten.
    Hinweis: Tragfähige Gewebe wird durch Fluoreszenz anionisches Farbstoff Calcein erkannt. Abgestorbene Zellen werden durch Komplexbildung EthD-1 und Nukleinsäuren diskriminiert.

8. Bild-Rendering

Hinweis: Die Computer-Empfehlung von der Bild-Rendering-Software muss, berücksichtigt werden da dieses Programm die entsprechende Hardware benötigt.

  1. Laden Sie die LSM-Datei von mikroskopischen Lebensfähigkeit Färbung des PCLS (siehe Abschnitt 7) in der Bild-Rendering-Software erworben. Speichern Sie es als .ims Datei, bevor Sie fortfahren. Alle Parameter für die Gewebe-Steuerelement festgelegt und diese auf alle Bilder anwenden. Keine weiteren Änderungen sind zulässig.
  2. Verwenden Sie die Lautstärketaste für Flächenrückführung tragfähige Gewebe (Calcein Färbung) (ergänzende Abbildung 1A) und Schaltfläche "Spots" für tot Zellkerne (ergänzende Abbildung 1 H). Beim Rendern von einem Kanal schalten Sie den anderen Kanal im Anzeigefenster Anpassung.
  3. Starten, indem man das Volumen der lebenswichtigen Gewebe: Stellen Sie den Kanal der Oberfläche, das gesamte Bild, stellen Sie die reibungslose Faktor bis 0,5 µm, zu verarbeiten und nutzen absolute Intensität Schwelle (ergänzende Abbildung 1 b, C). Drücken Sie den blauen Vorwärtspfeil.
  4. Stellen Sie die absolute Intensität Schwelle des rekonstruierten Volumens; Lärm und Hintergrund Intensität sollte abgezogen werden. Oberfläche-Overlay wird grau dargestellt und die Genauigkeit der Flächendeckung sollte überprüft (ergänzende Abbildung 1). Drücken Sie nach Abschluss der Anpassungsprozess den blauen Vorwärtspfeil. In den meisten Fällen ist dieser Schritt für die Berechnung der Einstellungen erforderlich. Wenn die Software nicht in der Lage, das Volumen zu berechnen ist, erhöhen Sie die glatte Faktor.
  5. Wählen Sie im letzten Schritt einen Filter. Mithilfe des Sphärizität Filters (mit ca. 10 µm) für Surface Rendering Makrophagen im Bereich alveoläre (ergänzende Abbildung 1E) herausfiltern. Drücken Sie die grüne Schaltfläche Vorwärts.
  6. Optisch passen Sie das Ausgabebild und exportieren Sie Statistiken als XLS-Dateien. Das Gesamtvolumen (Summe) wird zur weiteren Analyse (ergänzende Abbildung 1F, G) verwendet werden. Speichern Sie Einstellungen und verwenden sie für alle weiteren Analysen von Z-Stacks am selben Tag mit der gleichen cLSM-Einstellungen (ergänzende Abbildung 1I) genommen.
  7. Den roten Kanal (Spots) für tot Zellkerne zu rekonstruieren. Nach dem Zufallsprinzip Messen Sie die Punktgröße in µm Skalierung im Fenster übertreffen; Punktgröße ist ca. 5 µm. Mark Enable und legen Sie die Punktgröße. Überprüfen Sie, ob alle Punkte markiert sind und jeder Punkt wird nur einmal gezählt. (Ergänzende Abbildung 1 b, H, J) ggf. manuell korrigieren. Drücken Sie den blauen Vorwärtspfeil.
  8. Drücken Sie die grüne Schaltfläche Weiter, das Programm berechnet die Gesamtzahl der Punkte nach den Parametern zählen lassen setzen und exportieren Sie das Ergebnis als XLS-Datei (Ergänzende Abbildung 1 K, L, M). Für grafische oder statistische Analyse des Bildes legen Sie die Anzahl der berechneten tot Zellkerne im Verhältnis zum Volumen des lebenswichtigen Gewebe.

9. Messung der Zytokine und Chemokine in menschlichen PCLS

Hinweis: Die Cytokine und Chemokin Immunantwort können extrazellulär im Kultur überstand und intrazellulär in Gewebe Lysates nach der Inkubationszeit gemessen werden. ELISA wird in Duplikate in einer 96-Well-Platte mit 100 µL/Well gemessen.

  1. Bereiten Sie eine 1 %-Waschmittel-Lösung durch Mischen von 5 mL Spülmittel mit 495 mL Pufferlösung. Die Lösung kann bei RT für mehrere Monate aufbewahrt werden.
  2. Mischen Sie die 1 %-Reinigungslösung mit Protease-Inhibitor (PI) in einem Verhältnis von 1: 500. Die benötigte Menge richtet sich nach der Kultur-Platte; z. B. 500 µL/Well für ein 24-Well-Platte. Für einen Brunnen mix 1 µL von PI mit 499 µL der Reinigungslösung.
  3. Bereiten Sie Rohre mit 1 µL PI Lösung vor und sammeln Sie 500 µL überstand in diese Rohre Kultur. Sofort ersetzen Sie das Medium in der 24-Well-Platte mit 500 µL Reinigungslösung mit PI, wie in Schritt 9.2 vorbereitet. Lösen Sie Gewebe für 1 h, indem man 24-Well-Platte in bei 4 ° c Das Gewebe in einen neuen Schlauch lysate pipettieren und speichern diese Rohre bei-80 ° C bis zur weiteren Analyse.
    Hinweis: Das ELISA Protokoll hoch hängt vom Hersteller und den Anweisungen des Herstellers beachtet werden. Ein Standardprotokoll ELISA wird im folgenden beschrieben.
  4. Führen Sie die ELISA Zytokin Ebenen im überstand oder lysate gemäß den Anweisungen des Herstellers zu messen. Zur Messung von IL-1α und TNF-α Mantel a96-Well-Platte von pipettieren 100 µL der Capture-Antikörper (für Verdünnung folgen Sie den Anweisungen des Herstellers) und über Nacht bei RT inkubieren
  5. Bereiten Sie waschen Puffer durch Auflösen einer Waschmaschine Puffer Tablets in 1 L Bidistilled Wasser. Entfernen Sie die Erfassung Antikörper und pipettieren 400 µL waschen Puffer in jede Vertiefung. Ersetzen Sie diesen Datenträger dreimal. Blockieren Sie die Platte, indem man die blockierende Lösung (z. B.1 % BSA in Pufferlösung, gemäß den Anweisungen des Herstellers). 1 h bei RT inkubieren.
    Hinweis: Standard im Handel erhältlichen ELISAs benötigen 2 x 100 µL des Gewebes überstand oder lysate. Proben sollten einmal aufgetaut und nur vor dem Gebrauch sein. Abhängig von der Empfindlichkeit des Tests und auf die freigesetzte Cytokine müssen Proben vor Messungen verdünnt werden. Daher verdünnen Sie die Probe in das Reagenz zur Verfügung gestellt durch die Probe.
  6. Die blockierende Lösung entfernen und Hinzufügen von verdünnten Proben für die Standardkurve (für Verdünnung folgen Sie den Anweisungen des Herstellers) und 100 µL des Gewebes überstand oder 100 µL des Gewebes lysate in Duplikate in Schritt 9.3 gesammelt. 2 h bei RT inkubieren
  7. Entfernen Sie die Proben und pipettieren 400 µL waschen Puffer in jede Vertiefung. Ersetzen Sie diesen Datenträger dreimal. Pipettieren 100 µL biotinylierte detektionsantikörper (für Verdünnung folgen Sie den Anweisungen des Herstellers) und 2 h bei RT inkubieren
  8. Entfernen Sie die Antikörper und pipettieren 400 µL waschen Puffer in jede Vertiefung. Ersetzen Sie diesen Datenträger dreimal. 100 µL/Well des HRP-Label Streptavidin (für Verdünnung folgen Sie den Anweisungen des Herstellers) hinzufügen und 20 min bei RT inkubieren (überprüfen Sie die Angaben des Herstellers).
  9. Entfernen Sie Streptavidin und pipettieren 400 µL waschen Puffer in jedes gut. Ersetzen Sie diesen Datenträger dreimal.
  10. Fügen Sie 100 µL des Substrates (vom Hersteller empfohlen) und 20 Minuten im Dunkeln inkubieren (überprüfen Sie die Angaben des Herstellers).
    Hinweis: Dieser Schritt ist lichtempfindlich. Vermeiden Sie die Belichtung des Substrats und Platte.
  11. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 50 µL Stopplösung (1 M H2SO4). Messen Sie die Absorption von jedem Bohrloch bei 450 nm (Referenz: 570 nm) mit einer Mikrotestplatte Reader. Subtrahieren Sie die Absorption bei 570 nm von 450 nm.
    Hinweis: Unbehandelt und/oder Fahrzeug-Gewebe-Kontrollen dienen als Negativkontrollen. Um eine Immunantwort im Lungengewebe zu induzieren, verwenden Sie geeignete Stimulation (z. B.100 ng/mL Lipopolysaccharid (LPS)) als Positivkontrolle. Zwei Brunnen mit zwei SPS pro Bohrloch mit 100 ng/mL LPS in Kulturmedium, z. B. inkubieren 24 h, und sammle die überstand und Gewebe lysate wie in Schritt 9.3 beschrieben.
    Hinweis: Die gemessenen Ergebnisse werden akzeptiert, wenn die Absorption auf höchstem Niveau gleich oder größer 1,0 ist; Ansonsten muss die Messung wiederholt werden. Die Standardkurve sollte die Dosis-Wirkungs-sigmoidale Kurvenanpassung folgen.
  12. Zytokin-Konzentrationen (Pg) im Schritt 9.11 von ELISA bestimmt sind normiert auf der gesamten Eiweißgehalt im Gewebe lysate jeder Probe bestimmt (siehe Kapitel 10).

10 Messung der Gesamtproteingehalt in menschlichen PCLS

Hinweis: Die PCLS musst lysiert werden, um die Gesamt-Protein-Konzentration zu messen. Die Gewebe-Lysaten aus Schritt 9.3 sind für diesen Schritt verwendet. Der Test erfolgt in ein flach 96-Well-Platte mit 25 µL/Well des Gewebes lysate, pipettieren in Duplikate.

  1. Bereiten Sie einen 7-Punkte-BSA-Standard mit BSA Konzentrationen von 2.000 µg/mL, 1.500 µg/mL, 1.000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL und 125 µg/mL. Gelten Sie 25 µL in Duplikate für jeden Standard und verwenden Sie 25 µL Pufferlösung als Leerzeichen auf einer 96-Well-Platte (verwenden Sie einen Teller mit einer Platte Abdeckung) zu.
  2. Pipettieren 25 µL der Lysaten (siehe Punkt 9.3) aus jedem Brunnen in Duplikate in einer 96-Well-Platte. Insgesamt ist gut 50 µL der einzelnen erforderlich. Bereiten Sie das Arbeiten Reagenz BCA-Lösung durch Verdünnung BCA Reagenz B 01:50 in BCA Reagenz A. Verwenden Sie für eine 96-Well-Platte 400 µL Reagenz B und 20.000 µL Reagenz A.
  3. Vorsichtig pipettieren 200 µL des Reagenz arbeiten in jede Vertiefung Luftblasen zu vermeiden. Legen Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler (150 u/min) für 30 s, um die richtige Mischung von Lysaten und arbeiten Reagenz zu gewährleisten, und eine Abdeckung der Platte auf die Platte legen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 30 Minuten im Dunkeln. Messen Sie die Absorption von jedem Bohrloch bei 540-590 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.
    Hinweis: Die Messergebnisse werden akzeptiert, wenn die Absorption der höchsten BSA standard gleich oder größer 0,8 ist; Ansonsten muss die Messung wiederholt werden. Die Standardkurve sollte die Dosis-Wirkungs-sigmoidale Kurvenanpassung folgen.
  4. Für die Analyse Berechnung der Standardkurve mit einer 4-Parameter-Marquardt-Gleichung nach Abzug des Rohlings. Berechnen Sie die proteinkonzentrationen unbekannter Proben anhand der Standardkurve passen.

Representative Results

Mit der vorliegenden Forschungsmethode wurden menschliche PCLS vorbereitet und fünf Konzentrationen der industriellen Substanzen chemisch induzierten immunmodulatorische Effekte in der menschlichen Lunge Material beurteilen ausgesetzt. Lungengewebe war unter Wasser Bedingungen ausgesetzt, wie permanente Kultur für 24 h Toxizität durch Messung von freigesetzten LDH, mitochondriale Aktivität und mikroskopische Lebensfähigkeit Färbung bewertet wurde. Darüber hinaus wurden Gesamtproteingehalt für Normalisierung und Pro-inflammatorische Zytokine gemessen. Wann immer möglich, wurden hemmende (IC) 75 Konzentrationswerte von nicht-linearen sigmoidale Kurvenanpassung berechnet. Die positive Referenzsubstanzen, Reinigungsmittel für Zytotoxizität und LPS für die angeborene Zytokin-Antwort, dienten zur Validierung des Fahrbetriebs. Die logarithmisch transformierten IC75 [µM] Werte (Log IC50) dienten als "reizend" Konzentrationen für nachfolgende Cytokine Freigabe Messungen.

Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen die Prozedur von Füllmaterial menschlichen Lunge und beispielhafte H & E Färbung des menschlichen PCLS. Hygienische Routineverfahren müssen befolgt werden, um negative Auswirkungen auf die Gesundheit zu vermeiden und sorgen für Sicherheit der Mitarbeiter, die Umgang mit dem Material der menschlichen Lunge. Die Technik erfordert Schulung und Praxis. Erfahrene Pathologen, die verschiedene Regionen (obere/untere Lappen und Subpleural versus zentraler) zu unterscheiden und erkrankten im Vergleich zu gesunde Bereichen werden zur Beurteilung des pathologischen Zustands der menschlichen Lunge Material benötigt. Die erzeugten menschlichen PCLS sollte verwendet werden, für die Vorbereitung der H & E-gefärbten Dünnschliffe, welches erneut von einem Pathologen ausgewertet werden kann. Dieses Verfahren hilft Benutzern, die Praxis in anspruchsvollen erkrankten Bereiche und Standorte innerhalb der Lungen zu gewinnen.

Abbildung 3 zeigt die Messergebnisse für LDH und WST-1 Aktivität im menschlichen PCLS nach 24 h Inkubation mit SLS. Die mittlere unbehandelte Kontrolle ohne SLS, gezeigt bei 0 µg/mL SLS, ist eine wichtige Qualitätskontrolle. Werte sollte unter 20 % für LDH mit Waschmittel lysiert Gewebe im Vergleich und > 0,7 Absorptionseinheiten für WST-1-Assay. Diese Qualitätskontrollen dienen auch als Indikatoren für die unzureichende Gewebe Lebensfähigkeit. Reaktionsfähigkeit des menschlichen Gewebes in Richtung der Waschlauge als effektive toxische Substanz, beizufügen als Positivkontrolle. Es sollte eine Steigerung von 300-500 % führen (> 2,0 Absorptionseinheiten) der LDH im Vergleich zu unbehandeltem Gewebe und in den Werten < 0,1 Absorptionseinheiten für WST-1-Assay. SLS führte zu einer Dosis-abhängigen Reduktion der Zellviabilität gemessen an ein Anstieg der LDH und eine Abnahme der metabolischen Aktivität der WST-1-Assay bei Konzentrationen > 87 µg/mL. Eine sigmoid Konzentration-Reaktions-Modell wurde auf die Daten ausgestattet, so dass es möglich ist, IC75 oder IC50-Werte zu berechnen. Diese Werte können anschließend zur Konzentrationen für Cytokine und Chemokin Ebenen auswählen: bei hochgiftigen Konzentrationen in der Regel keine oder nur verminderte Zytokine und Chemokine erkannt werden können. Daher sind nicht toxisch oder nur leicht toxische Konzentrationen (IC75) empfohlen. Es ist wichtig zu beachten, dass der erwartete Anstieg der LDH-Aktivität in der Zellkultur überstand oft durch die angewandte Substanz21beeinflusst wird. Häufig treten Interferenzen zwischen Substanz und Enzym-Aktivität führt zu Fehlinterpretationen der Ergebnisse, wenn die LDH-Assay die einzige Zytotoxizität Assay verwendet wurde. Daher ist es wichtig und notwendig, mehrere Zytotoxizität Assays um zuverlässige und gültige Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus sei darauf hingewiesen, dass Sensitivität von LDH und WST-1 Assays sehr vergleichbar ist.

In Abbildung 4zeigen mikroskopische Lebensfähigkeit Bilder des PCLS Reaktionsfähigkeit des menschlichen Gewebes zu Waschmittel als effektive toxische Substanz. Die Ergebnisse sind sehr nützlich, um andere Lebensfähigkeit Daten bestätigen, aber dies erfordert zusätzliche Ausrüstung. Toxische Wirkungen sind durch Auswertung von Calcein-positiven Gewebe im Vergleich zu EthD-1-positiven Zellkerne visuell beurteilt. Zufällig ausgewählte Segmente im Parenchym führen in der Regel Vergleichsdaten, Airways oder Blutgefäße sollte vermieden werden, da größere Hohlräume die Ergebnisse verschieben können. Von unserer Erfahrung und mit der oben beschriebenen mikroskopische Einstellungen wird ein durchschnittliches Volumen zwischen 1,5 x 106 und 5 x 106 µm3 des Gewebes Kontrolle gemessen. Die Werte sind abhängig von Lunge Materialqualität, PCLS Qualität, und auch die Krankheit der Lunge Gewebespender. Obwohl die Lebensfähigkeit des menschlichen Lungengewebe zwischen den Gebern variiert, sollte die Zahl der Toten Zellkerne tragfähige Gewebe gegenüber 15 % des Kontrollstreifens Gewebe nicht überschreiten. Wenn Tote Zellkerne überwiegend in das Gewebe-Steuerelement vorhanden sind, jedoch sollte das Experiment aufgegeben werden.

Abbildung 5 zeigt repräsentative Daten für die immunmodulatorische Wirkung von HClPt und SLS auf menschliche Lungengewebe. Die Pro-inflammatorische Zytokine IL-1α und TNF-α sind Biomarker der Entzündung, die den Beginn der entzündlichen Prozesse nach Exposition mit anregenden Substanzen. Beide Zytokine wurden von ELISA gemessen. Extrazelluläre IL-1α ist in der Regel gering im menschlichen PCLS während intrazelluläre IL-1α Höhen von 1.000 Pg/mL und mehr erreicht. Eine Abnahme der intrazellulären IL-1α zeigt laufende zytotoxische Prozesse - und vor allem nach der Exposition des menschlichen PCLS Chemikalien beobachtet. Wenn Gewebe mit LPS stimuliert wird, ein Aktivator des angeborenen Immunsystems und als solche die positive Behandlung zu steuern, dann die meisten induzierte IL-1α nur intrazellulär nach 24 h erkannt werden können. Im Gegensatz dazu kann TNF-α-Sekretion durch LPS Stimulation induzierte vor allem extrazellulär gemessen werden. Die Verwendung von geeigneten Positivkontrolle, wie LPS, zeigt die Gültigkeit einer Methode. Mit der vorliegenden Forschungsmethode waren menschlichen PCLS ausgesetzt drei Konzentrationen von HClPt (32, 64 und 125 µg/mL) oder zwei Konzentrationen von SLS (1 und 10 µg/mL) für 24 h Zytokin-Sekretion als Summe der extrazellulären und intrazellulären Zytokinen ermittelt wurde. auf insgesamt proteinkonzentrationen normiert, wie in Abbildung 5dargestellt. Es ist erwähnenswert, dass der BCA-Test dient in der Regel zur Bestimmung der Gesamtproteingehalt, reflektiert aber auch Stoff-induzierte Zytotoxizität. Daher kann bei sehr toxischen Konzentrationen der Gesamtproteingehalt für die Normalisierung der Zytokin-Daten verwendet werden. Sekretion von IL-1α stieg deutlich von 263 ± 38 Pg/mg bis 887 ± 216 Pg/mg und für TNF-α von 263 ± 38 Pg/mg bis 1.160 ± 286 Pg/mg (Abbildung 5A, B). Darüber hinaus präsentiert LPS-induzierte IL-1α und TNF-α-Sekretion im Vergleich eine unstimulierte gewebekontrolle. Induktion von Pro-inflammatorischen Zytokinen von Pathogen-assoziierte molekulare Muster, z. B. LPS, die Gültigkeit einer Methode und wird dringend empfohlen, bei der Arbeit mit menschlichen PCLS verwendet werden, um die immunmodulatorische Effekte zu untersuchen. Finden Sie für mehr Details über HClPt und SLS-Daten in der Studie von Lauenstein Et al. 21

Figure 1
Abbildung 1 : Verfahren zur menschlichen Lunge Füllmaterial. Die menschliche Lunge ist sofort nach der Resektion bereit. Die Lunge ist bei Raumtemperatur für konsequente Füllung mit Agarose und plötzliche Agarose Polymerisation während des Füllens zu vermeiden aufzubewahren. Die Lunge ist horizontal, mit den Lappen ausgebreitet für eine optimale Sicht auf die wichtigsten Bronchus oder Bronchien (A & B für Großansicht auf Bronchus) positioniert. Die Bronchien sind mit einem flexiblen Silikonschlauch kanülierte und mit Klemmen (C) fixiert. Nach der Füllung Verfahren und Agarose Polymerisation im Gewebe schneiden ausgebildete Pathologen die Lunge in Scheiben von etwa 3-5 cm Dicke (D). Aus diesen Scheiben sind zylindrische Gewebe Kerne (Ø z.B., 8 mm) mit einem erbohrte Werkzeug (E) bereit. Diese Gewebe-Kerne werden mit einem Gewebe-Hobel in PCLS, geschnitten und sofort ins Medium gefüllten Petrischalen zur Inkubation unter normalen Zelle Kulturbedingungen (E) übertragen werden. Nachdem mehrere Waschschritte die PCLS in Kultur Zellplatten (z.B. 24-Well-Platte mit zwei PCLS pro Brunnen und 500 µL Medium) überführt werden, um restliche zellenrückstand und veröffentlichten Zelle Mediatoren (F) zu entfernen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Ermittlung des Gesundheitszustands des menschlichen PCLS von H & E Färbung. Die PCLS in diesem Bild, zubereitet von einem Spender mit einem Lungentumor zeigt intakt Lungengewebe mit alveoläre Parenchym peripheren Atemwege (*) und Blutgefäße (Pfeilspitzen) in der Übersicht (A). Bei höherer Vergrößerung Durchführung von Airways mit intakten respiratorische Flimmerepithel (Pfeilspitzen) (B), eine intakte alveoläre Struktur gesäumt von lebensfähigen Pneumozyten, einschließlich einer Kapillare mit zahlreichen Erythrozyten (Pfeilspitzen) (C), alveoläre Räume, in denen alveoläre Makrophagen (CD68 Immunohistochemistry) (D), sowie Blutgefäße mit intakten Endothel (CD31 Immunohistochemistry) (E) beobachtet werden. Nur frei von Tumor Gewebe wurde für die PCLS verwendet, weshalb keine makroskopisch erkrankten Bereiche sichtbar sind. Im Gegensatz zu PCLS vorbereitet von Spendern mit anderen Lungenerkrankungen, wie Emphysem oder Fibrose, die alveoläre Struktur wird nicht gestört und die PCLS ist nur leicht an der äußeren Grenze, wahrscheinlich wegen Vorbereitungsschritte ausgefranst. Maßstabsleisten geben 1.000 µm (A) und 50 µm (BE), beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Bestimmung der Zytotoxizität induziert durch SLS in menschlichen PCLS gemessen durch Leckage des Enzyms LDH in Kulturmedium (A) und Verlust der metabolischen Enzymaktivität bewertet mit dem Farbstoff WST-1 (B). Steigenden Konzentrationen von SLS waren menschliche PCLS ausgesetzt. Eine sigmoid Konzentration-Reaktions-Modell wurde später auf die Daten ausgestattet, so dass IC75 oder IC50-Werte (hemmende Konzentration auf 25 % und 50 % Reduzierung der Zellviabilität) berechnete (richtige Zahlen) sein können. Daten werden als ± SEM bedeuten präsentiert, n = 3-5. Absorption von LDH-Assay wurde gemessen bei 492 nm (Referenz bei 630 nm) und der WST-1-Assay bei 450 nm (Referenz bei 630 nm). Daten wurden angepasst und geändert von Lauenstein Et al. 21 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Repräsentative Bilder der dreidimensionalen mikroskopische Färbung und Bild Rendern des menschlichen PCLS. Lebender gewebekontrolle und Reaktionsfähigkeit des Gewebes, Waschmittel, als eine effektive toxische Substanz, werden nach der Färbung des menschlichen PCLS mit Calcein AM (gelb) und EthD-1 (rot) angezeigt. Stapel von 30 µm wurden mit einem 10 X-Objektiv (A) und (B) dargestellt. Der Maßstab zeigt 100 µm. Erregung Wellenlängen 488 nm und 543 nm, Emission Filter BP 505-550 nm und LP 560 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Ammonium Hexachloroplatinate (HClPt)-induzierte IL-1α und TNF-α-Sekretion in menschlichen PCLS nach 24 h Exposition. PCLS waren drei Konzentrationen (32 µg/mL, 64 µg/mL und 125 µg/mL HClPt) und zwei verschiedenen Konzentrationen (1 µg/mL und 10 µg/mL) des SLS ausgesetzt. Extrazellulären und intrazellulären IL-1α (A) und TNF-α (B) wurden von ELISA bestimmt und auf der Gesamtproteingehalt normalisiert. Um zu zeigen, die Gültigkeit der Methode wird eine positive Aktivator des angeborenen Immunsystems, LPS, intrazelluläre IL-1α (A) und extrazellulären TNF-α (B) Freilassung, normiert auf Gesamtproteingehalt als Referenz angezeigt. Daten werden als ± SEM bedeuten präsentiert *p < 0,05 und ***p < 0,001; HClPt und SLS: n = 9, IL-1αLPS: n = 5, TNF-α-LPS: n = 4 Zoll technische Duplikate (Mann-Whitney-Test). Diese Zahl wurde von Lauenstein Et Al. modifiziert 21 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Supplementary Figure 1
Ergänzende Abbildung1: detaillierte computergestützten Verarbeitung für Bilder von mikroskopischen Lebensfähigkeit Färbung mit Rendering-Software. Schritt für Schritt operative Verfahren zur Bildanalyse von LSM Bilder für Oberfläche Rendering von Calcein-gefärbten tragfähige Gewebe (AG, I) und Spoterkennung von Interkalation Homodimer-gefärbten Zellkernen (H, JM). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Supplementary Figure 2
Ergänzende Abbildung2: Übersicht über computergestützte Bildanalyse von mikroskopischen Lebensfähigkeit Färbung des menschlichen Lungengewebe. Tragfähige Gewebe (gelb) wurde durch Surface Rendering (Bich) analysiert und tot Zellkerne (rot) wurden von Spoterkennung (JP) erkannt. Die Snapshot-Modus wurde verwendet, um das Bild (Q) exportieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

In unserem Labor ist die menschliche PCLS Technik etabliert. Der vorliegende Beitrag beschreibt diese Technik und deren Verwendung zu Testzwecken Toxizität von Substanzen in Lunge Gewebe ex Vivo. In der Regel im Zusammenhang mit jedem Labor verwenden, die diese Technik ein Test einrichten soll, Definition der messbaren reicht, Schätzung der Variabilitäten und Qualitätskontrollen garantieren Gültigkeit des Experiments. Mögliche Standardverfahren könnte beispielsweise jedes Endgerät, z.B.Zytotoxizität Assay, in einem Minimum von drei biologische Spender (einzelne Läufe) mit einem Minimum von zwei bis drei technische Wiederholungen pro Probe einschließlich positiv zu wiederholen und negativen Äußerungen. Laborpersonal sollte trainiert werden, Assay Konsistenz zu erhöhen und minimieren Assay Variabilität.

Endpunkte, die häufig verwendet, um die immunmodulatorische Substanzen am Lungengewebe Bewertung gehören Zytotoxizität Messungen mit verschiedenen Tests (z.B., LDH-Assay, WST-1-Assay, mikroskopische Färbung Assay), Cytokine Release assays, sowie so Änderungen im Expressionsprofil und Charakterisierung von Änderungen in der zellularen Bevölkerung durch Immunohistopathological Methoden6. Darüber hinaus gibt es Techniken beschreiben, die Visualisierung von Zellen, wie z. B. pulmonale Dendritische Zellen in murinen PCLS28 , die auch auf menschliche PCLS übertragen werden können und könnte somit detailliertere Einblick in die zelluläre Zusammensetzung vor und nach der Behandlung mit vermeintlichen Zytotoxische Substanzen.

Dieser grundlegende Protokoll und Technik für die Vorbereitung der menschlichen Lunge Gewebeschnitte ist vergleichbar mit Techniken, die in Publikationen29gut beschrieben haben. Kurz gesagt, ist das Organ Material von Patienten mit chronischen Krankheiten Leben bedrohen, wie Lungenkrebs, gewonnen, die Operation für Resektion oder Transplantation unterziehen müssen. Die Studien bedürfen der Zustimmung der lokalen Ethikkommission. Patienten fundierte schriftliche Zustimmung ist erforderlich. Einrichten eines Workflows zwischen Klinik und Labor ist ein kritisches Thema und erfordert Kommunikation und Definition der Schnittstellen und Infrastruktur zwischen beiden Standorten. Menschlichen Lunge Material muss direkt nach der Resektion, Lebensfähigkeit des Gewebes zu bewahren verarbeitet werden. Es ist erwähnenswert, dass die hier beschriebene für menschliche PCLS Technik für jung und alt Lunge und zu gesunden und erkrankten Lunge angewendet werden kann. In den USA ist es beispielsweise möglich, Lunge aus gesunder Organspender starb bei Unfällen oder deren Organe für die Transplantation abgelehnt wurden.

Der erste wichtige Schritt in das Protokoll ist die Inflation der Atemwege und der umgebenden Parenchym mit Agarose-Lösung. Dieser Schritt ist notwendig, das sehr weiche Gewebe für das weitere Vorgehen slicing zu festigen. Die Qualität der menschlichen Lunge Material, basierend auf dem Hintergrund der Krankheit, ist hier entscheidend. Nur Lappen mit intakten Pleura können gefüllt werden. Endstadium Tumoren in der Nähe der Bronchus verhindern manchmal der Füllvorgang. Bevor das Menschenmaterial aufgeblasen, hat die Temperatur der Agarose-Lösung gründlich geprüft werden. Zu viel Blut (oder anderen Flüssigkeiten, Exsudate) in den menschlichen Lungengewebe führt zu unerwünschten Verdünnung der Agarose und beeinflussen den Polymerisationsprozess. Lungen werden nach Inflation des Lungengewebes und Gelierung der Agarose auf Eis in Abschnitte von 200 bis 300 µm Dicke geschnitten. Konsistenz des Gewebes ist ein sehr kritisches Thema. Wenn das Gewebe zu weich ist, ist es schwierig, gleiche Teile schneiden. Auch wenn die gleichen Mikrotom Parameter für jeden Spender, der Dicke der Scheiben zwischen den Gebern variieren kann, aufgrund individueller Bedingungen und Veränderungen während das Aufblasen für jede Lunge verarbeiten. Anderes Segment dicken führt inhomogene Füllung des Gewebes. Messung der Gesamtproteingehalt ist anstelle von Mess- und Standardisierung der Dicke der Scheiben, lässt sich indirekt Lunge Stück dicken überwachen. Mehrere zum terminalen Krankheiten beeinträchtigen die sliceprozess; z.B.kann Blut, die Schiffe extrem Lungenhochdruck und fibrotische Gewebe verdickt sind so steif, dass Schneiden von Gewebe-Zylindern kaum möglich ist und die Mikrotom Klinge sehr oft ausgetauscht werden muss.

Nach Vorbereitung des menschlichen PCLS und Intensive Waschschritte, die notwendig sind, um die Zelle Ablagerungen zu entfernen und freigegeben Enzyme, Gewebe, die Abschnitte für Experimente29verwendet werden können. Menschlichen PCLS sind unter normalen Zelle Kulturbedingungen kultiviert und ausgesetzt, zum Beispiel Chemikalien, Drogen oder Lipopolysacchariden. Gelegentliche Verseuchung der PCLS durch (unbekannte) Infektionen ist eine Sonderausgabe in der Kultur der menschlichen Lunge Material. Gewebekulturen zeigt Infektionen verworfen werden muss und das Gerät gründlich desinfiziert werden muss. Räumliche Trennung zwischen Labor stellen, verwendet für die Zubereitung auf der einen Seite und Kultivierung kann auf der anderen Seite helfen, um Kreuz-Infektionen zu vermeiden. Im Hinblick auf die Ausrüstung Mikrotom kann auslaufen, und lose Sechskantschrauben zu Motorschäden und Stopp der messerbewegung führen können. Nicht jedes Teil des Slicers ist aus rostfreiem Stahl gefertigt, und so wird es oxidieren nicht getrocknet Reinigung sofort zu ändern. Um Ausrüstung Probleme zu überwinden, kann es notwendig, mindestens ein backup-Gerät zu haben sein.

In früheren Publikationen wurde Agarose berichtet, ausgewaschen werden und während der intensiven Waschschritten nach Vorbereitung entfernt. In der Tat ist dies nicht möglich, die Agarose kann nicht entfernt werden. Für eine vollständige Entfernung von der Agarose muss es wieder geschmolzen werden bei hohen Temperaturen, die das Gewebe zerstören würde. Die Agarose in Alveolen und Airways stört nicht die beschriebenen Endpunkte. Andere Endpunkte durch die Anwesenheit von Agarose beeinflusst werden könnte (siehe auch Einschränkungen). Sehr frische Gewebeschnitte vorbereiten muss betont werden, da Gewebe Lebensfähigkeit ein kritisches Thema in Kultur ist. Bronchokonstriktion ist kein gültiger Parameter für Rentabilität. Wir empfehlen die Verwendung von mindestens zwei oder drei unabhängige Zytotoxizität Assays Lebensfähigkeit der umgebenden Parenchym zu überprüfen; Dies muss in jedem Experiment30überprüft werden. Qualitätskontrollen in Zytotoxizität Tests dienen als Indikatoren für die unzureichende Gewebe Lebensfähigkeit. Daher empfiehlt es sich, die Reaktionsfähigkeit des Gewebes, z. B. um eine effektive giftige Substanz wie ein Waschmittel in allen Zytotoxizität Tests zu beurteilen. Basierend auf Dosis-Wirkungs-Kurven, minimalen und maximalen Werte der Absorption für Zytotoxizität Assays definiert werden müssen und für spätere Experimente erfüllt. Weitere Änderungen des Protokolls hängen meist Angewandte Chemie und die Endpunkte von Interesse. Die Anwendbarkeit des unlöslichen oder hochreaktive Chemikalien ist begrenzt. Der höchste Lösemittelkonzentration für DMSO ist auf 1 % begrenzt. Höhere Konzentrationen können verwendet werden, aber unter Umständen ausgeprägten Freisetzung von Pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL-8. Auf der anderen Seite könnte der Stimulus verwendet relativ schwach sein. In diesem Fall kann die Menge des Gewebes von zwei bis vier Scheiben pro Bohrloch erhöht werden. Diese Vorgehensweise schränkt die Lebensfähigkeit bis 24 h.

Eine große Einschränkung der menschlichen PCLS ist, dass in Deutschland nur von Kranken menschlichen Lunge Material vorbereitet werden können. Patienten, die operiert werden sind normalerweise älter als 50 Jahre und 80 % der Patienten mit Lungenkrebs sind oder zum Raucher zu werden. Medikation von Patienten, wie z. B. Glukokortikoide, kann auch Einfluss auf das Ergebnis der Experimente mit menschlichen Gewebes. Daher ist es wichtig,: i) überprüfen Sie jedes Experiment durch positive Referenzen überprüfen, Wirtschaftlichkeit, Funktionalität und Sensibilität der einzelnen Gewebe und Ii) Kreuz-Validierung der Ergebnisse mit gesunden, nicht-erkrankten, mittleren Alters Lungengewebe aus Versuchstieren (nichtmenschlichen Primaten wie Cynomolgus und, wenn möglich, Maus, Ratte, Meerschweinchen). Umso besser ist die Bewertung der Pathologie des erkrankten Gewebes, desto besser die experimentellen Ergebnisse. Stark erkranktes Gewebe kaum genutzt werden kann und sehr oft Shows begrenzt Lebensfähigkeit, unzureichend niedrigen oder extrem hohen Zytokin Ebenen, bakterielle oder Pilzinfektionen und weniger Bronchokonstriktion. Geber, Spender Variation ist höher im Vergleich mit Ergebnissen von Versuchstieren, die individuelle Variabilität des Menschen widerspiegelt. Dies ist jedoch keine Einschränkung im allgemeinen; wie in anderen Ländern (z.B.den USA) erwähnt, ist es möglich, gesunde lungen von verstorbenen Organspendern abgelehnt für die Transplantation zu erhalten. Reaktionsfähigkeit des Gewebes ist gut für die erste bis zu 48 h in akuter Exposition Experimente beschrieben worden. Wirtschaftlichkeit und Funktionalität des Gewebes sinkt nach vielen Tagen der Kultur oder nach Lagerung bei-80 ° C. Es ist möglich, Kultur menschlichen Lungengewebe für bis zu ca. 14 Tage. Lebensfähigkeit bleibt während dieser Zeit; Allerdings ist eine Erhöhung der Variabilität sowie einen Verlust von Funktionalität mehrere Zellpopulationen, z. B. Makrophagen im Gewebe beobachtet, was begrenzt Zytokin Auflösung als Reaktion auf Mitogene. Eine weitere Einschränkung für einige Endpunkte ist das Vorhandensein von Agarose im Gewebe, behindern, beispielsweise die Isolierung von hoher Qualität und ausreichende Mengen an RNA31 oder die Vorbereitung von einzelligen Suspensionen für nachfolgende Durchflusszytometrie und Phänotypisierung von Zellen. Somit beschränkt sich die Möglichkeit, mechanistische Einblicke in Einzel-Zell-Reaktionen und Funktionalität.

Organotypischen Gewebemodelle, wie menschliche PCLS gelten als einen hohen Einfluss auf Grundlagen- und nichtklinische Forschung haben. Menschlichen Lunge Material hat eine biologische Zusammensetzung eng die normalen Orgel Architektur widerspiegelt. Es enthält zum Beispiel Wohn-alveoläre und bronchialen Epithelzellen, glatten Muskelzellen, Fibroblasten, Endothelzellen, Nervenfasern und Makrophagen. Das Gewebe ist lebensfähig und Zellen reagieren auf verschiedene Reize. Nerv Fasern, obwohl geschnitten, kann lokal aktiviert werden, was zu terminal reflex Antworten14. Dieses ex-Vivo -Modell bietet daher die Möglichkeit zellulären angeborenen Immunantwort, Verteidigung Antworten, Cytokine signaling und Induktion von Zelle oberflächenmarker zu studieren. Diverse Verbesserungen in Technik, Kultivierung und Validierung der Endpunkte erlauben die Verwendung von menschlichen PCLS in translational Wissenschaft. Beispiele für zukünftige Ansätze sind: (i) Validierung von neu richtet sich an im menschlichen Lungengewebe, (Ii) Bewertung von Immunreaktionen nach Exposition, beispielsweise Chemikalien, Drogen, Nanopartikel, etc., Iii) Ergänzung des Lungengewebes mit Immunzellen, so als T-Lymphozyten, iv) Identifikation und Modifikation von molekularen Mustern, zum Beispiel nach Exposition gegenüber Atemwege Sensibilisatoren, Krankheit auslösende Substanzen oder Wirkstoffe hemmen Wege; Darüber hinaus V) Atemwege Umbau und vi) neuronale Verordnung32. Der Wissenschaft interessiert sich für diese gegenwärtige und zukünftige Ansätze mit PCLS. Darüber hinaus gibt es eine Vielzahl von verschiedenen Entwicklungen, die dazu beitragen wird, die PCLS Technik wie Kryokonservierung20und33 imitieren die natürliche Bewegung des Gewebes während der Atmung oder mechanische Dehnung Gewebe zu verbessern Be-und Entlüftung.

Der große Vorteil des menschlichen PCLS im Vergleich zu anderen 3D Modellen ist das Vorhandensein von Immunzellen und Nervenfasern. Experimente können auch durchgeführt werden, bei Maus, Ratte und nichtmenschlichen Primaten, die die Tierarten sind, die in der Pharmakologie und Toxikologie nach wie vor am häufigsten verwendet werden. Die Komplexität der menschlichen Lungengewebe unterstützt die Übersetzung der Ergebnisse von Tier zu Mensch und von in Vitro , in Vivo. Im Rahmen der bestehenden alternativen Assays für die Identifizierung der Atemwege Sensibilisatoren menschliche PCLS sind sehr komplex und erlauben keine Einblicke in einzelne Zelle Antworten. Doch vielleicht Mikroskopie und Flow Cytometry geben Auskunft über zelluläre Reaktionen, wenn der Rechts zelluläre Marker in Kombination, beispielsweise mit Apoptose, Nekrose oder intrazellulären Marker verwendet wird. Es gibt veröffentlichte Tests validiert und berichtet, dass für die Identifizierung der Atemwege Sensibilisatoren verwendet wurden. Allerdings sind die Fortschritte bei der Verwendung von PCLS mit all ihren Vorteilen über einzellige Assays leisten einen wichtigen Beitrag in dem Sinne, dass die Technik für Hochdurchsatz-Screening verwendet werden kann wie durch Watson Et Al. beschrieben 34 sie entwickelt einen Hochdurchsatz-Screening Assay um Atemwege Toxizität in murinen Cryo erhalten PCLS vorherzusagen. Mit ihrer miniaturisierten 96-Well PCLS Format erkannt sie ähnliche anzeigen in murinen Lavage-Flüssigkeit, wodurch PCLS einen machbaren Hochdurchsatz-Assay.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben. Fraunhofer ITEM ist eine unabhängige öffentliche Non-Profit-Organisation für angewandte Forschung, Durchführung von Auftragsforschung im Namen der Biotech, Pharma, Chemie und Kosmetik-Industrie. Finanzierung des Instituts kommt aus nationalen und internationalen öffentlichen Projekten.

Acknowledgments

Wir möchten ihre Vorarbeiten bezüglich alternativer Prüfstrategien für die Risikobewertung mit menschlichen PCLS Lan Lauenstein verdanken. Einige der Forschung wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der Europäischen Kommission im Rahmen der 6th Rahmenprogramm SENS-IT-IV "Neuartige Testing Strategien für In-vitro- Prüfung der Allergene".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm A. Hartenstein (Leipzig, Germany) SS04
Syringe Faust Lab Science (Klettgau, Germany) 9.410 050
Coring tools custom-made custom-made
Trimming Blade Handle (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205530001
Trimming Blades (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205500000
Microtome: Tissue Slicer Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) 303400-ADPT Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)
Microtome blade Wilkinson Sword (Solingen, Germany) ENR-4027800011506
Tissue culture dishes Sigma (München, Germany) Z666246-420EA
Cell strainer filter (100 µm Nylon) Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) BD352360
Inoculation loop Copan Diagnostics (Murrieta, USA)  CD176S01
TPP Tissue culture plates 24wells Sigma (München, Germany) Z707791-126EA
Cassette Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 1000957
Nunc MaxiSorp flat-bottom Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) 44-2404-21
Nunc MicroWell 96-Well  Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 260836
Confocal Microscope Zeiss (Jena, Germany) Confocal LSM Meta 510
Image rendering software Bitplane AG (Zürich, Switzerland) IMARIS 7.6
LSM Image Browser Zeiss (Jena, Germany)
Multiwell-Reader Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) Tecan infinite F200Pro Plate Reader
Plate shaker Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) KM-2 Akku
BenchMark ULTRA Ventana Medical Systems (Tucson, USA) Automated IHC/ISH slide staining system
Assays
Cell Proliferation Reagent WST-1 Roche (Basel, Switzerland) 11644807001
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche (Basel, Switzerland) 11644793001
Microscopical vitality staining  Invitrogen (Carlsbad, USA) L-3224 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit
BCA Protein Assay Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 23225
ELISA assay kit R & D systems various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) DuoSet
Reagents
Agarose, low gelling temperature  Sigma (München, Germany) A9414-100G
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) Sigma (München, Germany) E2888-500ML
Penicillin and streptomycin Lonza (Verviers, Belgium) 17-602E
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) Gibco (Darmstadt, Germany) 11039-047 Culture medium
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) Lonza (Verviers, Belgium) BE17-513F   Buffer solution
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma (München, Germany) A9647-500G
Detergent Sigma (Saint Louis, USA) X100-100ML Triton X-100
Washing buffer Merck (Darmstadt Germany) 524653  0.05% Tween 20 in PBS

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References

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Bewertung der zytotoxischen und immunmodulatorische Wirkung von Substanzen im menschlichen Precision-Cut Lung Slices
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Neuhaus, V., Danov, O., Konzok, S., Obernolte, H., Dehmel, S., Braubach, P., Jonigk, D., Fieguth, H. G., Zardo, P., Warnecke, G., Martin, C., Braun, A., Sewald, K. Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (135), e57042, doi:10.3791/57042 (2018).More

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