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Immunology and Infection

세포 독성의 평가 인간의 정밀 컷 폐 분할 영역에서 물질의 Immunomodulatory 효과

doi: 10.3791/57042 Published: May 9, 2018
* These authors contributed equally

Summary

3Rs 원리에 비추어 호흡기 모델 동물 연구 대안으로 진화 됩니다. 특히 호흡 물질의 위험 평가 대 한 적절 한 분석의 부족이 이다. 여기, 우리는 공 수 물질의 평가 대 한 인간의 정밀 컷 폐 슬라이스를 사용 하 여를 설명합니다.

Abstract

그들의 광범위 한 다양성에 호흡기 질병 근본적인 메커니즘을 이해 하 고 새로운 치료제의 개발에 대 한 적절 한 모델 시스템 필요. 또한, 새로운 물질의 등록 다치게 되 고, 예를 들어 작업 환경에서 개인의 위험을 피하기 위해 적절 한 테스트 시스템과 적절 한 위험 평가 해야 합니다. 이러한 위험 평가 동물 연구에서 보통 지휘 된다. 3Rs 원리 및 동물 실험에 대 한 공공 회의론에 비추어 인간 대체 메서드를 정밀 컷 폐 조각 (웹), 진화 되었습니다. 현재 종이 암모늄 hexachloroplatinate (HClPt) 등의 저 분자 무게 물질의 immunomodulatory 잠재력 연구를 인간의 웹의 비보 전 기술을 설명 합니다. 측정 된 끝점 생존 등 지역의 호흡기 염증, cytokines 그리고 발산의 변경된 분 비에 의해 표시. 프로 염증 성 cytokines, 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α), 그리고 인터 루 킨 1 알파 (IL 1α) HClPt의 하위 독성 농도에 노출 된 후 인간의 웹에서 크게 증가 했다. 웹 기술은 지난 수 십년 동안 실질적으로 최적화 된, 비록 immunomodulation의 테스트에 대 한 그것의 적용은 아직도 개발. 따라서, 여기에 제시 된 결과 예비, 그들은 호흡 연구에 귀중 한 도구로 인간의 웹의 잠재력을 보여 비록.

Introduction

알레르기 성 천식, 직업 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 기종, 위와 더 낮은 기도의 감염 등 호흡기 질병 증가 하 고 전세계 건강 부담1,2를 나타냅니다. 적합 한 테스트 시스템은 적절 한 물질의 개발 뿐만 아니라이 질병을 기본 기본 메커니즘의 일부를 식별 하는 데 필요한. 임상 약물 개발 뿐만 아니라 기본 연구는 생체 외에서 또는 vivo에서 분석 실험에서 얻은 결과에 집중 된다. 그러나이 분석 실험은, 그들의 한계3있다. 첫째, 분석 실험 체 외에 활용 인간의 세포는 고립 되었고 인접 한 조직이 나 장기에서 제거 되며 따라서 더 이상와 상호 작용 하거나 다른 세포3에 의해 보호 될 수 있습니다. 둘째, 동물 모델은 종종 생리 및 생 화 확 적인 차이점4차이로 인해 인 간에 게 번역. 이러한 한계를 최소화는 3Rs의 맥락에서 (, 세련미, 감소) 원칙5, 새로운 대체 모델은 끊임없이 발전 하는.

대체 인간의 3 차원 조직 모델, 웹, 생체 외에서 인간 기반 및 복잡 한 동물 vivo에서 모델 간의 링크는. 웹은 호흡기6에 모든 관련 셀 종류와 기능이 반영합니다. 또한, 웹 기술은 단일 동물 또는 인간 조직 기증자 로부터 정확한 두께의 여러 얇은 조각의 재현할 준비의 이점이 있다. 이 내부 제어 뿐만 아니라 다른 농도 또는 테스트할 마약.

피셔 그 외 여러분 에 의해 1994 년에 인간의 폐 한 가득 조각의 첫 번째 도입 이후 7 조각화 및 폐 조직 배양 기술을 크게 향상 되었습니다. 기독교 마틴 외. 이 기술은 더 화학과 약리학 응용 프로그램8을 개선 했습니다. 우리의 그룹이이 기술은 기독교 마틴에 의해 2007 년에 도입 되었다. 그 이후, 연구에서 웹의 응용 프로그램 기능에 대 한 응답, 기도9,10 , vasoconstriction11, 같은 면역학, 약리학12,13, 테스트에서 확장 했다 그리고 독물학7 여러 실험실에서 다양 한 종에서 테스트. 예를 들어, Schlepütz 외. 14 종의 차이 대 한 기도 응답을 조사 하 고 비교 주변 신경 활성화 전기 필드 자극 (EFS) 또는 capsaicin 쥐, 쥐, 기니 돼지, 양, marmosets, 및 인간. 그들은 신경 중재 기관지의 고유 하지만 다른 패턴을가지고 다양 한 종족을 발견 하 고 일반적으로 사용 되는 실험실 동물 (쥐, 쥐)는 항상 인간의 응답을 반영 하지 않습니다 결론을 내렸다. 폐 독성 테스트와 이러한 맥락에서 헤스 동물의 수를 줄이기 위해 15 미리 흡입 독성 연구를 위한 비보 전 대신 쥐 웹 확인. 이 multicentric 사전 검증 연구 결과 유망한 결과 함께 웹을 사용 하 여 두 개의 예측 모델의 개발.

또한, 기초 연구에 웹 칼슘 신호16, 초기 알레르기 성 응답17및 바이러스 감염 응답18,19명료 하 사용 되었습니다. 기술 진보는 지속적인 고 더 진보 탐구 되 고 있다. 예를 들어 필드 저장 및 냉동된 조직의 재사용에 의해 인간의 조직 혜택을 증가 하고있다. 로즈 그 외 여러분 설명 중지 및 재개 능력 기도의 자극에 따라 계약을 유지 하는 murine 웹의 기술: 따라서, 기술은 연장 가능한, 그리고 그래서 더 조직 유지 하는 제한 된 시간 창 분석 실험은 동일한 기증자20시간이 지남에 따라 적용할 수 있습니다. 이러한 연구 발전, Lauenstein 그 외 여러분 뿐만 아니라 21 은 최근 인간의 웹 직업 천식에 대 한 잠재적인 sensitizers 역할을 수 있는 다양 한 화학 물질의 위험 평가 조사.

그 증상은 공기 흐름 방해와 기도 hyperresponsiveness, 유사한 알레르기 성 천식, 직업 천식, 높은-분자-무게 (HMW)22 또는 저 분자 무게 (LMW) 물질23 에 노출에 의해 유도 된다 (예: , 백 금 화합물) 직장 환경에서. LMW 에이전트 haptens 형성 때 잠재적인 높은 민감성을가지고 고 캐리어 단백질21에 바인딩합니다. 새로운 HMW 또는 LMW 화학 물질의 등록 잠재적인 putative 그들의 민감성에 관한 생체 외에서 그리고 vivo에서 위험 평가가 필요한 (., OECD 가이드라인 429)24. 그러나 잠재적인, 상 상속 민감성을 결정 하는 데 사용 하는 테스트, 원래 설계 되지 않은 호흡기 sensitizers, 위험 평가 하지만 연락처 sensitizers, 물질25의 작은 하위 집합에 대 한 몇 가지 적합성 있을 듯 하지만 . Lauenstein 그 외 여러분 에 의해 작업 putative 접촉 또는 폐 sensitizers21의 위험 평가 대 한 대체 테스트 전략을 개발 하기 위해 센스-그것-4 유럽 연합 프로젝트의 일환으로 설계 되었다. 이 프로젝트를 위해 우리는 대체 테스트 도구로 인간의 웹의 유용성을 테스트에 집중 했다. 따라서, immunomodulatory 끝점 (예를 들어, 생존 및 cytokine 분 비)의 집합 LMW 백 금 화합물 등의 화학 물질의 자극 또는 염증 성 잠재력을 결정 하기 위해 선정 됐다. Lauenstein 외. 모든 호흡기 sensitizers;에 적용할 수 있는 일반적인 패턴을 발견 그러나, 그들의 작품26최근에 출판 된 프로토콜 대 한 기초를 제공합니다.

요약 하면, 준비와 인간의 웹의 후속 노출에 대 한 여기에 제시 된 프로토콜 메서드를 제공 합니다 도움이 잠재적으로 폐 독성의 평가 및 호흡기의 개발에 참여 있을 immunomodulatory 물질 질병, 직업 천식 등입니다.

Protocol

인간의 웹 실험 세계 의학 협회의 윤리 규범에 따라 수행 되어야 하며 (여기에 표시 된 모범적인 웹 실험은 하노버의 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 지역 윤리 위원회에 의해 승인 과 대학; 수 2701-2015 년)입니다. 인간의 폐 자료의 사용에 서 면된 동의 모든 기증자 환자 또는 그들의 친척에서 필요 합니다. 이 원고에 설명 된 결과 폐암으로 고통 받아 환자에서 받은 조직의 대부분 이었지만 다른 연령대, 성별, 병력, 그리고 절제의 원인의 기증자 로부터 조직 조각으로 획득 했다. 만 조직 종양-무료 실험을 위해 사용 되었다.

1. 일반 인간 웹 및 화학 물질에 연속적인 노출의 준비

참고: 두 사람 폐를 채우기 위해 필요 합니다. 간염 A와 B에 대 한 최신 예방 접종 기록 것이 좋습니다. 환자는 폐 이식 전에 HCV 및 HIV에 대 한 정기적으로 상영 된다. 활성 결핵균 감염 진단 또는 의심 하는 경우 폐를 거부 한다. 그럼에도 불구 하 고, 모든 신선한 인간의 폐 조직 및 샘플에서 파생 된 치료를 해야 합니다 (입자 필터 마스크 (FFP2), 보호 안경, 장갑)의 산업 안전 보장 하기 위해 잠재적으로 전염 하 고는 해당 보호조치는가지고 야 한다로 직원입니다. 절차는 60-90 분 걸립니다.

  1. 인간의 폐 엽의 intactness를 확인 합니다.
    참고: 늑 막에 눈물 조직의 균질 작성을 방지합니다. 인간의 폐 재료 절제의 하루에서 수 있어야 합니다. 실내 온도 (RT) agarose 얼음에 함께 작성 이전에 약 2 h의 저장 기간 용납 됩니다. 우리가이 프로토콜에서 사용 하는 조직 절제술을 받은 환자에서 얻은 것입니다. 그것은 고 인된 환자 에서입니다. 조직 얼음에 저장 되어, 그것을 작성 하기 전에 rt 미리 따뜻한 하 고 그렇지 않으면는 agarose 즉시, 유해는 아무 균질 작성 가능 합니다.
    주의: 네이티브 인간의 물질 접촉 모든 사람은 실험실 외 투, 장갑, 모자, 얼굴 마스크의 2 개 쌍 및 안전 안경의 한 쌍의 구성 된 보호복에 넣어 확인 하십시오. 인간의 물질은 잠재적으로 전염 성.
  2. 낮은 고 agarose의 7.5 g 무게 고 이중 증 류 물 250 mL를 추가 합니다. agarose 해산 될 때까지 전자 레인지에 agarose를 끓인 다. 약 40 ° c는 agarose의 용융과 고 포인트에 따라 멋진.
    참고: 여러 플라스 크는 엽 크기에 따라 필요한.
  3. 미리 따뜻하게 하 고 37 ° c.에 문화 매체 (자료 테이블)을 유지
    참고:는 agarose 너무 뜨거운 경우에, 문화 매체에서 비타민 효과 잃을 것 이다 하 고 세포를 손상 될 것 이다. 매체/agarose 솔루션의 온도 37 ° C이 하 있는 경우에, 고 과정 시작 하 고 폐의 균질 작성 손상 됩니다. 37 ° C ~ 39 ° C의 온도 범위에만 것이 좋습니다.
  4. 도달 시간을 시작 하기 전에 모든 필요한 자료를 배치: 5-10 클램프, 약 1 m 길이, 적합 한 주사기 (예를 들어, 50 mL)의 가동 가능한 카 테 테 르, 카 테 터와 얼음으로 채워진 얼음 상자에 연결 피팅.
  5. 실리콘 튜브를 삽입 하 여 기관/주요 기관지를 cannulate 하 고 있도록 클램프 조직에 좋다고 함께 실리콘 튜브와 함께 떨어져 그것을 곤란 하 게 하지 않고 튜브를 병렬 지향 클램프와 편집증. 실리콘 튜브 안에 집착 하 고 작성 절차 동안 빠져나갈 수 없습니다 확인 하십시오. 아무 agarose 작성 절차 동안 밖으로 누출 수 있도록 클램프, 모든 다른 기관지, 혈관 및 상해를 닫습니다.
  6. 비 커 문화 매체 믹스 3% 낮은 고 agarose의 해당 볼륨. 50 mL 주사기를 사용 하 여 폐로 혼합물을 주는. 이전에 매체와 주사기를 채우는, 클램프 손가락 또는 공기 방울 및 agarose 역류 방지 하기 위해 클램프와 함께 테 닥. 그것은 완전히 팽창 될 때까지 폐 엽을 입력 합니다. 조심 스럽게 터치 폐 늑 막에; 늑도 열심히 해야 합니다.
    참고: 폐 엽의 크기에 따라 agarose/매체 솔루션의 2 또는 3 L까지 필요할 수 있습니다.
  7. 단일 표본 내에서 여러 기관지의 경우 각 기관지에 대 한 1.5-1.6 단계를 반복 합니다.
  8. Agarose 젤 얻은 agarose의 양에 따라 20-40 분의 중 합에 대 한 얼음에 폐를 넣어. 신중 하 게 열심히 하 고 멋진, 그 중 합 완료 되 면 나타내는 있는지 확인, 그렇지 않으면 계속 해 서 기다려야 여러 면에서 늑 막 터치. 병리학 폐 조각으로 잘라, 그들의 샘플을 채취 되며 폐 물자 수송을 위한 얼음에 저장 하자.
  9. 인간의 폐 조직을 날카로운 칼으로 3-5 cm 석판에 잘라.
    참고: 모든 폐에 대 한 새로운 블레이드를 사용 하 여 선명도 보장 하기.
  10. 400 mL 얼음 얼의 균형된 소금 솔루션 (EBSS)로 조직 슬라이서를 채우십시오. 즉시 원하는 직경의 coring 도구로 반자동된 드라이버를 사용 하 여 폐 석판에서 원통형 조직 코어 절단 (예를 들어, 8 mm, 10 mm).
    참고:이 직경 컴퓨터 내부 조직 홀더의 직경에 해당 되어야 합니다.
  11. 원하는 두께 값을 폐 조각의 두께 조정 합니다.
    참고: 약 250 µ m의 두께 일반적으로 웹 실험에 사용 됩니다. 조직 슬라이서의 제조 업체는 슬라이스 두께의 확인에 대 한 그들의 조직 슬라이스 두께 게이지를 권장합니다. 또는, 전체 마운트 결합 confocal 현미경 검사 법 얼룩 Brismar 에 설명 된 대로 슬라이스 두께 결정 하 사용할 수 있습니다. 27
  12. 조직 슬라이서의 조직 홀더에 조직 코어를 전송 합니다. 무게 (조직 홀더 부분의) 조직의 코어 위에 넣어. 조직 슬라이서에 6 팔 속도 블레이드 속도 설정 합니다. 웹으로 조직의 핵심을 자르는 시작 합니다.
  13. 500 mL의 상용 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 보충: 영양소 혼합 F-12 DMEM/F12 (1:1) 페니실린 (10000 단위/mL)와 스 (10000 µ g/mL)의 5 mL와 함께. 냉장고 살 균 조건 하에서 며칠 동안 문화 매체를 저장 합니다. 미리 따뜻하게만 매체의 필요한 볼륨.
    참고: 페니실린 기간 더 긴 동안 37 ° C에서 보관 하는 경우 비활성화 될 것입니다. 혈 청 무료 및 염료 무료 문화 매체를 사용 하 여 혈 청 성분 변화에서 일괄 처리를 일괄 처리 하 고 페 놀 레드 등 염료 분석을 방해할 수 있습니다.
  14. 25 mL 차가운 문화 매체와 페 트리 접시 (100 x 15 m m)를 채우십시오. 중간 유리 실린더의 클램프를 열어 비 커에 조직 기계 밖으로 배수 한다. (예를 들어, 접종 루프) 주걱을 사용 하 여 비 커 문화 매체와 페 트리 접시에 슬라이스 전송. 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2, 100% 습도)에 페 트리 접시를 넣어. 중간 세척 단계 전에 워밍업을 허용 합니다.
    참고: 모든 추가 단계는 무 균 조건 하에서 수행 됩니다.
  15. 빨 래는 웹 페 트리 접시에 셀 여과기를 놓습니다. 완전히 셀 스 트레이너를 통해 10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 문화 매체를 제거 하 고 37 ° C에 미리 데워 진된 신선한 매체의 25 mL를 추가 합니다. 이 단계 3-4 시간 30 분 마다 반복 합니다.
    참고: 셀 스 트레이너는 조각에 어떤 손상을 방지 하기 위해 피 펫으로 빨려에서 슬라이스를 방지할 수 있습니다.
  16. 잘 당 두 조각에 대 한 500 µ L 문화 매체의 최소 24 잘 문화 접시에 폐 분할 영역을 신중 하 게 전송 합니다. 노출 물질 (단계 3.1-3.4 참조), 폐 조직 예를 들어, 37 ° C, 5% CO2에서 24 h에 대 한.
    참고: 전송, 가급적 접종 루프를 사용 하 여 및 조직 손상을 방지 하기 위해 루프에 조각 플 로트 보자. 충분 한 신선한 매체의 부족만 조직 조각에 세포 죽음을 유도 것으로 조각의 더 분리 필요 하다. 조각 수 겹치거나 서로 잘에서 터치: 이것은 조직 생존 능력에 아무런 영향을 미치지 않습니다.
  17. 모든 잔여 인간 자료는 정착 액 (예를 들어, 버퍼링 10% 포름알데히드) 24 시간 이상으로 플라스틱 플라스 크에 넣어 하 고 처리 과정에서이 구울.
    주의: 포름알데히드는 독성, 후드 아래이 단계를 수행.

2. 웹의 조직학 분석

  1. 정착 액에 담가 두 거품 패드와 함께 생 검 카세트를 준비 (., 4% 포름알데히드 버퍼링). 생 검 카세트에 거품 패드 사이의 웹 놓고 통 솔루션으로 조직을 즉시 전송 합니다. 수정 4%에서 숙박 조직 버퍼링 포름알데히드.
  2. 크 실 렌 (3 x 1 h) 및 표준 histopathology 프로토콜에 의하여 액체 파라핀 (3 x 1 h) 세척 뒤 에탄올 (70%, 90%, 100%, 100%, 100%, 100%), 각 1 시간에 대 한 샘플을 탈수 하 여 포함 하는 파라핀에 대 한 조직에 처리 합니다.
  3. 임베딩 몰드에는 웹을 전송 합니다. 접종 루프를 사용 합니다. 액체 파라핀에 웹 조직을 포함 합니다. 파라핀 블록을 캐스팅할 때 금형에 조직을 균등 하 게 배치 되었는지 확인 합니다.
  4. 때까지 그것은 표면이 평평 하 고 심지어는 웹 로타리 톰 포함 하는 조직 블록을 잘라. 받아 원하는 두께의 직렬 부분 (., 4 µ m), 처리 된 전체 웹까지 연속적으로 번호가 코팅된 유리 슬라이드 (일반적으로 25-30 섹션을 취할 수 있습니다)에 개별적으로 그들을 배치.
  5. 되며 고 오신 얼룩과 (H & E) 방향에 대 한 단일 유리 슬라이드 (모든 8-10 절)을 얼룩. (첫 번째 및 마지막 8 섹션은 일반적으로 불완전) 방향 슬라이드에 따라 실험에 대 한 섹션을 선택 합니다.
    참고: (선택 사항) 장기간된 보관에 대 한 슬라이드 보존을 위한 액체 파라핀에 담근 수 있습니다.

3입니다. 물질에 대 한 솔루션의 준비

참고: 작업 솔루션 및 즉시 사용 하기 전에 컨트롤을 준비 합니다.

주의: 안전 지침에 따라 물질을 처리 하거나 잠재적으로 유해한으로 알 수 없는 경우 일상적인 안전 예방 조치를 따르십시오.

  1. 문화 매체에 직접 수용 성 물질을 분해. 불용 성 또는 가난 하 게 녹는 화학 물질의 용 해도 따라 적절 한 용 매에 있는 물질을 분해 먼저. 제한 된 물 가용성을 가진 물질 (< 0.1 mg/mL) 녹을 수 있다, 예를 들어 에탄올 또는 DMSO. 비-독성 용 매 농도 미리 적정에 의해 결정 되어야 합니다. 물질 매체에 희석 하는 경우 솔루션에서 침전 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오.
    참고: HClPt 및 나트륨 laureth 황산 염 (SLS) 솔루션은 준비.
  2. 약 물질 재고 솔루션을 준비 문화 매체 또는 용 매에서 원하는 높은 농도의. 그리고 무게 12.5 mg HClPt 및 34.4 mg SLS 1 mL 문화 매체에 화학 물질을 용 해 하 여 재고 솔루션을 준비.
    참고: 없음 용 매는 이러한 화학 물질에 대 한 필요 합니다.
  3. 미리 따뜻하게 매체에서 1: 100의 최종 희석을 준비 합니다. 솔벤트의 이전 사용, 경우이 방법은 모든 물질 농도 대 한 동일한 마지막 용 매 농도에서 발생합니다.
  4. 마지막 용 매 농도 (예를 들어, 단계 3.3에에서 설명 된 대로 1%)를 사용 하 여 웹 참조 처리를 위해. 솔벤트 제어 결과 섹션에 언급 된 화학 물질에 대 한 필요 했다.

4. 긍정적이 고 부정적인 세포 독성 분석 실험에 대 한 참조

  1. 모든 생존 능력 분석 실험에 대 한 다음과 같은 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 준비:
    1. 조직 제어: 셀 문화 조건 (37 ° C, 5% CO2, 100% 습도)에 24 h에 대 한 치료 웹에 대 한 참조로만 문화 매체에서 웹을 품 어.
    2. 차량 제어 (필요한 경우): 웹에 대 한 참조만 차량으로 치료로 최종 용 매 농도와 웹을 품 어 (단계 3.4 참조) 셀 문화 조건 (37 ° C, 5% CO2, 100% 습도)에 24 h에 대 한.
    3. 긍정적인 통제: 1 h 4 ° c.에 대 한 버퍼 솔루션에 1% 세제로 웹을 품 어
      참고: 웹 될 경우 무색, 조직은 죽 다. 전체 L-젖 산 효소 (LDH) 약 1.9-2.3 (단계 6.1 6.4 참조)의 흡수와 상쾌한에 결정 됩니다. 서 부 표준시-1 시험에 사용 되는 조직 (참조 단계 5.1-5.5), 약 0의 흡수와.

5. 서 부 표준시-1 분석 결과 의해 인간의 웹의 화학적으로 유도 된 세포 독성의 측정

참고: 서 부 표준시-1 분석 결과 24-잘 접시 잘 당 두 웹에서에서 수행 됩니다. 가급적 이면, 각 매개 변수에 대 한 중복을 사용 하 고 측정 후 이러한 중복의 결과 수영장.

  1. 시작 하기 전에 즉시 매체에서 서 부 표준시-1 시 약을 diluting 하 여 작업 솔루션을 준비 합니다. 작업 솔루션의 필요한 금액은 250 µ L/24-잘 접시의 잘. 따라서, 하나의 잘 문화 매체의 225 µ L 25 µ L 시 약의 혼합.
  2. 1.16 단계에서 웹의 부 화 후 폐기 하거나 cytokine 측정 또는 LDH 분석 결과 같은 다른 테스트는 상쾌한을 사용 합니다. 나머지 조직 다음 단계에 사용 됩니다.
  3. 피펫으로 250 µ L 당 서 부 표준시-1 시의 작업 농도의 고 1 헤는 웹 인큐베이션 기간 동안 서 부 표준시-1 시에 의해 완벽 하 게 보호 됩니다 확인에 대 한 37 ° C, 5% CO2 접시를 품 어.
  4. 궤도 셰이 커 (200 rpm)에 접시를 놓고 30에 대 한 신중 하 게 흔들어 철저 한 서 부 표준시-1 시 약의 혼합 되도록 s. 24-잘 접시의 각의 상쾌한에서 중복에는 새로운 평면 바닥 96 잘 접시와 피펫으로 100 µ L를 가져가 라.
  5. 각 450에서의 흡수를 측정 nm (참조: 630 nm) microplate 리더를 사용 하 여. 630에서 흡수를 빼기 nm에서 450 nm. 이러한 값 사용 됩니다 단계 5.6에서에서 계산에 대 한).
    참고: 세포 독성 평가 대 한 신뢰할 수 있는 데이터는 가능한 조직 에서만에서 얻어질 수 있다. 따라서, 이러한 승인 기준 발행 헤스 외. 15 각 실험에 충족 되어야 한다. 이러한 조건이 충족 되지 않으면, 실험을 반복 한다.
  6. 치료 중간 제어의 흡수는 0.6, 그렇지 않으면 실험을 반복 해야 합니다 이상 이어야 한다. 데이터는이 요구 사항을 충족, 100% 조직 제어의 흡수 값을 설정 하 고 조직 제어에 관하여 치료 샘플의 서 부 표준시-1 감소를 계산.

6. LDH 분석 결과

참고: LDH 시험 후 잠복기 후 100 µ L 문화 총에서 표면에 뜨는 96 잘 접시에서 수행 됩니다.

  1. 테스트 에이전트의 유무에 관계 없이 웹의 부 화, 후 단계 1.16에서에서 상쾌한의 50 µ L 고 새로운 96 잘 접시에 중복에 그것을 전송. 이 각 24-잘 접시의 취급에서 중복을 생성 합니다.
  2. 분석 결과 직전 시 약 LDH의 작업 솔루션을 준비 합니다. 작업 솔루션 구성 촉매 솔루션 (lyophilisate 1 bidistilled 물에 녹아 있는)의 제조업체에서 제공 하는 솔루션을 염색 하 고. 한 96 잘 접시, 철저 하 게 촉매 솔루션의 125 µ L 염료 솔루션의 6.25 mL 믹스.
    주의: 팬 들은 빛을 직접 솔루션의 정보를 노출 하지 마십시오.
  3. 피펫으로 50 µ L 각 작업 솔루션의 상쾌한의 50 µ L를 이미 포함 하 고 어둠 속에서 RT에서 20 분 동안 접시를 품 어. 더 이상 혼합 하는 것이 필요 합니다.
  4. 492에 각 잘 흡수 측정 nm (참조: 630 nm) microplate 리더를 사용 하 여. 630에서 흡수를 빼기 492에서 nm nm. 이러한 값은 6.5 단계에서 계산에 사용 됩니다.
    참고: 세포 독성 평가 대 한 신뢰할 수 있는 데이터는 가능한 조직 에서만에서 얻어질 수 있다. 세제 처리 제어의 흡수는 1 이상 이어야 한다.
  5. 분석을 위해 단계 100%로 4.1에서에서 긍정적인 통제의 흡수 가치를 설정 하 고 긍정적인 컨트롤 (, 최대 LDH 릴리스)에 관하여 대우 샘플에서 LDH 릴리스를 계산 합니다.

7. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (cLSM) 미세한 생존 능력 분석 결과

참고: 미세한 생존 능력 분석 결과 대 한 24-잘 접시의 250 µ L/잘에서 얼룩이 두 정상 250 µ m 두께 웹. 각 분할은 별도로 몇 군데 서 더 중복이 필요 합니다.

  1. 외피의 웹 테스트 항목의 유무에 관계 없이, 후에 상쾌한 삭제 또는 cytokine 측정 또는 LDH 분석 결과 같은 다른 테스트를 위해 그것을 사용 하 여. 남은 티슈를 사용 하 여 여기에 설명 된 절차에 대 한.
  2. 작업의 희석 calcein 오전 및 브로민 homodimer 1 (EthD-1) 문화 매체에서 4 µ M의 두 약의 작업 농도로 준비. 이 목적에 대 한 997 µ L 문화 매체를 calcein-오전 (4 m m)의 1 µ L 및 EthD-1 (2 mM)의 2 µ L를 추가 합니다. 이 볼륨 2 웹으로 4 우물 얼룩 필요 합니다.
    참고: 직접 빛을 시 약의 노출을 피하십시오.
  3. 피펫으로 250 µ L 각 작업 희석의 고 어둠 속에서 RT에서 45 분 24-잘 접시를 품 어. 얼룩 솔루션에 조직의 더 나은 노출 되도록 인큐베이션 기간 동안 150 rpm에서 궤도 통에 접시를 놓습니다.
  4. 45 분 후 얼룩 솔루션을 삭제 하 고 어둠 속에서 RT에서 3-5 분 동안 150 rpm에서 떨고 통해 1 mL 버퍼 솔루션 웹을 씻어. 이 단계를 두 번 반복 합니다.
  5. 버퍼 솔루션의 500 µ L 문화 매체에서 autofluorescence을 피하기 위해 스테인드 웹 포함 된 각 잘 적용 됩니다. 미세한 평가 대 한 두 개 이상 무작위로 분산된 z-스택은 cLSM 수행 합니다.
  6. 10 X / 0.3 선택 하 눈 탭에서 클릭 객관적이 고 사용 하는 cLSM 표준 가벼운 현미경으로 웹의 표면 온라인 클릭. 눈 설정 종료 오프 라인 클릭 하십시오.
  7. 인수 탭에서 클릭 하 고 적절 한 레이저는 fluorophores에 대 한 설정.
    참고: 우리는 488의 파장으로 아르곤 레이저 사용 polyanionic 염료 calcein에 대 한 nm (495의 여기 파장 nm)와 HeNe 레이저 543의 파장으로 nm EthD-1/DNA 복합체의 검출에 대 한 (533의 여기 파장 nm). 아르곤 레이저로이 크게 레이저 수명 연장의 약 5.7 A, 튜브 전류 수 있도록 최대 전류의 30-50%에서 일반적으로 실행 해야 합니다.
  8. 인수 탭 아래 빛 경로 에 클릭 하 고 필요한 필터와 실험에 대 한 거울을 설정.
    참고: 현재 연구에 필터 기반 시스템 사용 되었다 주요 dichroic 빔 스플리터와 함께 (., HFT 488/543) 여기 및 방출 빛을 분리. 이 빛은 이동 보조 dichroic 광속 분리기 (예를 들어, NFT 545) 더 반영 거울을 통해 별도 빛 방출 샘플에서 두 채널에.
  9. 밴드 설정 (예를 들어, BP 505-530 calcein 신호 및 EthD-1/DNA 복잡 한 신호에 대 한 혈압 560-615) 특정 범위의 파장을 전송 하 고 채널 3에 2 채널 calcein 신호 및 EthD-1/DNA 복잡 한 신호를 지정 하는 필터를 전달 합니다.
  10. 미세한 볼륨에 대 한 위와 더 낮은 한계를 설정 하려면 Z-스택 상자를 확인 하십시오. 화면에는 해당 계층의 라이브 보기 라이브 단추를 누릅니다. 위나 찾기 날카로운 신호 웹의 표면으로 포커스를 이동 합니다.
  11. 채널 섹션에서 클릭 하 고 모두 표시확인란. 라이브 이미지 아래 해당 채널의 버튼을 눌러 테이블을 잠금 / 채널 색상을 활성화 합니다.
    참고: 라이브 이미지에서 파란색 높은 신호 화이트에 나타나고 설쳐 신호 빨간색으로 표시 됩니다 반면, 신호는 표시 됩니다.
  12. 빨간 EthD-1 채널에 대 한 작은 구멍 빛 수집의 효율성과 광 단면 사이 최고의 트레이드 오프에 대 한 1 공기 단위를 설정 하 고 calcein 채널을 적절 하 게 조정. 처럼 보이지만 흰색 하지 활성화 채널 색상 잠금 테이블 라이브 이미지에 빨간색 그런 이득의 감지 신호를 증가.
    참고: 마스터 이득 600 단위를 초과 하지 않아야 합니다.
  13. 배경 활성화 채널 색상 잠금 테이블 라이브 이미지에 파란색에서 표시 되도록 조정 디지털 오프셋을 늘리거나 설정 합니다.
  14. 다차원 수집에서 Z-스택 탭에서 클릭 하 고 포커스를 사용 하 여 관심의 z 계층으로 이동. 처음 설정 최신 수집을 위한이 위치 하기를 누릅니다. 천천히 이동 초점 또는 아래로 30 µ m의 범위에 도달 했습니다 때까지 마지막 설정 저장을 누릅니다.
  15. 라이브 다시 한번을 라이브 이미지 비활성화 시작 실험 에 이미징 시작을 클릭 하십시오.
    참고: 실행 가능한 조직 polyanionic 염료 calcein의 형광을 통해 감지 됩니다. 죽은 세포는 EthD-1 및 핵 산의 복잡 한 형성에 의해 감 별.

8. 이미지 렌더링

참고: 이미지 렌더링 소프트웨어의 컴퓨터 추천 계정에,이 프로그램 적절 한 하드웨어를 필요로 해 서 촬영 해야 합니다.

  1. 이미지 렌더링 소프트웨어에 웹 (섹션 7 참조)의 미세한 생존 얼룩에서 인수 LSM 파일을 로드 합니다. 계속 하기 전에.ims 파일으로 저장 합니다. 조직 제어에 모든 매개 변수를 설정 하 고 이러한 모든 이미지에 적용 합니다. 추가 변경 허용 됩니다.
  2. 볼륨 단추를 사용 하 여 실행 가능한 조직 (calcein 얼룩)의 표면 재구성 (보충 그림 1A)와 죽은 세포 핵 (보충 그림 1 H)에 대 한 관광 명소 버튼. 하나의 채널을 렌더링할 때 디스플레이 조정 창에 다른 채널을 전환 합니다.
  3. 중요 한 조직의 볼륨 렌더링 하 여 시작: 표면의 채널 설정, 전체 이미지를 처리 하 고 0.5 µ m, 부드러운 요소를 설정 하 고, 절대 강도 사용 하 여 임계값 (보충 그림 1B, C)에 대 한. 블루 앞으로 화살표를 누르십시오.
  4. 재건된 볼륨의 절대 강도 임계값 조정 소음 및 배경 강도 공제 한다. 오버레이 표면 회색으로 표시 하 고 표면 검사의 정확도 해야 (보충 그림 1D)를 선택. 조정 완료 후 블루 앞으로 화살표를 누르십시오. 대부분의 경우이 단계는 설정의 계산 필요 합니다. 소프트웨어 볼륨을 계산할 수 없는 경우에, 부드러운 요소 증가.
  5. 마지막 단계에서 필터를 선택 합니다. 표면 렌더링에 대 한 (약 10 µ m)와 구형 필터를 사용 하 여 치조 공간 (보충 그림 1E)에서 세포를. 앞으로 버튼을 누릅니다.
  6. 광학 출력 이미지를 조정 하 고 통계.xls 파일로 내보내기. (합)의 총 볼륨 추가 분석 (보충 그림 1 f, G)을 위해 사용 됩니다. 설정을 저장 하 고 z-스택 같은 cLSM 설정 (보충 그림 1I)와 같은 날에 찍은의 모든 추가 분석에 대 한 사용.
  7. 죽은 세포 핵에 대 한 빨강 채널 (명소)을 재구성 합니다. 무작위로 surpass 창; 스케일링 µ m의 점 크기를 측정 점 크기는 약 5 µ m. 마크 사용 하 고 점 크기를 설정 합니다. 확인 여부를 모든 점을 표시 되 고 각 점을 한 번만 계산 됩니다. (보충 그림 1B, H, J) 필요한 경우에 수동으로 수정 합니다. 블루 앞으로 화살표를 누르십시오.
  8. 눌러서 녹색 앞으로 단추 프로그램 계산 수 매개 변수에 따라 명소의 총 수를 설정 하 고.xls 파일 (보충 그림 1 K, L, M)으로 결과 내보냅니다. 이미지의 그래픽 또는 통계 분석에 대 한 중요 한 조직의 볼륨 비율에서 계산 된 죽은 세포 핵의 수를 설정합니다.

9. Cytokines와 인간의 웹에 발산의 측정

참고: cytokine 및 chemokine 면역 반응은 측정할 수 있습니다 extracellularly 문화 상쾌한 및 침 조직 lysates 외피 시간 후. ELISA는 100 µ L/잘 96 잘 접시에 중복에 측정 된다.

  1. 버퍼 솔루션의 495 mL와 세제의 5 mL를 혼합 하 여 1% 세제 솔루션을 준비 합니다. 솔루션은 몇 달 동안 RT에 저장할 수 있습니다.
  2. 효소 억제제 (PI) 1: 500의 비율로 1% 세제 솔루션 믹스. 필요에 따라 다릅니다 문화 접시; 예를 들어 500 µ L/잘 사용 하 여 24-잘 접시. 한 우물에 대 한 세제 솔루션의 499 µ L PI의 1 µ L 믹스.
  3. PI 솔루션의 1 µ L 튜브를 준비 하 고이 튜브에 표면에 뜨는 문화의 500 µ L를 수집 합니다. 즉시 500 µ L 세제 솔루션 준비 단계 9.2에서에서 파이 포함 하 여 24-잘 접시에 매체를 교체 합니다. 4 ° c.에 24-잘 접시에 배치 하 여 1 시간에 대 한 조직 lyse 피펫으로 새로운 튜브에서 lysate 조직 추가 분석까지-80 ° C에이 튜브를 저장.
    참고: ELISA 프로토콜 높은 제조 업체에 의존 하 고 제조업체의 지침을 따라야 한다. 표준 ELISA 프로토콜은 다음에 설명 되어 있습니다.
  4. 표면에 뜨는 또는 제조업체의 지침에 따라 lysate cytokine 수준을 측정 하는 ELISA를 수행 합니다. IL 1α 및 TNF-α를 측정, 하 코트 a96 잘 플레이트 캡처 항 체의 pipetting 100 µ L에 의해 (희석 제조업체의 지침에 따라)에 대 한 실시간에서 밤새 품 어와
  5. Bidistilled 물 1 L에 세척 버퍼 태블릿을 용 해 하 여 세척 버퍼를 준비 합니다. 각 우물에 캡처 항 체와 피펫으로 400 µ L 세척 버퍼를 제거 합니다. 이 볼륨을 세 번 바꿉니다. (예를 들어, 제조업체의 지침에 따라 버퍼 솔루션에 1 %BSA) 차단 솔루션을 추가 하 여 접시를 차단 합니다. 1 시간에 대 한 RT에서 품 어.
    참고: 표준 상용 ELISAs 조직 표면에 뜨는 또는 lysate의 2 x 100 µ L를 필요합니다. 샘플 한번 해 동 하 고 그냥 사용 하기 전에 해야 합니다. 감도의 분석 결과 및 발표 cytokine에 따라 측정 전에 샘플을 희석 해야 합니다. 따라서, 분석 결과에서 제공 하는 시 약에 샘플을 희석.
  6. 차단 솔루션을 제거 하 고 표준 곡선에 대 한 희석된 샘플 (희석 제조업체의 지침에 따라)에 대 한 추가 및 조직의 표면에 뜨는 100 µ L 또는 조직의 중복 단계 9.3에서에서 수집에 lysate 100 µ L. 실시간에서 2 h에 대 한 품 어
  7. 각 우물에 샘플 및 피펫으로 400 µ L 세척 버퍼를 제거 합니다. 이 볼륨을 세 번 바꿉니다. 피펫으로 100 µ L biotinylated 탐지 항 체 (희석 제조업체의 지침에 따라)에 대 한 실시간에 2 h에 대 한 품 어와
  8. 각 우물에 항 체 및 피펫으로 400 µ L 세척 버퍼를 제거 합니다. 이 볼륨을 세 번 바꿉니다. (희석 제조업체의 지침에 따라) 100 µ L/잘 HRP 표시 streptavidin의 추가 RT에서 20 분 동안 품 어 (제조 업체의 지침을 확인).
  9. 각 잘으로 streptavidin과 피펫으로 400 µ L 세척 버퍼를 제거 합니다. 이 볼륨을 세 번 바꿉니다.
  10. (제조업체가 권장) 기판의 100 µ L을 추가 하 고 어둠 속에서 20 분 동안 품 어 (제조 업체의 지침을 확인).
    참고:이 단계는 빛에 민감한. 기판 및 플레이트의 빛 노출을 피하십시오.
  11. 50 µ L 정지 솔루션을 추가 하 여 반응을 중지 (1m H2이렇게4). 각 450에서의 흡수를 측정 nm (참조: 570 nm) microplate 리더를 사용 하 여. 570에서 흡수를 빼기 nm에서 450 nm.
    참고: 치료 하거나 차량 조직 컨트롤 부정적인 컨트롤 역할을 합니다. 폐 조직에서 면역 반응을 유도, 긍정적인 제어로 적절 한 자극 (예를 들어, 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS))을 사용 합니다. 예를 들어 24 h에 대 한 문화 매체에서 100 ng/mL LPS와 잘 당 두 개의 plc 2 개의 우물을 품 어 고 상쾌한 및 조직 단계 9.3에서에서 설명 된 대로 lysate를 수집 합니다.
    참고: 측정된 결과 허용, 가장 높은 표준의 흡수는 1.0; 이상 하는 경우 그렇지 않으면 측정 반복 될 필요가 있다. 표준 곡선 자형 복용량 응답 곡선 맞춤을 따라야 한다.
  12. 사이토카인 농도 (pg) 단계 9.11에서에서 ELISA 정한 lysate 각 샘플의 조직에 결정 총 단백질 콘텐츠를 정규화 (섹션 10 참조).

10. 인간의 웹에 총 단백질 함량의 측정

참고:는 웹 총 단백질 농도 측정 하기 위해 lysed 될 필요가 있다. 단계의 9.3 조직 lysates이 단계는 데 사용 됩니다. 분석 결과 중복에서 pipetted 25 µ L/잘 조직, lysate의 평면 96 잘 접시에서 수행 됩니다.

  1. 7 포인트 BSA 표준 BSA 2000 µ g/mL, 1500 µ g/mL, 1000 µ g/mL, 750 µ g/mL, 500 µ g/mL, 250 µ g/mL, 및 125 µ g/mL의 농도 준비 합니다. 각 표준에 대 한 중복에 25 µ L을 적용 하 고 96 잘 접시 (접시 접시 커버와 함께 사용)에 빈으로 25 µ L 버퍼 솔루션을 사용 하 여.
  2. 피펫으로 25 µ L 96 잘 접시에 중복에 각 우물에서 (단계 9.3 참조) lysates의. 총에서 각의 50 µ L 잘이 필요 합니다. 준비 작업 시 약 희석 BCA, BCA 솔루션의 BCA 시 대답에에서 시 B 1시 50분 96 잘 접시 사용 시 B의 400 µ L 20000 µ L a. 시 약의
  3. 조심 스럽게 피펫으로 200 µ L의 각 음에 작업 시 공기 방울을 피하. 30 궤도 셰이 커 (150 rpm)에 접시를 놓고 s lysates 및 작업 시의 적절 한 혼합을 확인 하 고 접시에 접시 커버를 넣어. 어둠 속에서 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어. 540-590 nm microplate 리더를 사용 하 여 각의 흡수를 측정 합니다.
    참고: 측정 결과 허용, 표준 높은 BSA의 흡수는 0.8; 이상 하는 경우 그렇지 않으면 측정 반복 될 필요가 있다. 표준 곡선 자형 복용량 응답 곡선 맞춤을 따라야 한다.
  4. 분석을 위해 빈의 빼기 후 4-매개 변수 Marquardt 방정식을 사용 하 여 표준 곡선을 계산 합니다. 맞는 표준 곡선을 사용 하 여 알 수 없는 샘플의 단백질 농도 계산 합니다.

Representative Results

현재 연구 방법으로 인간의 웹 준비 하 고 인간 폐 물질에 화학적 유도 immunomodulatory 효과 평가 하기 위해 산업 물질의 5 개의 농도에 노출 했다. 폐 조직 24 h. 독성에 대 한 영구 문화 발표 LDH, 미토 콘 드리 아 활동 및 미세한 생존 얼룩의 측정에 의해 평가 되었다 침수 조건에서 노출 되었다. 또한, 정상화와 프로 염증 성 cytokines에 대 한 총 단백질 함량 측정 되었다. 가능 하다 면, 비-선형 자형 곡선에 피팅 하 여 금지 농도 (IC) 75 값 계산 했다. 긍정적인 참조 물질, cytokine 타고 난 응답에 대 한 세포 독성 및 LPS에 대 한 세제는 각 실행의 유효성 검사를 위해 사용 되었다. 로그값으로 변환 된 IC75 [μ M] 값 (로그 IC50) 후속 cytokine 방출 측정 농도 "자극성"로 사용 되었다.

그림 1그림 2 인간의 폐 소재와 모범 H & E 염색 인간의 웹의 작성의 절차를 보여줍니다. 일상적인 위생 절차 건강에 불리 한 영향을 방지 하 고 인간의 폐 재료를 처리 하는 직원의 안전 보장에 따라 해야 합니다. 기술 인력 훈련 및 연습을 요구 한다. 다른 영역 (위/아래 돌출부 및 더 많은 중앙 대 subpleural) 구별 병리학 경험 대 병 하 고 건강 한 지역 인간의 폐 재료의 병 적인 상태를 평가 하는 데 필요한. 생성 된 인간의 웹 H & E-얼룩진 얇은 섹션, 병리학 자에 의해 다시 계산 될 수 있는 준비를 위해 사용 되어야 한다. 이 절차는 사용자 차별 다른 병에 걸리는 지역 및 폐 내의 위치에서 연습을 얻을 수 있습니다.

그림 3 SLS와 24 시간 배양 후 인간의 웹에서 LDH 및 서 부 표준시-1 활동에 대 한 측정 결과 제공합니다. SLS, 0 µ g/mL SLS에서 표시 없이 치료 매체 제어는 중요 한 품질 관리. LDH에 비해 세제 lysed 조직에 대 한 값이 20% 미만 이어야 하 고 > 서 부 표준시-1 분석 결과 대 한 0.7 흡 광도 단위. 이 질 통제는 또한 부족 한 조직 생존 능력의 지표 역할을 합니다. 효과적인 독성 물질, 세제 솔루션으로 인간 조직의 응답 긍정적인 컨트롤로 포함 되어야 합니다. 그것은 300-500% 증가 초래 한다 (> 2.0 흡 광도 단위) 치료 조직 및 값에 비해 LDH의 < 서 부 표준시-1 분석 결과 대 한 0.1 흡 광도 단위. SLS는 복용량-의존 감소 LDH 농도에서 서 부 표준시-1 분석 결과 대사 활동의 감소에 있는 증가 의해 측정 된 세포 생존 능력의 결과 > 87 µ g/mL. 시그모이드 농도-응답 모델 IC75 또는 IC50 값을 계산할 수 있도록 데이터를 장착 했다. 이러한 값 cytokine 및 chemokine 수준에 대 한 농도 선택 하는 데 사용 이후 수: 매우 독성 농도에서 일반적으로 없음 또는 저하 cytokines 및 발산만 검출 될 수 있다. 따라서, 비 독성 또는 유일한 약간 독성 농도 (IC75)는 것이 좋습니다. 그것은 여기 표면에 뜨는 세포 배양에서 LDH 활동의 예상된 증가 종종 적용된 물질21에 의해 영향을 주의 하는 것이 중요. 자주, 방해 물질과 효소 활동, LDH 분석 결과 사용 하는 유일한 세포 독성 시험 하는 경우 결과의 오해로 이어지는 간에 발생 합니다. 따라서, 그것은 중요 하 고 안정적이 고 유효한 결과 얻기 위해 여러 가지 세포 독성 분석 실험을 수행 하는 데 필요한입니다. 또한, LDH 및 서 부 표준시-1 분석의 감도 매우 유사한 언급 한다.

그림 4에서 웹의 미세한 생존 이미지 효과적인 독성 물질로 서 세제에 인체 조직의 응답을 보여 줍니다. 결과 다른 생존 데이터를 확인 하는 매우 유용 하지만이 추가 장비가 필요 합니다. 독성 효과 시각적으로 calcein-긍정적인 조직 EthD-1-긍정적인 세포 핵에 비해의 평가 의해 평가 됩니다. 실질 내에서 임의로 선택 된 세그먼트 일반적으로 귀 착될 비교 데이터, 항공 또는 혈관을 피해 야 한다, 반면 큰 충 치 결과 교대로 수 있습니다. 우리의 경험에서 그리고 위에서 설명한 미세한 설정, 1.5 x 106 와 5 x 106 µ m3 의 컨트롤 조직 사이 평균 볼륨 측정 됩니다. 값에는 폐 소재 품질, 웹 품질, 그리고 또한 폐 조직 기증자의 질병에 따라 달라 집니다. 인간의 폐 조직 생존 기증자 마다 다릅니다, 비록 죽은 세포 핵 가능한 조직에 비해 수 조직 제어의 15%를 넘지 말아야 한다. 그러나 죽은 세포 핵 인 조직 제어에 주로 존재 하는 경우, 실험 포기 되어야 한다.

그림 5 는 인간의 폐 조직에 HClPt와 SLS의 immunomodulatory 효과 대 한 대표적인 데이터를 표시합니다. 프로 염증 성 cytokines 일리노이-1α 및 TNF-α는 염증에 노출 된 후 염증 성 프로세스의 시작을 나타내는의 생체 물질을 자극. 두 cytokines는 ELISA에 의해 측정 되었다. Extracellular IL 1α는 세포내 IL 1α 1000 pg/mL의 위 수준에 도달 하는 반면 인간의 웹에서 일반적으로 낮은. 세포내 IL 1α 감소 지속적인 세포 독성 프로세스-나타내고 인간의 웹의 화학 물질에 노출 후 주로 관찰 된다. 조직 LPS로 자극 하는 경우 활성기의 타고 난 면역 체계와 같은 긍정적인 치료 통제, 다음 유도 IL 1α의 대부분을만 24 시간 후 침 검출 될 수 있다. 반면에, LPS 자극에 의해 유도 하는 TNF-α 분 비 주로 측정할 수 있습니다 extracellularly. LPS와 같은 적합 한 긍정적인 컨트롤의 사용 방법의 타당성을 보여줍니다. 현재 연구 방법으로 인간의 웹 HClPt (32, 64, 및 125 µ g/mL)의 3 개의 농도 또는 24 h. Cytokine 분 비 세포 외 및 세포내 cytokines의 합으로 결정 했다에 대 한 SLS (1, 10 µ g/mL)의 2 개의 농도에 노출 됐다 그림 5에서 같이 총 단백질 농도를 정상화. 그러나 그것은 BCA 분석 결과 총 단백질 함량의 결정에 대 한 일반적으로 사용 된다,, 그것은 또한 물질 유도 된 세포 독성을 반영 여기 언급 가치가 있다. 따라서, 높게 유독한 농도에서 cytokine 데이터의 정규화에 대 한 총 단백질 콘텐츠를 사용할 수 없습니다. IL 1α의 분 비 증가 크게 263 ± 38 pg/mg에서 887 ± 216 pg/mg와 TNF-α에 대 한 263 ± 38 pg/mg에서 1160 ± 286 pg/mg (그림 5A, B). 또한, LPS 유발 IL 1α 및 TNF-α 분 비 unstimulated 조직 제어에 비해 제공 됩니다. 병원 체 관련 된 분자 패턴, LPS, 등으로 프로 염증 성 cytokines의 유도 방법의 타당성 및 고 immunomodulatory 효과 조사 하기 위해 인간의 웹 작업할 때 사용 하는 것이 좋습니다. 에 대 한 자세한 내용은 HClPt 및 SLS 데이터, 참조 하십시오 연구를 Lauenstein 그 외 여러분 에 의해 21

Figure 1
그림 1 : 인간의 폐 소재를 채우는 절차. 인간의 폐 절제 후 즉시 준비 된다. 폐는 일관 된 작성 agarose와을 피하기 위해 작성 하는 동안 갑자기 agarose 중 합을 위한 실내 온도에 저장 되어야 합니다. 폐는 주요 기관지 또는 기관지 (A & B 기관지에 근접 촬영을 위한)에 최적의 보기 위해 밖으로 확산 하는 돌출부와 가로로 배치 됩니다. 기관지 유연한 실리콘 튜브와 cannulated 되며 고정 클램프 (C). 충전 절차 및 agarose 중 합 조직에서 후 훈련된 병리학 폐 3-5 cm 두께 (D)에 대 한의 조각으로 잘라. 이러한 조각에서 원통형 조직 코어 (Ø 예를 들어, 8 m m)는 coring 도구 (E)을 준비 하 고 있다. 이러한 조직 코어 매체 가득 접시 정상 세포 배양 조건 (E)에서 부 화에 대 한로 전송 즉시 웹에 조직 슬라이서와 절단 됩니다. 후 여러 세척 단계는 웹 잔여 세포 파편 및 출시 셀 중재자 (F) 제거 세포 배양 배지 (예를 들어, 24-잘 잘하고 500 µ L 매체 당 두 개의 웹 판)로 전송 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : H & E 염색에 의해 인간의 웹의 건강 상태의 결정. 폐 종양과 기증자에서 준비 하는이 이미지에 웹 보여줍니다 치경 실질으로 그대로 폐 조직 주변 항공 (*)과 혈관 (화살촉) 개요 (A). 더 높은 확대, 항공 그대로 ciliated 호흡기 상피 (화살촉) (B), 수많은 적혈구 (화살촉) (C)와 모 세관을 포함 하 여 가능한 pneumocytes 늘어서 그대로 치경 구조와 실시 치경 공간 치경 대 식 세포 (CD68 immunohistochemistry)를 포함 (D), 그대로 피 (CD31 immunohistochemistry)와 혈관 뿐만 아니라 (E)를 관찰할 수 있다. 만 조직 종양-무료 아무 거시적 질병 영역은 표시 하는 이유는 웹에 대 한 사용 되었다. 웹 달리 기종 같은 다른 폐 질환과 기증자에서 준비 또는 섬유 증, 치경 구조를 방해 하지는 웹은 약간 외부 보더, 대부분 준비 단계 때문에 마모 됩니다. 스케일 바 1000 µ m (A)와 50 µ m (EB-), 각각 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 문화 매체로 LDH 효소의 누설 (A)와 서 부 표준시-1 (B) 염료와 평가 하는 대사 효소 활동의 손실에 의해 인간의 웹에 SLS에 의해 유도 된 세포 독성의 측정. 인간의 웹 SLS의 농도 증가에 노출 되었다. Sigmoid 농도-응답 모델은 IC75 또는 IC50 값 (억제 농도에서 세포 생존 능력의 25% 및 50% 감소) 계산된 (오른쪽 그림) 될 수 있도록 데이터를 연속적으로 장착 됩니다. 데이터는 ± SEM을 의미 하는 대로 표시 됩니다 n = 3-5. 492에서 LDH 분석 결과의 흡 광도 측정 했다 nm (630에서 참조 nm)와 서 부 표준시-1 450에 분석 결과의 nm (630에서 참조 nm). 데이터 적응 되었고 Lauenstein 그 외 여러분 에서 수정 21 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 인간의 웹의 3 차원 미세 얼룩 및 이미지 렌더링의 대표 이미지. 살아있는 조직 제어 및 조직의 효과적인 독성 물질, 세제, 응답 속도 표시 됩니다 calcein 오전와 인간의 웹 (노란색) 및 EthD-1 얼룩 후 (빨간색). 30 µ m의 10 X 목표 (A)와 함께 촬영 했다와 (B)를 렌더링 합니다. 눈금 막대는 100 µ m. 여기 파장 488 nm 및 543 nm, 방출 필터 BP 505-550 nm와 LP 560 nm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 암모늄 hexachloroplatinate (HClPt)-유도 IL 1α 및 TNF-α 분 비 인간의 웹에 24 시간 노출 후. 웹 3 농도 (32 µ g/mL, 64 µ g/mL, 및 HClPt의 125 µ g/mL)와 SLS의 두 개의 다른 농도 (1 µ g/mL와 10 µ g/mL)에 노출 되었다. Extracellular 세포내 IL 1α (A)와 TNF-α (B) ELISA에 의해 결정 되었고 총 단백질 함량에 정규화. 표시 방법의 유효성을 타고 난 면역 계통, LPS의 긍정적인 활성 세포내 IL 1α (A)에 대 한 고 extracellular TNF-α (B) 출시, 총 단백질 콘텐츠를 정규화 된 참조로 표시 됩니다. 데이터는 ± SEM을 의미 하는 대로 표시 됩니다 *p < 0.05와 * * *p < 0.001; HClPt와 SLS: n = 9, IL 1αLPS: n = 5, TNF-αLPS: n = 기술 중복 (맨-휘트니 테스트)에서 4. 이 그림 Lauenstein 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 21 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Supplementary Figure 1
보충 그림 1: 미세한 생존 렌더링 소프트웨어를 사용 하 여 얼룩의 이미지에 대 한 자세한 계산 처리. Calcein-얼룩진 가능한 조직 (A-G, )의 표면 렌더링 및 브로민 homodimer 스테인드 세포 핵 (H, 의 자리 검출을 위한 업로드 LSM 이미지의 이미지 분석을 위한 단계별 절차 J-M). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Supplementary Figure 2
보충 그림 2: 인간의 폐 조직의 얼룩이 지기 현미경 생존의 전산 이미지 분석의 개요. 실행 가능한 조직 (노란색) 표면 렌더링 (B-I)에 의해 분석 하 고 죽은 세포 핵 (적색) 자리 탐지 (J-P)에 의해 감지 되었다. 스냅숏 모드 이미지 (Q)을 내보내는 데 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

인간의 웹 기술은 우리의 실험실에서 잘 설립입니다. 현재 종이이 기술과 폐 조직 비보 전물질의 독성 시험에 대 한 사용 설명을 제공 합니다. 일반적으로, 정량 범위 정의 variabilities, 그리고 실험의 타당성을 보장 하는 품질 제어의 추정 관련 모든 실험실을 사용 하 여이 기술을 설정 분석 결과를 받아야 한다. 가능한 표준 절차 수, 예를 들어 각 끝점, 예를 들어, 샘플 등 긍정적인 당 2 ~ 3 기술 복제의 최소 최소 3 명의 생물 학적 기증자 (개별 실행)에서 세포 독성 분석 실험을 반복 하 고 네거티브 참조 합니다. 실험실 인원 분석 결과 일관성을 증가 분석 결과 변화를 최소화 하 고 훈련 한다.

폐 조직에 물질의 immunomodulatory 효과 평가 하기 위해 자주 사용 하는 끝점 포함 세포 독성 측정 (예를 들어, LDH 분석 결과, 서 부 표준시-1 분석 결과, 분석 결과 얼룩이 지기 현미경) 다른 분석 실험을 사용 하 여, cytokine 방출 분석 실험도 식 프로필과 immunohistopathological 방법6세포 인구에 있는 변화의 특성의 변화. 또한, 인간의 웹으로 또한 옮겨질 수 있다 하 고 따라서 전에 세포 구성에 대 한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다 murine 웹28 폐 수지상 세포와 같은 셀의 시각화를 설명 하는 기술이 있다 고 후에 상 상속 세포 독성 물질과 치료.

이 기본 프로토콜 및 인간의 폐 조직 단면도의 준비에 대 한 기술 간행물29에 잘 설명 되어 있는 기술을 비교입니다. 즉, 기관 자료 절제술 또는 이식 수술을 받아야 할 폐 암, 등 라이브-위협 하는 만성 질병 으로부터 고통 받는 환자에서 얻은 것입니다. 연구는 지역 윤리 위원회에 의해 승인을 받아야 한다. 환자 정보 동의서가 필요 합니다. 클리닉 및 연구소 간의 워크플로 설정은 중요 한 문제 이며 통신, 인터페이스 및 두 사이트 간 인프라의 정의. 인간의 폐 재료 조직의 생존을 유지 하기 위해 절제 후 직접 처리할 수 있다. 그것은 젊은이 노인 모두 폐를 건강 하 고 병에 걸리는 폐 인간 웹에 대 한 여기에 설명 된 기술을 적용할 수 있습니다 언급할 가치가 있다. 예를 들어 미국에서 폐를 건강 한 장기 기증자 사고에서 죽은 또는 그 장기 이식에 대 한 거부 되었습니다에서 가능 하다.

프로토콜의 첫 번째 중요 한 단계는 기도 및 주변 실질 agarose 솔루션의 인플레이션입니다. 이 단계는 후속 조각화 절차에 대 한 매우 부드러운 조직을 공고히 하는 데 필요한. 여기 질병 배경에 따라 인간의 폐 재료의 질이 중요 합니다. 그대로 늑 막에와 함께 엽만 채울 수 있습니다. 기관지 근처 말기 종양은 가끔 작성 프로세스를 방지합니다. 인간의 재료를 팽창 하기 전에 agarose 솔루션의 온도 철저 하 게 검사할 수 있다. 너무 많은 혈액 (또는 다른 체액, exudates) 인간 안에 폐 조직 agarose의 원치 않는 희석 고 중 합 과정에 영향을 미칠 것 이다. 폐 조직의 인플레이션 및 얼음에 agarose의 고, 후 폐 200 ~ 300 µ m 두께의 섹션으로 절단 됩니다. 조직의 일관성은 매우 중요 한 문제입니다. 조직 너무 연약한 경우에, 동일한 섹션의 슬라이스 하는 것은 어렵습니다. 각 폐에 대 한 매개 변수는 각 기증자, 기증자 사이 조각의 두께 다를 수 있습니다에 대 한 설정 되어 동일한 톰, 개별로 조건 및는 팽창 하는 동안 변경 내용을 처리 하는 경우에. 조직의 휘도가 작성 다른 슬라이스 두께에 발생 합니다. 측정 하 고 표준화 하는 조각의 두께, 대신 총 단백질 함량의 측정 폐 슬라이스 두께 직접 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다. 여러 가지 말기 질병 방해 조각화 프로세스; 예를 들어, 혈액 혈관은 폐 고혈압과 거리 조직에 두꺼워 매우 단단하게 가능 하다 조직 실린더의 조각화와 톰 블레이드 매우 자주 교체 해야 그래서 뻣 뻣 한 수 있습니다.

인간 웹 및 집중 단계 세척의 준비, 후는 세포 파편을 제거 하는 데 필요한 하 고 출시 효소, 조직 실험29의 섹션은 사용할 수 있습니다. 인간의 웹 정상 세포 배양 조건에서 배양 되며 노출 하는, 예를 들어 화학 물질, 약물, 또는 lipopolysaccharides. (알 수 없음된) 감염으로 인해 웹의 가끔 오염 인간 폐 재료의 문화에 특별 한 문제입니다. 감염을 표시 하는 조직 문화를 폐기 해야 하 고 장비를 철저 하 게 소독 해야 합니다. 다른 한편으로 준비를 위해 한 손으로 사용 하는 실험실 장소 및 경작 사이 공간 별거 교차 감염을 피하기 위해 도움이 됩니다. 장비에 관하여는 톰 누설 수 있습니다, 그리고 느슨한 육각 나사 모터 손상 및 블레이드 운동의 중지 발생할 수 있습니다. 슬라이서의 모든 부분 스테인레스 스틸로 만들었고 그래서 그것 건조 하지 경우 산화 됩니다 즉시 청소 변경. 장비 문제를 해결 하려면 적어도 하나의 백업 장치를가지고 필요할 수 있습니다.

이전 간행물에서 agarose 씻 겨 보고 되어과 집중 준비 후 단계를 세척 하는 동안 제거. 사실, 이것은 불가능 하는 agarose를 제거할 수 없습니다. agarose의 완전 한 제거, 조직을 파괴 하는 것을 높은 온도에서 다시 녹 인 될 필요 합니다. 폐 포 및 항공 agarose 설명된 끝점 방해 하지 않습니다. 다른 끝점 agarose의 존재에 의해 영향을 받을 수 있습니다 (제한 참조). 조직 생존 능력은 문화에서 중요 한 문제가 매우 신선한 조직 단면도 준비할 필요가 강조 되어야 했다. 기관지는 생존에 대 한 유효한 매개 변수가 아니다. 적어도 2 개 또는 3 개의 독립적인 세포 독성 분석 실험을 사용 하 여 주변 실질;의 생존 능력을 확인 하는 것이 좋습니다. 이것은 모든 실험30에 체크 합니다. 세포 독성 분석 실험에서 품질 컨트롤 부족 조직 생존 능력의 지표 역할을 합니다. 따라서, 모든 세포 독성 분석 실험에 세제와 같은 효과적인 독성 물질에의 조직, 예를 들어 응답을 평가 하는 것이 좋습니다. 복용량 응답 곡선을 바탕으로, 흡수의 최소 및 최대 값 세포 독성 분석 실험에 대해 정의 하는 데 필요한 하 고 후속 실험을 위해 만났다. 추가 수정 프로토콜에 주로 적용 된 화학 물질과 관심의 끝점에 따라 달라 집니다. 불 용해성 또는 반응성이 매우 높은 화학 물질의 적용은 제한 됩니다. DMSO에 대 한 높은 용 매 농도 1%로 제한 됩니다. 높은 농도 사용할 수 있지만 프로 염증 성 cytokines, IL-8 등의 발음 릴리스에서 발생할 수 있습니다. 다른 한편으로, 사용 하는 자극은 상대적으로 약한 수 있습니다. 이 경우에, 조직의 양은 2 잘 당 4 조각에서 늘릴 수 있습니다. 이 방법은 24 시간을 생존 능력을 제한합니다.

인간의 웹의 주요 한계는 독일에서 그들은 준비 될 수 있다 질병 인간 폐 자료에서 이다. 수술을 받을 환자는 일반적으로 50 년 보다 더 오래 된와 폐암에서 고통 받는 환자의 80%는 흡연 자 수 하는 데 사용. 환자, 스테로이드 제제 등의 약물도 인체 조직을 사용 하 여 실험의 결과 좌우할 수 있다. 따라서, 그것을 필수적 이다: i) 긍정적인 참조 생존 능력, 기능, 및 개별 조직의 감도 확인 하 여 각 실험의 유효성을 검사 하 고 ii) 크로스-건강, 비 병에 걸리는, 중간 나이 폐 조직에서를 사용 하 여 결과 확인 실험 동물 (cynomolgus 같은 비 인간 영장류 고, 가능 하면, 마우스, 쥐, 기니 피그). 병에 걸리는 직물의 더 나은 병 리 점수는 더 나은 실험 결과. 주로 병에 걸린 조직을 거의 사용할 수 하 고 매우 자주 쇼 제한 가능성, inadequately 낮거나 매우 높은 cytokine 수준, 세균 이나 곰 팡이 감염, 그리고 적은 기관지. 기증자 기증자 변형 높은 인간의 개별 다양성을 반영 하는 실험실 동물에서 얻은 결과와 비교 됩니다. 그러나 이것은,, 하지 한계 일반적으로; 다른 국가에서 (예를들면, 미국) 그것 죽은 장기 기증자 이식에 대 한 거부에서 건강 한 폐를 얻을 수, 위에서 언급 했 듯이. 조직의 응답 급성 노출 실험에서 48 h에 대 한 첫 번째 최대에 대 한 잘 설명 하고있다. 문화의 많은 일 후에 또는-80 ° c.에 저장 후 생존 및 조직의 기능 감소 약 14 일에 대 한 문화 인간의 폐 조직에 가능 하다. 이 시간 동안 계속 생존 능력 그러나, 다양성, 여러 세포 인구 세포, 조직에서 등의 기능의 손실에 있는 증가 관찰, 제한 된 사이토카인 릴리스 mitogens에 대 한 응답에서 결과. 일부 끝점에 대 한 또 다른 한계는 agarose 방해, 예를 들면, 높은-품질 및 충분 한 양의 RNA31 의 격리 또는 후속 cytometry에 대 한 단일 셀 정지의 준비 조직에 존재 하 고 형질 세포의. 단일 셀 반응과 기능에 기계 통찰력을 얻을 수 있는 가능성은 따라서 제한 됩니다.

Organotypic 조직 모델, 인간의 웹 기본 및 비 임상 연구에 높은 영향을 간주 됩니다. 인간의 폐 재료는 밀접 하 게 정상적인 기관 아키텍처를 반영 하는 생물 학적 구성. 그것은 예를 들어 주거 치경과 기관지 상피 세포, 평활 근 세포, 섬유 아 세포, 내 피 세포, 신경 섬유, 및 대 식 세포 포함. 조직 실용적 이며 여러 가지 자극에 응답 하는 셀. 비록 섬유, 신경 절단, 활성화 될 수 있다 로컬, 터미널 반사 응답14선도. 따라서,이 비보 전 모델 세포질 타고 난 면역 반응, 방위 응답, 신호, cytokine 유도 세포 표면 마커 연구 가능성을 제공 합니다. 몇 가지 개선 기술, 경작, 및 끝점의 유효성 검사 변환 과학에서 인간의 웹의 사용을 허용합니다. 미래 접근의 예는: i) 유효성 검사의 새로운 대상으로 인간의 폐 조직, 노출, 면역 반응의 평가 ii)에 예를 들어 화학 물질, 약물, 나노 입자, , iii), 면역 세포와 폐 조직 보완 등 T-세포, iv)으로 식별 및 호흡기 sensitizers, 질병 유도 물질, 또는 통로; 억제 활성 화합물에 노출 후 분자 패턴 등의 수정 또한, v) 개장 하는 기도 vi) 신경 규정32. 과학 분야는 웹과 현재와 미래의 이러한 접근에 관심을. 또한, 다양 한 다른 개발 cryo 보전20및 조직 호흡 하는 동안 또는 기계적인 직물의 자연 스러운 움직임을 모방 하33 스트레칭 등 웹 기술을 향상 하는 데 도움이 됩니다 있다 환기입니다.

다른 3D 모델에 비해 인간의 웹의 주요 장점은 면역 세포와 신경 섬유의 존재입니다. 실험 또한 마우스, 쥐, 및 아직도 약리학과 독물학에서 가장 자주 사용 되는 동물 종 비 인간 영장류에서 수행할 수 있습니다. 인간의 폐 조직의 복잡성 결과 인간을 동물에서 생체 외에서 vivo에서에서 번역을 지원합니다. 호흡기 sensitizers의 식별에 대 한 기존 대안 분석의 맥락에서 인간의 웹은 매우 복잡 하 고 단일 세포 응답에 대 한 통찰력을 허용 하지 않습니다. 그러나, 현미경 및 흐름 cytometry 바로 세포 마커 사용 하는 경우에, 예를 들어 apoptosis, 괴 사, 또는 세포내 표식 세포질 응답에 대 한 정보를 줄 수도 있습니다. 검증 되 고 호흡기 sensitizers의 식별을 위해 사용 되었다고 보고 있는 게시 된 분석 실험을 확인 하 고 있습니다. 그러나, 단일 세포 분석 실험을 통해 그들의 모든 장점 가진 웹을 사용 하 여에서 발전 하고있다 귀중 한 기여를 기술은 높은 처리량 검열을 위해 사용 될 수 있다는 의미에서 왓슨 에 설명 된 대로 34 그들은 murine cryo 보존 웹에서 기도 독성을 예측 하는 높은 처리량 검열 분석 결과 개발. 그들의 소형된 96 잘 웹 형식으로 그들은 murine 게 액체, 가능한 높은 처리량 분석 결과 웹을 만들기에 유사한 정보를 발견.

Disclosures

저자는 공개 없다. 프라운호퍼 항목 대신 생명 공학, 제약, 화학, 및 화장품 산업 계약 연구 수행 연구, 대 한 독립적인 공공 비영리 연구 조직 이다. 연구소의 자금 국내외 공공 프로젝트에서 온다.

Acknowledgments

우리는 인간의 웹와 위험 평가 대 한 대체 테스트 전략에 대 한 그녀의 사전 작업에 대 한 Lan Lauenstein를 감사 하 고 싶습니다. 연구의 일부는 6번째 프레임 워크 프로그램 센스-그것-4 "생체 외에서 알레르기 증상의 평가 대 한 새로운 테스트 전략" 내 유럽 위원회에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm A. Hartenstein (Leipzig, Germany) SS04
Syringe Faust Lab Science (Klettgau, Germany) 9.410 050
Coring tools custom-made custom-made
Trimming Blade Handle (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205530001
Trimming Blades (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205500000
Microtome: Tissue Slicer Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) 303400-ADPT Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)
Microtome blade Wilkinson Sword (Solingen, Germany) ENR-4027800011506
Tissue culture dishes Sigma (München, Germany) Z666246-420EA
Cell strainer filter (100 µm Nylon) Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) BD352360
Inoculation loop Copan Diagnostics (Murrieta, USA)  CD176S01
TPP Tissue culture plates 24wells Sigma (München, Germany) Z707791-126EA
Cassette Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 1000957
Nunc MaxiSorp flat-bottom Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) 44-2404-21
Nunc MicroWell 96-Well  Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 260836
Confocal Microscope Zeiss (Jena, Germany) Confocal LSM Meta 510
Image rendering software Bitplane AG (Zürich, Switzerland) IMARIS 7.6
LSM Image Browser Zeiss (Jena, Germany)
Multiwell-Reader Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) Tecan infinite F200Pro Plate Reader
Plate shaker Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) KM-2 Akku
BenchMark ULTRA Ventana Medical Systems (Tucson, USA) Automated IHC/ISH slide staining system
Assays
Cell Proliferation Reagent WST-1 Roche (Basel, Switzerland) 11644807001
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche (Basel, Switzerland) 11644793001
Microscopical vitality staining  Invitrogen (Carlsbad, USA) L-3224 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit
BCA Protein Assay Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 23225
ELISA assay kit R & D systems various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) DuoSet
Reagents
Agarose, low gelling temperature  Sigma (München, Germany) A9414-100G
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) Sigma (München, Germany) E2888-500ML
Penicillin and streptomycin Lonza (Verviers, Belgium) 17-602E
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) Gibco (Darmstadt, Germany) 11039-047 Culture medium
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) Lonza (Verviers, Belgium) BE17-513F   Buffer solution
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma (München, Germany) A9647-500G
Detergent Sigma (Saint Louis, USA) X100-100ML Triton X-100
Washing buffer Merck (Darmstadt Germany) 524653  0.05% Tween 20 in PBS

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References

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세포 독성의 평가 인간의 정밀 컷 폐 분할 영역에서 물질의 Immunomodulatory 효과
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