Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vurdering av den cytotoksiske og immunmodulerende effekter av stoffer i menneskelig presisjonsstyrte kutte lunge skiver

doi: 10.3791/57042 Published: May 9, 2018
* These authors contributed equally

Summary

I lys av 3Rs prinsipp, er åndedretts modeller som alternativer til dyrestudier utvikling. Spesielt for risikovurdering av respiratoriske stoffer er det mangel på passende analyser. Her beskriver vi bruk av menneskelige presisjonsstyrte kutte lunge skiver for vurdering av luftbåren stoffer.

Abstract

Luftveissykdommer i deres brede mangfoldet må riktig modellsystemer å forstå de underliggende mekanismene og utvikling av nye therapeutics. I tillegg krever registrering av nye stoffer riktig risikovurdering med tilstrekkelig testing systemer å unngå risikoen for enkeltpersoner å bli skadet, for eksempel i arbeidsmiljøet. Slike risikovurderinger utføres vanligvis i dyrestudier. I lys av 3Rs prinsipp og offentlige skepsis mot dyreforsøk, har human alternative metoder, for eksempel presisjonsstyrte kutte lunge skiver (PCLS), utviklet. Utredningen beskriver ex vivo teknikken av menneskelig PCLS å studere immunmodulerende potensialet av lav-molekylvekt stoffer, som ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Målt endepunktene inkluderer levedyktighet og lokale åndedretts betennelse, preget av endrede sekresjon av cytokiner og chemokines. Pro-inflammatoriske cytokiner, tumor nekrose faktor (TNF-α) alfa og interleukin 1 alpha (IL-1α) var betydelig økt i menneskelig PCLS etter eksponering for en sub giftige konsentrasjon av HClPt. Selv om teknikken av PCLS er vesentlig optimalisert de siste tiårene, er brukbarheten for testing av immunomodulation fortsatt i utvikling. Derfor er resultatene som presenteres her foreløpige, selv om de viser potensialet i menneskelige PCLS som et verdifullt verktøy i luftveiene forskning.

Introduction

Luftveissykdommer som allergisk astma, yrkesmessig astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), emfysem og infeksjoner i øvre og nedre luftveiene er på vei og et verdensomspennende helse byrden1,2. Egnet testsystemer er nødvendig, for å identifisere noen av de grunnleggende mekanismene underliggende disse sykdommer, i tillegg til utvikling og testing av riktig stoffer. Grunnforskning samt prekliniske narkotika utvikling er fokusert på resultater i i vitro eller vivo analyser. Disse analyser, men har sine begrensninger3. Først i vitro analyser utnytte menneskeceller som ble isolert og fjernet fra tilstøtende vev eller organer og er dermed ikke lenger kunne samhandle med eller beskyttes av andre celler3. Dernest er dyremodeller ofte ikke oversettbare til mennesker på grunn av forskjeller i fysiologi og biokjemiske forskjeller4. For å minimere disse begrensningene, og i sammenheng med 3Rs (erstatning, raffinement, reduksjon) prinsippet5, nye alternative modeller stadig utvikling.

Alternative menneskelig vev 3D modeller, for eksempel PCLS, er en kobling mellom menneske-baserte i vitro og komplekse dyr i vivo modeller. PCLS gjenspeiler den funksjonelle heterogenitet med alle aktuelle celletyper tilstede i luftveiene6. I tillegg har PCLS teknikken fordelen av reproduserbar utarbeidelse av flere tynne skiver av presise tykkelse fra en enkelt dyr eller human vev donor. Dette tillater en intern kontroll samt ulike konsentrasjoner eller narkotika testes.

Siden første introduksjonen av agar fylt menneskelige lunge skiver i 1994 av Fisher et al. 7 teknikken for kutting og dyrking av lungevev er betydelig forbedret. Christian Martin et al. har forbedret denne teknikken for videre kjemiske og farmakologiske søknader8. Vår gruppe ble introdusert til denne teknikken av Christian Martin i 2007. Siden da har anvendelse av PCLS i forskning utvidet fra testing av funksjonelle svar, for eksempel luftveiene9,10 og vasokonstriksjon11, til immunologiske, farmakologiske12,13, og toksikologiske7 testing i ulike arter i flere laboratorier. For eksempel Schlepütz et al. 14 undersøkt airway svar for arter forskjeller og sammenlignet perifere Nevron aktivisering av elektriske feltet stimulering (EFS) eller av capsaicin i mus, rotter, marsvin, sauer, silkeaper og mennesker. De ulike artene har atskilte, men ulike mønstre av nerve-mediert bronchoconstriction og konkluderte med at de brukte forsøksdyr (mus og rotter) ikke alltid gjenspeiler menneskelige reaksjoner. For testing av lungene-toksisitet og redusere antall dyr i denne sammenheng, Hess et al. 15 pre godkjent rotte PCLS som et ex vivo alternativ for innånding toksisitet studier. Denne multicentric før validering studien resulterte i utviklingen av to prediksjon modeller PCLS med lovende resultater.

Videre i grunnleggende forskning, har PCLS blitt brukt til å belyse kalsium signalering16og tidlig allergiske reaksjoner17virusinfeksjon svar18,19. Tekniske fremskritt er pågående ytterligere fremskritt blir undersøkt. For eksempel øker feltet fordelen av menneskelig vev ved lagring og gjenbruk av frossent. Rosner et al. beskrevet teknikk fryses murine PCLS som bevarer evne til luftveiene kontrakt ved stimulering: derfor teknikken forlenger vinduet tidsbegrenset som vev være levedyktig, og så videre Analyser kan brukes over tid de samme donor20. I tillegg til disse forskning fremskritt, Lauenstein et al. 21 nylig undersøkt risikovurdering av ulike kjemikalier som kan fungere som potensielle allergifremkallende stoffer for yrkesmessig astma i menneskelig PCLS.

Yrkesmessig astma, som har symptomer er luftveisobstruksjon og luftveier hyperresponsiveness, ligner på allergisk astma, er indusert av eksponering for høy-molekylvekt (HMW)22 eller lav-molekylvekt (LMW) stoffer23 (f.eks , platina forbindelser) i arbeidsmiljø. LMW har en høy sensibilisering potensielle når danner kan og binde til carrier proteiner21. Registrering av nye HMW eller LMW kjemikalier krever i vitro og i vivo risikovurdering om deres antatte sensibilisering potensielle (f.eks., OECD retningslinje 429)24. Tester til å bestemme den antatte sensibilisering potensial, men var ikke konstruert for risikovurdering av respiratoriske allergifremkallende stoffer, men for kontakt allergifremkallende stoffer, men det syntes å være noen kongruens for en undergruppe av stoffer25 . Arbeidet Lauenstein et al. var utformet som en del av EU prosjektet Sens-it-iv å utvikle alternative testing strategier for risikovurdering av antatte kontakt eller lunge allergifremkallende stoffer21. For dette prosjektet fokuserte vi på teste brukbarheten av menneskelige PCLS som et testing verktøy. Derfor ble en rekke immunmodulerende endepunkt (f.eks, levedyktighet og cytokin sekresjon) valgt til irriterende eller inflammatorisk potensialet i kjemikalier, som LMW platinum forbindelser. Lauenstein et al. funnet noen generelle mønsteret som kan brukes på alle åndedretts allergifremkallende stoffer; men gitt arbeidet grunnlaget for nylig publisert protokoller26.

Oppsummert gir protokollen presenteres her for forberedelser og etterfølgende eksponering av menneskelig PCLS en nyttig metode for evaluering av potensielt lunge-giftig og/eller immunmodulerende stoffer som kan være involvert i utviklingen av luftveiene sykdommer, for eksempel yrkesastma.

Protocol

Eksperimenter med menneskelige PCLS må utføres i henhold til Den etiske av World Medical Association og godkjent av den lokale etikk (eksemplarisk PCLS eksperimenter vises her ble godkjent av den lokale etikk i av Hannover Medisinsk skolen; antall 2701-2015). Det kreves skriftlig samtykke til bruk av menneskelige lunge materiale fra alle donor pasienter eller deres pårørende. Resultatene som beskrives i dette manuskriptet ble innhentet med vev skiver fra givere i ulike aldre, kjønn, medisinsk historie, og årsaken til resection, selv om de fleste av vev fikk var fra pasienter som lider av lungekreft. Bare svulsten uten vev ble brukt for eksperimenter.

1. generelle utarbeidelse av menneskelig PCLS og påfølgende eksponering for kjemikalier

Merk: To personer må fylle en lunge. En oppdatert vaksinasjon post for hepatitt A og B anbefales. Pasienter er rutinemessig undersøkt for HCV og HIV før lungetransplantasjon. Hvis en aktiv infeksjon med Mycobacterium tuberculosis er diagnostisert eller mistenkt, bør lunge bli avvist. Likevel alle friske menneskelige lungevev og eksempler fra det må behandles som potensielt smittsomme og tilsvarende forholdsregler må tas (partikkel filtermasker (FFP2), vernebriller, hansker) for å sikre yrkesmessig sikkerhet av den personalet. Prosedyren tar 60-90 min.

  1. Bekrefte intactness av den menneskelige lunge lobe.
    Merk: En tåre i pleura hindrer homogen fylling av vev. Menneskelige lunge materiale må være fra dagen av resection. Lagring perioder på ca 2 timer ved romtemperatur (RT) før fylle den med agarose på isen er tolerert. Vevet som vi bruker i denne protokollen hentes fra pasienter som gjennomgår resection. Det er ikke fra avdøde pasienter. Hvis vevet er lagret på is, Forvarm det til RT før fylle det, ellers agarose vil danner umiddelbart og ingen homogen fylling vil være mulig.
    Advarsel: Pass på at alle personer i kontakt med innfødt menneskelige materiale oppføre verneklær som består av en labfrakk, to par hansker, cap, ansiktsmaske og et par vernebriller. Menneskelige materialet er potensielt.
  2. Veie 7.5 g av lav-gelling agarose og legge den til 250 mL bi-destillert vann. Kok agarose i en mikrobølgeovn til agarose er oppløst. Avkjøle den ca 40 ° c, avhengig av smelter og gelling poenget med agarose.
    Merk: Flere flasker er nødvendig, avhengig lobe.
  3. Forvarm og holde kultur medium (Tabell for materiale) på 37 ° C.
    Merk: Hvis agarose for varmt, vitaminer i kultur medium mister effektivitet og cellene vil bli skadet. Hvis temperaturen på medium/agarose løsningen er under 37 ° C, gelling prosessen starter og svekke homogen fylling av lungene. Bare et temperaturområde på 37 ° C til 39 ° C anbefales.
  4. Plassere alle nødvendige materialer innen rekkevidde før du starter: 5-10 klemmer, fleksibel kateter ca 1 m lengde, egnet sprøyter (f.eks, 50 mL) passer tilkoblingen til kateter, og en isen boksen fylt med is.
  5. Cannulate spor/main bronchus ved å sette silikon røret og fixating den med en klemme orienterte parallell til røret, slik at klemmen presser vevet sammen sammen med silikon røret uten å klemme den av. Kontroller at silikon røret er fiksert inni og ikke kan skli ut under fylling prosedyren. Lukk alle andre bronchi, blodkar og skader festing, slik at ingen agarose kan lekke ut under fylling prosedyren.
  6. Bland en tilsvarende volum på 3% lav-gelling agarose med kultur medium i et beaker. Innpode blandingen i lungene med en 50 mL sprøyte. Før påfylling sprøyte med middels, stengt klemme kateter eller en klemme å unngå luftbobler og agarose reflux. Fylle lungene lobe før det er fullt ut oppblåst. Nøye touch lunge pleura på siden; pleura skal selv og vanskelig.
    Merk: Avhengig av lunge lobe, opp til 2 eller 3 L agarose/middels løsning kan være nødvendig.
  7. Gjenta trinn 1.5-1.6 for hver bronchus ved flere bronchi innenfor et enkelt eksemplar.
  8. Sette lungene på is av agarose å gel i 20-40 minutter, avhengig av innpodet agarose. Nøye trykk pleura på flere sider for å kontrollere om det er hard og kult, som angir at polymerisasjon er fullført, ellers venter. La patologer vil skivet lungene, ta sine prøver og lagre lunge materialet på is for transport.
  9. Skjær menneskelige lungevev i 3-5 cm plater med en skarp kniv.
    Merk: Bruk en ny blad for hver lunge for å sikre skarphet.
  10. Fyll vev sliceren med 400 mL iskald Earle balansert salt løsning (EBSS). Umiddelbart kutte sylindriske vev kjerner av lunge plater med en semi-automatisert skrutrekker med coring verktøyet av foretrukne diameter (f.eks8 mm, 10 mm).
    Merk: Dette diameter må være tilsvarende diameteren på vev holderen inni maskinen.
  11. Justere tykkelsen på lunge skiver til ønsket tykkelse-verdien.
    Merk: En tykkelse på ca 250 µm brukes vanligvis i PCLS eksperimenter. Produsenten av vev sliceren anbefaler sine vev Slice tykkelse Gauge for bekreftelse av skive tykkelsen. Alternativt, hele-mount flekker kombinert med AC confocal mikroskopi kan brukes til å angi skive tykkelsen som beskrevet av Brismar et al. 27
  12. Overføre vev kjernene inn i vev holderen for vev slicer. Legge vekten (del av vev holderen) på vev kjernen. Angi den armen og blad hastighet til 6 på vev sliceren. Starte kutting vev kjernen i PCLS.
  13. Supplere 500 mL av kommersielt tilgjengelige Dulbecco endret Eagle Medium (DMEM): næringsstoff blanding F-12 DMEM/F12 (1:1) med 5 mL av penicillin (10.000 enheter/mL) og streptomycin (10.000 µg/mL). Lagre kultur medium i flere dager under sterile forhold i kjøleskap. Forvarm bare et bestemt volum av medium.
    Merk: Penicillin vil deaktiveres hvis holdt på 37 ° C for lengre perioder. Bruk serum- og fargestoff-fri kultur medium, serum komposisjon varierer fra parti til parti og fargestoffer, som fenol-rød, kan forstyrre analyser.
  14. Fyll en Petriskål (100 x 15 mm) med 25 mL iskald kultur medium. Middels skal dreneres ut av vev sliceren i et beaker ved å åpne klemmen på glass sylinder. Overføre skiver fra et beger i Petriskål med kultur medium ved hjelp av en applicator (f.eks, inokuleringen sløyfe). Sette Petriskål i en inkubator (37 ° C, 5% CO2, 100% luftfuktighet). Tillate medium å varme opp før vask trinnene.
    Merk: Alle ytterligere trinn utføres under sterile forhold.
  15. Plass en celle sil i Petriskål for vask av PCLS. Fjerne kultur medium med en 10-mL serologisk pipette gjennom cellen silen og legge til 25 mL av 37 ° C forvarmes frisk medium. Gjenta dette trinnet 3 - 4 ganger enhver 30 min.
    Merk: Cellen silen hindrer skiver blir sugd inn pipette, å unngå skade på sektorene.
  16. Overføre lunge skiver nøye til en 24-brønnen plate med et minimum av 500 µL kultur medium for to-stykker per brønn. Utsette lungevev stoffer (se trinnene 3.1-3.4), f.eks24 h ved 37 ° C, 5% CO2.
    Merk: For overføringen, helst bruke en inokuleringen sløyfe og la skiver float på loop for å hindre skade på vev. Ingen ytterligere skille sektorene er nødvendig, som bare mangel på tilstrekkelig frisk medium vil indusere celledød i vev skiver. Skiver kan overlappe eller være borti hverandre i brønnen: Dette har ingen innflytelse på vev levedyktighet.
  17. Putte alle gjenværende menneskelige materiale i en plast kolbe med et bindemiddel (f.eks, 10% bufret formaldehyd) for minst 24 timer og brenne dette i disposisjon prosessen.
    Forsiktig: Formaldehyd er giftig, utføre dette trinnet under en hette.

2. histologiske analyse av PCLS

  1. Forberede biopsi kassetter med to skum pads dynket i bindemiddel (f.eks., 4% bufret formaldehyd). Plasser PCLS mellom skumet Polstrer i biopsi kassetten og øyeblikkelig overføre vevet i etappe, den stabiliserende løsning. Fastsette vevet overnatter i 4% bufret formaldehyd.
  2. Behandle vev for parafin innebygging av dehydrating prøver etanol (70%, 90%, 100%, 100%, 100%, 100%) 1t hver, etterfulgt av vask xylen (3 x 1 h) og flytende parafin (3 x 1 h) som standard histopatologi protokoller.
  3. Overføre til PCLS i en innebygging mold. Bruk en inokuleringen sløyfe. Bygge PCLS vevet i flytende parafin. Pass på at vevet jevnt i mold når avstøpning parafin blokken.
  4. Kuttet vev blokken som inneholder PCLS med en roterende mikrotom til den er en jevn og flat overflate. Ta føljetong deler av ønsket tykkelse (f.eks., 4 µm), plassere dem individuelt på fortløpende nummererte tonet glass lysbilder (vanligvis 25-30 deler kan tas) før det hele PCLS er behandlet.
  5. Stain enkelt glass lysbilder (hver 8-10 deler) med hematoxylin og eosin flekk (H & E) for orientering. Velg deler for eksperimentet basert på retningen lysbildene (de første og siste 8 delene er vanligvis ufullstendig).
    Merk: (Valgfritt) For langvarig lagring, lysbilder kan være dyppet i flytende parafin for bevaring.

3. forberedelse av løsninger for stoffer

Merk: Forbered arbeidet løsninger og kontroller umiddelbart før bruk.

Forsiktig: Håndtere stoffer ifølge sikkerhetsinstruksjoner hvis ukjent, som potensielt skadelig og følg rutinemessige sikkerhetstiltak.

  1. Oppløse vannløselige stoffer i kultur medium. For uløselig eller dårlig vannløselige kjemikalier, først oppløse stoffet i riktig løsemidlene avhengig av stoffet oppløselighet. Stoffer med begrenset vannløselighet (< 0,1 mg/mL) kan forsvinne, for eksempel i DMSO eller etanol. Ikke-giftig løsemiddel konsentrasjoner bør fastsettes av titrering på forhånd. Kontroller at stoffer ikke bunnfall ut av løsningen når utvannet til medium.
    Merk: HClPt og sodium laureth sulfate (SLS) løsninger er forberedt.
  2. Forberede stoff lager løsninger på 100-fold av ønsket høyeste konsentrasjonen i kultur medium eller løsemiddel. Veie 12.5 mg HClPt og 34.4 mg SLS og forberede lager løsninger ved å løse opp kjemikaliene i 1 mL kultur medium.
    Merk: Ingen løsemiddel kreves for disse kjemikaliene.
  3. Forberede en endelig fortynning av 1: 100 forvarmes medium. Ved tidligere bruk løsemiddel resulterer dette i samme endelige løsemiddel konsentrasjonen for alle stoff konsentrasjoner.
  4. Bruk siste løsemiddel konsentrasjonen (f.eks1% som beskrevet i trinn 3.3) for referanse behandling av PCLS. Noen løsemiddel kontroll var nødvendig for kjemikalier nevnt i resultatinndelingen.

4. positive og Negative referanser for cytotoksisitet analyser

  1. For alle levedyktighet analyser, forberede følgende positive og negative kontroller:
    1. Vev kontroll: ruge PCLS kultur medium kun som en referanse for ubehandlet PCLS 24 h på celle kultur forhold (37 ° C, 5% CO2, 100% luftfuktighet).
    2. Kjøretøy kontroll (hvis nødvendig): ruge PCLS med siste løsemiddel konsentrasjonen som en referanse for PCLS behandlet med kjøretøy bare (se trinn 3.4) 24 h på celle kultur forhold (37 ° C, 5% CO2, 100% luftfuktighet).
    3. Positiv kontroll: ruge PCLS med 1% vaskemiddel i buffer løsning 1t på 4 ° C.
      Merk: Hvis PCLS blir fargeløs, vevet er død. Totalt L-laktat dehydrogenase (LDH) bestemmes i nedbryting, med en absorpsjon av ca 1.9-2.3 (se trinnene 6.1-6,4). Vevet brukes for WST-1 analysen (se trinn 5.1-5.5), med en absorpsjon av ca 0.

5. måling av kjemisk indusert cytotoksisitet i menneskelig PCLS av WST-1 analysen

Merk: WST-1 analysen utføres i en 24-vel plate med to PCLS per brønn. Helst bruk duplikater for hver parameter og samle resultatene av disse like etter måling.

  1. Forbered arbeidet løsningen fortynne WST-1 reagensen i medium umiddelbart før du starter. Den nødvendige mengden av fungerende løsning er 250 µL/vel av en 24-vel plate. Derfor bland 25 µL til reagensen med 225 µL av kultur medium for en godt.
  2. Etter inkubasjon av PCLS fra trinn 1,16 forkaste eller bruk nedbryting for cytokin mål eller andre tester som LDH analysen. Gjenværende vev brukes til neste trinn.
  3. Pipetter 250 µL av arbeider konsentrasjonen av WST-1 reagensen per godt og ruge platen på 37 ° C og 5% CO2 for 1 h. Kontroller at PCLS er fullstendig dekket av WST-1 reagensen under inkubasjon.
  4. Plasser platen på en orbital shaker (200 rpm) og riste nøye for 30 å sikre grundig blanding av WST-1 reagensen. Ta en ny flatskjerm-96-brønns bunnplaten og Pipetter 100 µL i duplikater fra nedbryting av hver brønn av 24-vel plate.
  5. Måle absorpsjon av hver brønn ved 450 nm (referanse: 630 nm) bruker en microplate reader. Trekke opptaket på 630 nm fra 450 nm. Disse verdiene brukes for beregning i trinn 5.6).
    Merk: Pålitelige data for cytotoksisitet vurdering kan fås fra levedyktig vev. Derfor disse akseptkriterier publisert av Hess et al. 15 skal oppfylles i hvert eksperiment. Hvis disse kriteriene ikke oppfylles, bør forsøket gjentas.
  6. Absorpsjon av ubehandlet middels kontrollen skal være over 0,6, ellers eksperimentet skal gjentas. Hvis dataene oppfyller dette kravet, setter absorpsjon av vev kontrollen til 100% og beregne WST-1 reduksjon av behandlet prøver i forhold til kontrollen vev.

6. LDH analysen

Merk: LDH analysen utføres i en 96-brønns plate med 100 µL kultur supernatant totalt etter etter vekst.

  1. Etter inkubasjon av PCLS med eller uten test agenter ta 50 µL av nedbryting fra trinn 1,16 og overføre den i duplikater i en ny 96-brønns plate. Dette genererer duplikater fra hver behandlet godt av en 24-vel plate.
  2. Forbered arbeidet løsningen av LDH reagensen umiddelbart før analysen. Arbeider løsningen består av catalyst løsningen (lyophilisate oppløst i 1 mL bidistilled vann) og farge løsning levert av produsenten. En 96-brønns plate, grundig blande 125 µL av catalyst løsning med 6,25 mL fargestoff.
    Forsiktig: Ikke utsette løsningen for direkte lys.
  3. Pipetter 50 µL av arbeider løsningen i hvert godt allerede inneholder 50 µL av nedbryting og ruge platen i 20 min på RT i mørket. Ingen ytterligere miksing er nødvendig.
  4. Måle absorpsjon av hver brønn på 492 nm (referanse: 630 nm) bruker en microplate reader. Trekke opptaket på 630 nm fra 492 nm. Disse verdiene brukes for beregning i trinn 6.5.
    Merk: Pålitelige data for cytotoksisitet vurdering kan fås fra levedyktig vev. Absorpsjon av vaskemiddel-behandlet kontrollen skal være over 1.
  5. For analyse, setter absorpsjon av positiv kontrollen fra trinn 4.1 som 100% og beregne LDH utgivelsen i behandlet prøver i forhold til positiv kontrollen (dvs., maksimal LDH release).

7. mikroskopiske levedyktighet analysen med AC Confocal Laser skanning mikroskopet (cLSM)

Merk: For mikroskopiske levedyktighet analysen, er to av de normale 250 µm tykke PCLS farget i 250 µL/godt av en 24-vel plate. Som hver skive er imaged separat, kreves ingen ytterligere duplikater.

  1. Etter inkubasjon av PCLS med eller uten test elementene, forkaste nedbryting eller bruke den for cytokin mål eller andre tester som LDH analysen. Bruke gjenværende vevet til fremgangsmåten som er beskrevet her.
  2. Forbered arbeidet fortynning av calcein-AM og ethidium homodimer 1 (EthD-1) med en arbeider konsentrasjon av både reagenser på 4 µM i kultur medium. For dette formålet, legge til 1 µL av calcein-AM (4 mM) og 2 µL av EthD-1 (2 mM) 997 µL kultur medium. Dette volumet er nødvendig stain 4 brønner med to PCLS.
    Merk: Unngå eksponering av reagenser til direkte lys.
  3. Pipetter 250 µL av arbeider fortynning i hver godt og ruge 24-vel platen i 45 min på RT i mørket. Plass platen på en orbital shaker på 150 rpm under incubation å sikre bedre eksponering av vev til farging løsning.
  4. Etter 45 minutter, forkaste flekker løsningen og vask PCLS med 1 mL buffer løsning gjennom rister på 150 rpm for 3-5 minutter på RT i mørket. Gjenta dette trinnet to ganger.
  5. Bruke 500 µL av buffer løsning i hver brønn som inneholder den fargede PCLS for å unngå autofluorescence fra kultur medium. Mikroskopiske vurdering, utføre minst to tilfeldig fordelte z-stabler med en cLSM.
  6. Klikk kategorien okulær velge en 10 X / 0,3 målsettingen og klikk på Online bruke cLSM som standard lys mikroskop finne overflaten av PCLS. Klikk på Offline avslutte okulær innstillingen.
  7. Klikk på fanebladet kjøp og slå på de aktuelle laser for fluorophores.
    Merk: Vi brukte en argon laser med en bølgelengde på 488 nm for polyanionic fargestoff calcein (eksitasjon bølgelengden til 495 nm) og en HeNe laser med en bølgelengde på 543 nm for gjenkjenning av EthD-1/DNA komplekset (eksitasjon bølgelengden til 533 nm). Argon laser bør vanligvis kjøre 30-50% av maksimal gjeldende aktivere en tube strøm av rundt 5.7 A, som dette forlenger laser levetid betraktelig.
  8. Klikk på Lys banen under kategorien oppkjøp og angi nødvendige filtre og speil for eksperimentet.
    Merk: Studien, en filter-basert system ble brukt med en dichroic fjernlyset splitter (f.eks., HFT 488/543) skille lyset eksitasjon og utslipp. Gjennom et reflekterende speil dette lyset er rettet til sekundære dichroic strålen fordeleren (f.eksNFT 545) til ytterligere separat lyset ut fra utvalget i to kanaler.
  9. Sett opp bandet passerer filtre (f.eksBP 505-530 for calcein signalet og BP 560-615 EthD-1/DNA komplekse signalkabelen) som overfører bare et bestemt utvalg av bølgelengder og tilordne calcein signal kanal 2 og EthD-1/DNA komplekse signalet kanalen 3.
  10. Merk Z-stabler for å angi øvre og nedre grensene for mikroskopiske volumet. Trykk på Live for å se en live visning av tilsvarende laget på skjermen. Flytte fokus opp eller ned for å finne overflaten av PCLS med et kraftig signal.
  11. Klikk avsnittet kanaler og Merk av for Vis alle. Låse opp tabellen ved å trykke på knappen på tilsvarende kanalen under bor bildet og aktivere kanalen fargen.
    Merk: Blått i live bildet angir at det ikke er noe signal, mens en høy signal vises i hvitt og et overeksponert signal vises i rødt.
  12. Angi hullet for den røde EthD-1-kanalen til 1 luftige enhet for den beste avveining mellom effektivitet av lys samling og optisk snitting og justere calcein kanalen deretter. Øke oppdaget signal om gevinsten slik at det vises hvite men ikke rødt i live bildet med aktivert kanal fargetabell fengsel.
    Merk: Master gevinst bør ikke overstige 600 enheter.
  13. Øker eller reduserer digital forskyvningen for å justere bakgrunnen slik at den vises i blått i live bildet med aktivert kanal fargetabell fengsel.
  14. Klikk på kategorien Z-Stack under flerdimensjonale oppkjøp og bruke fokus skifte til en z-lag rundt. Trykk Angi første lagre denne posisjonen for senere kjøp. Sakte flytte fokuset opp eller ned til et utvalg av 30 µm er nådd og trykk Angi siste lagre.
  15. Klikk på Live igjen å deaktivere det levende bildet og trykker på Start eksperimentet å starte avbilding.
    Merk: Levedyktig vev registreres gjennom fluorescens av polyanionic fargestoff calcein. Døde celler er blir diskriminert av komplekse dannelsen av EthD-1 og atomer syren.

8. bildegjengivelse

Merk: Datamaskinen anbefaling av gjengivelsesprogramvaren bildet må tas i betraktning, som dette programmet krever maskinvaren.

  1. Last filen LSM fra mikroskopiske levedyktighet farging av PCLS (se punkt 7) i gjengivelsesprogramvaren bilde. Lagre den som .ims før du fortsetter. Angi alle parametrene på kontrollen vev og bruke disse til alle bilder. Ingen flere endringer er tillatt.
  2. Bruke volumknappen for surface rekonstruksjon av levedyktig vev (calcein farging) (supplerende figur 1A) og knappen flekker for død celle kjerner (supplerende figur 1 H). Når gjengivelse én kanal, slå den andre kanalen i justering visningsvinduet.
  3. Start ved å gjengi volumet av viktige vev: Konfigurer kanalen av overflaten, behandle hele bildet, sett den glatte faktoren til 0,5 µm og bruke absolutte intensitet for terskelen (supplerende figur 1B, C). Trykk den blå pilen fremover.
  4. Justere absolutt intensitet terskelen rekonstruert lydstyrken støy og bakgrunn intensitet skal trekkes. Overflaten overlegg vises i grått og nøyaktigheten av dekning bør være sjekket (supplerende figur 1 d). Etter endt justeringen, trykker du den blå pilen fremover. Mesteparten av tiden er dette trinnet nødvendig for beregning av innstillingene. Hvis programvaren ikke er i stand til å beregne volumet øker glatt faktoren.
  5. I det siste trinnet, velge et filter. Bruk sphericity-filteret (med ca 10 µm) overflate gjengivelse til å filtrere ut makrofager i alveolar plass (supplerende figur 1E). Trykk den grønne fremover.
  6. Optisk justere produksjon image og eksportere statistikk som XLS-filer. Det totale volumet (sum) brukes for videre analyse (supplerende figur 1F, G). Lagre innstillingene og bruke dem for alle ytterligere analyser av z-stabler tatt på samme dag med samme cLSM innstillinger (supplerende figur 1I).
  7. Rekonstruere den røde kanalen (flekker) for død celle kjerner. Tilfeldig måle prikk-størrelse i µm skalering i vinduet overgå; prikk-størrelse er ca 5 µm. merke Enable og angi dot. Kontroller om alle prikkene er merket og hvert punkt telles bare én gang. Korrigere manuelt om nødvendig (supplerende figur 1B, H, J). Trykk den blå pilen fremover.
  8. Trykk grønn frem for å la programmet beregne/telling antall flekker i henhold til parameterne satt og eksportere resultatet som XLS-fil (Supplerende figur 1 K, L, M). Angir antall beregnede døde celle kjerner i forhold til volumet av viktige vev for grafisk eller statistisk analyse av bildet.

9. måling av cytokiner og Chemokines i menneskelig PCLS

Merk: Immunrespons cytokin og chemokine kan måles extracellularly kultur nedbryting og intracellulært vev lysates etter inkubasjon. ELISA måles i duplikater i en 96-brønns plate med 100 µL/godt.

  1. Forberede såpevann 1% ved å blande 5 mL av vaskemiddel med 495 mL buffer. Løsningen kan lagres på RT i flere måneder.
  2. Bland 1% såpevann med protease hemmer (PI) i forholdet 1:500. Den nødvendige mengden avhenger på kultur plate; Bruk for eksempel 500 µL/godt for en 24-vel plate. En vel, blande 1 µL av PI med 499 µL av rengjøringsmiddel.
  3. Forberede rør med 1 µL av PI løsningen og samle 500 µL av kultur supernatant i disse rørene. Umiddelbart bytte ut mediet i 24-vel plate av 500 µL såpevann inneholder PI som forberedt i trinn 9.2. Lyse vev 1t ved å plassere 24-vel platen i på 4 ° C. Pipetter vev lysate i et nytt rør og lagre disse rørene ved-80 ° C til videre analyse.
    Merk: ELISA protokollen avhenger sterkt på produsenten og produsentens anvisninger skal følges. En standardprotokoll for ELISA er beskrevet nedenfor.
  4. Utføre ELISA for å måle cytokin nivåer i supernatant eller lysate i henhold til produsentens instruksjoner. For å måle IL-1α og TNF-α, pels a96-vel plate av pipettering 100 µL fange antistoff (for fortynning følger produsentens instruksjoner) og ruge over natten på RT.
  5. Klargjør vaske bufferen ved oppløsende en vaske bufferen tablett i 1 L bidistilled vann. Fjern fange antistoff og Pipetter 400 µL vaske bufferen i hver brønn. Erstatte dette volumet tre ganger. Blokkere platen ved å legge til blokkering løsningen (f.eks1% BSA i buffer løsning, i henhold til produsentens instruksjoner). Ruge på RT 1t.
    Merk: Standard kommersielt tilgjengelig ELISAs krever 2 x 100 µL av vev supernatant eller lysate. Prøver bør være tinte gang og like før bruk. Avhengig av følsomheten til analysen og utgitt cytokin, må prøver fortynnes før mål. Derfor fortynne eksemplet i reagensen levert av analysen.
  6. Fjerne blokkering løsningen og legge fortynnede prøver for standardkurven (for fortynning følger produsentens instruksjoner) og 100 µL av vev supernatant eller 100 µL av vev lysate i duplikater samlet i trinn 9.3. Inkuber 2 h på RT.
  7. Fjern prøver og Pipetter 400 µL vaske bufferen i hver brønn. Erstatte dette volumet tre ganger. Pipetter 100 µL biotinylated gjenkjenning antistoff (for fortynning følger produsentens instruksjoner) og Inkuber 2 h på RT.
  8. Fjern antistoff og Pipetter 400 µL vaske bufferen i hver brønn. Erstatte dette volumet tre ganger. Legge til 100 µL/godt av HRP-merket streptavidin (for fortynning følger produsentens instruksjoner) og Inkuber etter 20 min på RT (Sjekk produsentens instruksjoner).
  9. Fjern streptavidin og Pipetter 400 µL vaske bufferen i hver brønn. Erstatte dette volumet tre ganger.
  10. Legg 100 µL av underlaget (anbefalt av produsenten) og ruge for 20 min i mørket (Sjekk produsentens instruksjoner).
    Merk: Dette trinnet er lys-sensitive. Unngå eksponering av underlaget og plate.
  11. Stoppe reaksjonen ved å legge til 50 µL stopp løsning (1 H M2SO4). Måle absorpsjon av hver brønn ved 450 nm (referanse: 570 nm) bruker en microplate reader. Trekke opptaket på 570 nm fra 450 nm.
    Merk: Ubehandlet og/eller kjøretøy vev kontroller tjene som negative kontroller. Bruk riktig stimulering (f.eks100 ng/mL lipopolysakkarid (LPS)) for å indusere en immunrespons i lungevev, som en positiv. Inkuber to brønner med to FORETAK per brønn med 100 ng/mL LPS i kultur medium, for eksempel 24 h, og samle nedbryting og vev lysate som beskrevet i trinn 9.3.
    Merk: Målt resultatene er akseptert, hvis absorpsjon av høyeste standard er lik eller over 1.0; ellers må måling gjentas. Standardkurven bør følge sigmoidal dose-respons kurve montering.
  12. Cytokin konsentrasjoner (pg) bestemmes av ELISA i trinn 9.11 normalisert den totale protein innhold i vev lysate av hvert utvalg (se del 10).

10. måling av totale proteininnhold menneskelig PCLS

Merk: PCLS må være lysed for å måle totale protein konsentrasjon. Vev lysates fra trinn 9.3 brukes for dette trinnet. Analysen utføres i en flat 96-brønns plate med 25 µL/godt av vev lysate, pipetted i duplikater.

  1. Forberede en 7-punkts BSA standard med BSA konsentrasjoner av 2000 µg/mL, 1500 µg/mL, 1000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL og 125 µg/mL. Bruk 25 µL i duplikater for hver standard og bruk 25 µL buffer løsning som en tom på en 96-brønns plate (bruk en tallerken med en plate cover).
  2. Pipetter 25 µL av lysates (se trinn 9.3) fra hver brønn i duplikater i en 96-brønns plate. Totalt er 50 µL av hver godt nødvendig. Forberede arbeider reagensen BCA løsning ved utvannende BCA reagens B 1:50 i BCA reagens A. For en 96-brønns plate bruker 400 µL til reagensen B og 20.000 µL til reagensen A.
  3. Nøye Pipetter 200 µL av arbeider reagensen i hver brønn, unngå luftbobler. Plasser platen på en orbital shaker (150 rpm) for 30 å sikre riktig blanding lysates og arbeider reagens og sette en plate cover på tallerkenen. Inkuber platen på 37 ° C i 30 min i mørket. Måle absorpsjon av hver brønn på 540-590 nm likner en microplate.
    Merk: Måleresultatene godtas, hvis absorpsjon av høyeste standard BSA er lik eller over 0,8; ellers må måling gjentas. Standardkurven bør følge sigmoidal dose-respons kurve montering.
  4. Beregne standardkurven med en 4-parameteren Marquardt ligningen etter subtraksjon av tomt analyse. Beregn protein konsentrasjonen av ukjent prøver ved hjelp av standard kurve.

Representative Results

Med metoden nåværende forskning var menneskelige PCLS forberedt og utsatt for fem konsentrasjoner av industrielle stoffer å vurdere kjemisk indusert immunmodulerende effekter i menneskelig lunge materiale. Lungevev ble eksponert under neddykket forhold som permanent kultur for 24 h. toksisitet ble vurdert av måling av utgitt LDH, mitokondrie aktivitet og mikroskopiske levedyktighet flekker. I tillegg total proteininnhold for normalisering og pro-inflammatoriske cytokiner ble målt. Mulig inhibitoriske konsentrasjon (IC) 75 verdier ble beregnet av ikke-lineær sigmoidal kurve montering. Positiv referanse rusmidlene, vaskemiddel for cytotoksisitet og LPS for medfødte cytokin responsen, ble brukt for validering av hvert løpe. Logaritmisk transformerte IC75 [µM] verdier (Logg IC50) ble brukt som "irriterende" konsentrasjoner for påfølgende cytokin utgivelsen målinger.

Figur 1 og figur 2 viser fremgangsmåten fylle menneskelige lunge materiale og eksemplarisk H & E farging av menneskelig PCLS. Rutinemessig hygienisk prosedyrer må følges for å unngå negative effekter på helse og sikre sikkerheten til de ansatte håndtering menneskelige lunge materialet. Teknikken krever opplæring og praksis. Erfarne patologer som skiller ulike regioner (små lobes og subpleural versus mer sentralt) og syke versus rask arealer er nødvendig for å evaluere patologisk menneskelige lunge materialet. Den genererte menneskelige PCLS bør brukes for utarbeidelse av H & E-farget tynne snitt, som kan bli re-vurdert av en patologen. Denne fremgangsmåten hjelper brukere med å få praksis i kresne ulike syke områder og steder i lungene.

Figur 3 viser måleresultatene LDH og WST-1 aktivitet i menneskelig PCLS etter 24-timers inkubasjon med SLS. Ubehandlet middels kontrollen uten SLS vist på 0 µg/mL SLS er en viktig kvalitet kontroll. Verdier skal under 20% for LDH sammenlignet med vaskemiddel-lysed vev og > 0,7 absorbansen enheter for WST-1 analysen. Disse kvalitetskontroll også tjene som indikatorer på utilstrekkelig vev levedyktighet. Responsen av menneskelig vev mot rengjøringsmiddel, som en effektiv giftige stoffet, må inkluderes som positiv. Det bør resultere i en økning av 300-500% (> 2.0 absorbansen enheter) av LDH sammenlignet med ubehandlet vev og verdier < 0,1 absorbansen enheter for WST-1 analysen. SLS resulterte i en doseavhengig reduksjon av cellen levedyktighet målt ved en økning i LDH og en nedgang på metabolsk aktivitet i WST-1 analysen i konsentrasjoner > 87 µg/mL. Sigmoid konsentrasjon-respons modell ble montert på dataene, slik at det er mulig å beregne IC75 eller IC50. Disse verdiene kan senere brukes til å velge konsentrasjoner for cytokin og chemokine nivåer: i svært giftige konsentrasjoner vanligvis ingen eller bare redusert cytokiner og chemokines kan oppdages. Det anbefales derfor ikke giftig eller bare litt giftig konsentrasjoner (IC75). Det er viktig å merke seg her at den forventede økningen i LDH aktivitet i cellekultur supernatant er ofte påvirket av brukte stoffet21. Ofte oppstår forstyrrelser mellom substans og enzym aktiviteten, fører til feiltolkning av resultater hvis LDH analysen var bare cytotoksisitet analysen brukes. Dermed er det viktig og nødvendig å utføre flere cytotoksisitet analyser for å få pålitelige og gyldige resultater. Videre bør det nevnes at sensitiviteten av LDH og WST-1 analyser er svært sammenlignbare.

I Figur 4demonstrere mikroskopiske levedyktighet bilder av PCLS reaksjonsevne av menneskelig vev til vaskemiddel som en effektiv giftig. Resultatene er svært nyttig å bekrefte andre levedyktighet data, men dette krever ekstra utstyr. Toksiske effekter er visuelt vurdert ved evaluering av calcein-positive vev sammenlignet med EthD-1-positiv celle kjerner. Tilfeldig valgt segmenter innen parenchyma resulterer generelt sett i sammenlignbare data, mens luftveiene eller blod fartøy bør unngås, som større hulrom kan forskyve resultatene. Erfaring og mikroskopiske innstillingene beskrevet ovenfor, måles en gjennomsnittlig volum mellom 1,5 x 106 og 5 x 106 µm3 av kontroll vev. Verdiene avhenger av lunge materialkvalitet, PCLS kvalitet, og også sykdommen av lunge vev donor. Selv om levedyktigheten til menneskelig lungevev varierer mellom givere, bør antall døde celle kjerner sammenlignet med levedyktig vev ikke overstige 15% av kontrollen vev. Hvis død celle kjerner finnes hovedsakelig i kontrollen vev, men bør eksperimentet forlates.

Figur 5 viser representant data for immunmodulerende effekten av HClPt og SLS på menneskelig lungevev. De pro-inflammatoriske cytokiner IL-1α og TNF-α er biomarkers av betennelse, indikerer begynnelsen av inflammatoriske prosesser etter eksponering for stimulerende stoffer. Begge cytokiner ble målt med ELISA. Ekstracellulære IL-1α er vanligvis lav i menneskelige PCLS, mens intracellulær IL-1α når nivåene på 1000 pg/mL og over. En nedgang i intracellulær IL-1α angir pågående cytotoksiske prosesser - og er mest observert etter eksponering for menneskelig PCLS kjemikalier. Hvis vev stimuleres med LPS, en aktivator av det medfødte immunsystemet og som sådan positiv behandling styre, så de fleste av de indusert IL-1α kan bare oppdages intracellulært etter 24 timer. Derimot kan TNF-α sekresjon av LPS stimulering hovedsakelig måles extracellularly. Bruk av en egnet positiv kontroll, for eksempel LPS, demonstrerer gyldigheten av en metode. Med metoden nåværende forskning ble menneskelige PCLS utsatt for tre konsentrasjoner av HClPt (32, 64 og 125 µg/mL) eller to konsentrasjoner av SLS (1 og 10 µg/mL) for 24 h. cytokin sekresjon ble bestemt som en sum av den ekstracellulære og intracellulære cytokiner normalisert til totalt protein konsentrasjoner som vist i figur 5. Det er verdt å nevne her at BCA analysen brukes vanligvis for fastsettelse av totale proteininnhold, men også gjenspeiler stoffinduserte cytotoksisitet. Derfor, i svært giftige konsentrasjoner totale proteininnholdet kan ikke brukes for normalisering av cytokin data. Utskillelsen av IL-1α betraktelig fra 263 ± 38 pg/mg 887 ± 216 pg/mg og TNF-α fra 263 ± 38 pg/mg til 1,160 ± 286 pg/mg (figur 5A, B). Videre er LPS-indusert IL-1α og TNF-α sekresjon presentert i forhold til en unstimulated vev kontroll. Induksjon av pro-inflammatoriske cytokiner av patogen-forbundet molekylær mønster, for eksempel LPS, viser gyldigheten til en metode og er sterkt anbefalt å brukes når du arbeider med menneskelige PCLS for å undersøke immunmodulerende effekter. For mer informasjon om HClPt og SLS, se studien av Lauenstein et al. 21

Figure 1
Figur 1 : Prosedyre for å fylle menneskelige lunge materiale. Menneskelige lungene er forberedt umiddelbart etter eksisjon. Lungene bør lagres ved romtemperatur for konsekvent fylling med agarose og å unngå plutselige agarose polymerisasjon under fylling. Lungene er plassert vannrett med lobes spredt ut for en optimal visning på viktigste bronchus eller bronchi (A & B for nærbilder på bronchus). Bronchi er cannulated med en fleksibel silikon rør og fast med klemmer (C). Etter fylling prosedyre og agarose polymerisasjon i vevet skåret utdannet patologer lunge i skiver av om 3-5 cm tykkelse (D). Fra disse sektorene tilberedes sylindriske vev kjerner (Ø f.eks, 8 mm) med et coring verktøy (E). Disse vev kjerner kuttes med en vev slicer i PCLS, som overføres umiddelbart til middels-fylt Petri retter for inkubasjon under normal celle kultur forhold (E). Etter flere vask trinn i PCLS overføres til celle kultur plater (f.eks, 24-vel plate med to PCLS per godt og 500 µL medium) for å fjerne gjenværende celle rusk og befridd cellen meglere (F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Bestemmelse av helsetilstanden til menneskelige PCLS ved H & E farging. PCLS i dette bildet, utarbeidet fra en donor med en lunge svulst, viser intakt lungevev med alveolar parenchyma, ytre luftveier (*), og blodkar (pilspisser) i oversikten (A). Ved høyere forstørrelse, gjennomføre airways med intakt tungeformet åndedretts epitel (pilspisser) (B), en intakt alveolar struktur med levedyktig pneumocytes, inkludert en kapillær med mange erytrocytter (pilspisser) (C), alveolar områder som inneholder alveolar makrofager (CD68 immunohistochemistry) (D), samt blod fartøy med intakt endotelet (CD31 immunohistochemistry) (E) kan observeres. Bare svulsten uten vev ble brukt til PCLS, det er derfor ingen macroscopically syke områder er synlig. I motsetning til PCLS forberedt fra givere med andre lungesykdommer, som emfysem eller fibrosis, alveolar strukturen ikke forstyrres og PCLS er bare litt slitt på den ytre grensen, sannsynligvis på grunn av forberedelsene. Skala stolper angir 1000 µm (A) og 50 µm (B-E), henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Bestemmelse av cytotoksisitet indusert av SLS i menneskelige PCLS, målt ved lekkasje av enzymet LDH til kultur medium (A) og tap av metabolsk enzym aktivitet vurdert med fargestoff WST-1 (B). Menneskelige PCLS ble utsatt for økende konsentrasjoner av SLS. Sigmoid konsentrasjon-respons modell ble senere montert på dataene, slik at IC75 eller IC50 verdier (inhibitoriske konsentrasjon på 25% og 50% reduksjon av cellen levedyktighet) kan være beregnet (høyre tall). Dataene presenteres som betyr ± SEM, n = 3-5. Absorbansen LDH analysen ble målt på 492 nm (referanse på 630 nm) og WST-1 analysen ved 450 nm (referanse på 630 nm). Data ble tilpasset og endret fra Lauenstein et al. 21 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Representant bilder av tredimensjonale mikroskopiske flekker og bilde gjengivelsen av menneskelig PCLS. Levende vev kontroll og responsen til vev vaskemiddel, som en effektiv giftige stoffet, vises etter farging av menneskelig PCLS med calcein AM (gul) og EthD-1 (rød). Stabler av 30 µm ble tatt med en 10 X målsetting (A) og gjengis (B). Baren skala angir 100 µm. eksitasjon bølgelengder 488 nm og 543 nm utslipp filtre BP 505-550 nm og LP 560 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Ammonium hexachloroplatinate (HClPt)-indusert IL-1α og TNF-α sekresjon i menneskelig PCLS etter 24 h eksponering. PCLS ble utsatt for tre konsentrasjoner (32 µg/mL, 64 µg/mL og 125 µg/mL av HClPt) og to ulike konsentrasjoner (1 µg/mL og 10 µg/mL) av SLS. Ekstracellulære og intracellulær IL-1α (A) og TNF-α (B) ble bestemt av ELISA og normalisert til totalt proteininnhold. For å vise gyldigheten av metoden vises en positiv aktivator av det medfødte immunsystemet, LP-plater, som en referanse for intracellulær IL-1α (A) og ekstracellulære TNF-α (B) utgivelse, normalisert totale protein innhold. Dataene presenteres som betyr ± SEM, *p < 0,05 og ***p < 0,001; HClPt og SLS: n = 9, IL-1αLPS: n = 5, TNF-αLPS: n = 4 i teknisk duplikater (Mann-Whitney test). Dette tallet har blitt endret fra Lauenstein et al. 21 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1: detaljert beregningsorientert behandling for bilder av mikroskopiske levedyktighet flekker bruker gjengivelsesprogramvaren. Drift fremgangsmåte for bildeanalyse av opplastede LSM bilder for overflate gjengivelsen av calcein-farget levedyktig vev (A-G, jeg) og spot påvisning av ethidium homodimer-farget celle kjerner (H, J-M). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 2
Supplerende figur 2: oversikt over beregningsorientert bildeanalyser med mikroskopiske levedyktighet farging av menneskelig lungevev. Levedyktig vev (gul) ble analysert av overflaten gjengivelse (B-jeg) og døde celle kjerner (rød) ble oppdaget av spot gjenkjenning (J-P). Øyeblikksbilde-modus ble brukt til å eksportere avbildningen (Q). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Menneskelige PCLS teknikken er godt etablert i vårt laboratorium. Utredningen gir en beskrivelse av denne teknikken og bruken for toksisitet testing av stoffer i lunge vev ex vivo. Generelt relaterte noen laboratorium bruker denne teknikken bør søke å sette opp en analysen definisjonen av kvantifiserbare områder, estimering av variabilities og kvalitetskontroll garanterer gyldigheten av eksperimentet. Mulig standard prosedyrer kan være, for eksempel Gjenta hvert sluttpunkt, f.ekscytotoksisitet analysen, i minst tre biologiske givere (personlige tekster) med et minimum av to til tre tekniske replikat per eksempel inkludert positiv og negativ referanser. Laboratoriepersonell bør trenes til å øke analysen konsistens og minimere analysen variasjon.

Endepunktene brukes ofte til å vurdere immunmodulerende effekter av stoffer på lungevev inkluderer cytotoksisitet mål med ulike analyser (f.eks, LDH analysen, WST-1 analysen, mikroskopiske flekker analysen), cytokin utgivelsen søk, så vel som endringer i profilen for expression og karakterisering av endringer i mobilnettet bestander av immunohistopathological metoder6. Videre finnes det teknikker som beskriver visualisering av celler, for eksempel lunge dendrittiske celler, i murine PCLS28 kan også overføres til menneskelig PCLS og kan dermed gi mer detaljert innblikk i mobilnettet sammensetningen før og etter behandling med antatte cytotoksiske stoffer.

Denne grunnleggende protokollen og teknikk for utarbeidelse av menneskelig lunge vev deler sammenlignes teknikker som har blitt beskrevet i publikasjoner29. Kort sagt, hentes orgel materialet fra pasienter som lider av live-truende kroniske sykdommer som lungekreft, som måtte opereres for resection eller transplantasjon. Studiene må godkjennes av den lokale etikk. Pasientenes informert skriftlig samtykke er nødvendig. Definere en arbeidsflyt mellom klinikk og laboratoriet er viktig og krever kommunikasjon og definisjon av grensesnitt og infrastruktur mellom begge områder. Menneskelige lunge materiale må behandles direkte etter eksisjon å bevare levedyktighet av vev. Det er verdt å nevne at teknikken beskrevet her for menneskelig PCLS kan brukes til både unge og gamle lungene og friske og syke lungene. I USA, for eksempel er det mulig å få lungene fra sunn orgel givere som døde i ulykker eller som organer er avvist for transplantasjon.

Det første kritiske trinnet i protokollen er inflasjonen airways og omkringliggende parenchyma med agarose løsning. Dette trinnet er nødvendig å størkne veldig bløtvev for påfølgende kutting prosedyren. Kvaliteten på menneskelig lunge materiale, basert på sykdom bakgrunnen, er kritiske her. Bare lobes med intakt pleura kan fylles. Sluttstadiet svulster i bronchus hindre noen ganger fylling prosessen. Før oppblåsing menneskelige materialet, må temperaturen på agarose løsningen kontrolleres grundig. For mye blod (eller andre væsker, eksudater) i menneskelige lungevev vil resultere i uønsket fortynning av agarose og vil påvirke polymerisasjon prosessen. Etter inflasjon av lungevev og gelling av agarose på is, er lungene kuttet i seksjoner av 200 til 300 µm tykkelse. Konsistensen av vev er svært viktig. Hvis vevet er for myk, er kutting av like deler vanskelig. Selv om de samme mikrotomen er angitt for hver giver, tykkelsen på sektorene mellom givere kan variere, grunn av personlige forhold og endringer under den blåse prosessen for hver lunge. Ikke-homogen fylling av vev vil resultere i forskjellige skive tykkelser. Istedet for måling og standardisere tykkelsen på skiver, kan måling av totale proteininnhold brukes til å overvåke indirekte lunge skive tykkelser. Flere sluttstadiet sykdommer hemme kutting prosessen; f.eksblod fartøy er ekstremt fortykket i pulmonal hypertensjon og fibrotiske vev kan være så stiv at kutting av vev sylindere er neppe mulig og mikrotomen bladet må skiftes ofte.

Etter forberedelse av menneskelig PCLS og intensiv vask trinn, som er nødvendig for å fjerne celle rusk og utgitt enzymer, vev inndelinger kan brukes for eksperimenter29. Menneskelig PCLS er kultivert under normal celle kultur forhold og utsatt, for eksempel for kjemikalier, narkotika eller lipopolysaccharides. Sporadiske forurensning av PCLS på grunn av (Ukjent) infeksjoner er en spesialutgave i kulturen i menneskelig lunge materiale. Vev kulturer viser infeksjoner må kastes og utstyret må desinfiseres grundig. Romlig skille mellom laboratorium steder brukes for utarbeidelse på den ene siden og dyrking kan derimot bidra til å unngå kryss-infeksjoner. Når det gjelder utstyr, mikrotomen kan lekke og hex skruer kan føre til motor skade og stoppe av blade bevegelse. Ikke alle deler av sliceren er laget av rustfritt stål, og så det vil oksidere hvis ikke tørket umiddelbart endre rengjøring. For å overvinne utstyr problemer, kan det være nødvendig å ha minst én sikkerhetskopieringsenhet.

I tidligere publikasjoner, er agarose rapportert å være vasket og fjernet under intensiv vask trinn etter klargjøring. Faktisk, denne er ikke mulig, agarose fjernes ikke. For fullstendig fjerning av agarose må det være re smeltet ved høye temperaturer, som vil ødelegge vev. Agarose i alveoler og airways forstyrrer ikke beskrevet endepunktene. Andre endepunktene kan bli påvirket av tilstedeværelsen av agarose (se også begrensninger). Behovet for å utarbeide veldig ferskt vev deler har understrekes, som vev levedyktighet er viktig i kultur. Bronchoconstriction er ikke en gyldig parameter for levedyktighet. Vi anbefaler å bruke minst to eller tre uavhengige cytotoksisitet analyser sjekke levedyktigheten til de omkringliggende parenchyma; Dette må sjekkes inn hvert eksperiment30. Kvalitetskontroll i cytotoksisitet analyser tjene som indikatorer på utilstrekkelig vev levedyktighet. Det anbefales derfor å vurdere responsen til vev, for eksempel til en effektiv giftig som et vaskemiddel i alle cytotoksisitet analyser. Basert på dose-respons kurver, laveste og høyeste verdi absorpsjon må defineres for cytotoksisitet analyser og møtte for etterfølgende eksperimenter. Ytterligere modifiseringer å protokollen avhenger hovedsakelig brukt kjemikalier og endepunktene på interesse. Anvendelse av uløselig eller svært reaktive kjemikalier er begrenset. Den høyeste løsemiddel konsentrasjonen for DMSO er begrenset til 1%. Høyere konsentrasjoner kan brukes, men kan resultere i markert utgivelsen av pro-inflammatoriske cytokiner, slik som IL-8. På den annen side, kan stimulans brukes være relativt svake. I dette tilfellet kan du øke mengden vev fra to til fire skiver per brønn. Dette begrenser levedyktigheten til 24 h.

En stor begrensning av menneskelig PCLS er at i Tyskland de kan bare være forberedt fra syke mennesker lunge materiale. Pasienter som gjennomgår kirurgi er vanligvis eldre enn 50 år og 80% av pasienter som lider av lungekreft er eller pleide å være røykere. Medisinering av pasienter, som glukokortikoider, kan også påvirke utfallet av eksperimenter ved hjelp av menneskelig vev. Derfor er det viktig å: i) validere hvert eksperiment av positiv referanser bekrefter levedyktighet, funksjonalitet og følsomhet av personlige vev og ii) kryss-validere resultatene med sunn, ikke-syke, middelaldrende lungevev fra forsøksdyr (ikke-menneskelige primater som cynomolgus og, hvis mulig, mus, rotte, marsvin). Jo bedre patologi score av syke vev, jo bedre de eksperimentelle resultatene. Tungt syke vev kan neppe brukes og ofte viser begrenset levedyktighet, mangelfullt lav eller svært høy cytokin nivåer, bakterier og sopp infeksjoner og mindre bronchoconstriction. Giver-til-donor variant blir høyere sammenlignet med resultatene fra forsøksdyr, gjenspeiler personlige variasjon av mennesker. Dette er imidlertid ikke en begrensning. som nevnt ovenfor, i andre land (f.eks, USA) er det mulig å få sunn lungene fra avdøde orgel givere avvist for transplantasjon. Responsen til vevet har blitt godt beskrevet for den første opptil 48 timer i akutt eksponering eksperimenter. Levedyktighet og funksjonaliteten av vev reduseres etter mange dager med kultur eller lagring på-80 ° C. Det er mulig å kultur menneskelige lungevev for opp til ca 14 dager. Levedyktighet fortsetter samtidig; men er en økning i variasjon, samt tap av funksjonalitet for flere celle populasjoner, som makrofager, i vevet observert, som resulterer i begrenset cytokin utgivelsen svar mitogens. En annen begrensning for noen endepunkter er tilstedeværelsen av agarose vev, hindre, for eksempel isolering av høy kvalitet og tilstrekkelig mengder RNA31 eller utarbeidelse av encellede suspensjoner for etterfølgende flowcytometri og phenotyping celler. Muligheten til å få mekanistisk innsikt i én celle svar og funksjonaliteten er begrenset.

Organotypic vev modeller, som menneskelige PCLS, anses å ha en høy effekt på grunnleggende og ikke-klinisk forskning. Menneskelige lunge materiale har en biologisk sammensetning som tett gjenspeiler vanlige orgel arkitektur. Den inneholder for eksempel bolig alveolar og bronkial epitelceller, glatte muskelcellene, fibroblaster, endotelceller, nerve fiber og makrofager. Vevet er levedyktig cellene reagerer flere stimuli. Nerve fibre, selv om kuttet, kan lokalt aktiveres, fører til terminal refleks svar14. Derfor tilbyr denne ex vivo modellen muligheten til å studere mobilnettet medfødte immunreaksjoner, forsvar svar, cytokin signalering og induksjon av cellen overflate markører. Flere forbedringer i teknikk, dyrking og validering av endepunktene tillate bruk av menneskelige PCLS i translasjonsforskning vitenskap. Eksempler på fremtidige tilnærminger: i) validering av nye mål i menneskelig lungevev, ii) vurdering av immunreaksjoner etter eksponering, for eksempel kjemikalier, narkotika, nanopartikler, etc., iii) tilskudd av lungevev med immunceller, slik som T-lymfocytter, iv) identifikasjon og endring av molekylær mønster, for eksempel etter eksponering for åndedretts allergifremkallende stoffer, sykdom-inducing stoffer eller aktive forbindelser hemme baner; Videre v) airway ombygging og vi) neuronal regulering32. Det vitenskapelige feltet er interessert i disse nåværende og fremtidige tilnærminger med PCLS. I tillegg finnes det en rekke ulike utviklingstrekk som vil bidra til å forbedre PCLS teknikken, som cryo-bevaring20og vev strekker33 å etterligne den naturlige bevegelsen av vev under puste eller mekanisk ventilasjon.

Hovedfordelen med menneskelige PCLS sammenlignet med andre 3D-modeller er tilstedeværelsen av immunceller og nerve fibre. Eksperimenter kan også utføres i mus, rotte og ikke-menneskelige primater, som er dyrearter som fortsatt brukes oftest i farmakologi og toksikologi. Kompleksiteten i menneskelig lungevev støtter oversettelsen av resultater fra dyr til menneske og i vitro in vivo. I forbindelse med eksisterende alternativ analyser for identifikasjon av respiratoriske allergifremkallende stoffer, menneskelig PCLS er svært komplekse og tillater ikke innsikt i én celle svar. Likevel, mikroskopi og flyt cytometri kan gi informasjon om mobilnettet svar, hvis høyre mobilnettet markøren brukes i kombinasjon, for eksempel med apoptose, nekrose eller intracellulær markører. Det er publisert analyser som er godkjent og rapportert å ha vært brukt til å identifisere åndedretts allergifremkallende stoffer. Men er fremskritt i bruk av PCLS med alle sine fordeler over encellede analyser å bidra i den forstand at teknikken kan bli brukt for høy gjennomstrømming screening, som beskrevet av Watson et al. 34 de utviklet en høy gjennomstrømming screening analysen å forutsi airway toksisitet i murine cryo bevarte PCLS. Med miniatyriserte 96-brønnen PCLS format oppdaget de lignende readouts i murine lavage væske, gjør PCLS en mulig høy gjennomstrømming analysen.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre. Fraunhofer element er en uavhengig offentlig non-profit forsknings-organisasjon for anvendt forskning, utfører kontrakt forskning på vegne av bioteknologi, farmasøytisk, kjemisk og kosmetikk industrien. Finansiering av instituttet kommer fra nasjonale og internasjonale offentlige prosjekter.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Lan Lauenstein for sitt pre arbeid om alternative testing strategier for risikovurdering med menneskelige PCLS. Noen av forskningen ble støttet av et stipend fra Europakommisjonen i 6th framework programmet SENS-IT-IV "Romanen Testing strategier for In Vitro vurdering av allergener".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm A. Hartenstein (Leipzig, Germany) SS04
Syringe Faust Lab Science (Klettgau, Germany) 9.410 050
Coring tools custom-made custom-made
Trimming Blade Handle (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205530001
Trimming Blades (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205500000
Microtome: Tissue Slicer Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) 303400-ADPT Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)
Microtome blade Wilkinson Sword (Solingen, Germany) ENR-4027800011506
Tissue culture dishes Sigma (München, Germany) Z666246-420EA
Cell strainer filter (100 µm Nylon) Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) BD352360
Inoculation loop Copan Diagnostics (Murrieta, USA)  CD176S01
TPP Tissue culture plates 24wells Sigma (München, Germany) Z707791-126EA
Cassette Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 1000957
Nunc MaxiSorp flat-bottom Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) 44-2404-21
Nunc MicroWell 96-Well  Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 260836
Confocal Microscope Zeiss (Jena, Germany) Confocal LSM Meta 510
Image rendering software Bitplane AG (Zürich, Switzerland) IMARIS 7.6
LSM Image Browser Zeiss (Jena, Germany)
Multiwell-Reader Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) Tecan infinite F200Pro Plate Reader
Plate shaker Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) KM-2 Akku
BenchMark ULTRA Ventana Medical Systems (Tucson, USA) Automated IHC/ISH slide staining system
Assays
Cell Proliferation Reagent WST-1 Roche (Basel, Switzerland) 11644807001
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche (Basel, Switzerland) 11644793001
Microscopical vitality staining  Invitrogen (Carlsbad, USA) L-3224 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit
BCA Protein Assay Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 23225
ELISA assay kit R & D systems various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) DuoSet
Reagents
Agarose, low gelling temperature  Sigma (München, Germany) A9414-100G
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) Sigma (München, Germany) E2888-500ML
Penicillin and streptomycin Lonza (Verviers, Belgium) 17-602E
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) Gibco (Darmstadt, Germany) 11039-047 Culture medium
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) Lonza (Verviers, Belgium) BE17-513F   Buffer solution
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma (München, Germany) A9647-500G
Detergent Sigma (Saint Louis, USA) X100-100ML Triton X-100
Washing buffer Merck (Darmstadt Germany) 524653  0.05% Tween 20 in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. D'Amato, G., et al. Climate change, air pollution and extreme events leading to increasing prevalence of allergic respiratory diseases. Multidiscip Respir Med. 8, (1), 12 (2013).
  2. Pawankar, R., et al. State of world allergy report 2008: allergy and chronic respiratory diseases. World Allergy Organ J. 1, (6), Suppl 4-17 (2008).
  3. Hartung, T., Daston, G. Are in vitro tests suitable for regulatory use. Toxicol Sci. 111, (2), 233-237 (2009).
  4. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, (7252), 208-212 (2009).
  5. Balls, M., Straughan, D. W. The three Rs of Russell & Burch and the testing of biological products. Dev Biol Stand. 86, 11-18 (1996).
  6. Sewald, K., Braun, A. Assessment of immunotoxicity using precision-cut tissue slices. Xenobiotica. 43, (1), 84-97 (2013).
  7. Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Hum Exp Toxicol. 13, (7), 466-471 (1994).
  8. Ressmeyer, A. R., et al. Characterisation of guinea pig precision-cut lung slices: comparison with human tissues. Eur Respir J. 28, (3), 603-611 (2006).
  9. Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309, (10), 1219-1228 (2015).
  10. Koziol-White, C. J., et al. Inhibition of spleen tyrosine kinase attenuates IgE-mediated airway contraction and mediator release in human precision cut lung slices. British journal of pharmacology. 173, (21), 3080-3087 (2016).
  11. Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. J Vis Exp. (83), e50970 (2014).
  12. Lamb, D. J., et al. Bl 1002494, a Novel Potent and Selective Oral Spleen Tyrosine Kinase Inhibitor, Displays Differential Potency in Human Basophils and B Cells. J Pharmacol Exp Ther. 357, (3), 554-561 (2016).
  13. Leus, N. G., et al. HDAC 3-selective inhibitor RGFP966 demonstrates anti-inflammatory properties in RAW 264.7 macrophages and mouse precision-cut lung slices by attenuating NF-kappaB p65 transcriptional activity. Biochem Pharmacol. 108, 58-74 (2016).
  14. Schleputz, M., et al. Neurally mediated airway constriction in human and other species: a comparative study using precision-cut lung slices (PCLS). PLoS One. 7, (10), 47344 (2012).
  15. Hess, A., et al. Prevalidation of the ex-vivo model PCLS for prediction of respiratory toxicity. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 32, 347-361 (2016).
  16. Bergner, A., Sanderson, M. J. Acetylcholine-induced calcium signaling and contraction of airway smooth muscle cells in lung slices. J Gen Physiol. 119, (2), 187-198 (2002).
  17. Wohlsen, A., et al. The early allergic response in small airways of human precision-cut lung slices. Eur Respir J. 21, (6), 1024-1032 (2003).
  18. Wu, W., et al. Innate immune response to H3N2 and H1N1 influenza virus infection in a human lung organ culture model. Virology. 396, (2), 178-188 (2010).
  19. Zmora, P., et al. Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS One. 12, (5), 0176597 (2017).
  20. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, (5), 876-881 (2014).
  21. Lauenstein, L., et al. Assessment of immunotoxicity induced by chemicals in human precision-cut lung slices (PCLS). Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 28, (4), 588-599 (2014).
  22. Wild, L. G., Lopez, M. Occupational asthma caused by high-molecular-weight substances. Immunol Allergy Clin North Am. 23, (2), 235-250 (2003).
  23. Di Stefano, F., et al. Occupational asthma due to low molecular weight agents. Int J Immunopathol Pharmacol. 17, (2), Suppl 77-82 (2004).
  24. Buonsante, V. A., Muilerman, H., Santos, T., Robinson, C., Tweedale, A. C. Risk assessment's insensitive toxicity testing may cause it to fail. Environ Res. 135, 139-147 (2014).
  25. Boverhof, D. R., et al. Respiratory sensitization and allergy: current research approaches and needs. Toxicol Appl Pharmacol. 226, (1), 1-13 (2008).
  26. Johansson, H., Albrekt, A. S., Borrebaeck, C. A., Lindstedt, M. The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 27, (3), 1163-1169 (2013).
  27. Brismar, H., Patwardhan, A., Jaremko, G., Nyengaard, J. Thickness estimation of fluorescent sections using a CSLM. Journal of Microscopy. 184, (2), 106-116 (1996).
  28. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells. J Vis Exp. (122), (2017).
  29. Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 246, (3), 107-115 (2010).
  30. Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231, (1), 68-76 (2008).
  31. Niehof, M., et al. RNA isolation from precision-cut lung slices (PCLS) from different species. BMC Res Notes. 10, (1), 121 (2017).
  32. De Proost, I., et al. Purinergic signaling in the pulmonary neuroepithelial body microenvironment unraveled by live cell imaging. FASEB J. 23, (4), 1153-1160 (2009).
  33. Davidovich, N., Chhour, P., Margulies, S. S. Uses of Remnant Human Lung Tissue for Mechanical Stretch Studies. Cell Mol Bioeng. 6, (2), 175-182 (2013).
  34. Watson, C. Y., et al. Screening for Chemical Toxicity Using Cryopreserved Precision Cut Lung Slices. Toxicol Sci. 150, (1), 225-233 (2016).
Vurdering av den cytotoksiske og immunmodulerende effekter av stoffer i menneskelig presisjonsstyrte kutte lunge skiver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neuhaus, V., Danov, O., Konzok, S., Obernolte, H., Dehmel, S., Braubach, P., Jonigk, D., Fieguth, H. G., Zardo, P., Warnecke, G., Martin, C., Braun, A., Sewald, K. Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (135), e57042, doi:10.3791/57042 (2018).More

Neuhaus, V., Danov, O., Konzok, S., Obernolte, H., Dehmel, S., Braubach, P., Jonigk, D., Fieguth, H. G., Zardo, P., Warnecke, G., Martin, C., Braun, A., Sewald, K. Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (135), e57042, doi:10.3791/57042 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter