Summary
クロマチンの緩みは卵割球の進化の潜在性に関与することが表示されます。ただし、クロマチンの緩みを胚の発達の可能性を信頼性の高い指標として使用ことができるかどうかは知られていません。ここでは、クロマチン緩み評価受精卵が生じる完全な言葉こと実験的システムが記載されています。
Abstract
ライブ イメージングは、個体発生時分子事象の分析を可能にする強力なツールです。最近では、クロマチンの緩みや開放性多能性胚性幹細胞の細胞分化に関与する示されています。それは以前を比較した報告された胚性幹細胞と受精卵港の全能性との関連を示唆している非常にゆるめられた chromatin の構造。しかし、今までは、それが解決されていないこの非常に緩和/オープン クロマチン構造は萌芽期の進化の潜在性のために重要かどうか。本研究ではこの仮説を調べる蛍光によって分析されたどの受精卵の写真漂白後の回復の重要な損傷なしに開発することが実験的システムが開発されました。重要なは、この実験システムには、共焦点レーザー走査型顕微鏡に加えて魔法瓶プレート ヒーターのみが必要があります。この研究の調査結果は、写真漂白 (FRAP) 解析は, クロマチンの分子のイベントは完全な長期的開発のために重要かどうかを調査する使用ことができます後の蛍光回復をお勧めします。
Introduction
受精後クロマチン構造を動的に変更し、, クロマチン構造は最終的に確立された1,2。この間、父方の前核の支配的なクロマチン蛋白はヒストンにプロタミンから変更されます。結果クロマチンは精子と女性の卵子 (例えば、ヒストン バリアント組成、ヒストン修飾) いくつかの点で非常に異なる。したがって、形成された胚性クロマチンはその後の胚発生に重要であると考えられます。ただし、長期間にわたって, クロマチン構造の詳細を明らかにするための努力にもかかわらず受精卵の質を評価するまたは彼らのクロマチン構造を分析することによって 1 セル段階で完全な長期的開発を予測する方法はなかった設立。
以前の研究では、受精卵が非常に緩んでクロマチン構造3ある発見します。現在、クロマチンの緩みや開放性は、胚性幹 (ES) 細胞4潜在的な細胞の分化の重要な要因であると考えられています。ES 細胞、本質的に同質性を示さないが、むしろ異種;ES 細胞コロニーのいくつかは一過性高い微分の潜在性の 2 つのセル段階の胚の割球に匹敵するを取得します。この過渡期状態のような 2 つのセルに ES でクロマチン緩みセル 2 細胞期胚5と同等であるかに変更をします。したがって、クロマチンの緩みは、重要である細胞微分の潜在性、それは受精のクロマチンを広く開くことが可能とはココヤシの進化の潜在性の評価に有用なようです。
ライブ イメージングは、以来、このメソッドは、後続の開発とも完全な長期的開発6個体発生時分子事象の分析を可能にする強力なツールです。ライブ イメージングの方法のひとつとして、FRAP 解析は、着床前の胚や ES 細胞3,4,5におけるクロマチンの緩みを確認する使用されています。FRAP 解析による胚性クロマチン緩みを完全な長期的開発に悪影響を及ぼすことがなく分析する場合、1 セル段階の胚の質の評価のための貴重なツールがあります。しかし、この実験法によって完全な長期的発達に及ぼす影響を行った。最近では、ココヤシのクロマチンの緩みを評価する FRAP を用いた実験機が開発されました。これは、受精卵のための新しい観測システムは、ので、ココヤシ FRAP (zFRAP) と名付けられました。zFRAP は完全な長期的開発を批判的に影響しなかったし、されている7は別途報告します。本報告ではこの実験法のプロトコルの説明します。
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Protocol
本研究は、ケアと山梨大学の実験動物の使用のためのガイドの推奨事項に厳密に従って行った。プロトコルは山梨大学の動物実験の倫理委員会によって承認された (許可番号: A24 50)。Tribromoethanol 麻酔下ですべての手術を行った、すべての努力が苦しみを最小限に抑えるために作られました。手順とタイム テーブルの説明された概要はそれぞれ図 1と表 1のとおりです。
1. 調製されたメッセンジャー RNA (eGFP H2B mrnaの生体外のトランスクリプション)
- 30 Uのテンプレート DNA pTOPO eGFP H2B3、7の 5 μ g をリニア化私37 ° C で 50 μ L で一晩します。
- 電気泳動法で完全に消化されるかどうか確認のため消化の DNA の 1.5 μ L を収集します。
- 1.5 μ L と未消化の DNA, 2% の agarose のゲルの井戸の中に染料を読み込むとあり、電気泳動の 3-5 μ L を適用します。
注: 完全に消化して、単一のバンド (約 5 kb) が観察されます。未消化の DNA は、別の位置に表示されるコントロールとして使用されます。
- 1.5 μ L と未消化の DNA, 2% の agarose のゲルの井戸の中に染料を読み込むとあり、電気泳動の 3-5 μ L を適用します。
- 追加 ddH2O の 151.5 μ L、200 μ L 残りのフェノール/クロロホルム/イソアミル アルコール (25:24:1) の DNA を消化します。
- 渦によって精力的にミックスします。
- 15 分の最大速度の遠心分離機します。
- 上清を回復し、クロロホルムの 200 μ L を追加します。
- 渦によって精力的にミックスします。
- 15 分の最大速度の遠心分離機します。
- 上清を回復し、20 μ L の 3 M 酢酸ナトリウムと ethachinmate の 1.5 μ L 追加。
- 渦によって精力的にミックスします。
- 100% エタノールの 550 μ L を追加し、精力的に渦によるミックスします。
- 15 分の最大速度の遠心分離機します。
- 上澄みを廃棄し、その後、70% エタノールでペレットを洗います。
- 5-10 分の蒸発によって沈殿を乾燥させます。
- ヌクレアーゼ フリー水の 8 μ L で沈殿したプラスミド DNA を溶解します。
- プラスミド濃度の評価 (予想される濃度は約 300-500 ng/μ L) の製造元の指示に従って、nanodrop と。
- 製造元の指示に従い、全反応量の 20 μ L のテンプレートとして浄化された DNA の 1 μ g と eGFP H2B をエンコーディング mRNAの in vitro転写を実行します。
- In vitro転写後水の 36 μ L を追加し、(ポリ A) なし、電気泳動による分析合成された mRNA の 56 μ L から 1.5 μ L を回復します。
- 100 μ L 反応量の合成された mRNA のポリ A テーリングを実行するには、製造元の指示に従ってください。
- EGFP H2B の尾 mRNA ポリにリチウム塩化物の沈殿物溶液の 60 μ L を追加し、精力的にミックスします。
- -30 ° c で 30 分間冷やします。
- 15 分の最大速度の遠心分離機します。
- 上澄みを廃棄し、その後、70% エタノールでペレットを洗います。
- 5-10 分の蒸発によって沈殿を乾燥させます。
- 30 分の 55 ° C に加熱することにより、ヌクレアーゼ フリー水の 20 μ L でペレットを溶解します。
- Nanodrop で沈殿した mRNA の濃度を評価します。使用するまでヌクレアーゼ フリー水と-80 ° c ストア 500 ng/μ L に希釈します。
- 最寄りの mRNA 生産; を確認します。対象有無による mRNA の 1 μ L (それぞれ 1.8.1 と 1.12 の手順で得られた) ポリ臭化エチジウム 0.1 mg/mL の 1.5 μ L と 3 μ L の電気泳動分析サンプル読み込み色素混合尾。適用されたボリュームは、5.5 μ だった。
注: ポリ A のテーリングが成功した場合ポリ、テーリングなく mRNA と比較してシフトのバンドには (図 2 a) が観察すべき。
2. 精管男性マウスの作製
- 体重計を使用して 8-12 ヶ月で icr 系雄マウスの重量を量る。
- 0.7 - 0.9 mL 1.2 %tribromoethanol 麻酔雄マウス腹腔内注入します。
注: 麻酔の量は、マウスのサイズによって異なります。たとえば、マウスの体重 40 g 0.8 mL tribromoethanol 麻酔の注射します。 - 70% エタノールでベリーを濡れています。
- 小さな果実 (3 ~ 5 mm) を切り、はさみの助けを借りて筋肉壁に切開をするをします。
注: ハサミ、鉗子で手術を開始する前の 70% エタノールで洗浄する必要があります。 - 脂肪パッドを鉗子でつかんで、ゆっくりと引き出します。その後、精巣と輸精管が表示されます。
注:輸精管は、U 字管と赤い血管。 - 手術用縫合糸の 2 つの時点の輸精管を縛るし、結ばれたポイント間の中間部分を切り出してください。
- ゆっくり押し戻します脂肪パッドと精巣ベリー。
- 残りの精巣の手術を繰り返します。
- 手術用の縫合糸で 2 針で筋肉壁を縫います。
3. 体外受精
- 8 - 10 週間の古い女性 B6D2F1 を注入 (BDF1) マウス腹腔内 7.5 IU 馬絨毛性ゴナドトロピン (eCG) とひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) 46-50 h 間隔で。
- 精子の授精 30 mm 皿の体外受精前に 1 日 300 μ L 人間卵管液 (HTF)8メディアの滴を準備、実験室ベンチに鉱物油とこれらの滴をカバーし、インキュベーターで一晩 preincubate。
- 頚部転位によって成熟雄 ICR マウスを犠牲に。27 G 針と馬尾精巣上体を解剖し、精子を収集します。HTF のメディアに 38 ° C で 1-2 時間の 300 μ L 精子受精能獲得のためそれらを文化します。
- hCG 注射後 16 h は、頚部転位によって超排卵の雌マウスを犠牲します。HTF のメディアの横にある鉱物油に卵管膨大部に転送し、引いて卵丘細胞と卵母細胞の複雑なこの卵管膨大部から 30 G 針による授精授精 HTF 媒体に。
注:いくつかのメスのマウスは、しばしば、スーパー排卵治療にもかかわらず排卵を表示されません。拡大卵管膨大部は、排卵のサインです。 - 精子受精能獲得後、排卵卵子が収集された授精 HTF メディアに容量制約をもつ精子の 2-3 μ L を転送します。
- 1 h、授精後受精受精卵を収集し、100 μ g/mL CZB9メディアで 10 分間でヒアルロニダーゼとそれらを扱います。
注:人工授精は正しく実行されると、1 h、授精後 2nd極体と受精受精卵が観察されます。以下または低品質の精子を使用する場合は、2nd極体と小さな受精卵のみが観察されます。また、多くの精子は授精用、多精子侵入が発生します。適切な人工授精は、男性と女性の前核と受精卵につながります。これらの基準を使用して、かに人工授精を行うかどうかを見つけることが可能です。- CZB メディアで洗浄後、eGFP H2B mRNA マイクロインジェクションの第二極体と受精卵を対象します。
4. 準備室とマイクロインジェクション ピペット
- エンコード eGFP H2B ヌクレアーゼ フリー水を使用して 250 ng/μ L の濃度を取得する RNA を希釈します。
- PVP HTF の 2 〜 3 滴を準備、および eGFP H2B mRNA が値下がりしましたし、5-6 滴 Hepes バッファー 60 mm ディッシュに CZB (H CZB) が値下がりしました。鉱物油とこれらの滴をカバーします。
注: これらの準備作業は、研究室のベンチに実行できます。薄層流れのキャビネットを使用する必要はありません。 - ホウケイ酸ガラス マイクロ ピペットの引き手を引く (例えばP = 500、熱 825、プルを = = 30、ヴェル = 120 と時間 = 200)
- ピペットの先端を分解した後、マイクロフォージを使用して 30 ° のまわりで引っ張られたガラス マイクロインジェクション ピペット チップ (−300 μ m バック) に近いを曲げます。
5. マイクロインジェクション
- MRNA の注入中に、ピエゾと受精卵の殺害を防ぐためにマイクロマニピュレーターを舞台にプレート ヒーターの電源を切ります。
- 洗ってコート HEPES バッファー HTF で注射針の内側 10% を含む対人 (PVP HTF)。
- 2nd極体 (図 2 b) と受精受精卵を収集し、商工会議所と接続されている顕微鏡ステージ上に 20-25 受精卵を転送します。
- ホウケイ酸ガラス管先端からに希薄 eGFP H2B mRNA を入力します。
- ホールディング ピペットで受精卵を押しながら、透明帯とピエゾ ドライブとゾル性細胞質膜を破る。
- 約 10 の注入、受精卵の細胞質に mRNA の pL。長い保育器外受精卵の培養による被害を防ぐために 10 分以内 mRNA 注入を終了します。
注:注入量は、2nd極体と同じ大きさにする必要があります。注入 mRNA の量が大きすぎる場合、無料 eGFP H2B の分数は、モバイルの割合に影響を与える可能性がありますが発生する可能性は。 - マイクロインジェクション後、10 分は少なくとも 3 滴で洗うし、zFRAP 解析まで 38 ° C で CZB で注入された受精卵を培養します。
6. zFRAP 分析
- zFRAP 分析の前に 1 h は、レーザーと共焦点顕微鏡のステージにホット プレートを入れます。38 ° C の温度を設定します。
- HEPES バッファー CZB メディアの 6-10 μ L 60 mm ガラス底皿に鉱物油で覆われて、暖かいに置くヒーター受精卵のコレクションまで。
- 8 - 受精後 12 h は、収集 5 10 eGFP H2B 表現する受精卵との 6-10 μ L に転送で加温 HEPES バッファー CZB 中型ドロップ。
注: 5-10 eGFP H2B 表現する受精卵はインキュベーター外長く培養を避けるため、各解析で使用されました。5 に 10 の受精卵は、1 h 内で分析できます。 - 製造元の指示に従って漂白と撮像条件を設定します。共焦点レーザー走査型顕微鏡 (材料表) の場合を以下に示します。
- 使用油レンズ X 60 (60 X 60 X 1.35/オイル)。
注: レンズ高倍率 (高い開口数) を高い感度で。 - 「取り込み設定」(補足図 1) の「512」として 4.0 μ s/ピクセルとサイズのスキャン速度を設定します。
- 「5」(補足図 1) にデジタル ズームを拡大します。
注: より高いズーム フォーカス ドリフトが発生したかどうかを認識する必要です。 - 染料一覧 (補足図 1) と、選んだ「EGFP」を開きます。1.6 と観測時刻を設定 s (間隔は「フリーラン」で設定されて) (補足図 1)
注: より多くの観測点より詳細なデータを引き起こす可能性がありますが、それはまた、光毒性を引き起こすことがあります。ZFRAP 分析で 1.6 s 観測時間はクロマチン緩みの親の非対称性を検出する十分なようです。 - 合計 (補足図 1) の 12 の画像の数を設定します。
- 「刺激の設定」パネルを起動し UseScanner の「メイン」をクリック。スキャン 10.0 μ s/ピクセルとして速度を設定します。「シリーズの活性化」をクリックし、「5 秒」(補足図 1) として「3 フレーム」とアクティベーション時間自動アクティブを設定します。
- 「フォーカス x 2」をクリックして、フォーカスを設定し、"Stop"。
- 漂白とレーザー パワーをイメージング設定 (477 nm) 110 と 15 μ で、それぞれ調整することによって「レーザー ゲージ力」(補足図 1)。
注: 非常に強力な漂白剤定量分析のための困難を引き起こす大きい漂白周辺地域を引き起こす可能性があります。レーザー パワーの測定、電源メーターを使用します。レーザー パワーの時間による劣化の影響を避けるためのレーザー出力を確認することが重要です。 - 刺激の設定パネルで「クリップ Rect」(補足図 1) をクリックしてします。(ROI; 赤の関心領域を設定します。ROI # 1 b) 40 x 40 ピクセル (7.6 μ2) として。準備参照地域 (REF; 緑;投資収益率 #2) とバック グラウンド (BG; 青;投資収益率 #3) を使用して「ROI"コピペ」投資収益率"(マウスの右ボタン)。
注: ピクセル サイズは、ROI にカーソルがあるときにマウスの右ボタンをクリックして呼び出すことができます「ROI マネージャー」で設定できます。大きい・ ロワは、zFRAP スコアのばらつきを標準化するには良いと考えられています。ただし、投資収益率が大きすぎるは使用できませんこの分析の核小体の前駆体 (NPB) を避けることは困難といえます。この区画に eGFP H2B はクロマチンから自由であると考えられて、驚くべき高いモビリティ3を示した。可能な限り、ROI と REF の領域を区切ります。これらの 2 つの領域が近い場合に漂白可能性がありますも REF の地域が影響します。 - ツール ・ バーの「ライブ」をクリックし、「ライブ プロット」(補足図 1)。
メモ: ライブ プロットごとの ROI 内の蛍光信号強度を示します、HV を使用してレーザー出力を調整するため使用されます。ROI を選択しない場合、ライブ プロット パネルのない強度だろう検出されることに注意してください。 - ROI の位置を決定します。
注: 投資収益率は、前核の目的の位置にドラッグして移動できます。(1) 核小体を避けるために、(2) 核質に全体の投資収益率を合わせてください。ROI の原子膜 (細胞質) の領域の外側の領域は含まれません。EGFP H2B のローカリゼーションは、投資収益率に細胞質が含まれているかどうかまたはない eGFP H2B の蛍光性を見つけやすいように高い核質に制限されています。男性の前核は 2nd極体近くローカライズされます多くの場合、女性のものよりも大きくなる傾向があります。これらの基準を使用している間、男性または女性の前核を判断します。 - 「フォーカス x 2」をクリックして (補足図 1) し、2000 年頃に蛍光強度に EGFP のチャンネルの HV 電源ゲージを調整 (蛍光強度は「ライブ プロット」ウィンドウで見ることができる)。
- 使用油レンズ X 60 (60 X 60 X 1.35/オイル)。
- ZFRAP 分析を開始するには、「時間」し、"XY"(補足図 1) をクリックします。
注:「Time」ボタンを適切に選択すると、"t"が"XY"ボタンに表示されます。- 「やったシリーズ」(補足図 1)、FRAP イメージング「XY ボタン」に近いし、、FRAP 解析データを入手した後に表示されるをクリックします。
- 「2 d ビュー画像 XXXXX」で最寄りの名前付きファイル (oib。 ファイル形式) として"として保存"ファイルを保存 (Ctrl + Shift + S も使用できます)。
- BG、REF、ROI を選択し、クリックして (Ctrl キーを押しながら A キーも使用できます) 2次元画像を表示」ウィンドウで「時系列解析」。
- FRAP の行データを取得し、「保存」ライブ プロット ウィンドウでボタンをクリックします。
注: 行 FRAP 定量的データは csv ファイルとして保存されます。
- ZFRAP コントロールなしの蛍光観察を避けるためにガラス底培養皿の縁に近いドロップに mRNA を注射された受精卵のいくつかを置きます。
7. データの計算
- 使用しながら得られた量的データは (以下、補足を参照してください excel ファイル) いくつかの変更を参照3,7に示すように「回復曲線」と Excel で「モバイル率」グラフを作る。
- 各時点の 12 枚の写真でこれらの投資収益率と REF から BG の値を減算して相対強度を計算します。
- REF の投資収益率の値を分割します。その結果、各時点での 12 の標準化された相対強度スコアが得られます。
- 写真漂白の前に撮影した 3 つの画像の ROI の相対的なスコアの平均値を計算します。
- 回収率を計算します。分割、12 写真漂白 (7.1.3 で取得) の前に相対的なスコアの平均で各時点 (7.1.2 で取得) で撮影した画像の ROI の相対的なスコアを得られます。これらのスコアを使用して回復曲線を描画する (図 2 e)。
- 漂白のレートを計算します。
注: 漂白率 (%) = 100 - 4thイメージの回収率。 - 次のとおり10、11,12として数式を使用してモバイルの割合 (MF) の計算します。
MF (%) = (終点) - 12回回収率 4回回収率率 × 100 を漂白/。
8. 胚移植
- 8-12 ヶ月雄 ICR マウスの精管胚転送一晩同じケージでそれらをさせることで前に、の晩に成熟した ICR 雌を仲間します。
- ZFRAP 分析をされ、2 細胞期に開発する決定胚を収集します。
- 腹腔 - 0.7 0.9 mL 1.2 %tribromoethanol 麻酔または 0.35 - 胚移植前に 0.75/4/5mg/kg メデトミジン、ミダゾラム、ブトルファノール混合剤の 0.45 mL 雌マウスを注入します。
注: 麻酔の量は、マウスの体重によって決まります。Tribromoethanol: 0.2 mL/10 g の体重。メデトミジン/ミダゾラム/ブトルファノール混合剤: 体重の 0.1 mL/10 g。- 0.5 日のポストの coitum (dpc) で膣にプラグと偽女性 ICR マウスの卵管にこれらの 2 つのセル段階の胚を転送します。
- 胚移植後に目を覚ますまでは 37 ° C に設定器の雌マウスを置きます。
- 18.5 dpc で頚部転位によって代理母を犠牲にし、帝王切開による受精卵の zFRAP 分析から派生した子犬を復旧します。いくつかの回復された子犬は育てる母親に配信され、彼らの体重は毎週を評価しました。
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Representative Results
eGFP H2B と zFRAP 分析
適切に作られるエンコーディング eGFP-H2B、移されたバンドによるポリ (図 2 a) テーリングと見られている、mRNA は、授精 (図 2 b) 後 1-3 h、第 2 極体と受精卵の細胞質に注入されました。8 〜 12 の授精後 h、H2B eGFP の発現を示す 2 前核と受精卵は収集され、zFRAP 分析 (図 2) を受けます。FRAP 解析は漂白とリカバリの手順ので構成されます。あらかじめ漂白の段階で eGFP H2B の信号 (2 D 図-1) が観察できることを断ら漂白、一度信号無視できるレベル (2 D 図-2)。漂白が成功した場合は、漂白した後すぐに暗い穴の投資収益率と同じ大きさが登場しました。漂白した後、eGFP H2B 蛍光信号の強度回復わずかに異なります。蛍光信号は徐々 に無漂白核質 (2 D 図-3) 地区から ROI に eGFP H2B の無漂白の一部の流入増加。クロマチン緩みの zFRAP 分析の成功の確認、クロマチン緩み; の親の非対称性を使用する勧め男性の前核は、高速復旧曲線と女性 (図 2 eとF) のものよりもより多くのモバイル分数を示した。ZFRAP 解析、CZB メディアの洗浄と培養受精卵後 (図 2とH) の重要な損傷なし胚盤胞の段階に開発できます。強く長時間漂白、場合でも、受精卵まだ成長できる胚盤胞期同様に7。
受精卵の zFRAP 分析の完全な長期的発展の分析
ZFRAP 分析受精由来胚の完全な長期的開発を分析、2 細胞期胚偽母親の卵管に移った。コントロールとそのまま胚および 1 つの mRNA がない zFRAP 分析を注入を作製した.ZFRAP 分析胚 (41.0%) の出生率はわずかにそのまま胚 (62.2%) のそれより有意に減少がないの zFRAP コントロールの名前と同じ (52.6%) であった(表 2)。したがって、zFRAP 解析は通期胚に若干支障が出るようです。しかし、重要なは、子犬は健康なように見えた zFRAP 分析受精卵から派生し、(図 3) を完全に開発。
図 1: 実験のための手続きの流れの模式図。体外受精:たて収集中期 II (MII) 卵が容量制約をもつ精子で人工授精します。体外転写: メッセンジャー RNA (mRNA) eGFP 融合ヒストン H2B のエンコーディング (eGFP H2B)ないと一直線に並べられた pTOPO eGFP H2B3の SP6 プロモーターから転写された私。EGFP H2B mRNA は、ポリ A テーリングし浄化を受けます。浄化された eGFP H2B mRNA は、mRNA の注入に使用されます。mRNA 注入: 準備された eGFP H2B mRNA は 2nd極体と受精卵の細胞質に注入されます。zFRAP 解析: eGFP H2B 表現する受精卵は、zFRAP 分析に服従しました。利益 (投資収益率; 赤色の四角形) の地域が強いレーザー漂白され、その後 eGFP H2B 信号は無視できるレベルに低下しました。漂白した後、eGFP H2B の信号の強さは徐々 に増加します。体外の開発:ZFRAP の分析の後、受精卵は胚盤胞の段階に開発できます。胚移植: 2 つのセル段階で zFRAP 分析胚の偽妊娠雌マウスの卵管に転送されました。18 日以降、健康な生きている子犬は、zFRAP 分析の胚から取得でした。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: eGFP H2B と受精卵の zFRAP 分析。(A) の in vitro転写とポリ A テーリングによって適切に準備 mRNA の代表的なイメージ。レーン 1: 前のポリ、テーリング。レーン 2: ポリ A のテーリングを投稿します。EGFP H2B のエンコーディング(B) mRNA は、2ndの極体 1-3 h の記事授精 (hpi) と受精卵の細胞質に注入されました。スケール バー = 25 μ m (C) eGFP H2B 表現する受精卵が 8-12 hpi で収集されました。白のアスタリスクは核小体に前駆体 (NPB) を表示します。スケール バー = 10 μ m (D) eGFP H2B 式は、あらかじめ漂白の段階 (D-1) で NPB でも全体の核質で検出された回復 (D-3) 前後 (D-2) を漂白した後すぐに。原子膜 (白い点線) と NPB (アスタリスク) が表示されます。スケール バー = 10 μ m (E, F)の回復曲線とモバイル分数 45 受精 5 の独立した実験から得られました。青と赤は、男性と女性をそれぞれ示します。回復曲線では、単一の円は測定ポイントを指定します。散布では、ドットは前核からモバイル留分のスコアを指定します。(G) zFRAP 分析の受精卵の着床前発生の代表的な画像が表示されます。2 つのセル、4-8 細胞と胚盤胞 24、48、および 96 hpi で胚をそれぞれステージします。黄色のマル印は、よく発達した胚盤胞。この胚盤胞は拡大、右側のパネルに表示されます。スケールバー = 100 μ m (H)バー zFRAP 分析の胚の発達率のグラフ。バーは、zFRAP 分析 (zFRAP) 胚 (白) を示し、胚 (黒) mRNA がないの zFRAP 解析 (ない zFRAP) 注入を制御します。表示されるデータは、合計で少なくとも 57 胚を調べる 3 つの独立した実験からです。2 つのセル、4-8 細胞、桑実胚 (Mo)、および胚盤胞 (Bl) 段階で観測した 24、48、72、96 hpi それぞれ。この図は、[大賀 et al 2017]7から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: FRAP 解析受精卵に由来する子犬の健全な成長。(A) zFRAP 分析受精卵由来の子犬の写真が表示されます。(B)正常な成長は、zFRAP 分析の子犬の育児中に観察されました。(C)グラフは、(赤)、無漂白コントロール胚および胚の zFRAP 分析 (グリーン)、子犬の体重がそのまま胚 (青) から派生したことを示します。そのまま胚由来 29 子犬の重量をボディなし zFRAP 胚と 8 週間の期間での胚の zFRAP 分析から 15 から 24。アスタリスクで示された値は、そのままコントロールと異なっています。この図は、[大賀 et al 2017]7から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: FRAP 解析のためのグラフィカル ユーザー インターフェイス。(A)グラフィカル ユーザー インターフェイスの概要については、を示されました。(B)各ウィンドウの拡大画像を示されていた。(1)の取り込み設定ウィンドウは、画像取得条件を設定に使用されます。(2)刺激設定ウィンドウは、漂白の状態を設定するために使われます。画像取得ウィンドウ上のボタンをクリックして、このウィンドウを開くことができます。(3)の画像収集コントロール ウィンドウは FRAP 解析に使用されます。(4)ライブビュー (フォーカス x2 または XY ボタンをクリックした後は現在の画像が表示されます) 本画像を示しています。赤、緑、および光の青い四角形は、投資収益率 (興味の地域)、REF (参照)、BG (バック グラウンド) をそれぞれ示しています。(5) 2 D ビュー FRAP 解析画像を示しています、「シリーズの完了」をクリックした後表示されるボタン。この場合、FRAP 解析男性の雄性が例として表示されます。8 点で 3 つの四角形は、これらの領域が選択されていることを示します。(6)ライブ プロット領域ごとに現在の蛍光強度を示しています。X および Y 軸は、それぞれ時間 (ms) と蛍光強度を示します。(7)の時系列解析各地域での蛍光強度のトラックを示しています、2 D ビュー ウィンドウの時系列解析ボタンをクリックした後表示されます。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足 Excel ファイル 1: サンプル データと計算データ。(1 シート)男性の雄性のサンプル データが表示されます。違います。画像の連番を示します。各領域 (ROI、Ref、BG) 行強度が示されました。(2 シート)データの計算例です。プロトコル番号は、プロトコル] セクションの対応する場所を示します。ノートでは、各スコアの意味について説明します。数式は、セルをクリックして参照できます。回復曲線とモバイル割合棒グラフの例のとおりです。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
| 日-3 | 日-2 | 日-1 | FRAP の日 | 一日 +1 | 日 +3 | 日 +19 | |
| mRNA の準備 | カッティング テンプレート プラスミド (一晩) |
1). 浄化テンプレート プラスミド | |||||
| 2). 生体外のトランスクリプション | |||||||
| 3). 体外ポリ、テーリング | |||||||
| 4). 電気泳動による mRNA の品質チェック | |||||||
| FRAP | 1). 操作ピペットと商工会議所の準備 | ||||||
| 2). mRNA 注入 | |||||||
| 3). zFRAP 分析 | |||||||
| 4). 回復曲線とモバイルの分数の計算* 2 | |||||||
| 体外受精と着床前開発の分析 | 心電図注入 | 1). hCG 注射 | 1). 精子受精 | ||||
| 2). メディア (HTF) の中古インキュベーション | 2). 体外受精 | ||||||
| (HTF、CZB、H CZB、PVP CZB) メディアの準備 | 3). 評価着床前開発 | ||||||
| 胚移植 | 偽妊娠女性の準備 (精管のオスと交尾* 1) |
偽妊娠女性への 2 細胞期胚の転送 | 出生率の評価 | ||||
| * 1: 男性マウスの精管は、交尾する前に少なくとも 2 週間を準備する必要が | |||||||
| * 2: 計算は、次の日 (1 日) に延長ができます。 | |||||||
表 1: 実験のタイム テーブルです。FRAP 解析の日は、実行する必要があります実験は項目ごとにそれぞれの日に示された日 0 と見なされます。
| カテゴリ | 違います。注入された受精卵の | 違います。mRNA 注射 (%) 後回復した受精卵の * | 違います。受精卵の分析 | 違います。転送 | 違います。受信者の | 違います。子犬 (%) の * * * | 子犬 (g) の重量 | 違います。トランスジェニック子犬の |
| 2 細胞期胚 (%) * * | ||||||||
| そのまま | - | - | 99 | 98 (99.0) | 9 | 61 (62.2)、 | 1.64±0.02 | n.d |
| ない FRAP | 420 | 398 (94.8) | 82 | 78 (95.1) | 7 | 41 (52.6)b | 1.66±0.03 | n.d |
| FRAP | 79 | 78 (98.7) | 7 | 32 (41.0)b | 1.69±0.03 | 0 | ||
| *: なしで割ることによって計算されます。注入された受精卵。* *: なしで割ることによって計算されます。受精卵の分析の: なしで割ることによって計算されます。転送の 2 細胞期胚。a, b: 上付き文字を示す有意差 (P < 0.05)。n.d: 未定します。次の表は、[大賀 et al 2017]7から変更されています。 | ||||||||
表 2: 分析された胚の出生率:臨月に FRAP 解析されていたが、胚の発達の可能性を検討しました。これらの胚の得られた出生率が表示されます。コントロールとそのまま胚でない FRAP 解析も検討しました。これらの転送胚由来の子犬の重みが同じく表示されます。
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Discussion
本研究で明らかになった、zFRAP 解析は完全な長期的開発、このメソッドが分子イベントと胚の発育能の関係を明らかにする非常に有用なツールに重大な損傷を発生しません。それらの細胞の差動電位になる 2 つのセル段階の胚のほどまで ES 細胞の状態のような 2 つのセルにプログラムし直す時にクロマチン緩みは 2 細胞期胚5と対等であるに変わります。したがって、, クロマチンの緩みは萌芽期の進化の潜在性のために重要である可能性が。体細胞核が父方の前核だけでなく、母体の前核、体細胞核移植受精卵で買収クロマチンの欠如は、示唆するいると比較して低いクロマチン緩みを示した卵母細胞の細胞質に転送彼らの貧しい人々 の進化の潜在性に関与します。総称して、zFRAP 分析は、リプログラミング機構のゲノムを解明するために有用であることです。
ZFRAP システムは、開発可能性が高い受精卵を選択することが可能になります。法、に加えて、予備研究で spermatid 注入 (ROSI) をラウンドすることが分かった-受精卵港異常なクロマチン緩みを派生しました。その上、それらのいくつかを示したことレベルでクロマチン緩み体外受精由来同様、受精卵に匹敵するこれらの受精卵が発達期待をされていることを示唆しているがわかった。重要なは、zFRAP、クロマチンの緩みを評価した受精卵を長期的に開発できます。将来的に zFRAP によるクロマチンの緩みの評価が低いものから高い開発ポテンシャルを持つ法とロージ派生受精卵を区別することがあるためがあります。
日には、前研究は着床前胚におけるエピジェネティック状態の解析のライブ イメージング手法の有用性を示しています。ライブ イメージング法のいくつかは、着床前胚13,14それぞれのエピジェネティックな修飾 (例えば DNA/ヒストン修飾) を明らかにするが、zFRAP を使用して、それはなし, クロマチンの緩みを評価することが可能細胞を殺します。クロマチンの緩みは、エピジェネティック修飾の影響を受けるようです。たとえば、異質染色質、抑圧的なエピジェネティックな修飾 H3K9me3 と H3K27me3 を豊かなどを示したユークロマチン領域3,15より低いヒストン モビリティ。確かに、エピジェネティック状態を変換する化合物、化学治療は受精卵でクロマチン緩みの変化を引き起こした。したがって、zFRAP を使用して、それはクロマチン構造の総括のエピジェネティックな状態を明らかにすることが可能です。これは、受精卵の発達の可能性を評価するため利用だろうと思われていた。
ZFRAP の eGFP H2B をエンコーディング mRNA の注入は、減点が zFRAP の汎用性を高めます。MRNA 注入のデメリットはマイクロインジェクションによる被害です。これを避けるには、H2B eGFP トランスジェニック マウスを利用する非常に効果的です。H2B eGFP トランスジェニック マウスの線を使用している場合、mRNA マイクロインジェクションを用いた場合と比較して子孫率が増加可能性があります。逆に、それはメリット mRNA 注入の zFRAP 野生型マウスの系統の任意の種類の使用が可能します。マウス緊張の関心と zFRAP を使用する者は、遺伝子の eGFP H2B 必要なマウスの緊張を準備する必要はありません。このメリットが遺伝子の解析でより顕著になる (e.g。 過剰発現/ノックダウン) またはノックアウト マウス ライン。トランスジェニック/ノックアウト線で研究テーマを zFRAP を利用し者は関心ものの限られた数から H2B eGFP トランスジェニック ラインを準備する必要はありません。これは、研究の進行のための利点を示します。
着床前胚とライブ イメージング解析には、専門的な知識と非常に高価で、細かく調整された特殊なデバイスが必要です。したがって、このような実験的システムの導入は容易な決断ではありません。本研究で確立された実験的システムでは、共焦点レーザー走査型顕微鏡脇のみサーモ ヒーターを必要があります。研究所で初心者が 1 ヶ月以内 zFRAP のメソッドを学ぶことができるので、さらに、学習法、簡単です。しかし、まだ考察を必要とするいくつかの問題があります。まずはフォーカスのドリフトです。観察中に前核または、受精卵観察が始まる前にビジュアルクリエイター位置から逸脱することが可能です。フォーカス ドリフトが発生すると、Roi はまた正しい位置から逸脱します。このため、定量的なデータは無価値になります。この問題を避けるためには、研究者がエアコンからウィンドウに対する保護のためガラス底培養皿の蓋を使用し、対物レンズの上石油拡張を待ちます。フォーカスのドリフトが発生した場合逸脱した受精卵からデータを破棄する必要があり、同じ受精卵と 2nd FRAP 解析はお勧めしません。本研究では 150 s3から約 25 秒7の観測時間の短縮は非常に有用だった。2 番目は保育器外長く潜伏です。インキュベーター外の環境に長い露光時間は間違いなく萌芽期の開発のために有害、バッチあたり 1 h 以内 FRAP 解析を終了する推奨されました。受精卵数 6 10 ガラス底培養皿に HEPES バッファー メディアで FRAP 解析する必要があります。本実験の条件下で最大数は 4 h の約 30 が時間あたり 20 受精卵を参照と背景領域の蛍光強度の評価を延期することによって分析できますより多くの受精卵が必要な場合。第三は「共焦点レーザー顕微鏡レーザーの時間関係悪化」です。漂白レーザーが不足している場合、不十分な漂白のため正しい定量的データを取得できません。確かに、弱い漂白レーザーを用いた胚性クロマチン緩みの親の非対称性を取得できません。これを避けるは、必要に応じてレーザー出力が弱まったかどうかを確認することをお勧めします。この研究では、110 μ 漂白は親の非対称性の獲得のために十分だった。
コアヒストンに加えて蛋白質の他の種類の zFRAP 解析を使用できます。観測時間が長く合計コアヒストンは顕著に低い機動性を示す、ので (約 25 本研究で s) zFRAP 解析に必要です。したがって、受精卵のかなりの数を分析する長い時間のためヒーターを HEPES バッファー媒体で培養は避けられない。一方で、高い機動性蛋白質の zFRAP 分析の全観測時間設定できますショート、ショートするヒーターに HEPES バッファー媒体で培養時間を有効にします。したがって、長い露光時間インキュベーター外の環境には萌芽期の開発の非常に有害なため、コアヒストン、自然に高い機動性を持ち、他のタンパク質のための zFRAP 解析はコアヒストンより低い毒性を表示するよう.さらにさまざまな分子のイベントと萌芽期の開発の間の関係の調査でこの実験的システムを助ける、それが望まれます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
批判的なコメントおよびテクニカル サポートを提供するためかな岸田、上村聡明長友さやか和歌山聡岸上をありがとうございます。この仕事; ミズーリ州に国立大学の改革を促進するため文部省、文化、スポーツ、科学技術プログラムによって資金が供給された部分的に会科学 (16 H 02593) の昇進、浅田科学財団および t. w. に武田科学振興財団資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
References
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