Summary
Flojedad de cromatina parece estar involucrada en el desarrollo potencial de blastómeros. Sin embargo, no se sabe si flojedad de la cromatina puede utilizarse como un índice confiable para el potencial desarrollo de embriones. Aquí, se ha descrito un sistema experimental en el que pueden desarrollar cigotos evaluados flojedad de cromatina a término.
Abstract
En proyección de imagen es una poderosa herramienta que permite el análisis de los eventos moleculares durante la ontogénesis. Recientemente, flojedad de la cromatina o apertura ha demostrado para estar implicado en el potencial de diferenciación celular de células madre embrionarias pluripotenciales. Previamente se informó de que, en comparación con las células madre embrionarias, cigotos albergan una estructura de cromatina muy flojos, lo que sugiere su asociación con su totipotencia. Sin embargo, hasta ahora, no ha sido abordada si esta estructura de la cromatina abierta muy aflojado es importante para el potencial de desarrollo embrionario. En el presente estudio, para examinar esta hipótesis, se desarrolló un sistema experimental en que cigotos que fueron analizadas por fluorescencia recuperación después del blanqueamiento foto puede convertirse a término sin ningún daño significativo. Lo importante, este sistema experimental necesita solamente un calentador termo placa además de un láser confocal de barrido microscopio. Los resultados de este estudio sugieren que la recuperación de la fluorescencia después de blanqueo foto (FRAP) análisis puede utilizarse para investigar si los eventos moleculares en cromatina cigóticas son importantes para el desarrollo del término.
Introduction
Después de la fertilización, la estructura de la cromatina se altera la dinámica y estructura de la cromatina cigóticos es entonces finalmente establecido1,2. Durante este período, en pronúcleos paternos, la proteína dominante de la cromatina cambia de protamina en histonas. La cromatina resultante es muy diferente de la de espermatozoides y ovocitos femeninos en varios puntos (por ejemplo, composición variante de histonas, modificación de histonas). Por lo tanto, cromatina cigóticas formada cree que es importante para el posterior desarrollo embrionario. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos para revelar los detalles de la estructura de la cromatina cigóticos durante largos períodos, nunca han sido los métodos para evaluar la calidad de cigotos o predecir su desarrollo de término de la etapa de una célula mediante el análisis de su estructura de la cromatina establecido.
En el estudio anterior, se descubre que los cigotos tienen una estructura de cromatina muy flojos3. Actualmente, se cree que un factor importante para la diferenciación celular potencial de células madre embrionarias (ES)4flojedad de cromatina o apertura. Células madre embrionarias no presentan homogeneidad en la naturaleza, pero son bastante heterogéneos; en las colonias de células ES, algunas transitoriamente adquieren un mayor potencial de diferenciación comparable a blastómeros de embriones en estadío de dos células. Durante esta transición en la célula dos como estado, flojedad de la cromatina en ES células cambios en lo que es comparable con la etapa de dos células de embriones5. Así, flojedad de cromatina parece ser importante para el potencial de diferenciación celular y es posible que abra ampliamente la cromatina en cigotos es útil para la evaluación del potencial de desarrollo cigóticos.
En proyección de imagen es una poderosa herramienta que permite para el análisis de eventos moleculares durante la ontogénesis, ya que este método permite el posterior desarrollo y desarrollo incluso termino6. Como uno de los métodos de proyección de imagen vivo, análisis FRAP se ha utilizado para examinar la holgura de la cromatina en embriones preimplantación y ES células3,4,5. Si flojedad de cromatina cigóticos puede analizarse sin un efecto perjudicial sobre el desarrollo del término por el FRAP análisis, puede ser una valiosa herramienta para la evaluación de la calidad de los embriones en la etapa de una célula. Sin embargo, no se han examinado los efectos sobre el desarrollo del término por este método experimental. Recientemente, se desarrolló un sistema experimental con FRAP para evaluar la flojedad de cromatina cigóticos. Porque esto era un nuevo sistema de observación de cigotos, se dice que como FRAP cigóticos (zFRAP). zFRAP no afectó críticamente el término desarrollo y ha sido divulgado a otra parte7. En este informe se describe el protocolo de este método experimental.
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Protocol
Este estudio se realizó en estricta conformidad con las recomendaciones de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la Universidad de Yamanashi. El protocolo fue aprobado por el Comité de ética de los experimentos del Animal de la Universidad de Yamanashi (número de permiso: A24-50). Todas las cirugías fueron realizadas bajo anestesia tribromoethanol, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Un resumen ilustrado de los procedimientos y horarios se muestran en la figura 1 y tabla 1, respectivamente.
1. preparación de ARN mensajero (transcripciónIn Vitro del mRNA de eGFP-H2B)
- Alinear 5 μg de plantilla ADN pTOPO-eGFP-H2B3,7 con 30 U de no me en 50 μl a 37 ° C durante la noche.
- Recoger 1,5 μl de ADN digerido para confirmar ya sea completamente digerido por electroforesis.
- Aplicar 1,5 μl y 3-5 μl de ADN digerido con una carga de tinte al pozo del gel de agarosa al 2%, respectivamente y sometidos a electroforesis.
Nota: Si completamente digerida, se observa una sola banda (aprox. 5 kb). Sin digerir DNA se utiliza como un control, que aparece en una posición diferente.
- Aplicar 1,5 μl y 3-5 μl de ADN digerido con una carga de tinte al pozo del gel de agarosa al 2%, respectivamente y sometidos a electroforesis.
- Añadir 151,5 μl de ddH2O y 200 μL de fenol/cloroformo/isoamyl alcohol (25:24:1) para el restante digiere ADN.
- Mezclar vigorosamente en el vórtex.
- Centrifugar a velocidad máxima durante 15 minutos.
- Recuperar el sobrenadante y añadir 200 μL de cloroformo.
- Mezclar vigorosamente en el vórtex.
- Centrifugar a velocidad máxima durante 15 minutos.
- Recuperar el sobrenadante y añadir 20 μl de acetato de sodio de 3 M y 1,5 μl de ethachinmate.
- Mezclar vigorosamente en el vórtex.
- Añadir 550 μl de etanol al 100% y luego se mezclan vigorosamente en el vórtex.
- Centrifugar a velocidad máxima durante 15 minutos.
- Desechar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 70%.
- Secar el pellet por evaporación de 5-10 minutos.
- Disolver el precipitado plásmido ADN en 8 μl de agua libre de nucleasa.
- Evaluar la concentración de plásmido (concentración esperada es de 300-500 ng/μL) con nanodrop, siguiendo instrucciones del fabricante.
- Cabo en vitro de la transcripción de mRNA codificación eGFP-H2B con 1 μg de DNA purificado como plantilla en 20 μl de volumen de reacción total siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Después de la transcripción en vitro , añadir 36 μL de agua y recuperarse 1,5 μl μl 56 de ARNm sintetizada para el análisis por electroforesis (sin poli A).
- Realizar colas de poli A de ARNm sintetizada en un volumen de reacción de 100 μl, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Añadir 60 μL de solución de precipitación de cloruro de litio para la poli un mRNA cola de eGFP-H2B y luego Mezcle vigorosamente.
- Cool a-30 ° C durante 30 minutos.
- Centrifugar a velocidad máxima durante 15 minutos.
- Desechar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 70%.
- Secar el pellet por evaporación de 5-10 minutos.
- Disolver el precipitado con 20 μl de agua libre de nucleasa por calentamiento a 55 ° C durante 30 minutos.
- Evaluar la concentración del mRNA precipitado con nanodrop. Diluir a 500 ng/μl con agua libre de nucleasas y conservar a-80 ° C hasta su uso.
- Confirmar recomendado: producción de mRNA; tema 1 μl de mRNA con/sin (obtenido en la 1.8.1 y 1,12 medidas, respectivamente) poly una cola mezclada con 1.5 μl de bromuro de etidio 0,1 mg/mL y 3 μl de colorante de carga de la muestra para el análisis de electroforesis. Volumen aplicado fue de 5.5 μl.
Nota: Si la cola de poli A tuvo éxito, la banda cambió de puesto comparada con el mRNA sin poli un tizón debe observarse (figura 2A).
2. preparación de ratones machos vasectomizados
- Pesan los ratones macho ICR en 8-12 meses utilizando una escala de peso.
- Inyectar por vía intraperitoneal ratones machos con 0.7 - 0.9 mL 1.2% tribromoethanol la anestesia.
Nota: La cantidad de anestesia depende del tamaño del ratón. Por ejemplo, un ratón pesa 40 g se inyecta con 0,8 mL de anestesia tribromoethanol. - Moje la baya con etanol al 70%.
- Hacer un pequeño corte (3-5 mm) en la baya y luego realizar una incisión en la pared muscular con la ayuda de tijeras.
Nota: Tijeras y pinzas deben limpiarse con etanol al 70% antes de iniciar la cirugía. - Agarre un cojín gordo con pinzas y tire suavemente hacia fuera. Entonces, los testículos y conductos deferentes aparecen.
Nota: El conducto deferente es un tubo en forma de U y con un vaso rojo de la sangre. - Amarrar los conductos deferentes en los dos puntos con suturas quirúrgicas y luego corte la parte media entre los puntos de atado.
- Suavemente empuje hacia atrás el cojín gordo y del testículo en la baya.
- Repetir la cirugía con el testículo restante.
- Coser la pared muscular con dos puntos con sutura quirúrgica.
3. FECUNDACIÓN IN VITRO
- Inyectar de 8 - 10 - vieja de semana femeninos B6D2F1 (BDF1) ratones por vía intraperitoneal con IU 7,5 gonadotropina coriónica equina (eCG) y gonadotropina coriónica (hCG) en el intervalo h 46-50.
- Preparar gotas de 300 μL humano tubárico (HTF)8 medios flúidos para capacitación e inseminación 1 día antes de FIV en un plato de 30 mm, cubre estas gotas con el aceite mineral sobre la mesa de laboratorio y luego preincubate en una incubadora durante la noche.
- Madurados ratones ICR machos de sacrificio mediante dislocación cervical. Diseccionar cauda epidídimo con aguja 27 G y recoger el espermatozoide. Cultura para la capacitación en 300 μL de medio HTF para 1-2 h a 38 ° C.
- 16 h después de la inyección de hCG, sacrificar ratones hembra super ovuladas por dislocación cervical. Transferencia de la ampolla del oviducto en aceite mineral al lado de medio HTF y luego extraer células del cúmulo y complejos ovocitos de esta ampolla del oviducto por una aguja de 30 G en el medio HTF de inseminación incuba.
Nota: Algunos ratones hembras no demuestran a menudo la ovulación a pesar del tratamiento la super ovulación. Ampolla del oviducto ampliada es una señal de la ovulación. - Después de la capacitación, transferencia de 2-3 μl del espermatozoide capacitado en medios HTF de inseminación en la que se recogieron los ovocitos ovulados.
- 1 h después de la inseminación, recoger los cigotos fecundados y tratarlos con la hialuronidasa en 100 μg/mL durante 10 minutos en medios de comunicación CZB9 .
Nota: Cuando la inseminación se realiza correctamente, 1 h después de la inseminación, los cigotos fecundados con el cuerpo de polar de 2nd se observan. Si se utiliza esperma menos o baja calidad, se observan sólo poco cigotos con el cuerpo de polar de 2nd . Además, si se utilizan muchos espermatozoides para inseminación, polyspermy ocurre. Inseminación correcta conduce a cigotos con pronúcleos masculinos y femeninos. Utilizando estos criterios, es posible encontrar si la inseminación se realiza bien o no.- Después del lavado en los medios de comunicación CZB, exponga los cigotos con un segundo cuerpo polar a microinyección con eGFP-H2B mRNA.
4. preparación de la cámara y pipetas de microinyección
- Diluir el RNA codificación eGFP-H2B con agua libre de nucleasa para obtener una concentración de 250 ng/μl.
- Preparar 2-3 gotas de PVP-HTF eGFP-H2B gotas mRNA y 5-6 gotas de Hepes tampón CZB (H-CZB) gotas en el plato de 60 milímetros. Cubrir estas gotas con aceite mineral.
Nota: Estas preparaciones pueden realizarse en el Banco de laboratorio. No hay ningún requisito para el uso de cabina de flujo laminar. - Tire de vidrio borosilicato con un extractor de micropipeta (por ejemplo, P = 500, calor = 825, tire = 30, vel = 120 y tiempo = 200)
- Después de romper la punta de la pipeta, doblar la pipeta de microinyección de vidrio tirado cerca de la punta (−300 μm detrás) en alrededor de 30 ° con una microforge.
5. microinyección
- Apague el calentador de la placa en la etapa de instrumental quirúrgico para evitar la matanza de los cigotos con un piezo durante la inyección de mRNA.
- Lavar y cubrir el interior de agujas de inyección en HTF tamponado con HEPES que contiene 10% PVP (JcJ-HTF).
- Recoger los cigotos fecundados con un cuerpo de polar de 2nd (figura 2B) y transferencia de cigotos de 20-25 en la cámara de la platina del microscopio conectada un micromanipulador.
- Llene el mRNA de eGFP-H2B diluida en tubos capilares de vidrio borosilicato de las puntas.
- Sostenga el zigoto con una pipeta de sujeción y luego romper la zona pelúcida y la membrana citosólica con un accionamiento piezoeléctrico.
- Inyectar 10 pL del mRNA en el citoplasma de los cigotos. Final de inyección de mRNA dentro de 10 minutos para evitar daños causados por los cigotos fuera de la incubadora de cultivo más largo.
Nota: El volumen de inyección debe ser tan grande como el cuerpo polar de 2nd . Si la cantidad de mRNA inyectado es demasiado grande, es posible causar la fracción libre de eGFP-H2B, que pueda afectar a la fracción móvil. - 10 min después de la microinyección, lavar en al menos 3 gotas y luego la cultura los cigotos inyectados en CZB a 38 ° C hasta su análisis zFRAP.
6. zFRAP análisis
- 1 h antes de la zFRAP análisis, encienda el láser y la placa conectada a la etapa del microscopio confocal. Ajustar la temperatura a 38 ° C.
- Puesto 6-10 μl de medio tamponado con HEPES CZB cubierto con aceite mineral en el plato de fondo de vidrio de 60 mm y caliente en el calentador hasta colección de cigoto.
- 8 - 12 h después de la inseminación, recoger cigotos expresaban eGFP-H2B y transferencia 6-10 μl de 5-10 previamente calentado gota mediana CZB tamponado con HEPES.
Nota: Para evitar el cultivo más largo fuera de la incubadora, 5-10 expresaban eGFP-H2B cigotos fueron utilizados en cada análisis. 5 a 10 cigotos pueden ser analizadas dentro de 1 h. - Establecer las condiciones de blanqueaba y proyección de imagen según las instrucciones del fabricante. El caso de un láser confocal de barrido microscopio (Tabla de materiales) se muestra a continuación:
- Uso 60 X lente de aceite (60 X 60 X / 1.35 aceite).
Nota: Los lentes con mayor sensibilidad mayor aumento (mayor apertura numérica) Mostrar. - Establecer velocidad de escaneado como 4.0 μs/Pixel y tamaño como "512" en"adquisición" (suplementario Figura 1).
- Aumentar zoom Digital "5" (adicional Figura 1).
Nota: Un zoom mayor es necesaria para reconocer si deriva de foco se produce o no. - Abrir lista de tinte (suplementario Figura 1) y luego elegir "EGFP". Establecer tiempo de observación como 1.6 s (intervalo se define como "free-run") (figura 1 complementaria)
Nota: Más puntos de observación pueden causar datos más detallados, pero también puede causar fototoxicidad. En el análisis de zFRAP, un tiempo de observación s 1.6 parece ser suficiente para detectar la asimetría parental de la flojedad de la cromatina. - Configurar el número de cuadros como 12 en total (suplementario Figura 1).
- Iniciar panel de "Configuración del estímulo" y haga clic en "Main" en UseScanner. Sistema de escaneo velocidad 10.0 μs/Pixel. Haga clic en "Activación en serie" y luego poner el preencendido como "Marcos de 3" y el tiempo de activación como "5 segundos" (suplementario Figura 1).
- Haga clic en "Enfoque x 2" y ajustar el enfoque y luego "Stop".
- Set blanqueamiento y energía del laser de la proyección de imagen (477 nm) en 110 y 15 MW, respectivamente, por ajuste de "gage energía del laser" (suplementario Figura 1).
Nota: Blanqueo muy fuerte puede causar un área más grande de blanqueado, que causa dificultades para el análisis cuantitativo. Para la medición de la potencia del láser, utilice un medidor de potencia. Es importante confirmar la potencia del láser para evitar el efecto del deterioro relacionado con el tiempo de la potencia del láser. - Haga clic en "Clip Rect" (suplementario Figura 1) en el panel de configuración de estímulos. La región de interés (ROI; rojo; ROI #1B) como 40 x 40 píxeles (7,6 μm2). Preparar una región de referencia (REF; verde; ROI #2) y un fondo (BG; azul; ROI #3) usando "copiar ROI" y "pegar ROI" (botón de clic del ratón).
Nota: Tamaño de píxel se puede establecer a través del "Administrador de ROI", que se puede llamar haciendo clic en el botón derecho del ratón cuando el cursor está en el retorno de la inversión. ROIs más grandes se cree que son mejor ya que puede estandarizar la dispersión de la puntuación de zFRAP. Sin embargo, demasiado grande de un ROI no puede utilizarse para este análisis porque es difícil evitar el cuerpo del precursor del nucleolo (NPB). eGFP-H2B en este compartimiento fue pensado para ser libres de cromatina y demostró notable mayor movilidad3. Áreas de ROI y REF deben ser separadas lo más posible. Si estas dos regiones están cercanas, blanqueo puede afectar también la región de REF. - Haga clic en "Live" en la barra de herramientas y comience a "Vivir parcela" (suplementario Figura 1).
Nota: Vivo indica la intensidad de la señal de fluorescencia en cada retorno de la inversión y se utiliza para ajustar la energía del laser con alto voltaje. Tenga en cuenta que si ROI no se selecciona, ninguna intensidad se detectaría en panel en parcela. - Determinar la posición de retorno de la inversión
Nota: Retorno de la inversión se puede mover arrastrándolos a la posición deseada en pronúcleos. (1) ser seguro evitar el nucleolo y (2) ajuste el ROI todo en el nucleoplasia. No contienen la región fuera del área de la membrana nuclear (citoplasma) de retorno de la inversión. La localización de eGFP-H2B es altamente restringida en el nucleoplasia así que es fácil de encontrar si ROI contiene citoplasma o no por la fluorescencia de eGFP-H2B. Pronúcleos masculinos tienden a ser más grandes que las hembras, que se localizan a menudo cerca del cuerpo de polar de 2nd . Durante el uso de estos criterios, el juez los pronúcleos masculinos o femeninos. - Haga clic en "Enfoque x 2" (suplementario Figura 1) y ajuste el medidor de energía HV del canal para EGFP en intensidad de fluorescencia a alrededor de 2000 (la intensidad de la fluorescencia puede verse en la ventana de "en terreno").
- Uso 60 X lente de aceite (60 X 60 X / 1.35 aceite).
- Haga clic en "Tiempo" y luego "XY" (suplementario Figura 1) para iniciar el análisis de zFRAP.
Nota: Si convenientemente se selecciona el botón "Time", "t" aparece en el botón de "XY".- Haga clic en "hecho" (suplementario Figura 1), que aparece después de la proyección de imagen de FRAP cerca de la tecla"XY" y luego obtener datos analizados por el FRAP.
- Guarde el archivo "ver imagen 2D XXXXX" como un archivo de nombre recomendado: (formato de archivo de oib.) por "guarda como" (Ctrl + Mayús + S puede ser también utilizado).
- Seleccione ROI, REF y BG (Ctrl + A puede también usarse) "Análisis de Series" en ventana "imagen 2D de la vista".
- Obtener datos FRAP de fila y haga clic en "guardar" botón en la ventana de parcela vivo.
Nota: La fila datos cuantitativos FRAP se guardan como un archivo csv.
- Para ningún control del zFRAP, poner un poco de los cigotos inyectados con el mRNA de la gota, que está cerca del borde de los platos de fondo de cristal para evitar el efecto de la observación de la fluorescencia.
7. datos cálculo
- Durante el uso de los datos cuantitativos obtenidos, hacer la gráfica de la "curva de recuperación" y "fracción móvil" por Excel como se muestra en las referencias3,7 con algunas modificaciones (ver más abajo y suplementario excel archivo).
- Calcule la intensidad relativa restando el valor de BG de las de retorno de la inversión y REF en 12 cuadros para cada punto del tiempo.
- Dividir el valor de retorno de la inversión por el de la REF. Como resultado, se pueden obtener 12 puntuaciones estandarizadas intensidad relativa en cada momento.
- Calcular el promedio de la puntuación relativa para el retorno de la inversión en 3 imágenes tomadas antes foto de blanqueo.
- Calcular la tasa de recuperación. Brecha que 12 obtuvieron puntajes relativos para el retorno de la inversión en las imágenes tomadas en cada momento (obtenida en 7.1.2.) por el promedio de la puntuación relativa antes fotos (obtenidas en 7.1.3.). Dibujar la curva de recuperación con el uso de estos resultados (Figura 2E).
- Calcular la tasa de decoloración.
Nota: Blanqueo tasa (%) = 100 - tasa de recuperación de imagen deth 4. - Calcular la fracción móvil (MF) mediante la fórmula siguiente10,11,12
MF (%) = tasa de recuperación de 12th (en el punto final) - tasa de recuperación de 4th / blanqueo tasa × 100.
8. transferencia de embriones de
- Se aparean a hembras ICR maduradas en 8-12 meses con vasectomía ratones ICR machos la noche antes de transferir el embrión por permitirles estar en la misma jaula durante la noche.
- Recoger los embriones que fueron analizados zFRAP y decidieron a desarrollar la etapa de dos células.
- Inyectar por vía intraperitoneal ratones hembra con 0.7 - 0.9 mL tribromoethanol 1.2% la anestesia o con 0,35 - 0,45 mL de 0.75/4/5mg/kg midazolam/medetomidina/butorfanol mezclado agentes antes de la transferencia de embriones.
Nota: El volumen de anestesia es determinado por el peso corporal de ratones. Tribromoethanol: 0,2 mL/10 g de peso corporal; midazolam/medetomidina/butorfanol mezclado agentes: 0,1 mL/10 g de peso corporal.- Transferencia de estos embriones en fase de dos células en el oviducto de seudopreñadas ratones ICR femeninos con un tapón vaginal 0.5 días post coitum (dpc).
- Después de la transferencia de embriones, pusieron los ratones hembra en el calentador situado en 37 ° C hasta que se despiertan.
- A 18.5 dpc, sacrificar a la madre de alquiler por dislocación cervical y recuperar los cachorros derivados de cigotos zFRAP analizado por la sección cesariana. Algunos de los cachorros recuperados fueron entregados a la madre adoptiva y sus pesos corporales fueron evaluados cada semana.
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Representative Results
Análisis de zFRAP con eGFP-H2B
Correctamente producen mRNA codificación eGFP-H2B, que es visto como una banda cambiada de puesto había causada por poly un tizón (figura 2A), fue inyectado en el citoplasma de cigotos con un 2 º cuerpo polar en 1-3 h después de la inseminación (figura 2B). Ocho a 12 h después de la inseminación, cigotos con 2 pronúcleos mostrando la expresión de eGFP-H2B fueron recogido y sometido a análisis zFRAP (figura 2). El análisis FRAP consta de pasos de blanqueo y recuperación. En la fase pre-blanquea, la señal de eGFP-H2B se pudo observar (Figura 2D-1), pero una vez blanqueado, la señal disminuyó a un nivel insignificante (Figura 2D-2). Si el blanqueo fue exitoso, un agujero negro tan grande como el ROI apareció pronto después del blanqueamiento. Después del blanqueo, la intensidad de la señal de fluorescencia de eGFP-H2B recuperó un poco; la señal fluorescente aumenta gradualmente debido a la afluencia de la fracción sin blanquear de eGFP-H2B en el ROI de la zona de crudos en el nucleoplasia (Figura 2D-3). Para la confirmación del éxito de zFRAP análisis de la flojedad de la cromatina, se recomienda utilizar los padres asimetría de flojedad de cromatina; pronúcleos masculinos mostraron una curva de recuperación más rápida y las fracciones más móviles que los de las hembras (Figura 2E y F). Después de zFRAP análisis, cigotos lavados y cultivadas en medios CZB, podría desarrollar hasta la etapa de blastocisto sin daño significativo (figura 2 y H). Aunque fuertemente blanqueado por más tiempo, los cigotos podrían todavía convertirse en blastocisto así7.
Análisis del termino desarrollo de cigotos analizados zFRAP
Para analizar el desarrollo del término de embriones derivados de cigotos analizados zFRAP, fueron transferidos los embriones en la etapa de dos células en el oviducto de las madres seudopreñadas. Como controles, se prepararon los embriones intactos y se inyecta con el mRNA pero no zFRAP-análisis. La tasa de natalidad de los embriones analizados zFRAP (41.0%) fue ligeramente significativamente menor que la de embriones intactos (62.2%), pero fue el mismo que el no control de zFRAP (52.6%) (Tabla 2). Así, zFRAP-análisis parece ser un poco perjudicial para el desarrollo embrionario de termino. Lo importante, sin embargo, los cachorros derivan de cigotos analizados zFRAP parecidos sanos y completamente desarrollaron (figura 3).
Figura 1: Ilustración esquemática del flujo de los procedimientos de los experimentos. Fertilización in vitro : recién recogidos de la metafase II (MII) ovocitos fueron inseminados con espermatozoides capacitados. In vitro transcripción: ARN mensajero (ARNm) codificación eGFP fundido histona H2B (eGFP-H2B) fueron transcritas desde el promotor SP6 de pTOPO-eGFP-H2B lineal3 con no me. El mRNA de eGFP-H2B objeto de purificación y luego cola de poli A. El mRNA de eGFP-H2B purificada se utiliza en inyección de mRNA. inyección de mRNA: el mRNA de eGFP-H2B preparada se inyecta en el citoplasma de los cigotos con cuerpo de polar de 2nd . zanálisis FRAP: los cigotos expresaban eGFP-H2B se sometieron a análisis de zFRAP. La región de interés (ROI; rectángulo rojo) fue blanqueada con un laser fuerte y luego la señal de eGFP-H2B disminuyeron a un nivel insignificante. Después del blanqueo, aumenta gradualmente la intensidad de la señal de eGFP-H2B. In vitro desarrollo: Tras el análisis de zFRAP, los cigotos podrían convertirse en la fase de blastocisto. Transferencia de embriones: en etapa de dos células, los embriones analizados zFRAP fueron transferidos en los oviductos de ratones femeninos seudopreñadas. 18 días más tarde, saludables cachorros vivo podían obtenerse de embriones zFRAP-análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de zFRAP de cigotos con eGFP-H2B. (A) imagen representativa del mRNA correctamente preparado por en vitro transcripción y poli A tizón. Carril 1: pre-poly un tizón; carril 2: post cola poli A. (B) mRNA codificación eGFP-H2B fue inyectado en el citoplasma de cigotos con una inseminación de poste de 1-3 h 2nd cuerpo polar (hpi). Barra de escala = 25 μm (C) expresión de eGFP-H2B cigotos fueron recogidos en 8-12 hpi. Blanco asteriscos muestran nucleolo precursor cuerpos (NPB). Barra de escala = 10 μm (D) expresión de eGFP-H2B fue detectado en el nucleoplasia todo incluso en NPB en la fase pre-blanqueamiento (D-1), pronto después del blanqueamiento (D-2) y después de la recuperación (D-3). Las membranas nucleares (líneas punteadas blancas) y NPB (asteriscos) se indican. Barra de escala = 10 μm. curva de recuperación (E, F) y fracciones móviles se obtuvieron de 45 cigotos en 5 experimentos independientes. Azul y roja indican masculino y femenino, respectivamente. En las curvas de recuperación, solo círculos indican el punto de medición. En diagramas de dispersión, solo indica la puntuación de móvil fracciones obtenidas de pronúcleos. (G) se muestran imágenes representativas del desarrollo preimplantacional de cigotos analizados por zFRAP. Dos células, 4-8 células y blastocisto embriones en fase a las 24, 48 y 96 hpi, respectivamente. El círculo amarillo indica que el blastocisto bien desarrollado. Este blastocisto se amplió y se muestra en el panel derecho. Barra de escala = 100 μm. (H) barra gráfica de tasas de desarrollo de los embriones analizados por zFRAP. Barras indican embriones analizados zFRAP (zFRAP) (blanco) y controlan (negro) los embriones inyectados con mRNA pero ningún análisis de zFRAP (No zFRAP). Datos mostrados son de tres experimentos independientes, examinan los embriones por lo menos 57 en total. Dos células, 4-8 células, mórula (Mo) y etapas de blastocisto (Bl) fueron observadas a las 24, 48, 72 y 96 hpi, respectivamente. Esta figura ha sido modificada desde [Ooga et al 2017]7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: el crecimiento saludable de los cachorros se deriva de los cigotos analizados FRAP. (A) se muestran las imágenes de cachorros derivados de cigotos analizados por zFRAP. (B) crecimiento Normal fue observado durante la lactancia de los cachorros zFRAP-análisis. (C) el gráfico indica que el peso de los cachorros derivados de embriones intactos (azul), embriones de control sin blanquear (rojo) y embriones analizados zFRAP (verde). Pesos de 29 cachorros derivados de embriones intactos, del cuerpo 24 de no-zFRAP embriones y a 15 de zFRAP analizó embriones durante un período de 8 semanas. Los valores indicados por asteriscos son significativamente diferentes del control intacto. Esta figura ha sido modificada desde [Ooga et al 2017]7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 1: interfaz gráfica de usuario para el análisis FRAP. (A) un resumen de la interfaz gráfica de usuario se muestra. (B) mostraron imágenes ampliada para cada ventana. (1) ventana de la configuración de la adquisición se utiliza para establecer la condición de adquisición de imagen. (2) ventana de la configuración del estímulo se utiliza para establecer la condición de blanqueaba. Esta ventana se puede abrir haciendo clic en el botón en la ventana de adquisición de imagen. (3) ventana de Control de adquisición de la imagen se utiliza para el análisis FRAP. (4) el Live View muestra la imagen actual (la presente imagen aparece después de hacer clic el botón XY o enfoque x2). Los rectángulos azules rojos, verdes y luz muestran el ROI (región de interés), REF (referencia) y BG (fondo), respectivamente. (5) la vista 2D muestra la imagen de FRAP-análisis y aparece después de hacer clic en la serie"hecha" botón. En este caso, un pronúcleo masculino FRAP analizados se muestra como un ejemplo. Tres rectángulos con 8 puntos indican que estas regiones están seleccionadas. (6) la trama de vivir muestra la intensidad de la fluorescencia presente en cada región. Los ejes X e Y indican tiempo (ms) y la intensidad de fluorescencia, respectivamente. (7) el análisis de la serie muestra las pistas de la intensidad de fluorescencia en cada región y aparece después de hacer clic el botón Análisis de Series en la ventana vista de 2D. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Suplementario Excel archivo 1: datos de muestra y cálculo de datos. (Hoja 1) Se muestra un de datos de ejemplo para un pronúcleo masculino. No. indica el número consecutivo de la imagen. Se indican las intensidades de fila para cada región (ROI, Ref y BG). (Hoja 2) Se muestra un ejemplo para el cálculo de datos. Número de protocolo indica los lugares correspondientes en la sección de protocolo. Notas de explican el significado de cada puntuación. Haciendo clic en las celdas se puede hacer referencia la fórmula numérica. Se muestran ejemplos de la curva de recuperación y gráfico de barras de fracción móvil. Haga clic aquí para descargar este archivo.
| Día -3 | Día -2 | Día -1 | Día de FRAP | Día + 1 | Día + 3 | Día + 19 | |
| preparación de ARNm | Plásmido de plantilla de corte (durante la noche) |
1). plásmido de plantilla de purificación | |||||
| 2). transcripción In vitro | |||||||
| 3). poli In vitro un tizón | |||||||
| 4). control de calidad de mRNA por electroforesis | |||||||
| FRAP | 1). preparación de cámara y pipeta de manipulación | ||||||
| 2). inyección de mRNA | |||||||
| 3). Análisis de zFRAP | |||||||
| 4). cálculo de la curva de recuperación y fracción móvil* 2 | |||||||
| Fecundación in vitro y análisis de desarrollo antes de la implantación | inyección de eCG | 1). la inyección de hCG | 1). la capacitación espermática | ||||
| 2). la incubación de los medios de comunicación (HTF) | 2). fertilización In vitro | ||||||
| Preparación de los medios de comunicación (HTF, CZB, H-CZB y PVP-CZB) | 3). desarrollo preimplantacional de la evaluación | ||||||
| Transferencia de embriones | Preparación de mujer seudopreñada (monta con macho vasectomizado* 1) |
Transferencia de embriones en estadío de 2 células a mujer seudopreñada | Evaluación de la tasa de natalidad | ||||
| * 1: ratón hombres vasectomía debe prepararse por lo menos 2 semanas antes del apareamiento | |||||||
| * 2: cálculo puede prolongarse en el día siguiente (día + 1) | |||||||
Tabla 1: tabla de tiempo de los experimentos de. El día del análisis FRAP se considera como día 0 se indican los experimentos que deben llevarse a cabo en los días respectivos de cada elemento.
| Categorías | Jajaja de cigotos inyectados | Jajaja de cigotos recuperados después de la inyección de mRNA (%) * | Jajaja de cigotos analizados | Jajaja de transferir | Jajaja de los receptores | Jajaja de crías (%) *** | Peso de crías (g) | Jajaja de cachorros transgénicos |
| embriones en fase de 2 células (%) ** | ||||||||
| Intacta | - | - | 99 | 98 (99.0) | 9 | 61 (62,2)un | 1.64±0.02 | n.d |
| No FRAP | 420 | 398 (94.8) | 82 | 78 (95.1) | 7 | 41 (52,6)a,b | 1.66±0.03 | n.d |
| FRAP | 79 | 78 (98.7) | 7 | 32 (41.0)b | 1.69±0.03 | 0 | ||
| *: dividiendo con no. de cigotos inyectados; **: dividiendo con no. de cigotos analizados; : dividiendo con no. de embriones en estadío de 2 células transferidas. a, b: superíndices indican diferencias significativas (P < 0,05). n.d: no determinado. Esta tabla ha sido modificada de [Ooga et al 2017]7. | ||||||||
Tabla 2: la tasa de natalidad de los embriones analizados: Se examinó el potencial de desarrollo de los embriones, que habían sido analizados por el FRAP, a término. Se muestra la tasa de natalidad obtenida de esos embriones. Como controles, intactos y no embriones analizados FRAP también fueron examinados. Así se muestran los pesos de crías derivados de estos embriones transferidos.
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Discussion
Según lo revelado en este estudio, el análisis de zFRAP no hace daño crítico al termino desarrollo, lo que sugiere que este método es una herramienta muy útil para mostrar la asociación entre eventos moleculares y el potencial del desarrollo embrionario. Durante la reprogramación, en la célula dos como estado de células madre embrionarias, por que el potencial diferencial de esas células llega a ser tan alto como la de embriones en estadío de dos células, flojedad de la cromatina cambia en eso comparable con la etapa de dos células de embriones5. Por consiguiente, es posible que la flojedad de cromatina cigóticos es importante potencial de desarrollo embrionario. Núcleos de células somáticas transfieren en el citoplasma de ovocitos mostraron menor holgura de cromatina en comparación con no sólo los pronúcleos paternos sino pronúcleos maternos, lo que sugiere que la falta de la cromatina abierta adquisición en cigotos de transferencia nuclear de células somáticas es involucrados en su pobre potencial de desarrollo. Colectivamente, el análisis de zFRAP parece ser útil para dilucidar los mecanismos de reprogramación del genoma.
El sistema de zFRAP puede hacer posible seleccionar cigotos con alto potencial de desarrollo. En el estudio preliminar, además de células somáticas, se reveló que alrededor de inyección spermatid (ROSI)-derivado de cigotos puerto cromatina anormal flojedad. Además, se encontró que algunos de ellos mostraban flojedad de la cromatina a nivel similar a cigotos derivados de fecundación in vitro, sugiriendo que estos cigotos tienen alto potencial de desarrollo. Lo importante, cigotos de la cromatina que flojedad fue evaluada por zFRAP podrían desarrollar a plazo. En el futuro, por lo tanto, es posible distinguir los cigotos derivados de células somáticas y ROSI con mayor potencial de desarrollo más bajas por la evaluación de aflojamiento de la cromatina por zFRAP.
Hasta la fecha, estudios previos han demostrado la utilidad del método de proyección de imagen vivo para el análisis del estado epigenético en embriones de preimplantación. Algunos de los métodos de proyección de imagen Vives pueden revelar cada modificación epigenética (p. ej. modificación de DNA/histonas) en embriones de preimplantación13,14, pero usando zFRAP, es posible evaluar la flojedad de cromatina cigóticos sin matando a las células. Flojedad de cromatina parece ser afectada por las modificaciones epigenéticas. Por ejemplo, la heterocromatina que represivas modificación epigenética como H3K9me3 y H3K27me3 se enriquecen demostró menor movilidad de la histona de región euchromatic3,15. De hecho, el tratamiento con un compuesto químico, que convierte el estado epigenético, provocó la alteración de la flojedad de la cromatina en cigotos. Por lo tanto, utilizando el zFRAP, es posible revelar el estado epigenético sumativa de estructura de la cromatina. Se pensaba que esto sería una ventaja para evaluar el potencial de desarrollo de los cigotos.
La inyección de mRNA codificación eGFP-H2B para zFRAP tiene un demérito, pero aumenta la versatilidad de zFRAP. El demérito de la inyección de ARNm es el daño causado por microinyección. Para evitar esto, es muy eficaz utilizar el ratón transgénico de eGFP-H2B. Si se utiliza la línea de ratón transgénico de eGFP-H2B, la tasa de hijos puede incrementarse en comparación con el caso de usar microinyección de mRNA. Por el contrario, es el mérito de la inyección de mRNA que zFRAP permite el uso de cualquier tipo de cepa de ratones de tipo salvaje. Los investigadores que quieran utilizar zFRAP con su interés de cepa de ratón no es necesario preparar la cepa de ratón deseado con eGFP-H2B transgen. Este mérito se hace más prominente en el análisis de transgénicos (e.g. sobreexpresión/caída) o la línea de ratón knockout. Los investigadores que quieran utilizar el zFRAP para sus temas de investigación con la línea transgénica/nocaut no debe preparar la línea transgénica eGFP-H2B de un número limitado de su interés los. Esto indica una ventaja para el progreso de la investigación.
Análisis de proyección de imagen vivo con embriones preimplantación requiere conocimiento especializado y muy costosos y finamente sintonizados de dispositivos especializados. Por lo tanto, una introducción de un sistema experimental no es una decisión fácil. El sistema experimental que se establece en este estudio necesita sólo un termo calentador de además de un láser confocal de barrido microscopio. Además, el método de aprendizaje es fácil para que un principiante en un laboratorio puede aprender el método de zFRAP dentro de 1 mes. Sin embargo, hay algunas cuestiones que todavía necesitan consideración. En primer lugar es deriva del enfoque. Durante la observación, es posible que los pronúcleos o los cigotos se desvían de la posición donde presentó antes del comienzo de la observación. Si se produce la deriva de foco, ROIs difiera también de la posición correcta. Como resultado, datos cuantitativos se convierte en inútiles. Para evitar este problema, el investigador tiene que usar la tapa de los platos de fondo de vidrio para la protección contra la ventana del acondicionador de aire y esperar a que la expansión del aceite sobre la lente del objetivo. Si deriva del enfoque, los datos de los cigotos de la desviación deben ser descartados y no se recomienda un análisis FRAP 2nd con los cigotos mismo. En este estudio, acortando el tiempo de observación de 150 s3 a 25 s7 fue muy útil. En segundo lugar es una incubación más larga fuera de la incubadora. Puesto que una exposición más larga para el medio ambiente fuera de la incubadora es definitivamente dañino para el desarrollo embrionario, se recomendó para terminar el análisis de FRAP en 1 h por lote. El número de los cigotos FRAP-analizados en un medio tamponado con HEPES en los platos de fondo de vidrio debe ser de 6-10. En esta condición experimental, el número máximo es alrededor de 30 durante 4 horas pero si se necesitan más cigotos, 20 cigotos por h pueden ser analizadas por posponer la evaluación de la intensidad fluorescente en la región de referencia y antecedentes. En tercer lugar es "relacionados con el tiempo deterioro del laser de la microscopía de láser confocal". Si el blanqueamiento láser es insuficiente, la corrección de los datos cuantitativos no puede obtenerse por blanqueo insuficiente. En efecto, la asimetría parental de flojedad de cromatina cigóticos no puede ser adquirida con un blanqueamiento laser débil. Para evitar esto, se recomienda comprobar si se ha debilitado la energía del laser como la ocasión se presenta. En este estudio, 110 MW blanqueo fue suficiente para la adquisición de la asimetría de los padres.
Análisis de zFRAP pueden utilizarse para otros tipos de proteínas, además de las histonas del core. Puesto que las histonas core Mostrar prominentemente baja movilidad, más tiempo de observación total (cerca de 25 s en este estudio) es necesario en el análisis de zFRAP. Por lo tanto, para analizar un número considerable de cigotos, cultivo en medio tamponado con HEPES en el calentador durante mucho tiempo es inevitable. Por otra parte, para el análisis de zFRAP de proteínas de alta movilidad, el tiempo total de observación puede establecerse corto, lo que permite el tiempo de cultivo en medio tamponado con HEPES en el calentador para ser corto. Por lo tanto, puesto que una exposición más larga para el medio ambiente fuera de la incubadora es altamente perjudicial para el desarrollo embrionario, zFRAP análisis de las proteínas que no sean de las histonas del core, que tienen gran movilidad por naturaleza, parecen mostrar menor toxicidad que las histonas del core . Se espera que este sistema experimental ayudará aún más a la investigación de las relaciones entre distintos eventos moleculares y desarrollo embrionario.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura y Kana Kishida para proporcionar comentarios críticos y soporte técnico. Este trabajo fue parcialmente financiado por el programa Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología para promover la reforma de las universidades nacionales a M.O.; la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (16H 02593), Asada Science Foundation y la Fundación de ciencia de Takeda a T.W. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
References
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