Summary
Chromatin 설사 blastomeres의 발달 잠재력에 관련 된 것 처럼 보인다. 그러나, 그것은 알 수 없습니다 여부 chromatin 설사 배아에 대 한 발달 잠재력에 대 한 신뢰할 수 있는 인덱스로 사용할 수 있습니다. 여기, chromatin 설사 평가 zygotes 만기를 개발할 수 있는 실험 시스템 설명 하고있다.
Abstract
라이브 영상 ontogenesis 동안 분자 이벤트의 분석을 허용 하는 강력한 도구입니다. 최근, chromatin 풀림 또는 개방 만능 배아 줄기 세포의 세포질 감 별 법 잠재력에 포함 될 표시 되었습니다. 그것은 이전에 비해 알려졌다 배아 줄기 세포와 zygotes 항구 그들의 totipotency와의 연결을 제안 하는 매우 느슨하게 chromatin 구조를. 그러나, 지금까지 그것은 되지 해결 되었습니다이 매우 느슨하게/오픈 chromatin 구조 배아 발달 잠재력에 대 한 중요 한 인지. 현재 연구에서이 가설을 시험 하는 실험 시스템 형광에 의해 분석 된 어떤 zygotes 사진 표백 후 복구 기간 어떤 뜻깊은 손상도 없이 개발할 수 있는 개발 되었다. 중요 한 것은,이 실험적인 시스템만 보온병 플레이트 히터 confocal 레이저 스캐닝 현미경 이외에 필요 합니다. 이 연구의 결과 분석 (FRAP) 분석 사진 표백 zygotic chromatin에서 분자 이벤트 전체 기간 개발에 대 한 중요 한 인지 조사를 사용할 수 있는 후 그 형광 복구를 좋습니다.
Introduction
수정, 후 염색 질 구조를 동적으로 변경 하 고 zygotic 염색 질 구조는 다음 결국 설립된1,2. 아버지 pronuclei에이 기간 동안 지배적인 chromatin 단백질 히스톤으로 protamine에서 변경 됩니다. 결과 chromatin sperms와 몇 가지 포인트 (예, 히스톤 변형 구성, 히스톤 수정) 여성 oocytes에서 매우 다르다. 따라서, 형성된 zygotic chromatin 이후의 배아 발달에 대 한 중요 한 것으로 생각 된다. 그러나, 오랜 기간 동안 zygotic chromatin 구조의 세부 정보를 공개 하는 노력에 불구 하 고 방법을 zygotes의 품질을 평가 하거나 1 셀 단계에서 그들의 전체-용어 개발의 염색 질 구조를 분석 하 여 예측 하는 적 설립.
이전 연구에서 그것은 발견을 zygotes 매우 느슨하게 chromatin 구조3. 현재, chromatin 풀림 또는 개방 세포 분화 배아 줄기 (ES) 세포4잠재력에 대 한 중요 한 요소가 될 여겨진다. ES 세포 자연, 동질성을 전시 하지 않습니다 하지만 오히려 다른 유형의; ES 세포 식민지, 일부 정도 높은 감 별 법 잠재력 blastomeres 2 셀 단계 배아의 비교를 획득. 상태 처럼 2 셀으로이 전환 중 ES에서 chromatin 설사 2 세포 단계 태아5와 비교에 변화 세포. 따라서, chromatin 설사 세포질 감 별 법 잠재력과 그것은 가능한 광범위 하 게 chromatin zygotes에서 열리는 중요 한 것 zygotic 개발 잠재력의 평가 위해 유용 하는 것 같다.
라이브 영상 때문에이 메서드는 후속 개발 및도 전체 용어 개발6수 있습니다 ontogenesis 동안 분자 이벤트의 분석을 허용 하는 강력한 도구입니다. 라이브 이미징 방법 중 하나로 FRAP 분석 preimplantation 배아와 ES 세포3,,45chromatin 설사 검사를 사용 되었습니다. Zygotic chromatin 설사 FRAP 분석 개발 전체-용어에 해로운 효과 없이 분석할 수 있습니다, 만약 1 셀 단계에서 배아의 품질 평가 대 한 유용한 도구 수 있습니다. 그러나,이 실험 방법으로 전체 용어 개발에 효과 있다 하지 조사 되었습니다. 최근, FRAP를 사용 하 여 zygotic chromatin 풀림을 평가 하는 실험 시스템 개발 되었다. 왜냐하면이 zygotes 위한 새로운 관측 시스템, 그것 zygotic FRAP (zFRAP) 되 나 했다. zFRAP 전체 용어 개발을 비판적으로 미치지 않았다 고 되었습니다 보고 다른 곳에서7. 이 보고서에서이 실험 방법의 프로토콜을 설명 합니다.
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Protocol
이 연구는 관심과 야마나시 대학의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에서 권장 사항을 따라에서 수행 되었다. 프로토콜 야마나시 대학의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (허가 번호: A24-50). 모든 수술 tribromoethanol 마 취하에 수행 했다 하 고 고통을 최소화 하기 위해 모든 노력 했다. 절차 및 타임 테이블의 그림된 개요는 각각 그림 1 및 표 1에 표시 됩니다.
1. 메신저 RNA (eGFP H2B mRNA의체 외에서 전사)의 준비
- 하지 의 30 U 템플릿 DNA pTOPO eGFP H2B3,7 의 5 µ g을 선형화 나 37 ° C에서 50 µ L에서 하룻밤.
- 전기 이동 법에 의해 완전히 소화 여부 확인에 대 한 소화 DNA의 1.5 µ L를 수집 합니다.
- 1.5 µ L와 소화 되지 않은 DNA 전기 이동 법 및 2 %agarose 젤의 우물에 염료를 각각, 로드의 3-5 µ L를 적용 합니다.
참고: 완전히 소화, 단일 밴드 (약 5 kb) 관찰 됩니다. 소화 되지 않은 DNA는 서로 다른 위치에 표시 되는 컨트롤으로 사용 됩니다.
- 1.5 µ L와 소화 되지 않은 DNA 전기 이동 법 및 2 %agarose 젤의 우물에 염료를 각각, 로드의 3-5 µ L를 적용 합니다.
- DdH2O의 151.5 µ L를 더하고 200 µ L 나머지를 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜 (25:24:1)의 DNA를 소화.
- 적극적으로 소용돌이 의해 혼합.
- 15 분 동안 최대 속도로 원심.
- 복구는 상쾌한 고 클로 프롬의 200 µ L를 추가 합니다.
- 적극적으로 소용돌이 의해 혼합.
- 15 분 동안 최대 속도로 원심.
- 복구는 상쾌한 고 20 µ L 3 M 나트륨 아세테이트 및 ethachinmate의 1.5 µ L를 추가 합니다.
- 적극적으로 소용돌이 의해 혼합.
- 100% 에탄올의 550 µ L을 추가 하 고 적극적으로 소용돌이 의해 혼합.
- 15 분 동안 최대 속도로 원심.
- 삭제는 상쾌한 고 70% 에탄올과 펠 릿을 세척.
- 5-10 분에 대 한 증발에 의해 건조 한 펠 릿.
- Nuclease 무료 물 8 µ L에서 침전 된 플라스 미드 DNA를 분해.
- 플라스 미드 농도 평가 (예상된 농도 300-500 ng / µ L) 제조업체의 지시에 따라 nanodrop와 함께.
- 제조업체의 지침에 따라 총 반응 볼륨의 20 µ L에서 템플릿으로 eGFP H2B 1 µ g의 정제 DNA와 인코딩 mRNA 녹음 방송 생체 외에서 수행 합니다.
- 녹음 방송 생체 외에서 후 물 36 μ를 추가한 다음 (로 하지 않고 폴 리 A) 전기 이동 법에 의해 분석에 대 한 합성된 mRNA의 56 µ L에서 1.5 µ L를 복구 합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 합성된 mRNA를 100 µ L 반응 볼륨에 대 한 폴 리 A 미행을 수행 합니다.
- 폴 리의 eGFP H2B 꼬리 mRNA 리튬 염화 물 해결책 강수량의 60 µ L을 추가 하 고 적극적으로 섞는다.
- 30 분-30 ° C에 냉각 하십시오.
- 15 분 동안 최대 속도로 원심.
- 삭제는 상쾌한 고 70% 에탄올과 펠 릿을 세척.
- 5-10 분에 대 한 증발에 의해 건조 한 펠 릿.
- 30 분 동안 55 ° C에 난방에 의해 nuclease 무료 물 20 µ L와 펠 릿을 디졸브.
- Nanodrop와 침전 된 mRNA의 농도 평가 합니다. 사용까지 nuclease 무료 물과 저장소-80 ° C에서 500 ng / µ L를 희석.
- 확인 기본 설정된 mRNA 생산; 제목/없이 mRNA의 1 µ L (얻은 1.8.1 1.12 단계, 각각) 폴 리 꼬리 0.1 mg/mL ethidium 평범한 사람의 1.5 µ L와 3 µ L 전기 이동 법 분석 샘플 로드 염료의 혼합. 적용 된 볼륨 5.5 µ L 이었다입니다.
참고: 폴 리 A 미행에 성공 하면 폴 리는 미행 없이 mRNA에 비해 이동된 밴드 관찰 해야 (그림 2A).
2입니다. Vasectomized 남성 생쥐의 준비
- ICR 남성 쥐 체중 규모를 사용 하 여 8-12 개월에 무게.
- 0.7-0.9 mL 1.2 %tribromoethanol 마 취와 함께 남성 쥐를 주사 intraperitoneally.
참고: 마 취의 크기는 마우스의 크기에 따라 달라 집니다. 예를 들어 마우스 무게 40 g tribromoethanol 마 취의 0.8 mL로 주사 된다. - 70% 에탄올과 베리 젖은.
- 작은 베리에 (3-5 m m)를 잘라 이며가 위의 도움으로 근육 벽에 절 개를 확인 합니다.
참고:가 위, 집게 청소 되어야 한다 70% 에탄올과 수술을 시작 하기 전에. - 집게와 지방 패드를 살짝 밖으로 당겨. 그러면, 고환과 vas deferens 나타납니다.
참고: Vas deferens 는 U 자형 튜브와 빨간 혈관. - 수술 봉합 두 지점에서 vas deferens 에서 고 묶인된 점 사이의 중간 부분을 잘라.
- 부드럽게 다시 지방 패드와 고환에 밀어 베리.
- 나머지 고환으로 수술을 반복 합니다.
- 외과 봉합과 두 개의 바늘으로 근육 벽에 바느질도 해요.
3입니다. 시험관
- 8-10 주 오래 된 여성 B6D2F1 주사 7.5 IU 말 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (eCG)와 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG) 46-50 h 간격에 intraperitoneally (BDF1) 쥐.
- Capacitation 및 수정을 1 일전 30 mm 접시에는 IVF에 대 한 300 µ L 인간의 튜 유체 (HTF)8 미디어의 방울을 준비 하 고 실험실 벤치에 미네랄 오일이 방울 커버 다음 하룻밤 인큐베이터에 preincubate.
- 자 궁 경부 전위에 의해 성숙 된 남성 ICR 마우스를 희생. Cauda epididymis 27 G 바늘으로 해 부와 정자를 수집 합니다. 38 ° c.에 1-2 h HTF 미디어의 capacitation 300 µ L에 대 한 문화
- hCG 주사 후 16 h는 자 궁 경부 전위에 의해 슈퍼 ovulated 여성 쥐를 희생. 수 란 관 ampulla HTF 미디어 옆 미네랄 오일으로 전송 하 고 후 적 운 세포와 복잡 한 oocytes에서에서 그릴이 수 란 관 ampulla 30 G 바늘 preincubated 인공 HTF 매체에.
참고: 일부 여성 쥐 슈퍼 배 란 치료에도 불구 하 고 배 란 자주 표시 되지 않습니다. 확대 수 란 관 ampulla 배 란의 표시 이다입니다. - Capacitation, 후 2-3 µ L capacitated 정자의 수정을 HTF 미디어 ovulated oocytes 수집 된로 전송 합니다.
- 1 시간 후에 수정, 수정 란된 zygotes 수집 하 고 hyaluronidase CZB9 미디어에서 10 분 100 µ g/mL에서 그들을 치료.
참고: 수정을 제대로 수행 되 면 수정, 후 1 h 2nd 북극 시체와 함께 수정된 zygotes 관찰 된다. 또는 낮은 품질 정자를 사용 하는 경우 2차 극 체와 작은 zygotes만 관찰 된다. 또한, 많은 sperms 수정을 위해 사용 하는 경우 polyspermy 발생 합니다. 적절 한 인공 zygotes 남성과 여성 pronuclei로 이끌어 낸다. 이러한 기준을 사용 하 여 수정을 잘 되었는지를 찾아야 가능 하다.- CZB 미디어에서 세척, 후 두 번째 극 시체 zygotes eGFP H2B mRNA와 microinjection를 주제.
4. 준비 실 및 Microinjection의 펫
- 희석 RNA eGFP H2B nuclease 무료 물 250 ng / µ L의 농도를 사용 하 여 인코딩.
- PVP-HTF의 2-3 방울을 준비 및 eGFP H2B mRNA, 삭제 하 고 5-6 방울 Hepes 버퍼링 60 mm 접시에 드랍 스 CZB (H-CZB). 미네랄 오일이 방울을 커버.
참고: 이러한 준비는 실험실 벤치에 수행할 수 있습니다. 공기 흐름을 층 류 캐비닛을 사용 하 여에 대 한 필요가 있다. - Micropipette 끌어당기는 사람와 붕 규 산 유리를 끌어 (예를 들어, P = 500, 열 = 825, 풀 30, 벨 = = 120, 및 시간 = 200)
- 중단 후 피 펫, 팁은 microforge를 사용 하 여 30 °의 주위에 가져온된 유리 microinjection 피 펫 팁 (−300 다시 µ m) 주변을 구 부.
5입니다. microinjection
- Micromanipulator mRNA 주입 중 한 피와 zygotes의 살인을 방지 하기 위해 무대에 플레이트 히터를 끕니다.
- 워시와 HEPES 버퍼링 HTF에 주사 바늘의 내부 코트 10% 포함 된 PVP (PVP-HTF).
- 2차 극 체 (그림 2B)와 수정된 zygotes 수집 하 고는 micromanipulator와 연결 된 현미경 단계의 상공에 20-25 zygotes 전송.
- 도움말에서 붕 규 산 유리 모 세관으로 희석된 eGFP H2B mRNA를 채우십시오.
- 들고 피 펫과 접합 자 누른 다음 zona pellucida 및 피에 조 드라이브 cytosolic 막 휴식.
- 약 10 주사는 zygotes의 세포질에 mRNA의 pL. 더 이상 인큐베이터 밖에 zygotes 경작으로 인 한 피해를 방지 하기 위해 10 분 이내 mRNA-주입 완료.
참고: 사출 볼륨 2nd 극 몸 만큼 큰 해야 합니다. 주입 하는 mRNA의 양을 너무 크면, 모바일 분수에 영향을 미칠 수 있습니다 무료 eGFP H2B 분수 발생 가능 하다. - microinjection, 후 10 분 이상 3 방울에 세척 하 고 zFRAP 분석까지 38 ° C에 CZB에 주입된 zygotes 문화.
6입니다. zFRAP 분석
- zFRAP 분석, 이전 1 h 레이저 confocal 현미경의 단계에 연결 된 핫 플레이트에 설정. 38 ° c.에 온도 설정
- 위에 6-10 µ L HEPES 버퍼 CZB 미디어의 60 m m 유리 하단 접시에 미네랄 오일으로 덮여와 따뜻한 히터 zygote 컬렉션까지.
- 8-수정 후 12 h, 수집 5-10 zygotes eGFP H2B 표현 및 전송의 6-10 µ L로 미리 예 열 HEPES 버퍼 CZB 중간 드롭.
참고: 인큐베이터 밖에 더 이상 경작을 피하기 위해, 5-10 eGFP H2B 표현 zygotes 각 분석에서 사용 되었다. 1 시간 이내 5 ~ 10 zygotes는 분석할 수 있습니다. - 제조업체의 지침에 따라 표백 및 이미징 조건을 설정 합니다. 경우는 confocal 레이저 스캐닝 현미경 (자료 테이블)는 아래와 같습니다.
- 사용 오일 렌즈 X 60 (60 X 60 X 1.35 / 기름).
참고: 높은 배율 (높은 수 가늠 구멍) 쇼 높은 감도와 렌즈. - 스캐닝 속도 4.0 µs/픽셀 및 크기 "512" "수집 설정" (보충 그림 1)로 설정 합니다.
- 증가 디지털 확대/축소 "5" (보충 그림 1).
참고: 높은 줌 초점 드리프트 발생 하거나 하지 여부를 인식 해야 합니다. - 염료 (보충 그림 1) 목록과 다음 선택 "EGFP"를 엽니다. 1.6 관측 시간 설정 s (간격 "무료 실행" 설정으로 설정 되어) (보충 그림 1)
참고: 더 많은 관찰 포인트 더 자세한 데이터를 하지만 그것은 또한 phototoxicity를 발생할 수 있습니다. ZFRAP 분석에서 1.6 s 관측 시간 chromatin 풀림의 부모의 비대칭을 감지 하기에 충분 한 것으로 보인다. - 총 (보충 그림 1)에서 12 그림의 수를 설정 합니다.
- "자극 설정" 패널을 시작 하 고 UseScanner에 "기본"을 클릭 합니다. 스캐닝 속도 10.0 µs/픽셀으로 설정 합니다. "시리즈에 활성화"를 클릭 하 고 설정 PreActivation "3 프레임" 및 활성화 시간으로 "5 초" (보충 그림 1).
- "포커스 x 2" 클릭 하 고 포커스를 설정 하 고 "중지".
- 표백 및 이미징 레이저 전원 설정 (477 nm) 110 및 15 µW에 각각으로 조정 "게이지 전원 레이저" (보충 그림 1).
참고: 매우 강한 표백 정량 분석에 대 한 어려움을 일으키는 원인이 되는 더 큰 표백된 지역에 발생할 수 있습니다. 레이저 힘의 측정, 전력 측정기를 사용 합니다. 그것은 레이저 파워 레이저 힘의 시간 관련 저하의 효과 피하기 위해를 확인 하는 것이 중요입니다. - 자극 설정 패널에서 "클립 Rect" (보충 그림 1)를 클릭 합니다. (투자 수익; 빨강; 관심 영역을 설정 투자 수익 #1B) 40 x 40 픽셀 (7.6 μ m2). 준비 참조 영역 (REF; 녹색; 투자 수익 #2), 그리고 배경 (BG; 파랑; 투자 수익 #3)를 사용 하 여 "ROI 복사" 및 "ROI 붙여넣기" (마우스 오른쪽 클릭 버튼).
참고: 픽셀 크기는 커서가 ROI에 있을 때 마우스의 오른쪽 버튼을 클릭 하 여 호출할 수 있습니다 "ROI 관리자"를 통해 설정할 수 있습니다. 이후 그들은 zFRAP 점수의 분산을 표준화할 수 있습니다 나은 사람이 되도록 큰 ROIs 생각 된다. 그러나, ROI의 너무 큰 사용할 수 없습니다이 분석을 위해 그것은 어려운 핵소체 전조 몸 (일)을 방지 하기 때문에. 이 구획 eGFP H2B chromatin에서 자유를 생각 하 고 보여준 놀라운 높은 이동성3했다. 투자 수익 및 REF 영역 가능한 분리 되어야 한다. 이 두 영역은 긴밀, 표백 수 있습니다 또한 영향을 미칠 REF의 지역. - 도구 모음에서 "라이브"를 클릭 한 다음 "라이브 플롯" (보충 그림 1)을 시작 합니다.
참고: 라이브 작 각 ROI 내의 형광 신호 강도 나타냅니다 및 HV를 사용 하 여 레이저 파워를 조정 하기 위해 사용 됩니다. 투자 수익을 선택 하지 않으면 아무 강도 라이브 플롯 패널에 감지 것 참고. - 투자 수익 위치 결정
참고: 투자 수익 pronuclei의 원하는 위치로 드래그 하 여 이동할 수 있습니다. (1) 핵소체, 방지 하 고 (2)는 nucleoplasm에 전체 투자 수익 적합. 투자 수익에 핵 막 (세포질)의 영역 외부 영역을 포함 하지 않습니다. 쉽게 투자 수익 세포질 포함 여부 eGFP H2B의 형광을 찾을 수 있도록 eGFP H2B의 지역화는 매우는 nucleoplasm로 제한 됩니다. 남성 pronuclei 2차 극 체 근처 지역화 종종 여성 보다 더 큰이 어 경향이 있다. 이러한 기준을 사용 하 여, 하는 동안 남성 또는 여성 pronuclei 판단. - "포커스 x 2" 클릭 (추가 그림 1)는 HV 파워 게이지 채널의 EGFP 위한 형광 강도 약 2000으로 조정 (형광 강도 "라이브 음모" 창에서 볼 수 있습니다).
- 사용 오일 렌즈 X 60 (60 X 60 X 1.35 / 기름).
- "시간" 및 다음 "XY" (보충 그림 1) zFRAP 분석 시작을 클릭 합니다.
참고: "시간" 버튼 선택 적절 한 "t" "XY" 버튼에 표시 됩니다.- 클릭 "시리즈 완료" (보충 그림 1), FRAP 이미징 후 나타나는 "XY 버튼" 근처 고 FRAP 분석 데이터.
- "2D 이미지 보기 XXXXX" 의해 기본 명명 된 파일 (oib. 파일 형식)으로 "다른 이름으로 저장" 파일을 저장 (Ctrl + Shift + S 또한 사용할 수 있습니다).
- REF, 수익과 BG를 선택 하 고 다음을 클릭 합니다 (Ctrl + A 또한 사용할 수 있습니다) "2D 이미지 보기" 창에서 "시리즈의 분석".
- 행 FRAP 데이터를 취득 하 고 "저장" 라이브 작 창에서 버튼을 클릭.
참고: 행 FRAP 양적 데이터를 csv 파일로 저장 됩니다.
- ZFRAP 통제, 형광 관찰에서 효과 피하기 위해 유리 하단 접시의 가장자리에 가까이 있는 드롭에서 mRNA와 주입 zygotes의 일부를 넣어.
7. 데이터 계산
- 사용 하는 동안 얻은 정량적 데이터 참조3,7 일부 수정 (참조 추가 하 고 아래 엑셀 파일)와 같이 "복구 곡선" 및 "모바일 분수" Excel에서 그래프를 확인 합니다.
- 각 시간 지점에 대 한 12 그림에 투자 수익 및 REF의 BG의 값을 빼서 상대 강도 계산 합니다.
- 심판의 투자 수익의 값을 나눕니다. 그 결과, 각 시간 지점에서 12 상대 강도 표준화 된 점수를 얻을 수 있습니다.
- 3 이미지를 표백 하는 사진 전에 찍은 투자 수익에 대 한 상대 점수 평균을 계산 합니다.
- 복구 속도 계산 합니다. 나누기 12 사진 (7.1.3에 획득) 표백 하기 전에 상대 점수의 평균 (7.1.2에서 획득) 각 시간 지점에서 촬영 한 이미지에 투자 수익에 대 한 상대 점수를 획득 합니다. 이 점수를 사용 하 여 복구 곡선 그리기 (그림 2E).
- 표백 속도 계산 합니다.
참고: 표백 비율 (%) = 100-4번째 이미지의 복구 속도. - 다음과 같이10,,1112 에서 수식을 사용 하 여 모바일 분수 (MF) 계산
MF (%) = (끝점)-에서 12번째 복구 속도 4일 복구 속도 비율 × 100 표백 /.
8. 배아 전송
- 8-12 개월 vasectomized 남성 ICR 마우스 배아 하룻밤 같은 장에 될 하 여 전송 하기 전에 밤에 성숙된 ICR 여성 친구.
- ZFRAP 분석 되었고 냉동 단계로 개발 결정 배아를 수집 합니다.
- 0.7-0.9 mL 1.2 %tribromoethanol 마 취 또는 0.35-0.45 mL 배아 전송 전에 0.75/4/5mg/kg medetomidine/midazolam/butorphanol 혼합된 대리인의 intraperitoneally 여성 쥐를 주입.
참고: 마 취의 볼륨은 생쥐의 몸 무게에 의해 결정 됩니다. Tribromoethanol: 0.2 mL/10 g의 몸 무게; medetomidine/midazolam/butorphanol 에이전트 혼합: 몸 무게의 0.1 mL/10 g.- 0.5 일 게시물 coitum (dpc)에서 질 플러그 pseudopregnant 여성 ICR 생쥐의 oviducts에 이들 2 세포 단계 배아를 전송 합니다.
- 배아 전송 후 37 ° C에서 설정 하는 그들이 깨어 때까지 히터에 여성 쥐를 넣어.
- 18.5 dpc에서 대리 모 자 궁 경부 전위에 의해 희생 하 고 제왕 절 개에 의해 zFRAP 분석 zygotes에서 파생 된 새끼를 복구 합니다. 일부 복구 된 새끼 양 어머니에 게 전달 했다 고 그들의 몸 무게는 각 주를 평가 했다.
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Representative Results
eGFP H2B zFRAP 분석
제대로 생산 mRNA eGFP-H2B, 미행 (그림 2A) 폴 리로 인 한 이동된 밴드 볼, 인코딩 수정 (그림 2B) 후 1-3 h 2 극 시체 zygotes의 세포질으로 주입 했다. 8 12 수정 후 h, 2 pronuclei eGFP H2B의 식을 보여주는 함께 zygotes 수집 하 고 zFRAP 분석 (그림 2C)를 받게 했다. 표백 및 복구 단계 FRAP 분석에 의하여 이루어져 있다. 미리 표백 단계에서 eGFP H2B의 신호 (그림 2D-1), 관찰 될 수 있었다 그러나 표백, 일단 신호 무시할 수준 (그림 2D-2)을 거부 했다. 표백 하는 것에 성공 하면 투자 수익 만큼 큰 어두운 구멍 표백 후 곧 나타났다. 표백 후, eGFP H2B 형광 신호 강도 복구 약간; 형광 신호 (그림 2D-3) nucleoplasm에 표백 하지 않은 지역에서 투자 수익으로 eGFP H2B의 표백된 분수의 유입 때문에 점차적으로 증가. Chromatin 설사의 zFRAP 분석의 성공 여부의 확인에 대 한 것이 좋습니다 부모의 비대칭 chromatin 풀림;의 사용 남성 pronuclei 빠른 복구 곡선과 여성 (그림 2E 와 F) 보다 더 많은 모바일 분수를 보여주었다. ZFRAP 분석, 세척 하 고 교양 zygotes CZB 미디어, 후 (그림 2G 및 H) 중요 한 손상 없이 blastocyst 단계로 개발할 수 있습니다. 경우에 강력 하 게 긴 시간 동안 표백는 zygotes 개발할 수 있습니다 아직도 뿐만 아니라 blastocyst 단계에7.
ZFRAP 분석 zygotes의 전체 용어 개발의 분석
ZFRAP 분석 zygotes에서 파생 된 태아의 전체 기간 개발 분석, 2 셀 단계에서 배아는 pseudopregnant 어머니의 oviducts로 옮겨 졌다. 컨트롤, 그대로 태아, 그리고 mRNA 하지만 zFRAP 분석 되지 주입 준비 되었다. ZFRAP 분석 배아 (41.0%)의 출생 률은 약간 하지만 그대로 배아 (62.2%) 보다 크게 낮은 했지만 아무 zFRAP 제어와 동일 (52.6%) (표 2)입니다. 따라서, zFRAP 분석 약간 전체 기간 배아 발달에 유해할 것으로 보인다. 그러나, 중요 한 것은, 새끼 듯 건강 한 zFRAP 분석 zygotes에서 파생 하 고 완전 개발 (그림 3).
그림 1: 실험에 대 한 절차의 흐름의 구조 그림. 체 외에서 수정: 갓 수집된 분열 II (MII) oocytes capacitated 정자로 수정 했다. 생체 외에서 전사: 메신저 RNA (mRNA) eGFP 융합 히스톤 H2B 인코딩 (eGFP H2B)는 선형화 pTOPO eGFP H2B3 하지 의 SP6 발기인에서 변하게 했다 나. EGFP H2B mRNA 대상이 폴 리 A 미행 그리고 정화. 순화 eGFP H2B mRNA mRNA 주입에 사용 됩니다. mRNA 주입: 준비 eGFP H2B mRNA 2nd 북극 시체와 함께 zygotes의 세포질을 주입. zFRAP 분석: eGFP H2B 표현 zygotes zFRAP 분석을 복종 되었다. 이익 (ROI, 빨간색 사각형)의 지역 강한 레이저로 표백 했다 하 고 eGFP H2B 신호 무시할 수준으로 떨어졌다. 표백 후, eGFP H2B 신호의 강렬은 점차적으로 증가 했다. 생체 외에서 개발: ZFRAP 분석, 후에 zygotes blastocyst 단계에 개발할 수 있습니다. 배아 전송: 2 셀 단계에 zFRAP 분석 배아 pseudopregnant 여성 쥐의 oviducts로 옮겨 졌다. 18 일 후, 건강 한 살아있는 새끼 zFRAP 분석 배아에서 얻을 수 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: eGFP H2B로 zygotes의 zFRAP 분석. (A) 시험관에 전사와 폴 리 A 미행 하 여 제대로 준비 된 mRNA의 대표 이미지. 1 레인: 사전 많은 미행; 레인 2: 폴 리 A 미행을 게시. (B) mRNA eGFP H2B 인코딩 2nd 북극 본문 1-3 h 게시물 수정 (hpi)와 zygotes의 세포질에 주입 했다. 눈금 막대 = 25 µ m (C) eGFP H2B 표현 zygotes 8-12 hpi에서 수집 했다. 화이트 별표 표시 핵소체 전조 시체 (일). 눈금 막대 = 10 µ m (D) eGFP H2B 식 감지 되었습니다 일에도 전체 nucleoplasm에서 미리 표백 단계 (D-1), 곧 (D-2), 표백 후 전후 복구 (D-3). 핵 막 (흰색 점선)과 일 (별표) 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. (E, F) 복구 곡선과 모바일 분수 5 독립적인 실험에서 45 zygotes에서 입수 했다. 파란색과 빨간색 남성과 여성, 각각 나타냅니다. 복구 곡선에서 단일 원형 측정 포인트를 나타냅니다. 점도, 단일 점 pronuclei에서 얻은 모바일 분수의 점수를 나타냅니다. (G) 의 zFRAP 분석 zygotes preimplantation 개발의 대표 이미지는 표시 됩니다. 2 셀, 4-8 셀, 그리고 blastocyst 단계 배아에 24, 48, 96 hpi, 각각. 노란색 원은 개발된 blastocyst을 나타냅니다. 이 blastocyst 확대 하 고 오른쪽 패널에 표시 된. 눈금 막대 = 100 µ m. (H) 막대 그래프 zFRAP 분석 배아의 발달 속도의. 바는 zFRAP 분석 (zFRAP) 태아 (흰색) 나타내고 배아 (검정) mRNA 하지만 아무 zFRAP 분석 (zFRAP) 주입을 제어 합니다. 표시 되는 데이터는 총에서 적어도 57 태아 검사 3 개의 독립적인 실험에서. 2 셀, 4-8 셀, morula (Mo), 그리고 (Bl) blastocyst 단계 관찰 되었다 24, 48, 72, 및 96 hpi, 각각. 이 그림은 [우 외 2017]7에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 강아지의 건강 한 성장을 FRAP 분석 zygotes에서 파생 된. (A) zFRAP 분석 zygotes에서 파생 된 강아지의 사진이 표시 됩니다. (B) 정상적인 성장 zFRAP 분석 새끼의 간호 하는 동안 관찰 되었다. (C) 그래프 표백된 제어 배아 (빨간색), 그리고 zFRAP 분석 배아 (녹색) 강아지의 무게 그대로 배아 (파란색)에서 파생 된을 나타냅니다. 몸 무게 그대로 배아에서 파생 된 29 강아지의 아니오 zFRAP 배아, 그리고 zFRAP 분석 배아는 8 주 동안에서 15에서 24. 별표로 표시 된 값 그대로 컨트롤 크게 다르다. 이 그림은 [우 외 2017]7에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: FRAP 분석을 위한 그래픽 사용자 인터페이스. (A) 그래픽 사용자 인터페이스의 개요를 표시 했다. (B) 각 창에 대 한 확대 이미지 표시 했다. (1)는 수집 설정 창이 이미지 수집 조건을 설정 하는 데 사용 됩니다. (2)는 자극 설정 창이 표백 조건을 설정 하는 데 사용 됩니다. 이 윈도우 이미지 수집 창에 있는 단추를 클릭 하 여 열 수 있습니다. (3) 이미지 수집 제어 창이 FRAP 분석에 사용 됩니다. (4) 라이브 보기 (현재 이미지 초점 x2 또는 XY 단추를 클릭 한 후 나타납니다) 현재 이미지를 보여줍니다. 빨강, 녹색, 및 밝은 파란색 사각형 표시 ROI (관심 지역), REF (참조), 그리고 BG (백그라운드), 각각. (5) 2D 보기 FRAP 분석 이미지를 표시 하 고 "시리즈 완료"를 클릭 한 후 나타납니다 버튼. 이 경우에, 예를 들어 FRAP 분석 남성 pronucleus 표시 됩니다. 3 사각형 8 점 들을이 지역 선택 됩니다 나타냅니다. (6) 각 지역에서 현재 형광 강도를 보여줍니다 라이브 플롯. X 및 Y 축 표시 시간 (밀리초) 및 형광 강도, 각각. (7)는 시계열 분석 각 지역에서 형광 강도의 트랙을 표시 하 고 2D 뷰 창에 시리즈 분석 단추를 클릭 한 후 나타납니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 Excel 파일 1: 예제 데이터 및 데이터 계산. (1 장) 남성 pronucleus에 대 한 예제 데이터가 표시 됩니다. 롤 이미지의 연속 번호를 나타냅니다. 각 지역 (ROI, Ref, BG)에 대 한 행 농도 표시 했다. (부 2) 데이터 계산에 대 한 예가 표시 됩니다. 프로토콜 번호는 프로토콜 섹션에서 해당 위치를 나타냅니다. 노트 각 점수의 의미를 설명합니다. 숫자 수식 셀을 클릭 하 여 참조할 수 있습니다. 예 복구 곡선 및 모바일 분수 막대 그래프의 표시 됩니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
| 하루-3 | 하루-2 | 하루-1 | FRAP의 하루 | 하루 + 1 | 일 + 3 | 하루 + 19 | |
| mRNA 준비 | 절단 템플릿 플라스 미드 (밤새도록) |
1). 정화 템플릿 플라스 미드 | |||||
| 2). 생체 외 녹음 방송 | |||||||
| 3). 생체 외에서 폴 리는 미행 | |||||||
| 4). 전기 이동 법에 의해 mRNA 품질 검사 | |||||||
| 졸라 | 1). 조작 피펫으로 및 챔버의 준비 | ||||||
| 2). mRNA 주입 | |||||||
| 3). zFRAP 분석 | |||||||
| 4). 복구 곡선 및 모바일 분수의 계산* 2 | |||||||
| IVF와 사전 이식 개발의 분석 | eCG 주입 | 1). hCG 주입 | 1). 정자 capacitation | ||||
| 2). 미디어 (HTF)의 사전 부 화 | 2). 체 외 수정 | ||||||
| 미디어 (HTF, CZB, H-CZB 및 PVP-CZB)의 준비 | 3). 평가 preimplantation 개발 | ||||||
| 배아 전송 | Pseudopregnant 여자의 준비 (vasectomized 남성 짝짓기* 1) |
Pseudopregnant 여성 2 셀 단계 배아 전송 | 출생 률의 평가 | ||||
| * 1: vasectomized 남성 마우스 짝짓기 하기 전에 적어도 2 주를 준비 한다 | |||||||
| * 2: 계산 다음 날 (+ 1 일)로 연장 될 수 | |||||||
표 1: 실험의 타임 테이블. FRAP 분석의 하루 하루 0. 실험 수행 해야 하는 각 항목에 대 한 일에 표시로 간주 됩니다.
| 카테고리 | 롤 주입 된 zygotes의 | 롤 mRNA 주입 (%) 후 복구 zygotes의 * | 롤 zygotes의 분석 | 롤 전송 | 롤 받는 사람 | 롤 강아지 (%)의 * * * | 강아지 (g)의 무게 | 롤 유전자 변형 새끼의 |
| 2 세포 단계 태아 (%) * * | ||||||||
| 그대로 | - | - | 99 | 98 (99.0) | 9 | 61 (62.2)는 | 1.64±0.02 | n.d |
| 아니 FRAP | 420 | 398 (94.8) | 82 | 78 (95.1) | 7 | 41 (52.6)a,b | 1.66±0.03 | n.d |
| 졸라 | 79 | 78 (98.7) | 7 | 32 (41.0)b | 1.69±0.03 | 0 | ||
| *: 함께 나누어 계산. 주입된 zygotes; * *: 함께 나누어 계산. 분석; zygotes의 : 함께 나누어 계산. 전송된 2 셀 단계 배아. a, b: 위 첨자 나타냅니다 중요 한 차이 (P < 0.05). n.d: 결정 되지. 이 테이블은 [우 외 2017]7에서 수정 되었습니다. | ||||||||
표 2: 분석 된 태아의 출산 율: 전체 기간에 왔다 FRAP 분석, 배아의 발달 잠재력 시험 되었다. 이러한 배아의 획득된 출생 률이 표시 됩니다. 컨트롤, 그대로 고 더 FRAP 분석 태아 또한 시험 되었다. 이러한 전송된 배아에서 파생 된 새끼의 무게는 또한 표시 됩니다.
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Discussion
이 연구에서 밝혀, zFRAP 분석 전체 용어 개발,이 방법은 분자 이벤트와 배아 발달 잠재력 사이 협회를 공개 하는 매우 유용한 도구 제안에 중요 한 손상을 발생 하지 않습니다. 그 세포의 차동 잠재력 된다 2 셀 단계 배아의 높은 ES 세포의 상태 처럼 2 셀으로 프로그래밍 하는 동안 chromatin 설사 변경으로 2 세포 단계 태아5와 비교 합니다. 따라서, zygotic chromatin 설사 배아 발달 잠재력에 대 한 중요 하다는 것이 가능 하다. 체세포 핵 oocytes 보여준 아버지 pronuclei 뿐만 아니라 모성 pronuclei, 체세포 핵 이식 zygotes에서 인수 오픈 chromatin의 부족은 제안에 비해 낮은 chromatin 풀림의 세포질으로 전송 그들의 빈약한 발달 잠재력에 참여. ZFRAP 분석 elucidating 게놈 메커니즘을 프로그래밍 하는 데 유용할 것으로 보인다.
ZFRAP 시스템 높은 발달 잠재력 zygotes 선택할 수 할 수 있습니다. 예비 연구 외에, SCNT에서에서 밝혀졌다는 spermatid 주입 (ROSI) 라운드-파생 zygotes 하버 비정상적인 chromatin 풀림. 게다가, 그 그들 중 일부 보여주 수준에서 chromatin 설사 비교 IVF 파생 zygotes 뿐만 아니라, 이러한 zygotes 높은 발달 잠재력을가지고 제안 발견 했다. 중요 한 것은, zygotes는 chromatin의 설사는 zFRAP에 의해 평가 되었다 용어를 개발할 수 있습니다. 미래에, 따라서 수 있습니다 zFRAP에 의해 더 높은 발달 잠재력 SCNT ROSI 파생 zygotes chromatin 풀림의 평가 의해 낮은 사람에서 구별 가능한.
날짜 하려면, 이전 연구 preimplantation 배아에 epigenetic 상태 분석에 대 한 라이브 이미징 방법의 유틸리티를 나타났습니다. 일부 라이브 이미징 방법 preimplantation 배아13,14, 각 후 성적인 수정 (예: DNA/히스톤 수정)을 밝힐 수 있다 하지만 zFRAP를 사용 하 여 zygotic chromatin 풀림 없이 평가 하 세포를 죽이. Chromatin 설사 후 성적인 수정에 의해 영향을 받을 것으로 보인다. 예를 들어 어떤 억압 후 성적인 수정에 섬으로 같은 H3K9me3 및 H3K27me3 농축 euchromatic 지구3,15보다 낮은 히스톤 이동성을 보였다. 실제로, 화합물, 치료 후 상태를 변환, zygotes에서 chromatin 풀림의 변경을 발생 합니다. 따라서, zFRAP를 사용 하 여, chromatin 구조의 summative epigenetic 상태 공개 가능 하다. 이 zygotes의 발달 잠재력을 평가 하기 위한 이점을 것 생각 되었다.
인코딩 eGFP H2B zFRAP에 대 한 mRNA의 주사는 벌점 하지만 zFRAP의 다양성을 증가 시킵니다. MRNA 주입의 벌점은 microinjection으로 인 한 손상 이다. 이 방지 하려면 H2B eGFP 유전자 변형 마우스를 활용 하는 것 매우 효과적입니다. H2B eGFP 유전자 변형 마우스 라인을 사용 하는 경우 자손 속도 mRNA microinjection를 사용 하 여의 경우에 비해 증가 될 수 있습니다. 반대로, 그것은 장점은 mRNA 주입의 그 zFRAP 야생-타입 마우스의 긴장의 어떤 종류의 사용을 허용 한다. 연구팀은 마우스 긴장의 그들의 관심을 가진 zFRAP를 사용 하 고 싶은 준비 eGFP H2B transgene로 원하는 마우스 스트레인 필요가 없습니다. 이 공로의 유전자 변형 분석에 더 저명한 된다 (예. overexpression/최저) 또는 녹아웃 마우스 선. 연구팀은 유전자 변형/녹아웃 선으로 그들의 연구 주제에 대 한 zFRAP를 활용 하 고 싶은 그들의 관심이 그들의 한정 된 수에서 H2B eGFP 유전자 변형 라인 준비 필요가 없습니다. 이 연구의 진행에 대 한 이점을 나타냅니다.
Preimplantation 배아와 라이브 이미징 분석에는 전문 지식과 매우 비싸고 가늘게 조정 특수 장치 필요합니다. 따라서, 이러한 실험 시스템의 소개는 쉬운 결정이 아니다. 이 연구에서 설정 된 실험 시스템만 confocal 레이저 스캐닝 현미경 외 열 히터 필요 합니다. 또한, 학습 방법 쉽습니다 실험실에서 초보자 1 개월 이내 zFRAP의 방법을 배울 수 있도록. 그러나, 고려를 해야 하는 몇 가지 문제가 있다. 먼저 초점 드리프트가입니다. 관찰, 동안에 pronuclei 또는 zygotes 그들이 관찰이 시작 되기 전에 제시 하는 위치에서 이탈이 가능 하다. 초점 드리프트 경우 ROIs는 또한 올바른 위치에서 이탈. 그 결과, 정량적 데이터 가치가 된다. 이 문제를 방지 하려면 연구원 에어컨에서 창에 대 한 보호에 대 한 유리 하단 접시의 뚜껑을 사용 하 여 대물 렌즈를 통해 석유 확장 기다리는 있다. 초점 드리프트 발생, 일탈 zygotes에서 데이터를 삭제 해야 하 고 동일한 zygotes와 2nd FRAP 분석은 권장 하지 않습니다. 이 연구에서는 약 25 s7 150 s3 에서 관측 시간을 단축 매우 도움이 되었다. 둘째 인큐베이터 밖에 더 부 화가입니다. 인큐베이터 외부 환경에 오래 노출 확실히 배아 발달에 대 한 유해 이기 때문에, 그것은 일괄 처리 당 1 시간 이내 FRAP 분석 완료을 권장 했다. zygotes 수 유리 하단 요리에 HEPES 버퍼 미디어에서 FRAP 분석 되어야 6-10. 이 실험 조건에서 최대 약 4 시간 30 이지만 더 zygotes 필요 하면 h 당 20 zygotes 참조 및 배경 영역에서 형광 강도의 평가 연기 하 여 분석 될 수 있다. 3 "의 레이저 공초점 레이저 현미경의 시간 관련 저하" 이다. 표백 레이저, 충분 하지 않을 경우 부족 한 표백으로 인해 정확한 양적 데이터를 얻을 수 없습니다. 실제로, zygotic chromatin 풀림의 부모의 비대칭 약한 표백 레이저로 얻을 수 없습니다. 이 방지 하려면 발생 하는 경우로 레이저 파워는 약화 여부를 확인 하는 것이 좋습니다. 이 연구에서는 부모의 비대칭의 수집에 대 한 충분 했다 110-µW 표백.
zFRAP 분석 뿐만 아니라 코어 히스톤 단백질의 다른 종류를 위해 사용할 수 있습니다. 코어 히스톤 표시 눈에 띄게 낮은 이동성, 이후 더 이상 총 관찰 시간 (약 25이 연구에서 s) zFRAP 분석에 필요 하다. 따라서, 분석 zygotes의 상당한 수, 오랜 동안 히터 HEPES 버퍼 미디어에 경작 불가피 하다. 다른 한편으로, 높은 이동성 단백질의 zFRAP 분석을 위해 총 관측 시간 설정할 수 있습니다 짧은, 짧게 히터 HEPES 버퍼 미디어에 경작의 시간을 사용. 따라서, 인큐베이터 외부 환경에 오래 노출 배아 발달에 대 한 매우 해로운 이기 때문에, 자연에 의해 높은 기동성을가지고, 코어 히스톤 다른 단백질에 대 한 zFRAP 분석 보여줄 것 핵심 히스톤 보다 낮은 독성 . 그것은 기대는이 실험적인 시스템 도움이 될 것입니다 더 다양 한 분자 이벤트와 배아 개발 사이 관계의 조사.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 감사 사토시 Kishigami, 사야카 와카야마, 히로 아키 Nagatomo, 사토시의 카 미 무라, 그리고가 나 Kishida 중요 한 의견 및 기술 지원 제공. 이 작품의 지;에 국립 대학 개혁을 승진 시키기를 위한 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 프로그램에 의해 부분적으로 투자 되었다 과학 (16 H 02593)의 승진, 아사 다 과학 재단과 T.W. 다케다 과학 재단에 대 한 일본 사회 Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
References
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