Summary
यहां हम प्रोटीन microcrystals के नियंत्रित उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । प्रक्रिया एक स्वचालित कई क्रिस्टलीकरण मापदंडों के नियंत्रित हेरफेर की अनुमति डिवाइस का उपयोग करता है । निगरानी और क्रिस्टलीकरण छोटी बूंद में कणों की त्रिज्या वितरण की जांच करते हुए प्रोटीन क्रिस्टलीकरण, क्रिस्टलीकरण समाधान के नियंत्रण और स्वचालित अलावा द्वारा किया जाता है ।
Abstract
स्वचालित क्रिस्टलीकरण डिवाइस एक पेटेंट तकनीक1 विशेष रूप से ठीक प्रोटीन क्रिस्टल के वांछित आकार की ओर nucleation और क्रिस्टल विकास पैंतरेबाज़ी करने के उद्देश्य के साथ प्रोटीन क्रिस्टलीकरण प्रयोगों की निगरानी के लिए विकसित की है । नियंत्रित क्रिस्टलीकरण में सीटू गतिशील प्रकाश कैटरिंग (DLS) के साथ नमूना जांच पर आधारित है, जबकि छोटी बूंद में सभी दृश्य परिवर्तन एक सीसीडी कैमरे के लिए युग्मित एक खुर्दबीन की मदद से ऑनलाइन निगरानी कर रहे हैं, इस प्रकार एक पूर्ण सक्षम करने क्रिस्टलीकरण के सभी चरणों के दौरान प्रोटीन छोटी बूंद की जांच । पूरे प्रयोग में सीटू DLS माप का उपयोग अत्यधिक supersaturated प्रोटीन एक नए चरण में संक्रमण समाधान की एक सटीक पहचान-क्रिस्टल नाभिक के गठन की अनुमति देता है । प्रोटीन nucleation चरण की पहचान करके, क्रिस्टलीकरण प्रोटीन microcrystals के उत्पादन के लिए बड़े प्रोटीन क्रिस्टल से अनुकूलित किया जा सकता है । प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल precipitant अतिरिक्त, उच्च supersaturation उत्प्रेरण के लिए पानी वाष्पीकरण के रूप में सटीक स्वचालित कदम के आधार पर एक इंटरैक्टिव क्रिस्टलीकरण दृष्टिकोण से पता चलता है, और प्रेरित सजातीय nucleation के लिए नमूना कमजोर पड़ने या चरण संक्रमण पलटना ।
Introduction
पिछले कुछ वर्षों में, प्रोटीन सूक्ष्म और nanocrystals के विकास पर कब्जा कर लिया है प्रोटीन का ध्यान क्रि समुदाय, विशेष रूप से धारावाहिक Femtosecond क्रि (SFX) के सतत विकास के साथ । कारण उपंयास एक्स रे विकिरण स्रोतों की प्रतिभा और सफल अब तक प्राप्त परिणामों के आधार पर, सूक्ष्म प्रोटीन और nanocrystals के उत्पादन उच्च प्रासंगिकता के बन गया है, ऐसी क्रिस्टलीय निलंबन की तैयारी पर एक उच्च मांग खड़ी 2 , 3. छोटे क्रिस्टल आकार-मुक्त इलेक्ट्रॉन पराबैंगनीकिरण (XFELs) पर डेटा संग्रह के लिए आवश्यक सीमा और प्रयोगात्मक beamtime की सीमित उपलब्धता के कारण, नमूना लक्षण वर्णन से पहले डेटा संग्रह के लिए आवश्यक है । सबसे आम तकनीक प्रोटीन सूक्ष्म या nanocrystal निलंबन की विशेषता के लिए अब तक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और एक्स-रे पाउडर विवर्तन हैं ।
अब तक, कई दृष्टिकोण छोटे माइक्रोमीटर रेंज में आयामों के साथ प्रोटीन क्रिस्टल की भारी मात्रा में उत्पादन करने के उद्देश्य के साथ आम क्रिस्टलीकरण तरीकों से अनुकूलित किया गया है । बैच विधि तेजी से उच्च केंद्रित प्रोटीन और precipitant समाधान के मिश्रण के लिए प्रयोग किया जाता है, इस प्रकार एक उच्च supersaturated चरण के लिए नमूना समाधान मजबूर जहां nanocrystallization4इष्ट हो सकता है । अंय तरीकों के लिए एक क्रिस्टल घोल, जो nanocrystalline निलंबन के रूप में सेवा के लिए डेटा संग्रह5के लिए इस्तेमाल किया जा सकता फार्म बड़े प्रोटीन क्रिस्टल कुचल शामिल हैं । हालांकि, परिणाम कभी-कभार घटी विवर्तन गुणवत्ता में परिणाम हो सकता है, के रूप में बिगड़ा क्रिस्टल आंतरिक आदेश कम है । Nanocrystallization मुक्त अंतरफलक प्रसार पर आधारित भी एक उपलब्ध विकल्प है, जहां प्रोटीन समाधान छोटी मात्रा में एक उच्च ध्यान केंद्रित precipitant समाधान3में जोड़ा जाता है । हालांकि, सभी तकनीकों के बीच, सबसे कुशल तरीकों को बैच क्रिस्टलीकरण और अधिक अभिनव जोड़ तोड़ भाप का उपयोग कर-बैठे बूंदों में प्रसार विधियों6।
आम तौर पर, एक प्रोटीन के क्रिस्टलीकरण के लिए एक ऊर्जा बाधा nucleation समर्थन करने के लिए पार किया जाना चाहिए आदेश में एक ऊष्मा स्थिर राज्य से supersaturation और अंत में एक चरण संक्रमण प्रेरित करने के लिए प्रोटीन समाधान ले जाने के लिए, कुछ प्रोटीन समाधान से संबंधित चर को संशोधित करने की आवश्यकता है । इस तरह के चर आम तौर पर कर रहे है प्रोटीन समाधान की एकाग्रता, पर्यावरण परिवर्तन (जैसे, तापमान, आर्द्रता), विलायक विशेषताओं (जैसे, पीएच, ईओण ताकत), एकाग्रता और बफर गुण, आदि7 ,8 नमूना पैरामीटर जो बदला जा सकता है की एक सिंहावलोकन आमतौर पर चरण आरेख के माध्यम से प्रतिनिधित्व किया है, जो प्रस्तुति के विभिंन तरीकों जैसे घुलनशीलता आरेख, nucleation चरण आरेख, या और भी अधिक विस्तृत की अनुमति वर्णन जहां तीन आयामी या अधिक जटिल आरेख8,9,10ध्यान में आ सकते हैं । चरण आरेख के सबसे अपील प्रकार आमतौर पर दो आयामी हैं, जहां मुख्य चर एक और पैरामीटर के एक समारोह के रूप में प्रोटीन एकाग्रता है, जबकि शेष मापदंडों लगातार6,11रखा जाता है । एक बार एक या कुछ नाभिक का गठन कर रहे हैं, बड़े क्रिस्टल थोक समाधान से अतिरिक्त प्रोटीन लेने के द्वारा विकसित कर सकते हैं । जब सूक्ष्म और nanocrystal उत्पादन के लिए लक्ष्य, इस तरह के एक पारंपरिक क्रिस्टलीकरण दृष्टिकोण संभव नहीं है और क्रिस्टल की छोटी संख्या के कारण है कि समाधान में मौजूद हैं । Nanocrystalline निलंबन आमतौर पर क्रिस्टलीय संस्थाओं में अमीर होना है, इस प्रकार क्रिस्टलीकरण मार्ग को पुनः समायोजन किया जाना है, इस तरह के नमूने में मौजूद nucleation घटनाओं की एक maxima है । परिणाम में, यह कुछ नए की जांच की आवश्यकता है, अब तक बेरोज़गार प्रोटीन के लिए nucleation रास्ते, जो भी अभी तक पूरी तरह से12,13समझ में नहीं आ रहे हैं । चरण आरेख पहले उल्लेख किया बुनियादी बातों के आधार पर, शास्त्रीय सिद्धांत एक नई परिकल्पना है, जहां nucleation एक दो कदम तंत्र के रूप में वर्णित है के लिए विस्तारित किया गया है: पहले, एक उच्च प्रोटीन एकाग्रता के लिए एक संक्रमण जगह लेता है (घने तरल चरण) और दूसरा, एक घने अमीर चरण से एक उच्च आंतरिक आदेश (जाली वास्तुकला के साथ क्रिस्टल नाभिक)14,15,16के लिए एक संक्रमण । प्रोटीन क्रिस्टलीकरण कई कारकों के प्रति संवेदनशील है, और इसलिए जब क्रिस्टलीकरण व्यंजनों अलग आकार क्रिस्टल में परिणाम के लिए पुनः समायोजन कर रहे हैं, व्यंजनों हमेशा पिछले ज्ञान पर भरोसा नहीं कर सकते । नई अंतर्दृष्टि प्रत्येक व्यक्ति को प्रोटीन लक्ष्य के लिए स्थापित करने की आवश्यकता: बफर संरचना का समायोजन, शुद्धता और नमूने की स्थिरता, प्रोटीन घुलनशीलता का सटीक ज्ञान, आदि
गतिशील प्रकाश कैटरिंग आज विश्लेषण और प्रोटीन क्रिस्टलीकरण प्रक्रियाओं के अनुकूलन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है, कणों कि जांच की जा सकती है की एक विस्तृत आकार-सीमा के कारण: monomeric प्रोटीन से nanocrystals और छोटे microcrystals के लिए । विधि का कारनामा है कि समाधान में कणों Brownian गति से गुजरना और इस गति का औसत वेग कण आकार, उनके थर्मल ऊर्जा और माध्यम की चिपचिपाहट और कण ज्यामिति द्वारा निर्धारित किया जाता है । सबसे पहले, तरल माध्यम एक लेजर के उपयोग के साथ एक सुसंगत प्रकाश स्रोत से प्रबुद्ध है । प्रकाश कणों से बिखरे हुए एक हस्तक्षेप पैटर्न बनाने है । क्योंकि कण स्थाई गति में हस्तक्षेप पैटर्न भी स्थाई रूप से बदल रहे हैं । जब एक निश्चित दिशा में देख, तीव्रता उतार चढ़ाव मनाया जा सकता है । ये उतार-चढ़ाव अब Brownian प्रमोशन की वजह से कण आंदोलन दिखा रहे हैं. मापा तीव्रता उतार चढ़ाव से एक सहसंबंध समारोह (ACF) की गणना की है । ACF का एक विश्लेषण वेग वितरण के लिए एक उपाय (अधिक ठीक कणों के प्रसार गुणांक) और स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण का उपयोग करके दे देंगे, एक कण त्रिज्या वितरण में परिवर्तित किया गया है17. DLS कार्यक्षमता और कार्य सिद्धांत से संबंधित अतिरिक्त जानकारी विभिन्न प्रकाशनों और पुस्तकों में पाया जा सकता है18,19.
यहाँ हम लागू करते हैं और एक अद्वितीय स्वचालित क्रिस्टलीकरण डिवाइस का वर्णन, XtalController900, XtalController प्रौद्योगिकी के एक उन्नत संस्करण6, ठीक इंटरैक्टिव प्रोटीन क्रिस्टलीकरण प्रयोगों की निगरानी के लिए विकसित. इस तकनीक की पहचान और वास्तविक समय में nucleation घटनाओं की ट्रैकिंग के लिए एक उच्च क्षमता से पता चलता है, क्रिस्टलीकरण चरण आरेख के माध्यम से एक सटीक पैंतरेबाज़ी की अनुमति । इस विशेष क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया के उद्देश्य के लिए प्रोटीन क्रिस्टलीकरण का अनुकूलन करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन सूक्ष्म और nanocrystals कि माइक्रो-केंद्रित सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे स्रोतों, इलेक्ट्रॉन विवर्तन, या उपयोग अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है प्राप्त करने के लिए है Sfx.
Protocol
नोट: पूरे प्रोटोकॉल के दौरान, सूक्ष्म खुराक प्रणाली पानी के अलावा के लिए इस्तेमाल किया Pump0 के रूप में भेजा जाएगा, जबकि सूक्ष्म खुराक precipitant के अलावा के लिए इस्तेमाल किया प्रणाली Pump1 बुलाया जाएगा. इस प्रयोग के परिणामों पर आगे चर्चा की जाएगी और THM2_micro-क्रिस्टल के रूप में संदर्भित किया जाएगा ।
1. पैरामीटर्स और समाधान सेटअप
- फ़िल्टर 16 मिलीलीटर Na-Tartrate समाधान (१.२ मीटर) और आसुत जल के 16 मिलीलीटर एक ०.२ µm बाँझ सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर ।
नोट: न-tartrate समाधान क्रिस्टलीकरण प्रयोग के लिए precipitant समाधान का प्रतिनिधित्व करता है । - precipitant और पानी की बोतलें फ़िल्टर समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ भरें ।
नोट: बोतलें 5 मिलीलीटर की एक अधिकतम क्षमता है । - प्रायोगिक चैंबर के पंप धारकों में बोतलें माउंट ।
- निंनलिखित मूल्यों के लिए सॉफ्टवेयर विंडो में प्रायोगिक मापदंडों सेट: तापमान 20 डिग्री सेल्सियस, 20 में सापेक्षिक आर्द्रता, और विलायक पानी के रूप में ।
नोट: चित्रा 2 जहां उपयोगकर्ता तापमान, सापेक्षिक आर्द्रता, और विलायक के रूप में प्रत्येक पैरामीटर के लिए सही मान सम्मिलित कर सकते हैं प्रदर्शन विंडो दिखाता है । सॉफ़्टवेयर विंडो भी कुछ अतिरिक्त पैरामीटर जैसे additives दिखाता है । यह केवल उन प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है जहां additives precipitant समाधान में मौजूद हैं । - प्रयोगात्मक कक्ष के सामने का दरवाजा खोलो और coverslip वाहक हटा दें ।
- वाहक पर एक स्वच्छ और सिलिकॉन coverslip जगह है और यह डिवाइस में वापस जगह है ।
नोट: coverslip २.२ सेमी का एक आकार है । - १.४ कदम से पर्यावरण की स्थिति को सुरक्षित करने के लिए प्रयोगात्मक चैंबर बंद करें ।
नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।
2. माइक्रो-खुराक सिस्टम समायोजन
- चित्रा 3 में मुख्य पंप विशेषताओं का उपयोग कर Pump0 पर स्विच और एक पानी की धारा बनाने के लिए ।
नोट: जल धारा पथ कुछ पंप विशेषताओं है कि समायोजित किया जा सकता है के आधार पर बनाया गया है । चित्रा 3 मुख्य पंप विशेषताओं और इष्टतम मूल्यों है कि इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए दिखाता है । - मैन्युअल रूप से अपने निर्दिष्ट समायोजन पेंच ऑपरेटिंग द्वारा coverslip के केंद्र की ओर लक्ष्य स्थिति पानी की धारा को समायोजित करें । स्विच ऑफ Pump0 ।
- Pump1 पर स्विच करें और पहले चरण २.१ में किया के रूप में एक तरल स्ट्रीम बनाएँ । Pump0 के लिए तय की गई स्थिति की ओर Pump1 की धारा की स्थिति को समायोजित करें । स्विच ऑफ Pump1 ।
- क्रिस्टलीकरण प्रयोग के लिए एक नया और साफ एक के साथ इस्तेमाल किया coverslip बदलें ।
नोट: नरम पोंछे आमतौर पर अवशिष्ट धूल से नए coverslip की सफाई के लिए सिफारिश कर रहे हैं, क्रिस्टलीकरण प्रयोग में इस्तेमाल किया जा रहा से पहले ।
3. प्रयोगात्मक चैंबर में एक Thaumatin ड्रॉप की स्थापना
- सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग करके एक नया प्रायोगिक फ़ाइल बनाएं । प्रयोगात्मक फ़ाइल में निम्न जानकारी दर्ज करें: प्रोटीन ( Thaumatococcus danielliiसे thaumatin), प्रोटीन एकाग्रता (14 मिलीग्राम/एमएल), precipitant (Na-Tartrate), और precipitant एकाग्रता (१.२ मीटर) ।
नोट: यह जानकारी क्रिस्टलीकरण प्रयोग के दौरान precipitant और प्रोटीन एकाग्रता की स्वचालित गणना के लिए सेवा करेंगे । - चरण ३.१ से सभी जानकारी को सक्रिय करने के लिए नई प्रयोग फ़ाइल लोड करें ।
- Pump0 का उपयोग कर एक छोटे से पानी की बूंद जोड़कर प्रोटीन छोटी बूंद की स्थिति को चिह्नित करें ।
नोट: उद्देश्य एक छोटे से पानी की बूंद है कि एक मील का पत्थर है जिस पर प्रोटीन का नमूना रखा जाएगा के रूप में सेवा करेंगे बनाने के लिए है । - microbalance द्वारा दिए गए वजन को शून्य पर सेट करने के लिए बटन बारदाना दबाएँ ।
नोट: यह coverslip के वजन को दूर करने और अतिरिक्त वजन ३.३ कदम में बनाया छोटे पानी मील का पत्थर द्वारा जोड़ा जाएगा । - प्रायोगिक चैंबर के शीर्ष ढक्कन खोलें और पानी के मील का पत्थर पर thaumatin समाधान के 8 µ एल पिपेट ।
- नया thaumatin ड्रॉप अगले आदेश का पालन करके पंजीकृत करें ।
- प्रयोगात्मक फ़ाइल से प्रारंभिक स्थितियों को एट्रिब्यूट करने के लिए बटन नई ड्रॉप दबाएँ.
- पानी की छोटी बूंद से प्राकृतिक वाष्पीकरण की भरपाई के लिए बटन Const दबाएं ।
- अगर Pump0 प्रोटीन ड्रॉप में लक्ष्य है सीसीडी कैमरे के साथ जांच करें । Pump0 की स्थिति को पुनः समायोजित करें यदि पानी की धारा ड्रॉप के बाहर लक्ष्य है ।
नोट: इस पल के बाद से, प्रोटीन छोटी बूंद एक निरंतर वजन पर, स्वचालित पानी के अलावा जो प्रोटीन छोटी बूंद से प्राकृतिक पानी के वाष्पीकरण के लिए क्षतिपूर्ति के द्वारा ही रहेगा । प्रोटीन छोटी बूंद का वजन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अंय मानकों जैसे तापमान और सापेक्षिक आर्द्रता प्रदर्शन विंडो का उपयोग कर वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है । प्रयोग यहीं ठहर सकता है ।
4. सीटू DLS माप में
- DLS लेजर पर स्विच करें और मैंयुअल रूप से समायोजन शिकंजा का उपयोग करके प्रोटीन ड्रॉप में लेजर बीम जगह है ।
- निम्न DLS पैरामीटर दर्ज करें: माप अवधि (६० s), दो माप (10 s) के बीच प्रतीक्षा समय, और माप की संख्या (३००).
नोट: पहले 30 माप प्रोटीन स्थिरता के लिए संदर्भ माप के रूप में सेवा करेंगे-की जाँच करें. माप के बाकी क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया की कुल लंबाई के दौरान प्रोटीन छोटी बूंद की एक पूरी जांच के रूप में काम करेंगे । - प्रेस बटन DLS माप आरंभ करने के लिए शुरू करते हैं । DLS ग्राफ़िक निरूपण में से किसी एक का चयन कर नमूने की गुणवत्ता की जांच करें ।
नोट: नमूना समाधान में किसी भी समुच्चय के बिना, मोनो फैलाव के एक उच्च डिग्री दिखाना चाहिए. DLS परिणाम दिखाया और के रूप में पढ़ा जा सकता है: त्रिज्या वितरण, त्रिज्या हिस्टोग्राम, त्रिज्या भूखंड, माप सारांश, या गणना दर तीव्रता का एक सिंहावलोकन के रूप में ।
5. नमूना वाष्पीकरण कदम
- तालिका 1में दिखाए गए डेटा का उपयोग करके शेड्यूल तालिका में वाष्पीकरण चरण के लिए शर्तें दर्ज करें.
नोट: साइन "-" कॉलम में प्रस्तुत "Molarity/प्रतिशत" दूसरी पंक्ति में प्रोटीन छोटी बूंद से पानी की हानि का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि मूल्य "25" का अर्थ है कि छोटी बूंद मात्रा 25% की कमी भुगतना होगा । इसका मतलब यह है कि छोटी बूंद की प्रोटीन एकाग्रता 25% के साथ वृद्धि होगी । - बटन Automदबाकर नमूना वाष्पीकरण कदम को सक्रिय करें. नमूना वाष्पीकरण चरण समाप्त होने पर बटन रोकें दबाएँ.
- बटन Const सक्रिय करने के लिए ड्रॉप लगातार नमूना वाष्पीकरण को रोकने के बाद रखने के लिए ।
6. Precipitant अतिरिक्त कदम
- तालिका 2में दिए गए डेटा का उपयोग करके आरेख 4 में दिखाए गए शेड्यूल तालिका में precipitant अतिरिक्त चरण के लिए शर्तें दर्ज करें ।
नोट: तालिका की पहली पंक्ति एक अंशांकन चरण का प्रतिनिधित्व करती है, जिसके दौरान सॉफ्टवेयर प्रोटीन छोटी बूंद की मात्रा के आधार पर प्रोटीन छोटी बूंद के प्राकृतिक वाष्पीकरण की दर की गणना करता है जो precipitant को जोड़ा जाना है । सॉफ्टवेयर extrapolates यह मान और स्वचालित रूप से अगले precipitant अतिरिक्त कदम के लिए पानी वाष्पीकरण की भरपाई करने के क्रम में Pump0 के लिए शूटिंग आवृत्ति समायोजित कर देता है । - बटन Automदबाकर precipitant अतिरिक्त चरण सक्रिय करें ।
नोट: precipitant के अलावा एक स्वचालित प्रक्रिया है, अनुसूची तालिका से इनपुट के बाद ।
7. समय के साथ क्रिस्टलीकरण छोटी बूंद के विकास पर नज़र रखने
- सीसीडी कैमरे का उपयोग करके thaumatin क्रिस्टल की उपस्थिति की जांच करें ।
- DLS ग्राफ़िक प्रतिनिधित्व का उपयोग करके कण आकार वितरण की जांच करें ।
- प्रदर्शन विंडो का उपयोग करके वजन और प्रयोगात्मक मापदंडों के विकास की जाँच करें ।
नोट: जब Na-tartrate सॉल्यूशन में ०.७४ मीटर की एकाग्रता पहुंचती है तो प्रोटीन ड्रॉप में, छोटी बूंद thaumatin माइक्रो-क्रिस्टल में रिच हो जाती है जैसा कि चित्रा 7में देखा गया है ।
8. क्रिस्टलीकरण छोटी बूंद की वसूली
- कोट आयल तेल के साथ एक स्वच्छ मानक Terasaki प्लेट ।
- तेल की 3 मिलीलीटर की थाली में जोड़ें ।
- प्लेट कुओं पर आयल तेल फैलाकर धीरे अलग कोणों पर प्लेट चलती है ताकि तेल प्लेट के सभी ७२ कुओं को शामिल किया जाए.
- तेल है कि प्लेट पर तैरता बाहर घनघोर द्वारा आयल तेल की अतिरिक्त निकालें ।
- क्रिस्टलीकरण प्रयोग समाप्त करने के लिए बटन रोकें दबाएँ. ध्यान से नमूना वाहक क्रिस्टलीय छोटी बूंद युक्त बाहर ले ।
- एक पिपेट के उपयोग के साथ, Terasaki प्लेट के कुओं में क्रिस्टलीकरण बूंद के 2 µ एल aliquots का एक खंड रखें ।
नोट: तेल के तहत एक थाली में क्रिस्टलीकरण छोटी बूंद को ठीक करके, नमूना समय पर एक खुर्दबीन या अंय DLS तकनीकों के उपयोग के साथ स्थिरता और क्रिस्टल विकास के लिए जांच की जा सकती है कि मानक Terasaki प्लेटों के साथ काम करते हैं ।
Representative Results
क्रिस्टलीकरण प्रयोग के दौरान DLS माप द्वारा प्राप्त परिणामों में दो मुख्य कण वितरण अंशों में जिसके परिणामस्वरूप hydrodynamic कण radii का विस्तृत विकास दिखाई पड़ता है, जो समय के साथ विकसित होता है । प्रयोग के पहले भाग में, नमूना धीरे से काफूर हो गया था, ताकि एक उच्च प्रोटीन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए । के रूप में चित्रा 5Bमें दिखाया गया है, प्रोटीन ड्रॉप से ध्यान केंद्रित किया गया था 14 मिलीग्राम/एमएल के लिए १९.५ मिलीग्राम/ इस समय के दौरान, आंकड़ा 5में त्रिज्या वितरण पैटर्न के अनुसार, प्रोटीन लगभग २.५ एनएम के एक निरंतर कण आकार के साथ समाधान में एक monomeric व्यवहार से पता चलता है । नमूने के रूप में आगे काफूर किया जा रहा है, monomeric प्रोटीन विकार या नमूना एकत्रीकरण के किसी भी लक्षण के बिना, समाधान में स्थिर रहता है ।
प्रोटीन ड्रॉप करने के लिए precipitant समाधान के अलावा तुरंत नमूना वाष्पीकरण के बाद शुरू की है और त्रिज्या वितरण पैटर्न और बेहतर दृश्य (चित्रा 5) के लिए संतुलन घटता में ग्रे के साथ प्रकाश डाला । नमूना वजन से व्युत्पंन गणना के आधार पर, प्रकाश डाला कण अंश क्रिस्टल nucleation की दीक्षा के लिए जिंमेदार ठहराया है, लगभग २००-४०० एनएम के एक त्रिज्या आकार में जिसके परिणामस्वरूप । इस घटना (nucleation के रूप में जाना जाता है) प्रोटीन छोटी बूंद में ०.६ मीटर की एक precipitant एकाग्रता पर शुरू की है, प्रयोग की दीक्षा से लगभग ६६ मिनट की एक समय अवधि में और precipitant की दीक्षा के संबंध में लगभग 23 मिनट अलावा. precipitant की एकाग्रता बढ़ जाती है के रूप में, त्रिज्या वितरण समाधान में कणों का एक व्यापक वितरण से पता चलता है । के रूप में अधिक नाभिक फार्म, प्रारंभिक क्रिस्टलीय संस्थाओं के आकार में बढ़ रहे हैं, ८००-१,३०० एनएम के बीच एक त्रिज्या वितरण तक पहुंचने । यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि इस स्तर पर, क्रिस्टल नाभिक विकसित करने के लिए जारी है, और प्रोटीन का अंश धीरे से गरीब होता जा रहा है के रूप में प्रोटीन अणु microcrystals द्वारा लिया जाता है । के रूप में प्रोटीन ड्रॉप में precipitant एकाग्रता धीरे बढ़ जाती है, microcrystals के गठन आसानी से ७५ मिनट के बाद की पहचान की है, जब त्रिज्या वितरण ५०० और १,५०० एनएम के बीच विकसित करने के लिए जारी है । त्रिज्या वितरण के विकास भी सीसीडी कैमरा छवियों, जहां प्रोटीन microcrystals समाधान में ०.७ मीटर की एक precipitant एकाग्रता (चित्रा 7) में दिखाई दे रहे है द्वारा पुष्टि की है । के रूप में precipitant इसके अलावा समाप्त हो गया है और क्रिस्टलीकरण ड्रॉप लगातार रखा है, त्रिज्या वितरण १,००० और ३,००० एनएम के बीच एक प्रमुख चरण से पता चलता है, जबकि nucleation घटनाओं के अंश समय के साथ घटता है । इस समय, क्रिस्टलीकरण ड्रॉप पूरी तरह से microcrystals के साथ संतृप्त है और कोई आगे nucleation घटनाओं समाधान में मौजूद हैं ।
प्रयोगात्मक इनपुट प्रतिक्रिया microbalance, एक क्रिस्टलीकरण चरण आरेख द्वारा दिए गए डेटा के रूप में प्रयोग thaumatin क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया की एक व्यापक समझ के लिए तैयार किया गया था. चित्रा 6में, प्रयोगात्मक चरण आरेख तीन स्वतंत्र क्रिस्टलीकरण प्रयोगों, जहां thaumatin टी danielli microcrystals के उत्पादन THM_2 माइक्रो क्रिस्टल (प्रोटोकॉल) के रूप में लेबल है दिखाता है । दो अतिरिक्त क्रिस्टलीकरण प्रयोगों लेबल THM_1 मैक्रो-क्रिस्टल और THM_3 मैक्रो-क्रिस्टल इनपुट डेटा के रूप में इस्तेमाल किया गया है क्रम में विभिंन क्षेत्रों की सही मानचित्रण के लिए चरण आरेख (जैसे, घुलनशीलता या metastable क्षेत्र) । इन प्रयोगों के लिए प्रोटोकॉल के बाद से विभिन्न क्रिस्टलीकरण रास्ते का पालन करें, nucleation क्षेत्र की पहचान आसान हो जाता है, और इसलिए अधिक सटीक. प्रत्येक प्रयोग के लिए, क्रिस्टलीकरण पथ क्रम की संख्या से प्रकाश डाला है विभिंन दृष्टिकोण और क्रिस्टलीकरण कदम है कि एक विशिष्ट परिणाम के लिए इस्तेमाल किया गया की संख्या पर जोर है, जबकि भूरे तीर अंतिम प्रोटीन का एक आकलन का प्रतिनिधित्व एकाग्रता जब क्रिस्टल विकास अच्छी तरह से परिभाषित स्थिर प्रोटीन क्रिस्टल के गठन में समाधान से प्रोटीन अणुओं को सालभर ।
तीन thaumatin प्रयोग चित्रा 6 में प्रस्तुत विभिंन स्थितियों जब nucleation क्षेत्र में प्रवेश दिखाने के लिए, और इसलिए अलग अंतिम क्रिस्टलीकरण परिणाम के रूप में यह चरण आरेख नीचे चित्रों से देखा जा सकता है । THM1 और THM3 के मामले में, प्रोटीन समाधान nucleation चरण गुजरता है और फिर से metastable क्षेत्र है, जहां यह क्रिस्टल के रूप में टिकी हुई है प्रवेश करती है । नतीजतन, प्रयोगों का नेतृत्व बड़े, अच्छी तरह से परिभाषित आकार क्रिस्टल मां शराब से घिरा हुआ है । हालांकि, प्रोटोकॉल अनुभाग, THM2_micro-क्रिस्टल में प्रस्तुत प्रयोग के लिए, क्रिस्टलीकरण पथ एक विशेष दृष्टिकोण निंनानुसार है । एक पिछले अनुभाग में हमने उल्लेख किया है कि microcrystals देने के लिए एक नमूना के लिए, प्रोटीन समाधान nucleation चरण में गहरी स्थित होना है, ताकि nucleation घटनाओं एक अधिकतम दर पर फार्म कर सकते हैं. THM2_micro-क्रिस्टल के मामले में, precipitant एकाग्रता के लिए प्रोटीन का अनुपात इस तरह के एक फैशन में समायोजित किया गया था कि नमूना न केवल nucleation क्षेत्र में प्रवेश करती है, लेकिन एक precipitant के रूप में आगे प्रोटीन समाधान करने के लिए जोड़ा जाता है, और शर्तों के लिए कदम नहीं है चरण आरेख में एक अंय क्षेत्र है, लेकिन nucleation क्षेत्र के भीतर एक उच्च supersaturated राज्य में रहते हैं । एक परिणाम के रूप में, एन्ट्रापी प्रोटीन छोटी बूंद तुरंत छोटे क्रिस्टलीय संस्थाओं के साथ संतृप्त हो जाता है के रूप में काफी कम हो जाती है ।
चित्र 1. क्रिस्टलीकरण प्रयोग के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । ड्राइंग सभी तकनीकी एक स्वचालित क्रिस्टलीकरण प्रयोग के संचालन के लिए आवश्यक भागों के साथ क्रिस्टलीकरण प्रयोगात्मक चैंबर का अवलोकन से पता चलता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: DLS और नमूना पैरामीटर है कि एक क्रिस्टलीकरण प्रयोग के लिए प्रासंगिक है के लिए सॉफ्टवेयर विंडो । पैरामीटर तापमान, सापेक्षिक आर्द्रता, चिपचिपापन, आदिशामिल हैं ।
चित्रा 3: सूक्ष्म खुराक क्रिस्टलीकरण प्रयोग में शामिल प्रणालियों के लिए सॉफ्टवेयर नियंत्रण खिड़की. सुविधाओं की बूंदों या समाधान स्ट्रीम की पीढ़ी के लिए विशिष्ट मापदंडों के समायोजन की अनुमति है ।
चित्र 4: प्रयोग में शामिल क्रिस्टलीकरण चरणों का वर्णन करने वाली अनुसूची तालिका के लिए सॉफ़्टवेयर विंडो. क्रिस्टलीकरण छोटी बूंद की प्रारंभिक स्थिति भी इस विंडो में एकीकृत कर रहे हैं ।
चित्रा 5. thaumatin टी. daniellii microcrystals उत्पादन का अवलोकन. (क) संपूर्ण सघन प्रक्रिया के दौरान प्रोटीन ड्रॉप में कण के आकार का त्रिज्या वितरण. (ख) प्रायोगिक मापदंडों की निगरानी अवलोकन. भूखंडों प्रोटीन छोटी बूंद (काला वक्र) के वजन के लिए समय के साथ विकास की गणना प्रोटीन एकाग्रता (लाल वक्र) और precipitant एकाग्रता (नीला वक्र) के साथ प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6: परिणामी परिणामों के साथ साथ thaumatin टी danielli के लिए प्रयोगात्मक क्रिस्टलीकरण चरण आरेख. microbalance द्वारा दी गई फीडबैक जानकारी के आधार पर सभी भूखंड प्रायोगिक आंकड़ों से प्राप्त होते हैं । प्रत्येक प्रयोग जो कोष्ठक के बीच दिख रहे है के लिए जिंमेदार ठहराया संख्या आदेश और एक क्रिस्टलीकरण प्रोटोकॉल के दौरान उठाए गए कदमों की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 7: THM2_Micro के लिए दर्ज की तस्वीर क्रिस्टल (प्रोटोकॉल) समाधान में संतृप्त microcrystals की एक प्रचुर संख्या में दिखा । चित्र 4 एच (२४० मिनट) में क्रिस्टलीकरण के लिए प्रयोगात्मक चैंबर में प्रोटीन छोटी बूंद की स्थापना के बाद लिया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 8: THM_1 स्थूल के लिए दर्ज की गई तस्वीर-क्रिस्टल कुछ बड़े thaumatin समाधान में स्थिर क्रिस्टल दिखा । चित्र क्रिस्टलीकरण के लिए प्रायोगिक कक्ष में प्रोटीन छोटी बूंद की स्थापना के बाद 20 ज लिया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 9: THM_3 मेक्रो के लिए दर्ज की गई तस्वीर-क्रिस्टल समाधान में thaumatin क्रिस्टल के विभिंन आकारों दिखा । चित्र क्रिस्टलीकरण के लिए प्रायोगिक कक्ष में प्रोटीन छोटी बूंद की स्थापना के बाद 20 ज लिया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| पदार्थ | Molarity प्रतिशत/ | समय (ओं) |
| पानी | 0 | १०० |
| पानी | -25 | २१०० |
| पानी | 0 | २१०० |
तालिका 1: thaumatin microcrystals के उत्पादन में नमूना वाष्पीकरण चरण के लिए स्वचालित शेड्यूल इनपुट ।
| पदार्थ | Molarity प्रतिशत/ | समय (ओं) |
| पानी | 0 | १०० |
| prec | ०.८ | १८०० |
| पानी | 0 | १८००० |
तालिका 2: thaumatin के उत्पादन में precipitant अतिरिक्त चरण के लिए स्वचालित शेड्यूल इनपुट microcrystals ।
Discussion
क्रिस्टलीकरण डिवाइस पर नजर रखने और एक क्रिस्टलीकरण एक संशोधित वाष्प-प्रसार विधि के आधार पर प्रयोग के दौरान महत्वपूर्ण मापदंडों में हेरफेर करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । इस तकनीक की निगरानी और सभी चरणों में एक प्रोटीन क्रिस्टलीकरण प्रयोग स्कोरिंग की अनुमति देता है, उपयोगकर्ता को सक्षम करने के लिए सटीक ज्ञान और क्रिस्टलीकरण चरण आरेख भर में प्रोटीन समाधान के नियंत्रण, सीटू DLS विश्लेषण में पर आधारित का नमूना सस्पेंशन.
क्रिस्टलीकरण डिवाइस एक प्रयोगात्मक चैंबर (चित्रा 1) एक सीसीडी कैमरा है कि क्रिस्टलीकरण छोटी बूंद की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देता है से जुड़े शामिल हैं । कैमरा एक अलग इज़ाफ़ा लेंस से सुसज्जित माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित है, लगभग २.५ µm के एक अधिक से अधिक स्थानिक संकल्प प्रदान । प्रयोगात्मक चैंबर के कोर समय के साथ नमूना वजन के विकास पर नज़र रखने के लिए एक ultrasensitive microbalance है । क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया एक बैठे-ड्रॉप वाष्प-प्रसार प्रयोग से मेल खाती है, जहां प्रोटीन ड्रॉप को एक सिलिकॉन coverslip पर रखा जाता है, जो microbalance पर रखा जाता है । छोटी बूंद, जो precipitant अलावा, पानी की वजह से कर रहे हैं के वजन परिवर्तन के आधार पर, या नमूना वाष्पीकरण, microbalance समय के साथ प्रोटीन और precipitant एकाग्रता की तत्काल गणना के लिए एक एल्गोरिथ्म के लिए एक सटीक इनपुट देता है . इसके अलावा, ऐसे तापमान और सापेक्ष आर्द्रता के रूप में महत्वपूर्ण क्रिस्टलीकरण मापदंडों ठीक नजर रखी है और नियंत्रित कर रहे हैं ।
एक क्रिस्टलीकरण प्रयोग करने के लिए, डिवाइस दो सूक्ष्म खुराक प्रणालियों (संपर्क मुक्त piezoelectric पंपों) है कि precipitant और पानी के अलावा के लिए एक picoliter पैमाने पर काम से सुसज्जित है । पदार्थ की इतनी छोटी मात्रा के साथ काम करके, एकाग्रता ढाल और प्रोटीन छोटी बूंद के भीतर संवहन घटना को कम कर रहे हैं । piezoelectric पंपों की मुख्य भूमिका precipitant या पानी के अलावा, उदाहरण के लिए बाद प्रोटीन छोटी बूंद के प्राकृतिक वाष्पीकरण के लिए मुआवजे के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है । माइक्रो-खुराक सिस्टम सुविधाओं का एक सेट है, जो एक पदार्थ के अलावा हुक्म कर सकते हैं. ऐसी सुविधाओं में शामिल हैं: एक पदार्थ जोड़ने के लिए दोहराव दर, बूंदों की संख्या प्रति सेकंड जोड़ा, चौड़ाई और पदार्थ धारा पथ, आदिकी ऊंचाई इसके अलावा, पंपों की स्थिति को मैन्युअल रूप से समायोजित किया जा सकता है, प्रोटीन छोटी बूंद में पदार्थों के अलावा के लिए एक सटीक स्थिति के लिए उपयोगकर्ता को सक्षम करने.
अद्वितीय प्रतिक्रिया क्रिस्टलीकरण ड्रॉप की हेरफेर नियंत्रित सीटू DLS डेटा है, जो पूरे प्रयोगात्मक प्रक्रिया भर में प्रोटीन oligomeric राज्य में संभव परिवर्तन दिखा सकते है द्वारा हासिल की है । तकनीक समय पर कण आकार वितरण के निरंतर मूल्यांकन की अनुमति देता है, इस प्रकार अज्ञात प्रोटीन से संबंधित तंत्र का खुलासा । DLS प्रकाशिकी उपकरण रणनीतिक coverslip क्षेत्र के नीचे रखा गया है, डिटेक्टर और लेजर बीम coverslip के माध्यम से पारित करने की अनुमति है और आगे एक में प्रोटीन छोटी बूंद के माध्यम से सीटू फैशन; इसलिए, केवल छोटी बूंद के भीतर परिवर्तन DLS पथ से दर्ज की गई हैं । आसान हैंडलिंग की अनुमति देने के लिए, डिवाइस दो उद्घाटन: coverslip और एक शीर्ष ढक्कन जो हटाया जा सकता है की एक इष्टतम स्थिति के लिए एक सामने दरवाजा है, ताकि उपयोगकर्ता सूक्ष्म खुराक प्रणालियों की शूटिंग की स्थिति को समायोजित करने के साथ ही सटीकता के साथ स्थापित कर सकते है एक नया प्रोटीन डीआरओ plet पर coverslip ।
aforementioned डिवाइस का उपयोग कर इंटरैक्टिव क्रिस्टलीकरण विधि प्रोटीन क्रिस्टल के आकार नियंत्रित उत्पादन के लिए एक विश्वसनीय तकनीक है । हालांकि कई क्रिस्टलीकरण तरीके वर्तमान में उपलब्ध हैं, अंदर सघन तंत्र के बारे में जानकारी ही आसानी से प्राप्त नहीं है । सामांय में, पारंपरिक क्रिस्टलीकरण के तरीकों को लागू करने क्रिस्टलीकरण चरण आरेख में एक समाधान के केवल सीमित नियंत्रण की अनुमति देता है, अपने पाठ्यक्रम को बदलने की केवल कुछ संभावनाओं के साथ एक बार एक प्रयोग शुरू कर दिया है । जबकि एक क्रिस्टलीकरण प्रयोग प्रदर्शन और इस तरह के एक स्वचालित क्रिस्टलीकरण सीटू DLS, ज्ञान का एक बड़ा सौदा के साथ युग्मित प्रौद्योगिकी चरण आरेख में संक्रमण के बारे में प्राप्त की है । सामान्य रूप से, अमली हाला और सजातीय nucleation की प्रेरण के परिणामस्वरूप क्षेत्र चरण आरेख में एक-दूसरे के करीब हैं । इसलिए, इसके कण वितरण के बारे में वास्तविक समय की जानकारी के आधार पर एक क्रिस्टलीकरण छोटी बूंद के पाठ्यक्रम हेर-फेर करके, यह धीरे से nucleation की ओर क्रिस्टलीकरण शर्तों का समायोजन करके एक प्रोटीन की वर्षा से बचने के लिए संभव है और क्रिस्टल गठन ।
आजकल, कई क्रिस्टलीकरण की स्थिति precipitant समाधान जहां पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) डेरिवेटिव व्यापक रूप से मौजूद हैं शामिल हैं । इस तरह के यौगिकों आमतौर पर एक उच्च चिपचिपाहट जो pipetting या वितरण के लिए कठिनाइयों के अधिकारी कर सकते हैं । वर्तमान मामले के अध्ययन में, सूक्ष्म खुराक सिस्टम है कि precipitant वितरण के लिए उपयोग किया जाता है बहुत पतली केशिकाओं कि picolitre वेतन वृद्धि के अलावा संभव बनाने लागू होते हैं । एक परिणाम के रूप में, वहां अत्यधिक चिपचिपा पदार्थ के साथ काम करने में कुछ सीमाएं हैं । पिछले प्रयोगों की एक श्रृंखला के भीतर, प्रणाली सकारात्मक निंनलिखित खूंटी derivates: PEG200 ५०%, PEG3000 20%, PEG6000 10%, PEG800010% का उपयोग कर परिणाम दिया है । हालांकि अभी तक केवल aforementioned समाधान परीक्षण किया गया, सूक्ष्म खुराक सिस्टम एक विशेष हीटिंग तंत्र है जो आदेश में एक समाधान की चिपचिपाहट कमी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता होते हैं । एक अंय कारक नमक समाधान है कि माना जाता है जब प्रोटीन precipitant के रूप में इस्तेमाल किया है । अत्यधिक ध्यान केंद्रित लवण के साथ काम करते समय, एक छोटी राशि सूक्ष्म खुराक प्रणाली के नोजल पर सघन कर सकते हैं, precipitant अलावा के दौरान सूक्ष्म खुराक पंप के सतही अवरुद्ध कारण; यहां तक कि जब एक बहुत ही उच्च सापेक्ष आर्द्रता प्रयोगात्मक कक्ष में मौजूद है । इस समस्या को दूर करने के लिए, प्रयोग को होल्ड पर रखने की आवश्यकता है ताकि नोजल से नमक हटाया जा सके । यह विशेष हैंडलिंग की आवश्यकता हो सकती है और precipitant अतिरिक्त चरण में त्रुटियाँ उत्पन्न हो सकती है ।
इस तरह के स्वचालित क्रिस्टलीकरण प्रयोगों प्रदर्शन जब हासिल किया जा सकता है कि मूल्यवान जानकारी के आधार पर, इस तकनीक को भी प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के भौतिक रसायन पहलुओं की जांच अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । nucleation और क्रिस्टल विकास प्रतिक्रिया दर काइनेटिक घटनाएं जो व्युत्पंन किया जा सकता है और समय निर्भरता एक प्रयोग से चित्रित जानकारी के आधार पर गणना कर रहे है जैसे तापमान, कण आकार के विकास, और प्रोटीन और precipitant एकाग्रता.
Disclosures
हम इसके द्वारा घोषणा की है कि लेखक आऩने मेयेर, कर्स्टन Dierks, और ईसाई Betzel कंपनी Xtal के शेयरधारकों-अवधारणाओं GmbH, XtalController900 प्रौद्योगिकी के निर्माता हैं ।
Acknowledgments
लेखक यूरोपीय संघ के क्षितिज से धन स्वीकार २०२० अनुसंधान और अभिनव मैरी Sklodowska के तहत कार्यक्रम-क्यूरी संक्षिप्त "एक्स जांच" अनुदान समझौते No. ६३७२९५ और समर्थन BMBF अनुदान 05K16GUA के माध्यम से, और "हैंबर्ग Ultrafast के लिए केंद्र इमेजिंग-संरचना, गतिशीलता और मामले की परमाणु पैमाने पर नियंत्रण "ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) के उत्कृष्टता क्लस्टर.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
| Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
| di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
| Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
| Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
| Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
| Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
| Soft wipes | KIMTECH Science | ||
| XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |
References
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