Summary
Burada bir iletişim kuralı protein microcrystals kontrollü üretim için mevcut. Süreç kontrollü kristalizasyon parametreleri çeşitli manipülasyon sağlayan otomatik bir aygıt kullanır. Protein kristalizasyon taşınan-izleme ve kristalizasyon damlacık parçacıklar RADIUS dağılımı soruşturma sırasında kontrollü ve otomatik eklenmesi kristalizasyon çözümleri tarafından out.
Abstract
Özellikle protein kristalizasyon deneyler kesin çekirdekleşme ve istenilen boyutlarda doğru kristal gelişmesi protein kristalleri manevra amacı ile izlemek için geliştirilen patentli tekniği1 otomatik kristalizasyon cihazdır. Damlacık tüm görsel değişiklikleri online böylece tam bir etkinleştirme bir CCD kamera için birleştiğinde mikroskop yardımı ile izlenir iken örnek soruşturma in situ dinamik ışık saçılma (DL) ile kontrollü kristalizasyon dayanır protein damlacık soruşturma kristalizasyon her aşaması sırasında. Situ DLS ölçümleri boyunca tüm deneme kullanımı yeni bir faz-kristal çekirdek oluşumu geçiş son derece aşırıdoygun protein çözüm kesin bir kimlik sağlar. Protein çekirdekleşme sahne tanımlayarak, kristalizasyon büyük protein kristalleri protein microcrystals üretim için optimize edilebilir. Deneysel protokol bir etkileşimli kristalizasyon precipitant ek olarak, su buharlaşma inducing yüksek supersaturation için gibi hassas otomatik adımları dayalı yaklaşım ve yavaşlama için numune dilüsyonu homojen çekirdekleşme indüklenen gösterir veya Faz geçişleri ters.
Introduction
Son birkaç yıl içinde protein mikro - ve nanocrystals protein-kristalografisi topluluk dikkat özellikle ile sürekli gelişim seri Femtosecond kristalografisi (SFX) ele geçirdi. Roman X-ray parlak nedeniyle radyasyon kaynakları ve şu ana kadar elde edilen başarılı sonuçlarına göre protein mikro - üretim ve nanocrystals yüksek alaka, kristal böyle süspansiyonlar hazırlanması üzerinde yüksek bir talep poz haline gelmiştir 2 , 3. serbest elektron lazerler (XFELs), veri toplama ve deneysel beamtime sınırlı kullanılabilirlik için gerekli küçük kristal boyutu-aralığı nedeniyle örnek karakterizasyonu veri toplama önce esastır. Protein mikro - veya nanocrystal süspansiyonlar karakterize etmek için en sık kullanılan teknikler şimdi elektron mikroskobu ve x-ışını toz difraksiyon kadar vardır.
Şimdiye kadar birkaç yaklaşım ortak kristalizasyon yöntemlerinden protein kristalleri ile boyut küçük mikrometre aralığı toplu miktarlarda üretmek amacı ile adapte. Yüksek konsantrasyonlu protein ve precipitant çözümleri, böylece örnek çözümü nanocrystallization tercih4nerede olabileceğini son derece aşırıdoygun bir aşamaya zorlama hızlı karıştırma için kullanılan toplu iş yöntemidir. Diğer yöntemleri için veri koleksiyon5kullanılmak üzere nanocrystalline süspansiyonlar olarak hizmet verebilir bir kristal Bulamaç oluşturmak için büyük protein kristalleri kırma içerir. Ancak, sonuçlar bazen bozulan kristalleri düşük iç sınıf gibi azalmış kırınım kalitesinde neden olabilir. Ücretsiz arabirimi difüzyon dayalı Nanocrystallization da kullanılabilir, protein çözüm son derece yoğun precipitant çözüm3küçük miktarlarda eklendiği yerine kullanılabilir. Ancak, tüm teknikleri arasında en etkili yöntemleri toplu kristalizasyon ve daha yenilikçi manipülatif teknikleri damla6defada buharı difüzyon yöntemleri kullanarak gibi görünüyor.
Genel olarak, bir protein kristalleşme için bir enerji bariyeri çekirdekleşme - kristal oluşumu ilk termodinamik adımda desteklemek için geçti gerekir. Protein çözüm thermodynamically istikrarlı bir devlet için supersaturation taşımak için sipariş ve son olarak bir faz geçiş ikna etmek için protein çözüm ile ilgili bazı değişkenler değiştirilmesi gerekir. Gibi değişkenleri konsantrasyonu protein çözüm, çevresel değişiklikler genellikle (Örn., sıcaklık, nem), çözücü özellikleri (Örneğin, pH, iyonik gücü), konsantrasyon ve arabellek özellikleri, vb7 ,8 -ebilmek çevrilmek örnek parametrelerini genel bakış genellikle sunum çözünürlük diyagramları, çekirdekleşme faz diyagramları veya bile daha ayrıntılı gibi farklı modları sağlar Faz diyagramlar aracılığıyla temsil Burada üç boyutlu veya daha karmaşık diyagramları dikkate8,9,10gelebilir açıklamaları. Kalan parametreleri sürekli6,11tutarken başka bir parametre, bir fonksiyonu olarak protein konsantrasyonu ana değişken olduğu yerde en çekici faz diyagramları genellikle iki boyutlu türleridir. Bir veya birkaç hücre çekirdeği oluşmuş bir kez daha büyük kristaller toplu bir çözüm ek protein yukarıya alarak büyüyebilir. Mikro - ve nanocrystal üretimi için amaçlayan, böyle bir geleneksel kristalizasyon yaklaşım çözüm içinde mevcut olan kristalleri az sayıda nedeniyle artık mümkün değildir. Nanocrystalline süspansiyonlar genellikle böylece öyle ki bir maxima örnek mevcut çekirdekleşme olayların kristalizasyon yolu ayarlamalara gidilmesi zorunda kristal varlıklarda zengin olmak zorunda. Sonuç olarak, bu kadar şimdi keşfedilmemiş çekirdekleşme yolları da henüz tam olarak anlaşılır12,13değildir proteinler için araştırma bazı yeni, gerektirir. Daha önce bahsedilen faz diyagramı temelleri üzerinde bağlı olarak, klasik teori yeni bir hipotez için nerede çekirdekleşme iki aşamalı mekanizması olarak anlatılan biçimde genişletilmiştir: ilk olarak, protein yoğun bir geçiş gerçekleşir (yoğun sıvı Faz) ve ikinci, bir daha yüksek dahili sipariş (kafes mimarisi ile kristal çekirdek)14,15,16zengin yoğun faz bir geçiş. Protein kristalizasyon için birçok faktör duyarlıdır ve kristalizasyon tarifleri için farklı büyüklükte kristaller neden yeniden ne zaman, bu nedenle tarifleri her zaman önceki bilgiye güvenemezsiniz. Yeni anlayışlar gerekir her bireysel protein hedef için kurulacak: arabellek oluşturma, saflık ve istikrar protein çözünürlük, vbörnek, kesin bilginin düzeltilmesi.
Dinamik ışık saçılma olduğunu bugün için analiz ve optimizasyon boyutu-geniş bir soruşturma olması parçacıkları nedeniyle protein kristalizasyon süreçlerin köklü bir yöntem: nanocrystals ve küçük microcrystals monomeric proteinler üzerinden. Yöntemi çözüm parçacıkların Albert geçmesi ve bu hareket ortalama hızı viskozite orta ve parçacık geometri ve partikül büyüklüğü, termal enerji tarafından belirlenir patlatır. İlk başta, sıvı orta bir lazer kullanımı ile tutarlı bir ışık kaynağı tarafından aydınlatılır. Moleküller tarafından dağınık ışık bir kesişim deseni oluşuyor. Parçacıklar sürekli hareket halinde olduğundan kesişim deseni de kalıcı olarak değiştirir. Belirli bir yöne bakarken, şiddeti dalgalanmalar görülebilir. Bu dalgalanmalar tarafından Albert hareket neden parçacık hareketi şimdi gösteriliyor. Ölçülen şiddeti dalgalanmalar bir otokorelasyon işlevi (ACF) hesaplanır. ACF bir analizini bir ölçü birimi-ecek vermek hız dağılımı (daha doğrusu difüzyon katsayısı) parçacıklar ve Stokes-Einstein denklemi kullanarak, bir parçacık RADIUS dağıtım17dönüştürülür. Çeşitli yayınlar ve kitap18,19DLS işlevselliği ve çalışma prensibi ile ilgili daha fazla bilgi bulunabilir.
Burada biz uygulamak ve bir benzersiz otomatik kristalizasyon aygıt, XtalController900, XtalController teknoloji6tam olarak geliştirilen interaktif protein kristalizasyon deneyler izlemek için yükseltilmiş sürüm açıklar. Bu teknik bir yüksek kimlik ve çekirdekleşme olaylar gerçek zamanlı olarak izleme, kristalizasyon faz diyagramı kesin bir manevra izin için potansiyel gösterir. Bu belirli kristalizasyon yordamı amacı protein kristalizasyon yüksek kaliteli protein mikro - ve mikro odaklı sinkrotron x-ışını kaynakları, elektron kırınım, kullanan uygulamalar için uygun olan nanocrystals elde etmek için en iyi duruma getirmektir veya SFX.
Protocol
Not: precipitant eklenmesi için kullanılan mikro dozaj sistemi Pump1 adı verilecek süre boyunca tüm protokolünün, su ilavesi için kullanılan mikro dozaj sistemi Pump0 sevk edilecek. Bu denemenin sonuçları daha da ele olacak ve THM2_micro-kristaller anılacaktır.
1. parametreleri ve çözüm kurulum
- 16 mL Na tartarat çözüm (1,2 M) ve 16 mL distile su 0.2 µm steril enjektör filtre kullanarak filtre.
Not: Na-tartarat çözüm kristalizasyon deney için precipitant çözümü temsil eder. - Precipitant ve su şişeleri ile 5 mL süzülmüş çözümleri de doldurun.
Not: Şişeler 5 mL maksimum kapasitesine sahip. - Pompa sahipleri şişelerde deneysel odasının bağlayın.
- Yazılım penceresinde aşağıdaki değerleri için deneysel parametreleri ayarla: sıcaklık 20 ° C, bağıl nem 20 ve solvent su gibi.
Not: Resim 2 nereye Kullanıcı sıcaklık, bağıl nem ve solvent gibi her parametre için doğru değerler ekleyebilirsiniz görüntü penceresini gösterir. LightBox penceresinin da katkı maddeleri gibi bazı ek parametreleri gösterir. Bu sadece katkı maddeleri precipitant çözüm mevcut nerede deneyler için önemlidir. - Deneysel odası kapıyı açacağım ve coverslip taşıyıcı kaldırın.
- Temiz ve silikonlu coverslip taşıyıcı yerleştirin ve cihazın geri yerleştirin.
Not: Coverslip 2,2 cm yer kaplıyor. - Adım 1.4 çevre koşullarından korumak için deneysel odası kapatın.
Not: Protokol burada duraklatılmış.
2. Mikro dozaj sistemleri ayarlama
- Geçiş ON Pump0 ana kullanarak pompa özellikleri Şekil 3 ' te ve su akışı oluşturmak.
Not: Su akışı yörünge ayarlanabilir bazı pompa özellikleri temel alınarak oluşturulur. Şekil 3 ana pompa özellikleri ve bu deneme için kullanılan en iyi değerleri gösterir. - El ile belirlenmiş ayarı vida çalıştırılarak merkezine doğru konumunu coverslip amaçlayan su akışı ayarlayın. Kapalı Pump0 geçin.
- ON Pump1 geçin ve daha önce adım 2.1 yapılır bir sıvı akışı yaratmak. Pump0 için sabit pozisyon doğru Pump1 akışı konumunu ayarlamak. Kapalı Pump1 geçin.
- Kullanılan coverslip bir yeni ile değiştirin ve kristalizasyon deneme için bir temiz.
Not: Yumuşak mendil genellikle düşük kristalizasyon deneyde kullanılan önce arta kalan toz, yeni coverslip temizlemek için tavsiye edilir.
3. deneysel odasında bir Thaumatin damla ayarlama
- Yazılım paketi kullanarak yeni bir deneysel dosyası oluşturun. Deneysel dosyasında aşağıdaki bilgileri girin: protein (thaumatin Thaumatococcus danielliigelen), protein konsantrasyonu (14 mg/mL), precipitant (Na-Tartrate) ve precipitant konsantrasyonu (1,2 M).
Not: Bu bilgiler precipitant ve protein konsantrasyonu kristalizasyon deney sırasında otomatik hesaplamalar için görev yapacak. - 3.1. adımdaki tüm bilgileri etkinleştirmek için yeni deney dosya yükleyin.
- Pump0 kullanarak bir küçük su damlası ekleyerek protein damlacık konumunu işaretleyin.
Not: Amaç protein örnek yerleştirdiği bir dönüm noktası hizmet verecek bir küçük su damlası oluşturmaktır. - Dara sıfıra microbalance tarafından verilen ağırlık ayarlamak için düğmesine basın.
Not: Bu coverslip ağırlığını ve 3.3. adımda oluşturduğunuz küçük su Simgesel Yapı tarafından eklenen ekstra ağırlık kaldıracak. - Deneysel odasının üst kapağı açın ve thaumatin çözüm su dönüm noktası üzerinde 8 µL pipet.
- Yeni thaumatin damla sonraki komutları izleyerek kayıt.
- Başlangıç koşullarını deneysel dosyasından özniteliği için Yeni açılan düğmesine basın.
- Const doğal buharlaşma su damlacığı telafi etmek için düğmesine basın.
- Pump0 protein düşüş hedefliyor CCD kamera ile kontrol edin. Su akışı dışında açılan hedefliyor verirseniz Pump0 konumunu yeniden düzenlemek.
Not: Bu andan itibaren bir sabit kiloda olarak doğal su buharlaşma protein damlacık üzerinden dengeler otomatik su toplama tarafından protein damlacık kalır. Protein damlacık gibi diğer parametreler sıcaklık ve bağıl nem gibi ağırlığını gerçek zamanlı görüntü penceresini kullanarak izlenebilir. Deneme burada duraklatılmış.
4. Situ DLS ölçümleri
- DLS lazer ve lazer ışını protein düşüş el ile ayar vidaları kullanarak yerleştirebilirsiniz anahtarı üzerinde .
- Aşağıdaki DLS parametreleri girin: ölçüm süresi (60 s), iki ölçüm arasındaki bekleme süresi (10 s) ve ölçümleri (300) sayısı.
Not: İlk 30 ölçümleri protein istikrar-onay için referans ölçüm olarak görev yapacak. Ölçümler geri kalanı protein damlacık tam bir soruşturma sırasında kristalizasyon işleminin toplam uzunluğu olarak görev yapacak. - DLS ölçümleri başlatmak için Başlat düğmesine basın. Örnek kalitesini DLS grafik sunumlarını birini seçerek kontrol edin.
Not: Örnek mono-dispersity, çözüm herhangi bir toplamları olmadan yüksek derecede göstermelidir. DLS sonuçları gösterilen ve olarak okumak: RADIUS dağıtım, RADIUS çubuk grafik, RADIUS arsa, ölçümleri Özet, veya sayısı oranı yoğunluk genel bir bakış.
5. örnek buharlaşma adım
- Tablo 1' de gösterilen veri kullanarak zamanlama tablosu buharlaşma adım için koşulları girin.
Not: İşareti "-" değeri "25" damlacık birimin % 25 azalma yaşayacaktır anlamına gelir iken sütunda tanıtılan "derişim/yüzdesi" ikinci sırada su kaybı protein damlacık gösterir. Bu damlacığı protein konsantrasyonu % 25 ile artacağı anlamına gelir. - Örnek buharlaşma adım Automdüğmesine basarak aktif hale getirin. Örnek buharlaşma adım tamamladığında Durdur düğmesine basın.
- Damla örnek buharlaşma durdurduktan sonra sabit tutmak için Const düğmesini etkinleştirin.
6. precipitant ek adım
- Tablo 2' de sağlanan verileri kullanarak Şekil 4 gösterilen zamanlama tablosu precipitant ek adım için koşulları girin.
Not: Sırasında belgili tanımlık bilgisayar yazılımı protein damlacık eklenecek precipitant miktarına göre protein damlacık doğal buharlaşma hızı hesaplar bir kalibrasyon adım tablonun ilk satırı temsil eder. Yazılımı bu değer tahmininiçıkarmak ve otomatik olarak otomatik olarak sonraki precipitant ek adım için su buharlaşma telafi etmek için çekim frekans Pump0 için ayarlar. - Precipitant ek adım Automdüğmesine basarak aktif hale getirin.
Not: Otomatik bir işlemin zamanlama tablosu girişi takip precipitant eklenmesidir.
7. zaman içinde kristalizasyon damlacık evrimi izleme
- Thaumatin kristalleri görünümünü CCD kamera kullanarak kontrol edin.
- Parçacık boyutu dağıtım DLS grafik sunumlarını kullanarak kontrol edin.
- Görüntü penceresini kullanarak ağırlık ve deneysel parametreleri denetleyin.
Not: Na-tartarat çözüm protein düşüş 0,74 M bir konsantrasyon ulaştığında, damlacığı thaumatin mikro-kristaller Şekil 7' de görüldüğü gibi zengin olur.
8. kristalizasyon damlacık kurtarılması
- Kat temiz standart bir Terasaki plaka parafin yağı ile.
- Parafin yağı 3 mL plaka ekleyin.
- Parafin yağı plaka wells yağ plaka 72 wells kapsar böylece nazikçe plaka farklı açılarda hareket ettirerek dağıtmak.
- Parafin yağı fazlalığı plaka üzerinde yüzer petrol dökülen kaldırın.
- Kristalizasyon deneme bitirmek için Dur düğmesine basın. Dikkatle kristalizasyon damlacık içeren örnek taşıyıcı almak.
- Bir pipet kullanımıyla, kristalizasyon damla 2 µL aliquots hacmi Terasaki plaka wells yerleştirin.
Not: bir plaka petrol altında kristalizasyon damlacık kurtararak, örnek düzenli olarak istikrar ve kristal gelişmesi ile belgili tanımlık kullanma mikroskop ya da standart Terasaki plakaları ile çalışmak diğer DLS teknikleri için kontrol edilebilir.
Representative Results
DLS ölçümleri tarafından kristalizasyon deneme sırasında elde edilen sonuçları detaylı evrimi zaman içinde geliştirmek iki ana partikül dağıtım kesirler sonuçlanan hidrodinamik parçacık dönüş yarıçapını göster. Denemenin ilk bölümünde örnek yavaş yavaş, daha yüksek bir protein konsantrasyonu sağlamak için buharlaşıp. Şekil 5Biçinde gösterildiği gibi protein damla 14 mg/mL 19.5 mg/mL konsantre oldu. Bu süre boyunca, Şekil 5A, RADIUS dağıtım desene göre protein monomeric bir davranış, yaklaşık 2,5 sabit partikül büyüklüğü ile çözümde gösterir nm. Örnek daha da buharlaşıp, monomeric proteini denatürasyon veya örnek toplama belirtisi olmadan çözümde kararlı kalır.
Precipitant eriyik-e doğru belgili tanımlık protein damla eklenmesi hemen örnek buharlaşma sonra başlatılan ve gri renkle daha iyi görselleştirme (Şekil 5) için RADIUS dağıtım desen ve denge eğrileri ile vurgulanır. Örnek ağırlık türetilmiş hesaplamalar dayanarak, vurgulanan parçacık kesir bir RADIUS boyutu yaklaşık 200-400 nm kaynaklanan kristal çekirdekleşme, inisiyasyon atfedilir. Bu olgu (çekirdekleşme da bilinir) 0,6 M precipitant bir konsantrasyon protein damlacık başlatılması üzerinden yaklaşık 66 dk-deney ve yaklaşık 23 dk precipitant başlatılması açısından bir zaman diliminde başlatılan Ayrıca. Precipitant artar konsantrasyon, RADIUS dağıtım çözümde parçacıklar geniş bir dağılım gösterir. Daha fazla çekirdek biçimi olarak, ilk kristal varlıklar 800-1.300 nm arasında bir RADIUS dağıtım ulaşan, boyutu büyüyor. Bu aşamada, kristal çekirdek büyümeye devam etmek ve protein fraksiyonu yavaş yavaş protein molekülleri alınan-up microcrystals tarafından gibi yoksul oluyor söylenebilir. İçinde belgili tanımlık protein damla precipitant konsantrasyon yavaş yavaş arttıkça, 500 ve 1.500 nm arasında geliştirmek RADIUS dağıtım devam ederken microcrystals oluşumu 75 dk sonra kolayca tanımlanır. RADIUS dağıtım evrimi Ayrıca CCD kamera görüntüleri, protein microcrystals çözüm (Şekil 7) 0,7 M precipitant bir konsantrasyon görünür nerede tarafından onaylanır. Precipitant eklenmesi bitmiş ve kristalizasyon damla sabit tutulur, RADIUS dağıtım arasında çekirdekleşme olaylar kısmını zamanla azalır iken 1000 ve 3000 nm, baskın bir aşama gösterir. Şu anda, kristalizasyon damla tam microcrystals ile doymuş olduğunu ve daha fazla çekirdekleşme olaysız çözümde mevcuttur.
Deneysel giriş olarak microbalance tarafından verilen geribildirim verileri kullanarak, kristalizasyon faz diyagramı thaumatin kristalizasyon süreci kapsamlı bir anlayış için çizilmiştir. Şekil 6' da, thaumatin T. danielli microcrystals üretim THM_2 mikro-kristaller (iletişim kuralı) nerede etiketli üç bağımsız kristalizasyon deneyler, deneysel faz diyagramı gösterir. Etiketli THM_1 makro-kristaller ve THM_3 makro-kristaller olarak kullanılmıştır iki ek kristalizasyon deney doğru eşleme faz diyagramı farklı yerlerde olması için veri girişi (Örn., çözünürlük veya metastable bölge). Bu deneyler için protokolleri farklı kristalizasyon yolları takip beri çekirdekleşme bölgenin kimliği daha kolay ve bu nedenle daha doğru olur. Her deneme için farklı yaklaşımlar vurgulamak için sipariş numaralarını ve gri ok bir tahmini son protein temsil ederken bu için belirli bir sonuç, kullanıldı kristalizasyon adım sayısını tarafından kristalizasyon yolu vurgulanır kristal büyüme uptakes protein molekülleri iyi tanımlanmış oluşumunda çözümden protein kristalleri kararlı zaman konsantrasyon.
Şekil 6 ' da sunulan üç thaumatin deneyler farklı koşullar çekirdekleşme bölge girerken göstermek ve dolayısıyla farklı son kristalizasyon sonuçları olarak faz diyagramı aşağıda resimleri görülebilir. Durumunda THM1 ve THM3, protein çözüm çekirdekleşme evresi geçirir ve nerede kristalleri formu kadar dayanıyor metastable bölge yeniden girer. Sonuç olarak, deneyler anne içki tarafından çevrili büyük, iyi tanımlanmış şekilli kristaller neden. Ancak, THM2_micro-kristaller, protokol bölümünde sunulan deneme için belli bir yaklaşımı kristalizasyon yolunu izler. Bir önceki bölümde çekirdekleşme olaylar en fazla bir oranda oluşabilir bir örnek microcrystals vermek protein çözüm derin çekirdekleşme aşamasında bulunan olduğundan bahsetti. THM2_micro-kristaller durumunda böyle bir moda örnek sadece çekirdekleşme bölge girer precipitant konsantrasyonu protein oranını ayarlandı ama bir precipitant daha fazla protein çözüme eklenir ve koşulları için hareket etmiyor faz diyagramı, başka bir bölgede ama çekirdekleşme bölgesi içinde son derece aşırıdoygun bir durumda kalır. Sonuç olarak, protein damlacık hemen küçük kristal varlıkları ile doymuş hale gelir olarak entropi çözüm büyük ölçüde azaltır.
Şekil 1. Kristalizasyon deneme şematik Gösterim. Çizim bir otomatik kristalizasyon deney için gerekli tüm teknik bölümler ile kristalizasyon deneysel odası özetini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: yazılım DLS penceresi ve kristalizasyon deneme için ilgili örnek parametrelerini. Parametreler sıcaklık, bağıl nem, viskozite, vbdahil.
Şekil 3: kristalizasyon deneyde yer Mikro dozaj sistemleri için yazılım Denetim penceresi. Özellikleri belirli parametreleri ayarlanmasına damlacıkları veya çözüm akışı nesil için izin.
Şekil 4: denemede kristalizasyon adımları açıklayan zamanlama tablo için LightBox penceresinin. Kristalizasyon damlacık başlangıç koşullarını da bu pencerede entegre edilmiştir.
Şekil 5. Thaumatin T. daniellii microcrystals üretim bakış. (A)partikül büyüklüğü içinde belgili tanımlık protein damla RADIUS dağıtım tüm kristalizasyon işlemi sırasında. (B) izlenen deneysel parametreleri genel bakış. Araziler evrim protein damlacık (siyah eğri) ağırlık için zaman içinde hesaplanan protein konsantrasyonu (kırmızı eğri) ve precipitant konsantrasyonu (mavi eğri) ile birlikte temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: deneysel kristalizasyon faz diyagramı thaumatin T. danielli elde edilen sonuçlar ile birlikte için. Tüm araziler deneysel veriler, microbalance tarafından verilen geribildirim bilgiler temel alınarak türetilir. Köşeli ayraçlar arasında görünür her deney atfedilen numaralarını sipariş ve kristalizasyon iletişim kuralı sırasında gerçekleştirilen adımları sayısı temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: THM2_Micro-kristaller (iletişim kuralı) çözümde doymuş microcrystals bol bir sayısını gösteren için kaydedilen fotoğraf. Resim 4 h (240 min) kristalizasyon için deneysel odasında protein damlacık ayarladıktan sonra çekildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: THM_1 makro-kristaller birkaç büyük thaumatin kristalleri çözüm içinde gösterilen için kaydedilen fotoğraf. Resim 20 h kristalizasyon için deneysel odasında protein damlacık ayarladıktan sonra çekildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9: THM_3 makro-kristalleri thaumatin kristalleri çeşitli boyutlarda çözümde gösterilen için kaydedilen fotoğraf. Resim 20 h kristalizasyon için deneysel odasında protein damlacık ayarladıktan sonra çekildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Madde | Derişim/yüzdesi | Zaman (s) |
| su | 0 | 100 |
| su | -25 | 2100 |
| su | 0 | 2100 |
Tablo 1: Otomatik zamanlama giriş örnek buharlaşma için adım thaumatin microcrystals üretiminde.
| Madde | Derişim/yüzdesi | Zaman (s) |
| su | 0 | 100 |
| emsal | 0.8 | 1800 |
| su | 0 | 18000 |
Tablo 2: otomatik zamanlama giriş precipitant eklenmesi için adım thaumatin üretiminde microcrystals.
Discussion
Kristalizasyon cihaz izlemek ve değiştirilmiş buharı difüzyon yöntemi üzerinde dayalı bir kristalizasyon deney sırasında çok önemli parametreler işlemek için tasarlanmıştır. Bu teknik izleme ve tüm aşamaları, kesin bilgi ve protein çözüm kristalizasyon faz diyagramı boyunca kontrolünü sahip olmasını sağlayan bir protein kristalizasyon denemeyi Puanlama in situ üzerinde DLS analizi dayalı sağlar örnek süspansiyon.
Kristalizasyon aygıt kristalizasyon damlacık gerçek zamanlı izleme izin veren bir CCD kamera bağlı bir deneysel odası (Şekil 1) oluşmaktadır. Kamera yaklaşık 2.5 µm maksimal uzamsal çözünürlük sağlayan farklı büyütme lensler ile donatılmış bir mikroskop adapte olduğunu. Zaman içinde örnek ağırlık evrimi izlemek için bir vericiyi microbalance deneysel odası çekirdeğidir. Kristalizasyon yordamı protein damla microbalance yerleştirilen bir siliconized coverslip üzerinde yerleştirildiği bir oturma bırak buharı difüzyon deney karşılık gelir. Hangi precipitant toplama, / katkı ek veya örnek buharlaşma tarafından neden olduğu, kilo değişiklikleri, damlacık, microbalance bir algoritma kesin girişine yakın zaman içinde protein ve precipitant konsantrasyon hesaplanması için verir alan . Buna ek olarak, sıcaklık ve bağıl nem gibi önemli kristalizasyon parametreleri tam olarak izlenir ve kontrol.
Kristalizasyon deney gerçekleştirmek için aygıt precipitant ve su toplama için picoliter ölçekte çalışmak (ücretsiz piezoelektrik pompalar başvurun) iki mikro-dozaj sistemleri ile donatılmıştır. Böyle küçük miktarda madde ile çalışarak, konsantrasyon gradyanlar ve protein damlacık içinde konveksiyon fenomen en aza indirilir. Piezoelektrik pompaları ana rolü precipitant veya su, protein damlacık doğal buharlaşma için tazminat olarak kullanılan örneğin ikinci eklenmesidir. Mikro dozaj sistemleri bir madde eklenmesi dikte edebilirsiniz özellikleri bir dizi var. Bu tür özellikleri şunlardır: damlacıkları sayısı ikinci, genişlik ve yükseklik madde akışı yörünge, vbeklendi bir madde eklemek için tekrarlama oranı. Ayrıca, pompalar konumunu el ile maddeler ilavesi protein damlacık içine için kesin bir konum sahip olmasını sağlayan ayarlanabilir.
Kristalizasyon açılan benzersiz geribildirim kontrollü manipülasyon olası değişiklikler protein oligomeric devlet bütün deneysel prosedür boyunca gösterebilir situ DLS veri elde edilir. Teknik dağılımının böylece bilinmeyen protein ile ilgili mekanizmalar açığa parçacık boyutu zaman içinde sürekli değerlendirme sağlar. DLS optik donanımları stratejik coverslip alanının altında coverslip geçmek ve in situ moda protein damlacık yoluyla daha fazla dedektör ve lazer ışını izin yerleştirilir; Bu nedenle, yalnızca değişiklikleri damlacık içinde DLS yolundan kaydedilir. Kolay kullanım izin vermek için cihaz iki açıklıklar vardır: bir ön kapı için bir Kullanıcı Mikro dozaj sistemleri çekim konumunu ayarlayabilirsiniz böylece en iyi coverslip ve hangi-ebilmek var çıkarmak, üst kapaktan konumlandırma hem de doğruluğu ile yeni bir protein dro ayarlama Plet coverslip üzerinde.
Söz konusu aygıtı kullanarak etkileşimli kristalizasyon yöntemi boyutu denetimli üretim protein kristalleri için güvenilir bir tekniktir. Birçok kristalizasyon Yöntem şu anda mevcut olmasına rağmen kristalizasyon hakkında bilgi içinde mekanizması kendisi kolayca ulaşılabilir değildir. Genel olarak, geleneksel kristalizasyon yöntemleri uygulayarak kristalizasyon faz diyagramı, bir deney başladıktan sonra rotasını değişen sadece birkaç imkânına sahip bir çözüm yalnızca sınırlı kontrol sağlar. Bir kristalizasyon gerçekleştirirken deneme ve böyle bir otomatik kristalizasyon teknolojinin birleştiğinde situ ile DLS, büyük bir anlaşma bilgi faz diyagramı geçişler hakkında elde edilir. Genel olarak, amorf çökelti ve homojen çekirdekleşme indüksiyon ile sonuçlanan bölgeleri birbirine yakın faz diyagramı vardır. Bu nedenle, Parçacık dağılımı hakkında gerçek zamanlı bilgileri temel alarak kristalizasyon damlacık ders işleyerek, yavaş yavaş çekirdekleşme doğru kristalizasyon koşullar ayarlayarak bir protein yağış önlemek mümkün olduğunu ve kristal oluşumu.
Günümüzde, birçok kristalizasyon koşulları precipitant çözümleri Polietilen glikol (PEG) türevleri yaygın olarak mevcut nerede yer alır. Böyle bileşikler genellikle pipetting veya dağıtımı için zorluklar sahip bir yüksek viskozite var. Mevcut durumda çalışmada, picolitre aralıklarla eklenmesi mümkün kılmak çok ince kılcal damarlar precipitant dağıtımı için kullanılan mikro dozaj sistemleri uygulanır. Sonuç olarak, son derece ağdalı maddelerle çalışan bazı sınırlamalar vardır. Son deneyler bir dizi içinde sistem aşağıdaki PEG ortamlarda kullanarak olumlu sonuçlar verdi: PEG200 %50, PEG3000% 20, PEG6000 %10, PEG800010%. Şimdiye kadar yalnızca söz konusu çözümleri test rağmen Mikro dozaj sistemleri a eriyik viskozitesi azaltmak için kullanılan bir özel Isıtma mekanizması içerir. Precipitant protein kullanıldığında dikkate alınması gereken tuz çözümleri başka bir faktördür. Yüksek konsantrasyonlu tuzları ile çalışırken, küçük bir miktar yüzeysel Mikro dozaj pompası sırasında precipitant ek engelleme neden Mikro dozaj sistemi, meme, kristalize; çok yüksek bir bağıl nem deneysel odasında mevcut olsa bile. Bu sorunu aşmak için deneme böylece tuz nozzle dan kaldırılabilmesi için beklemeye gerekiyor. Bu özel işlem gerektirebilir ve hataları precipitant toplama aşamasında ortaya çıkarabilir.
Tür otomatik kristalizasyon deneyler yapılırken elde edilebilir değerli bilgilerini temel alarak, bu teknik aynı zamanda protein kristalizasyon fiziksel kimya yönlerini araştırma çalışmaları için uzatılabilir. Çekirdekleşme ve kristal büyüme tepki oranları elde edilen ve bir deneme sıcaklık, büyüme partikül büyüklüğü ve protein gibi tasvir zaman-bağımlılık bilgilere dayanarak ve precipitant hesaplanan kinetik fenomen vardır konsantrasyon.
Disclosures
Burada yazarlar Arne Meyer, Karsten Dierks ve Christian Betzel Xtal-kavramlar GmbH, XtalController900 teknoloji üreticisi şirket hissedarları olduğunu beyan ederiz.
Acknowledgments
Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı Marie Sklodowska-Curie Acronym "X-sonda" Hibe Sözleşmesi No 637295 ve BMBF grant 05K16GUA ve "Hamburg merkezi için Ultrafast üzerinden destek kapsamında fon yazarlar kabul Görüntü-yapısı, dinamiği ve kontrol maddenin atomik ölçekli"Mükemmellik küme Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
| Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
| di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
| Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
| Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
| Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
| Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
| Soft wipes | KIMTECH Science | ||
| XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |
References
- Xtal Concepts GmbH, Germany . Patent "Vorrichtung und Verfahren zur Kontrolle der Kristallisation". , EP 2 588 649 (11754824.8) and US 9,284,659 B2 (2010).
- Chapman, H. M., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcuselongatus as a model system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 369 (1647), 20130316 (2014).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2052-2525), 246-255 (2015).
- Stevenson, H. P., et al. Use of transmission electron microscopy to identify nanocrystals of challenging protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (23), 8470-8475 (2014).
- Meyer, A., et al. Single-drop optimization of protein crystallization. Acta. Crystallogr. Sect. F. Biol. Cryst. Commun. 68 (Pt 8), 994-998 (2012).
- Ferré-D'Amaré, A. R. Crystallization of Biological Macromolecules. 5 (7), Cold Spring Harbor Laboratory Press. 847-848 (1999).
- Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34 (3), 266-272 (2004).
- Sauter, C., Lorber, B., Kern, D., Cavarelli, J., Moras, D., Giege, R. Crystallogenesis studies on yeast aspartyl-tRNAsynthetase: use of phase diagram to improve crystal quality. Acta. Cystallogr. D. Biol. Crystallogr. 55 (Pt 1), 149-156 (1999).
- Ewing, F., Forsythe, E., Pusey, M. Orthorhombic lysozyme solubility. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 4), 424-428 (1994).
- Saridakis, E. E. G., Steward, P. D. S., Lloyd, L. F., Blow, D. M. Phase diagram and dilution experiments in the crystallization of carboxypeptidase G2. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 3), 293-297 (1994).
- McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta. Crystallogr. F. Struct. Biol. Commun. 70 (Pt 11), 1445-1467 (2014).
- Sleutel, M., Van Driessche, A. E. S. Role of clusters in nanoclassical nucleation and growth of protein crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (5), 546-553 (2014).
- Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-time observation of protein dense liquid cluster evolution during nucleation in protein crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (3), 954-958 (2017).
- Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346-2357 (2010).
- Vekilov, P. G. Dense liquid precursor for the nucleation of ordered solid phases from solution. Crystal Growth & Design. 4 (4), 671-685 (2004).
- Dierks, K., Meyer, A., Einspahr, H., Betzel, C. Dynamic light scattering in protein crystallization droplets: adaptations for analysis and optimization of crystallization processes. Cryst. Growth Des. 8 (5), 1628-1634 (2008).
- Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J. Appl. Cryst. 48, 1476-1484 (2015).
- Brown, W. Dynamic light scattering: the method and some applications. , Clarendon Press: Oxford. ISBN-13: 978-0198539421 978 (1993).
