Summary
Her præsenterer vi en protokol for kontrollerede produktion af protein microcrystals. Processen bruger en automatisk anordning, der sikrer kontrolleret manipulation af flere krystallisering parametre. Protein krystallisering er båret ud af kontrollerede og automatiseret tilsætning af krystallisering løsninger mens overvågning og undersøge radius fordelingen af partikler i krystallisering slipværktøj.
Abstract
Den automatiserede krystallisering enhed er en patenteret teknik1 specielt udviklet til overvågning protein krystallisering eksperimenter med formålet at netop manøvrere Nukleering og crystal vækst retning ønskede størrelser af protein krystaller. Den kontrollerede krystallisering er baseret på prøven undersøgelsen med i situ dynamiske lys spredning (DLS), mens alle visuelle ændringer i dråben overvåges online ved hjælp af et mikroskop, koblet til en CCD kamera, således at en fuld undersøgelse af protein droplet under alle faser af krystallisering. Brugen af i situ DLS målinger i hele den hele eksperiment giver en præcis identifikation af stærkt overmættet protein løsning overgang til en ny fase-dannelsen af krystal kerner. Ved at identificere protein Nukleering stadiet, kan krystalliseringen optimeres fra store protein krystaller til produktion af protein microcrystals. Den forsøgsplan viser en interaktiv krystallisering tilgang baseret på præcise automatiserede trin såsom fældningsmiddel tilføjelse, vand fordampning for overtalelse høj supersaturation, og prøveopløsning for aftagende induceret homogene Nukleering eller vende faseovergange.
Introduction
I de sidste par år, har væksten i protein mikro- og nanokrystaller fanget opmærksomhed fra Fællesskabets Proteinkrystallografi især med den fortsatte udvikling af serielle femtosekund krystallografi (SFX). På grund af glans af roman X-ray stråling kilder og baseret på de vellykkede resultater hidtil, produktion af protein mikro - og nanokrystaller er blevet for høj relevans, udgør en stor efterspørgsel på udarbejdelsen af sådanne krystallinsk suspensioner 2 , 3. på grund af den lille krystal størrelse-range kræves for dataindsamling på fri-elektron lasere (XFELs) og de begrænsede mængder af eksperimenterende beamtime, prøve karakterisering før dataindsamling er afgørende. De mest almindelige teknikker til at karakterisere protein mikro- eller nanocrystal suspensioner er indtil nu elektronmikroskopi og X-ray pulver diffraktion.
Hidtil har er flere tilgange blevet tilpasset fra fælles krystallisering metoder med henblik på at producere bulk mængder af protein krystaller med dimensioner i området små mikrometer. Af batch-metoden bruges til hurtig sammenblanding af højt koncentrerede protein og fældningsmiddel løsninger, dermed tvinge prøveopløsningen til en yderst overmættet fase, hvor nanocrystallization kunne være begunstiget4. Andre metoder omfatter knusning store protein krystaller til at danne en krystal gylle, som kan tjene som nanocrystalline suspensioner skal bruges til data indsamling5. Dog, resultaterne kan undertiden resultere i nedsat diffraktion kvalitet, som forringet krystaller har lavere intern ordre. Nanocrystallization baseret på gratis interface diffusion er også tilgængelige alternativ, hvor protein løsningen føjes i små mængder til en meget koncentreret fældningsmiddel løsning3. Men blandt alle teknikker, de mest effektive metoder synes at være batch krystalliseringen og mere innovative manipulerende teknikker, der anvender damp-diffusion metoder siddende dråber6.
Generelt for krystallisering af en protein skal en energi barriere krydses for at støtte Nukleering - den første termodynamiske skridt i krystal formation. I for at flytte protein løsningen fra en termodynamisk stabil stat til supersaturation og endelig nogle variabler i relation til protein løsning for at fremkalde en fase-overgang, bør ændres. Sådanne variabler er normalt koncentrationen af protein løsning, miljømæssige ændringer (fx., temperatur, fugtighed), opløsningsmiddel karakteristika (f.eks., pH, ionisk styrke), koncentration og buffer egenskaber, etc.7 ,8 en oversigt over prøve parametre, som kan ændres repræsenteres normalt ved hjælp af fasediagrammer, som giver mulighed for forskellige former for præsentation, såsom opløselighed diagrammer, Nukleering fasediagrammer, eller endnu mere detaljerede beskrivelser, hvor tre-dimensionelle eller mere komplekse diagrammer kan komme i betragtning8,9,10. De mest tiltalende typer af fasediagrammer er normalt to-dimensionelle, hvor de vigtigste variable er protein koncentrationen som funktion af en anden parameter, mens de resterende parametre holdes konstante6,11. Når en eller et par kerner er dannet, kan større krystaller vokse ved at optage ekstra protein fra bulk løsning. Når der sigtes for mikro- og nanocrystal produktion, er sådan en konventionel krystallisering tilgang ikke muligt længere på grund af det lille antal af krystaller, der er til stede i løsning. Nanocrystalline suspensioner nødt normalt til at være rig i krystallinsk enheder, således krystallisering pathway må justeres, således at der er en maxima af Nukleering arrangementer til stede i prøven. I følge kræver dette undersøgelse af nogle nye, indtil nu uudforsket Nukleering veje for proteiner, som også er endnu ikke fuldt forstået12,13. Baseret på de fase diagram fundamentals nævnte tidligere, den klassiske teori er blevet udvidet til en ny hypotese, hvor Nukleering er beskrevet som en to-trins-mekanisme: først en overgang til en højere proteinkoncentration finder sted (tætte væske fase) og for det andet, en overgang fra en tæt-rige fase til en højere interne orden (krystal kerner med gitter arkitektur)14,15,16. Protein krystallisering er følsomme over for mange faktorer, og derfor når krystallisering opskrifter er efterjusteres resultere i forskellige størrelse krystaller, opskrifterne kan ikke altid stole på forkundskaber. Ny indsigt skal fastsættes for hvert enkelt protein mål: justering af buffer sammensætning, renhed og stabilitet af den prøve, præcise viden om protein opløselighed, osv.
Dynamisk lysspredning er i dag en veletableret metode til analyse og optimering af protein krystallisering processer, på grund af en række størrelsen af partikler, der kan undersøges: fra monomere proteiner til nanokrystaller og små microcrystals. Metoden udnytter at partikler i løsning underkastes Brownske bevægelser og at den gennemsnitlige hastighed for denne bevægelse bestemmes af partikelstørrelse, deres termisk energi og af viskositet medium og partikel geometri. Ved første, er den flydende medium belyst af en sammenhængende lyskilde med brug af en laser. Lysspredningen af partikler er danner et interferensmønster. Da partiklerne er i permanent bevægelse ændres interferensmønster også permanent. Når man ser i en bestemt retning, kan intensitet udsving observeres. Disse udsving viser nu partikel bevægelse forårsaget af Brownske bevægelser. En autokorrelation funktion (ACF) er beregnet ud fra de målte intensitet udsving. En analyse af rådgivende vil give en foranstaltning for hastighed distribution (mere præcist diffusion koefficient) af partikler og ved hjælp af Stokes-Einstein ligning, omdannes til en partikel radius distribution17. Yderligere oplysninger om DLS funktionalitet og Funktionsprincip kan findes i forskellige publikationer og bøger18,19.
Her vi anvende og beskrive en unik automatiseret krystallisering enhed, XtalController900, en opgraderet version af den XtalController teknologi6, netop udviklet til overvågning af interaktive protein krystallisering eksperimenter. Denne teknik viser et højt potentiale for identifikation og sporing af Nukleering begivenheder i realtid, giver mulighed for en præcis manøvrering gennem krystallisering fase diagram. Formålet med denne særlige krystallisering procedure er at optimere protein krystallisering for at opnå høj kvalitet protein mikro- og nanokrystaller, der er egnet til anvendelser udnytter mikro-fokuserede synkrotron X-ray kilder, elektron diffraktion, eller SFX.
Protocol
Bemærk: I hele den hele protokol, mikro-dosering systemet anvendes i tilsætning af vand vil være omtalt som Pump0 mens mikro-dosering systemet anvendes i tilsætning af fældningsmiddel vil blive kaldt Pump1. Resultaterne af dette eksperiment vil være yderligere drøftet og omtales som THM2_micro-krystaller.
1. parametre og opsætning af løsning
- Filtrer 16 mL Na-tartrat løsning (1,2 M) og 16 mL destilleret vand ved hjælp af en 0,2 µm steril sprøjte filter.
Bemærk: Na-tartrat løsningen repræsenterer den fældningsmiddel løsning for krystallisering eksperiment. - Fyld fældningsmiddel og vand flasker med 5 mL af de filtrerede løsninger.
Bemærk: Flasker har en maksimal kapacitet på 5 mL. - Montere flasker i pumpen indehavere af den eksperimentelle kammer.
- De eksperimentelle parametre er angivet i vinduet software til følgende værdier: temperatur på 20 ° C, relativ fugtighed på 20 og opløsningsmiddel som vand.
Bemærk: Figur 2 viser displayvinduet, hvor brugeren kan indsætte de korrekte værdier for hver enkelt parameter såsom temperatur, relativ luftfugtighed og solvens. Vinduet software viser også nogle yderligere parametre såsom tilsætningsstoffer. Det er kun vigtigt for eksperimenter, hvor tilsætningsstoffer er til stede i opløsningen fældningsmiddel. - Åbne hoveddøren af eksperimentelle salen og fjerne coverslip luftfartsselskab.
- Placer en ren og Silikoniseret coverslip på transportøren og læg den tilbage i enheden.
Bemærk: Coverslip har en størrelse på 2,2 cm. - Luk det eksperimentelle kammeret for at sikre de miljømæssige forhold fra trin 1.4.
Bemærk: Protokollen kan pause her.
2. mikro-dosering systemer justering
- Skifte ON Pump0 via vigtigste pumpe karakteristika i figur 3 og skabe en vandstråle.
Bemærk: Vand stream bane er skabt baseret på nogle pumpe karakteristika, der kan justeres. Figur 3 viser de vigtigste pumpe karakteristika og den optimale værdier, der skal bruges til dette eksperiment. - Justere vand stream sigter position mod midten af coverslip af manuelt opererer sine udpegede justeringsskrue. Skifte ud Pump0.
- Skifte ON Pump1 og skabe en flydende strøm som tidligere gjort i trin 2.1. Justere positionen stream af Pump1 mod den holdning fast til Pump0. Skifte ud Pump1.
- Erstatte den anvendte coverslip med en ny og ren en for krystallisering eksperiment.
Bemærk: Bløde klude er normalt anbefales til rengøring den nye coverslip fra resterende støv, før der anvendes i krystallisering eksperiment.
3. indstilling et Thaumatin fald i den eksperimentelle kammer
- Opret en ny eksperimenterende fil ved hjælp af softwarepakken. Angiv følgende oplysninger i filen eksperimentelle: protein (thaumatin fra Thaumatococcus daniellii), proteinkoncentration (14 mg/mL), fældningsmiddel (Na-tartrat) og fældningsmiddel koncentration (1,2 M).
Bemærk: Denne oplysninger vil tjene for automatiske beregninger af fældningsmiddel og protein koncentration under krystallisering eksperimentet. - Indlæse filen nye eksperiment for at aktivere alle oplysninger fra trin 3.1.
- Mark positionen af protein droplet ved at tilføje en lille vanddråbe ved hjælp af Pump0.
Bemærk: Målet er at skabe en lille vanddråbe, der vil tjene som et vartegn, som eksemplet protein vil være placeret. - Tryk på knappen Tara til at indstille den vægt af microbalance til nul.
Bemærk: Dette vil fjerne vægten af coverslip og den ekstra vægt tilføjet af den lille vand landmark skabt taktfast 3.3. - Åbn det øverste låg af den eksperimentelle kammer og afpipetteres 8 µL af thaumatin løsning på vand vartegn.
- Registrer nye thaumatin drop ved at følge den næste befalinger.
- Tryk på knappen New drop at tilskrive de oprindelige betingelser fra den eksperimentelle fil.
- Tryk på knappen Const at kompensere den naturlige fordampning af vand fra slipværktøjet.
- Spørg CCD-kamera, hvis Pump0 sigter i drop-protein. Justere placeringen af Pump0, hvis vandet strøm sigter uden for drop.
Bemærk: Fra dette øjeblik og fremefter, protein droplet vil forblive på et konstant vægt, ved automatiseret vand som kompenserer for naturlige vand fordampning fra protein droplet. Vægten af protein slipværktøj, samt de andre parametre såsom temperatur og relativ luftfugtighed kan overvåges i realtid ved hjælp af displayvinduet. Forsøget kan afbrydes midlertidigt her.
4. in Situ DLS målinger
- Tænd på DLS laser og placere laserstrålen i protein drop ved manuelt ved hjælp af justering skruer.
- Angiv følgende DLS parametre: måling varighed (60 s), ventetid mellem to målinger (10 s), og antallet af målinger (300).
Bemærk: De første 30 målinger vil tjene som referencemålinger for protein stabilitet-check. Resten af målingerne vil tjene som en fuldstændig undersøgelse af protein droplet under den samlede længde af krystallisering processen. - Tryk på Start til at indlede DLS målinger. Kontrollere kvaliteten af prøven ved at vælge en af DLS grafiske fremstillinger.
Bemærk: Prøven skal vise en høj grad af mono-dispersity, uden nogen aggregater i løsningen. DLS resultater kan vist og læses som: radius distribution, radius histogrammet, radius plot, målinger Resumé, eller som en oversigt over antal sats intensitet.
5. prøven fordampning trin
- Angive betingelser for trinnet fordampning i tidsplanen tabel ved hjælp af de data, der er vist i tabel 1.
Bemærk: Tegnet "-" indført i kolonnen "Molariteten/procentdel" i den anden række repræsenterer et tab af vand fra protein slipværktøj, mens værdien "25" betyder at droplet volumen vil lide en nedsættelse på 25%. Det betyder, at protein koncentrationen af slipværktøjet vil stige med 25%. - Aktivere prøve fordampning trin ved at trykke på knappen multimediedrevet. Tryk på knappen Stop , når prøven fordampning trin er afsluttet.
- Aktivere knappen Const at holde drop konstant efter at have stoppet den prøve fordampning.
6. fældningsmiddel tilføjelse trin
- Angive betingelser for trinnet fældningsmiddel tilsætning i tidsplan tabel vist i figur 4 ved hjælp af oplysningerne i tabel 2.
Bemærk: Den første række i tabellen repræsenterer en kalibrering skridt, hvor softwaren beregner den naturlige fordampning sats af protein slipværktøjet baseret på mængden af fældningsmiddel, der skal føjes til protein slipværktøjet. Softwaren ekstrapolere denne værdi og justerer automatisk skydning frekvensen for Pump0 automatisk kompensation vand fordampning for den næste skridt i fældningsmiddel tilsætning. - Aktivere fældningsmiddel tilføjelse trin ved at trykke på knappen multimediedrevet.
Bemærk: Tilsætning af fældningsmiddel er en automatiseret proces, efter input fra tabellen tidsplan.
7. sporing udviklingen af krystallisering slipværktøjet Over tid
- Kontrollere udseendet af thaumatin krystallerne ved hjælp af CCD-kamera.
- Kontrollere partikelstørrelsesfordeling ved hjælp af DLS grafiske fremstillinger.
- Tjekke udviklingen i vægt og eksperimenterende parametre ved hjælp af displayvinduet.
Bemærk: Når Na-tartrat løsningen når en koncentration af 0,74 M i protein drop, slipværktøjet bliver rig på thaumatin mikro-krystaller som det ses i figur 7.
8. inddrivelse af krystallisering slipværktøj
- Coat en ren standard Terasaki plade med paraffinolie.
- Tilføj 3 mL af paraffinolie til pladen.
- Sprede paraffinolie på plade brønde ved at forsigtigt flytte pladen på forskellige vinkler, så at olien dækker alle 72 hullerne i pladen.
- Fjern overskydende paraffin olie ved at hælde ud af olien, der flyder på pladen.
- Tryk på knappen Stop til at afslutte krystallisering eksperiment. Omhyggeligt tage prøven Flyselskabet indeholdende krystallisering droplet.
- Med brug af en pipette, skal du placere en volumen på 2 µL delprøver af krystallisering drop i wells af Terasaki pladen.
Bemærk: Ved at inddrive krystallisering dråbe i en plade under olie, prøven kan jævnligt kontrolleres for stabilitet og crystal vækst ved hjælp af et mikroskop eller andre DLS teknikker, der arbejder med standard Terasaki plader.
Representative Results
Resultaterne af DLS målinger under krystallisering eksperimentet viser en detaljeret evolution af de hydrodynamiske partikel radier resulterer i to vigtigste partikel distribution fraktioner, der udvikler sig over tid. I den første del af forsøget, var prøven langsomt fordampet, for at opnå et højere proteinkoncentration. Som vist i figur 5B, var protein dråbe koncentreret fra 14 mg/mL til 19,5 mg/mL. I løbet af denne tid, ifølge radius fordeling mønster i figur 5A, proteinet viser en monomere adfærd i løsning med et konstant partikelstørrelse på ca 2,5 nm. Da prøven er der yderligere fordampet, forbliver de monomere protein stabil i løsning, uden nogen tegn på denaturering eller prøve sammenlægning.
Tilsætning af fældningsmiddel løsning til protein drop er straks indledes efter prøven fordampning og fremhævet med grå i radius fordeling mønster og balance kurver for bedre visualisering (figur 5). Baseret på beregninger afledt af prøven vægt, tilskrives fremhævet partikel brøkdel indledning af crystal Nukleering, hvilket resulterer i en radius størrelse på ca 200-400 nm. Dette fænomen (kendt som Nukleering) initieres ved en fældningsmiddel koncentration på 0,6 M i protein slipværktøjet, i en periode på ca. 66 min. efter indledningen af eksperiment og ca. 23 min. i forbindelse med iværksættelse af fældningsmiddel tilføjelse. Som en koncentration af de fældningsmiddel stigninger viser radius fordelingen en bred distribution af partikler i løsning. Som flere kerner form, den oprindelige krystallinsk enheder vokser i størrelse, nå en radius fordeling mellem 800-1.300 nm. Det kan konkluderes, at på dette tidspunkt, crystal kerner fortsætter med at vokse, og proteinfraktion gradvist bliver fattigere, da proteinmolekyler er taget op af microcrystals. Som fældningsmiddel koncentrationen i protein drop langsomt stiger, er dannelsen af microcrystals let identificeres efter 75 min, når radius distribution fortsætter med at udvikle mellem 500 og 1500 nm. Udviklingen af radius-distribution er også bekræftet af CCD kamerabilleder, hvor protein microcrystals er synligt ved en fældningsmiddel koncentration på 0,7 M i løsning (figur 7). Som fældningsmiddel tilføjelsen er færdig og krystallisering drop holdes konstant, viser radius fordelingen en fremherskende fase mellem 1.000 og 3.000 nm, mens fraktion af Nukleering begivenheder aftager over tid. I dette øjeblik, krystallisering drop er fuldt mættet med microcrystals og ingen yderligere Nukleering begivenheder er til stede i løsning.
Brug som eksperimentelle input feedback data, som afgives af microbalance, var en krystallisering fase diagram trukket for en omfattende forståelse af thaumatin krystallisering processen. I figur 6viser eksperimenterende fase diagram tre uafhængige krystallisering eksperimenter, hvor produktionen af thaumatin T. danielli microcrystals er mærket som THM_2 mikro-krystaller (protokol). To yderligere krystallisering eksperimenter mærket THM_1 makro-krystaller og THM_3 makro-krystaller er blevet brugt som input data for at få en korrekt kortlægning af de forskellige områder i fase diagram (fx., opløselighed eller metastabile region). Da protokollerne for disse eksperimenter følger forskellige krystallisering veje, bliver identifikation af regionen Nukleering lettere, og dermed mere nøjagtige. Til hvert eksperiment, er stien krystallisering fremhævet af antal for at fremhæve de forskellige tilgange og antallet af krystallisering trin, der er anvendt til et bestemt resultat, mens de grå pile repræsenterer et skøn over de endelige protein koncentration når crystal vækst fastkursaftaler proteinmolekyler fra løsning i dannelsen af veldefinerede stabil protein krystaller.
De tre thaumatin eksperimenter præsenteret i figur 6 viser forskellige betingelser når ind i regionen Nukleering, og dermed forskellige endelige krystallisering resultater som det kan ses fra billederne nedenfor fase diagram. THM1 og THM3, protein løsning passerer Nukleering fasen og igen træder den metastabile region, hvor den hviler indtil krystaller form. Derfor, eksperimenterne føre til store, veldefinerede formet krystaller omgivet af mor spiritus. Men for eksperimentet præsenteret i afsnittet protokol, THM2_micro-krystaller, krystallisering stien følger en bestemt tilgang. I et tidligere afsnit nævnt vi, at for en prøve for at give microcrystals, protein løsning har til at ligge dybt i Nukleering fasen, så Nukleering begivenheder kan danne med en maksimal hastighed. I forbindelse med THM2_micro-krystaller, forholdet mellem protein fældningsmiddel koncentration blev justeret på en sådan måde at prøven ikke kun træder Nukleering regionen, men som en fældningsmiddel tilføjes yderligere protein løsning, og betingelserne, der ikke flytter til et andet område i diagrammet, fase, men stadig i en stærkt overmættet stat i regionen Nukleering. Som et resultat, mindskes entropi med løsningen drastisk som protein droplet bliver straks mættet med små krystallinsk enheder.
Figur 1. Skematisk fremstilling af krystallisering eksperiment. Tegningen viser en oversigt over krystallisering eksperimentelle kammer med alle de tekniske dele kræves for at gennemføre en automatiseret krystallisering eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Software vindue for DLS og prøve parametre, der er relevante for en krystallisering eksperiment. Parametre omfatter temperatur, relativ luftfugtighed, viskositet, osv.
Figur 3: Software kontrol vindue for mikro-dosering systemer involveret i krystallisering eksperiment. Funktionerne, der tillader justering af specifikke parametre for generation af dråber eller løsning stream.
Figur 4: Software vinduet for tabellen skema beskriver krystallisering trin involveret i eksperimentet. De oprindelige betingelser for krystallisering droplet er også integreret i dette vindue.
Figur 5. Oversigt over thaumatin T. daniellii microcrystals produktion. (A) Radius distribution af partikelstørrelse i drop-protein i løbet af hele krystallisering processen. (B) overvåges oversigt over eksperimentelle parametre. Observationsområderne repræsenterer udviklingen over tid for vægten af protein slipværktøj (sort kurve) sammen med den beregnede proteinkoncentration (rød kurve) og fældningsmiddel koncentration (blå kurve). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: eksperimenterende krystallisering fase diagram for thaumatin T. danielli sammen med de resulterende resultater. Alle parceller er afledt af forsøgsdata, baseret på feedback oplysninger givet af microbalance. Numre henføres til hvert eksperiment, der er synlige mellem parenteser repræsenterer rækkefølgen og antallet af skridt taget under en krystallisering protokol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: indspillet fotografi til THM2_Micro-krystaller (protokol) viser et rigeligt antal microcrystals mættet i løsning. Billedet blev taget på 4 h (240 min) efter indstilling protein dråbe i den eksperimentelle kammer for krystallisering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: indspillet fotografi til THM_1 makro-krystaller viser et par store thaumatin krystaller stabil i løsning. Billedet blev taget 20 h efter indstilling protein dråbe i den eksperimentelle kammer for krystallisering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: indspillet fotografi til THM_3 makro-krystaller viser forskellige størrelser af thaumatin krystaller i løsning. Billedet blev taget 20 h efter indstilling protein dråbe i den eksperimentelle kammer for krystallisering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Stof | Molariteten/procentdel | Tid (s) |
| vand | 0 | 100 |
| vand | -25 | 2100 |
| vand | 0 | 2100 |
Tabel 1: Automatiseret tidsplan input til prøven fordampning trin i produktionen af thaumatin microcrystals.
| Stof | Molariteten/procentdel | Tid (s) |
| vand | 0 | 100 |
| præcision | 0,8 | 1800 |
| vand | 0 | 18000 |
Tabel 2: automatiseret tidsplan input fældningsmiddel tilføjelse trin i produktionen af thaumatin microcrystals.
Discussion
Krystallisering enhed er designet til at overvåge og manipulere afgørende parametre under en krystallisering eksperiment baseret på en modificeret damp-diffusion metode. Denne teknik giver mulighed for overvågning og scoring en protein krystallisering eksperiment på alle stadier, gør det muligt for brugeren at har præcis viden og kontrol af protein løsning i hele krystallisering fase diagram, baseret på in situ DLS analyse for eksempel suspension.
Krystallisering enhed består af en eksperimentel kammer (figur 1) tilsluttet en CCD-kamera, der giver mulighed for tidstro overvågning af krystallisering slipværktøjet. Kameraet er tilpasset et mikroskop udstyret med forskellige forstørrelse objektiver, giver en maksimal rumlige opløsning af ca 2,5 µm. Kernen i den eksperimentelle kammer er en ultrasensitive microbalance til at spore udviklingen af prøven vægt over tid. Krystallisering proceduren svarer til en møde-slip damp-diffusion eksperiment, hvor protein dråbe er placeret på en Silikoniseret coverslip, som er placeret på microbalance. Baseret på vægtændringer af droplet, som er forårsaget af fældningsmiddel tilsætning, vand/additiv tilsætning eller prøve fordampning, giver microbalance et præcist input til en algoritme for øjeblikkelig beregning af protein og fældningsmiddel koncentration over tid . Derudover vigtigt krystallisering parametre såsom temperatur og relativ luftfugtighed netop overvåges og kontrolleres.
For at udføre en krystallisering eksperiment, er enheden udstyret med to mikro-dosering systemer (kontakt gratis piezoelektriske pumper) at arbejde på en picoliter skala for fældningsmiddel og vand ud. Ved at arbejde med sådanne små mængder af stoffet, er koncentration stigninger og konvektion fænomen inden for protein droplet minimeret. Den vigtigste rolle i de piezoelektriske pumper er tilføjelsen af fældningsmiddel eller vand, sidstnævnte for eksempel bliver brugt som erstatning for naturlige fordampning af protein slipværktøjet. Mikro-dosering systemer har en række funktioner, som kan diktere tilføjelsen af et stof. Sådanne funktioner omfatter: gentagelseshyppighed for at tilføje et stof, antallet af dråber tilsat pr sekund, bredde og højde af stof stream bane osv. Derudover kan placeringen af pumperne manuelt justeres, gør det muligt for brugeren at have en præcis position for tilsætning af stoffer til protein slipværktøjet.
Unikke feedback styres manipulation af krystallisering drop opnås ved i situ DLS data, som kan vise eventuelle ændringer i tilstanden protein oligomere under hele eksperimentelle proceduren. Teknikken tillader konstant evaluering af partikelstørrelsesfordeling over tid, således afslører ukendt protein-relaterede mekanismer. DLS optik udstyr er beliggende strategisk under coverslip-området, som gør detektor og laser stråle til at passere gennem coverslip og videre gennem protein dråbe i en i situ mode; Derfor registreres kun ændringer inden for slipværktøjet fra DLS sti. For at give mulighed for nem håndtering, enheden har to åbninger: en dør til en optimal placering af coverslip og en top låg, som kan fjernes, således at brugeren kan tilpasse de skydning stilling af mikro-dosering systemer samt indstilling med nøjagtighed en ny protein dro plet på coverslip.
Den interaktive krystallisering metode ved hjælp af førnævnte enhed er en pålidelig teknik til størrelse-kontrollerede produktion af protein krystaller. Selvom mange krystallisering metoder er i øjeblikket tilgængelige, intern viden om krystalliseringen er mekanisme sig selv ikke let opnåelige. Generelt giver anvender konventionelle krystallisering metoder kun begrænset kontrol over en løsning i krystallisering fase diagram, med kun et par muligheder for at ændre sin kurs, når et eksperiment er begyndt. Mens de udfører en krystallisering eksperimentere og anvende sådanne en automatiseret krystallisering teknologi kombineret med i situ DLS, en stor portion viden er opnået om overgange i fase diagram. I almindelighed, er regionerne resulterer i amorfe bundfald og induktion af homogene Nukleering tæt på hinanden i fase diagram. Ved at manipulere kursus af en krystallisering droplet baseret på real-time oplysninger om dens partikel distribution, er det derfor muligt at undgå udfældning af et protein ved gradvist at krystallisering betingelser mod Nukleering og krystal formation.
I dag, omfatter mange krystallisering betingelser fældningsmiddel løsninger hvor polyethylenglycol (PEG) derivater er almindeligt stede. Sådanne forbindelser har som regel en høj viskositet, som kan have vanskeligheder for pipettering eller udlevering. I den aktuelle case study anvende de mikro-dosering systemer, der anvendes til fældningsmiddel udlevering meget tynd kapillærer, der muliggør tilføjelse af picolitre intervaller. Som følge heraf er der nogle begrænsninger i arbejdet med meget tyktflydende stoffer. Inden for en række tidligere eksperimenter, systemet har givet positive resultater ved hjælp af følgende PIND derivater: PEG200 50%, PEG3000 20%, PEG6000 10%, PEG800010%. Men indtil videre kun de ovennævnte løsninger blev testet, indeholder mikro-dosering systemer en særlig varme mekanisme, som kan anvendes til at reducere viskositeten af en løsning. En anden faktor er saltopløsninger, der skal overvejes, når det anvendes som protein fældningsmiddel. Når du arbejder med stærkt koncentrerede salte, kan en lille mængde krystallisere på dysen af mikro-dosering system, forårsager overfladiske blokering af mikro-dosering pumpe under fældningsmiddel tilføjelse; selv når en meget høj relativ luftfugtighed er til stede i den eksperimentelle kammer. For at afhjælpe dette problem, skal eksperimentet sættes på hold, således at salt fra dysen kan fjernes. Dette kræver muligvis særlig håndtering og kan producere fejl i fældningsmiddel tilføjelse fase.
Baseret på de værdifulde oplysninger, der kan opnås, når du udfører disse automatiserede krystallisering eksperimenter, kan denne teknik også udvides til studier undersøger fysisk kemi aspekter af protein krystallisering. Nukleering og crystal reaktion vækstraterne er kinetiske fænomener, som kan være afledt og beregnes baseret på den tid-afhængighed oplysninger afbildet fra et eksperiment som temperatur, vækst af partikelstørrelsen og protein og fældningsmiddel koncentration.
Disclosures
Vi erklærer hermed, at forfatterne Arne Meyer, Karsten Dierks og Christian Betzel er aktionærer i selskabet Xtal-begreber GmbH, producent af XtalController900 teknologi.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender finansiering fra EUs Horisont 2020 forskning og Innovation program under Marie Sklodowska-Curie Acronym "X-sonde" Grant aftale No. 637295 og støtte via BMBF grant 05K16GUA, og den "The Hamburg centrum for ultrahurtig Imaging-struktur, dynamik og kontrol af sagen på atomare skalaen"excellence klynge af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
| Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
| di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
| Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
| Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
| Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
| Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
| Soft wipes | KIMTECH Science | ||
| XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |
References
- Xtal Concepts GmbH, Germany . Patent "Vorrichtung und Verfahren zur Kontrolle der Kristallisation". , EP 2 588 649 (11754824.8) and US 9,284,659 B2 (2010).
- Chapman, H. M., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcuselongatus as a model system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 369 (1647), 20130316 (2014).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2052-2525), 246-255 (2015).
- Stevenson, H. P., et al. Use of transmission electron microscopy to identify nanocrystals of challenging protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (23), 8470-8475 (2014).
- Meyer, A., et al. Single-drop optimization of protein crystallization. Acta. Crystallogr. Sect. F. Biol. Cryst. Commun. 68 (Pt 8), 994-998 (2012).
- Ferré-D'Amaré, A. R. Crystallization of Biological Macromolecules. 5 (7), Cold Spring Harbor Laboratory Press. 847-848 (1999).
- Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34 (3), 266-272 (2004).
- Sauter, C., Lorber, B., Kern, D., Cavarelli, J., Moras, D., Giege, R. Crystallogenesis studies on yeast aspartyl-tRNAsynthetase: use of phase diagram to improve crystal quality. Acta. Cystallogr. D. Biol. Crystallogr. 55 (Pt 1), 149-156 (1999).
- Ewing, F., Forsythe, E., Pusey, M. Orthorhombic lysozyme solubility. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 4), 424-428 (1994).
- Saridakis, E. E. G., Steward, P. D. S., Lloyd, L. F., Blow, D. M. Phase diagram and dilution experiments in the crystallization of carboxypeptidase G2. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 3), 293-297 (1994).
- McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta. Crystallogr. F. Struct. Biol. Commun. 70 (Pt 11), 1445-1467 (2014).
- Sleutel, M., Van Driessche, A. E. S. Role of clusters in nanoclassical nucleation and growth of protein crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (5), 546-553 (2014).
- Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-time observation of protein dense liquid cluster evolution during nucleation in protein crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (3), 954-958 (2017).
- Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346-2357 (2010).
- Vekilov, P. G. Dense liquid precursor for the nucleation of ordered solid phases from solution. Crystal Growth & Design. 4 (4), 671-685 (2004).
- Dierks, K., Meyer, A., Einspahr, H., Betzel, C. Dynamic light scattering in protein crystallization droplets: adaptations for analysis and optimization of crystallization processes. Cryst. Growth Des. 8 (5), 1628-1634 (2008).
- Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J. Appl. Cryst. 48, 1476-1484 (2015).
- Brown, W. Dynamic light scattering: the method and some applications. , Clarendon Press: Oxford. ISBN-13: 978-0198539421 978 (1993).
