Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Växande proteinkristaller med olika dimensioner med automatiserad kristallisering tillsammans med In Situ det dynamiska ljusspridning

doi: 10.3791/57070 Published: August 14, 2018

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för kontrollerad produktion av protein microcrystals. Processen använder en automatiserad enhet som tillåter kontrollerad manipulation av flera kristallisering parametrar. Protein kristalliseringen är buret ut av kontrollerade och automatiserade tillägg av kristallisering lösningar samtidigt som övervakning och undersökning av RADIUS-fördelningen av partiklar i kristallisering droplet-programmet.

Abstract

Automatiserad kristallisering av enheten är en patenterad teknik1 speciellt utvecklad för övervakning protein kristallisering experiment i syfte att just manövrera den kärnbildning och crystal tillväxt mot önskad storlekar av proteinkristaller. Kontrollerad kristalliseringen är baserad på prov utredning med i situ dynamisk ljus spridning (DLS) medan alla visuella ändringar i droplet-programmet övervakas online med hjälp av ett mikroskop som kopplas till en CCD-kamera, vilket möjliggör en fullständig utredning av protein droplet-programmet under alla stadier av kristallisering. Användning av i situ DLS mätningar i hela hela experimentet tillåter en exakt identifiering av mycket övermättad protein lösningen övergår till en ny fas – bildandet av crystal atomkärnor. Genom att identifiera protein kärnbildning scenen, kan kristallisation optimeras från stora proteinkristaller till produktion av protein microcrystals. Experimentell protokollet visar en interaktiv kristallisering strategi baserad på exakt automatiserade steg såsom fällningsmedel dessutom vattenavdunstning för inducerande hög övermättnaden, och provspädning för att bromsa inducerad homogen kärnbildning eller backning fasövergångar.

Introduction

De senaste åren, har tillväxten av protein mikro- och nanokristaller fångat uppmärksamheten av röntgenkristallografi gemenskapen, särskilt med kontinuerlig utveckling av seriell femtosekund kristallografi (SFX). På grund av briljans av romanen röntgen strålning källor och baserat på framgångsrika resultat hittills, produktion av protein mikro - och nanokristaller blivit av hög relevans, poserar en hög efterfrågan på utarbetandet av sådana kristallina suspensioner 2 , 3. på grund av liten kristall-intervallet storlek krävs för datainsamling vid fri elektron lasrar (XFELs) och den begränsade tillgången på experimentell beamtime, prov karakterisering innan datainsamlingen är viktigt. De vanligaste teknikerna att karakterisera protein mikro- eller fysikalisk suspensioner är tills nu elektronmikroskopi och pulver röntgendiffraktion.

Flera metoder har hittills anpassats från vanliga kristallisering metoder i syfte att producera bulk mängder proteinkristaller med dimensioner i intervallet liten mikrometer. Metoden batch används för snabb blandning av hög koncentrerat protein och fällningsmedel lösningar, vilket tvingade provlösningen till en mycket övermättad fas där nanocrystallization kan vara gynnade4. Andra metoder inkluderar krossning stora proteinkristaller bildar en kristall slurry, som kan tjäna som nanokristallin suspensioner som ska användas för data collection5. Dock kan resultaten ibland resultera i minskad diffraktion kvalitet, som försämrade kristaller har lägre inre ordning. Nanocrystallization baserat på gratis gränssnitt diffusion är också tillgängliga alternativ, där protein lösning tillsätts i små mängder till en högkoncentrerad fällningsmedel lösning3. Men bland alla tekniker verkar de mest effektiva metoderna vara batch kristallisation och mer innovativa manipulativa tekniker med vapor-diffusion metoder i sittande droppar6.

I allmänhet för kristallisation av ett protein måste en energi barriär korsas för att stödja kärnbildning - det första termodynamiska steget i crystal bildandet. I för att flytta den protein-lösningen från en thermodynamically stabil stat till övermättnaden och slutligen för att framkalla en fas-övergång, vissa variabler med anknytning till protein lösningen måste ändras. Sådana variabler är oftast koncentrationen av protein lösningen, miljöförändringar (t.ex., temperatur, fuktighet), lösningsmedel egenskaper (t.ex., pH, jonstyrka), koncentration och buffert egenskaper, etc.7 ,8 en översikt över urval parametrar som kan ändras företräds vanligen genom fasdiagram, som tillåter olika lägen av presentation, såsom löslighet diagram, kärnbildning fasdiagram eller ännu mer detaljerad beskrivningar där tredimensionella eller mer komplexa diagram kan komma in i övervägande8,9,10. De mest tilltalande typerna av fasdiagram är vanligtvis tvådimensionell, där den viktigaste variabeln är protein koncentrationen som en funktion av en annan parameter, medan återstående parametrar hålls konstant6,11. När en eller några få kärnor bildas, kan större kristaller växa genom att ta upp ytterligare protein från bulk lösningen. När syftet för mikro- och fysikalisk produktion, är en sådan konventionella kristallisering strategi inte möjligt längre på grund av ett litet antal kristaller som finns i lösningen. Nanokristallin suspensioner har oftast att vara rik i kristallin enheter, således det kristallisering utbildningsavsnittet har justeras, sådan att det finns en maxima kärnbildning händelser i provet. I följd, kräver detta utredning av vissa nya, tills nu outforskade kärnbildning vägar för proteiner, som också är ännu inte helt förstått12,13. Baserat på fasen diagram grunderna som nämnts tidigare, den klassiska teorin har utökats till en ny hypotes, där kärnbildning beskrivs som en mekanism för två steg: först en övergång till en högre proteinkoncentration sker (tät vätska fas) och andra, en övergång från en tät-rik fas till en högre intern ordning (crystal kärnor med galler arkitektur)14,15,16. Protein kristallisering är känslig för många faktorer, och därför när kristallisering recept är återjusteras resultera i olika stora kristaller, recept kan inte alltid lita på tidigare kunskap. Nya insikter måste fastställas för varje enskilt protein mål: justering av buffert sammansättning, renhet och stabilitet av prov, exakt kunskap om protein löslighet, etc.

Dynamiska ljusspridning är idag en väletablerad metod för analys och optimering av protein kristallisering processer, på grund av en storlek-mängd partiklar som kan undersökas: från monomer protein nanokristaller och små microcrystals. Metoden utnyttjar att partiklar i lösningen genomgår Brownsk rörelse och att den genomsnittliga hastigheten på denna rörelse bestäms av partikelstorlek, sin värmeenergi och viskositet medium och partikel geometri. Först är det flytande mediet upplyst av en koherent ljuskälla med hjälp av en laser. Det ljus som sprids av partiklar bildas en interferensmönstret. Eftersom partiklarna är i ständig rörelse ändras interferensmönstret också permanent. När man tittar i en viss riktning, kan intensitet fluktuationer observeras. Dessa variationer visar nu den partikel rörelse orsakad av Brownsk rörelse. En autokorrelation funktion (ACF) beräknas från de uppmätta intensiteten fluktuationerna. En analys av ACF ger ett mått för velocity distribution (mer exakt den diffusionskoefficienten) av partiklar och med hjälp av Stokes-Einstein ekvation, omvandlas till en partikel radie distribution17. Ytterligare information om DLS funktioner och arbetssätt kan hittas i olika publikationer och böcker18,19.

Här vi tillämpar och beskriva en unik automatiserade kristallisering enhet, XtalController900, en uppgraderad version av XtalController teknik6, just utvecklats för att övervaka interaktiva protein kristallisering experiment. Denna teknik visar en hög potential för identifiering och spårning av kärnbildning händelser i realtid, vilket gör att en exakt manövrering genom kristallisering arrangera gradvisdiagrammet. Syftet med proceduren särskilt kristallisering är att optimera protein kristallisering för att få hög kvalitet protein mikro- och nanokristaller som är lämpliga för applikationer med hjälp av mikro-fokuserad synkrotron röntgenkällor, diffraktion, eller SFX.

Protocol

Obs: I hela hela protokollet, mikro-dos systemet används för tillsats av vatten kommer att betecknas som Pump0 medan de mikro-dosering-system som används för tillägg av fällningsmedel kommer att kallas Pump1. Resultatet av detta experiment kommer att diskuteras ytterligare och kallas THM2_micro-kristaller.

1. parametrar och lösning Setup

  1. Filtrera 16 mL Na-tartratlösning (1,2 M) och 16 mL destillerat vatten med ett 0,2 µm steril spruta filter.
    Obs: Na-tartrat lösningen representerar fällningsmedel för kristallisering experimentet.
  2. Fyll fällningsmedel och vattenflaskor med 5 mL av de filtrerade lösningarna.
    Obs: Flaskorna har en maximal kapacitet på 5 mL.
  3. Montera flaskorna i pumpen innehavare av experimentell kammare.
  4. Ställa in experimentella parametrar i fönstret programvara till följande värden: temperatur på 20 ° C, relativ luftfuktighet på 20, och vätska som vatten.
    Obs: Figur 2 visar displayfönstret där användaren kan infoga rätt värden för varje parameter som temperatur, relativ luftfuktighet och lösningsmedel. Fönstret programvara visar också vissa ytterligare parametrar såsom tillsatser. Detta är bara viktigt för experiment där det finns tillsatser i fällningsmedel lösningen.
  5. Öppna den främre luckan på experimentella avdelningen och ta bort täckglaset transportören.
  6. Placera ett rent och silikoniserad täckglas på hållaren och placera den tillbaka i enheten.
    Obs: Täckglaset har en storlek på 2,2 cm.
  7. Stäng den experimentella kammaren för att säkra miljöförhållandena från steg 1.4.
    Obs: Protokollet kan pausas här.

2. micro-dosering system justering

  1. Växla ON Pump0 med viktigaste pump egenskaper i figur 3 och skapa en vattenstråle.
    Obs: Vatten ström banan skapas baserat på några pump-kännetecken som kan justeras. Figur 3 visar huvudpumpen egenskaper och de optimala värdena som ska användas för detta experiment.
  2. Justera vattenströmmen siktar ställning mot mitten av täckglaset av manuellt löpande dess utsedda justerskruv. Byta ut Pump0.
  3. Växla ON Pump1 och skapa en flytande ström som tidigare gjort i steg 2.1. Justera den ström positionen Pump1 mot den ståndpunkt som fastställts för Pump0. Byta ut Pump1.
  4. Ersätta det begagnade täckglaset med en ny och ren en för kristallisering experimentet.
    Obs: Mjuk våtservetter brukar rekommenderas för rengöring av det nya täckglaset från kvarvarande damm, före används i kristallisering experimentet.

3. ställa in en taumatin droppe i experimentell kammare

  1. Skapa en ny experimentell fil med programpaketet. Ange följande information i filen experimental: protein (taumatin från Thaumatococcus daniellii), proteinkoncentration (14 mg/mL), fällningsmedel (Na-tartrat) och fällningsmedel koncentration (1,2 M).
    Obs: Denna information kommer att fungera för automatiserade beräkningar av fällningsmedel och protein koncentration under kristallisering experimentet.
  2. Läsa in nya experiment-filen för att aktivera all information från steg 3.1.
  3. Markera positionen för protein droplet-programmet genom att lägga till en liten vattendroppe med hjälp av Pump0.
    Obs: Syftet är att skapa en liten vattendroppe som ska fungera som ett landmärke som protein provet kommer att placeras.
  4. Tryck på knappen Tare att ställa den vikt som ges av microbalance till noll.
    Anmärkning: Detta tar bort vikten av täckglaset och den extra vikten som lagts till av den små vatten landmärke skapade i steg 3.3.
  5. Öppna locket på experimentella avdelningen och Pipettera 8 µL taumatin lösning på vatten landmärket.
  6. Registrera den nya taumatin nedrullningsbara enligt nästa kommandon.
    1. Tryck på knappen New släppa att tillskriva de ursprungliga villkoren från den experimentella fil.
    2. Tryck på knappen Const att kompensera naturliga avdunstningen av vatten från droplet-programmet.
  7. Kontrollera med CCD kameran om Pump0 syftar i protein drop. Justera positionen för Pump0 om vattenströmmen siktar utanför droppe.
    Obs: Från och med nu och framåt, protein droplet-programmet kvar på en konstant vikt genom automatiserade vatten tillägg som kompenserar för naturliga vattenavdunstning från protein droplet-programmet. Vikten av protein droplet-programmet, liksom andra parametrar såsom temperatur och relativ fuktighet kan övervakas i realtid med hjälp av displayfönstret. Experimentet kan pausas här.

4. in Situ DLS mätningar

  1. Slå DLS laser och placera laserstrålen i protein drop av manuellt med hjälp av justerskruvar.
  2. Ange följande DLS parametrar: mätning varaktighet (60 s), väntetiden mellan två mätningar (10 s), och antal mätningar (300).
    Obs: De första 30 mätningarna kommer att fungera som referensmätningar för protein stabilitet-check. Resten av mätningarna kommer att fungera som en fullständig utredning av protein droplet-programmet under den totala längden av kristallisation.
  3. Tryck på knappen Starta att inleda DLS mätningarna. Kontrollera kvaliteten på provet genom att välja en av de grafiska framställningarna DLS.
    Obs: Provet ska visa en hög grad av mono-systemdispertionen, utan någon aggregat i lösningen. DLS resultaten kan visas och läsas som: radie distribution, RADIUS-histogram, radie tomt, mätningar sammanfattning, eller som en översikt över de greve intensiteten.

5. prov avdunstning steg

  1. Ange villkoren för avdunstning steg schema tabellen med de data som visas i tabell 1.
    Obs: Tecknet ”-” infördes i kolumnen ”molariteten/procent” på den andra raden representerar en förlust av vatten från protein droplet-programmet, medan värdet ”25” betyder att droplet volymen kommer att lida en minskning med 25%. Det betyder att protein koncentrationen av droplet-programmet kommer att öka med 25%.
  2. Aktivera det prov avdunstning steget genom att trycka på knappen Autom. Tryck på knappen Stop när provet avdunstning steget har slutförts.
  3. Aktivera knappen Const att hålla droppa konstant efter avslutad provavdunstning.

6. fällningsmedel tillägg steg

  1. Ange villkoren för fällningsmedel tillägg steg i schema tabellen visas i figur 4 med hjälp av data som anges i tabell 2.
    Notera: Den första raden i tabellen representerar en kalibreringssteg, under vilken beräknar programvaran naturliga avdunstningen av protein droplet-programmet baserat på mängden fällningsmedel som måste läggas till protein droplet-programmet. Programvaran extrapolerar detta värde och justerar automatiskt skytte frekvensen för Pump0 för att automatiskt kompensera vattenavdunstning för fällningsmedel tillägg nästa steg.
  2. Aktivera steget fällningsmedel tillägg genom att trycka på knappen Autom.
    Obs: Tillägg av fällningsmedel är en automatiserad process, efter input från tabellen schema.

7. spåra utvecklingen av kristallisering droplet-programmet över tid

  1. Kontrollera utseendet på taumatin kristallerna med hjälp av en CCD-kamera.
  2. Kontrollera fördelningen av partiklarnas storlek med DLS grafiska representationer.
  3. Kontrollera utvecklingen av vikt och experimentella parametrar med hjälp av displayfönstret.
    Obs: När Na-tartrat lösningen når en koncentration av 0,74 M i protein drop, droplet-programmet blir rik på taumatin mikro-kristaller som kan ses i figur 7.

8. återvinning av kristallisering Droplet

  1. Coat en ren Terasaki Kantbockade med paraffinolja.
    1. Tillsätt 3 mL paraffinolja till plattan.
    2. Skingra paraffinolja på plattan brunnarna genom att försiktigt flytta plattan i olika vinklar så att oljan täcker alla de 72 brunnarna i plattan.
    3. Ta bort överskottet av paraffinolja genom att hälla ut oljan som flyter på plattan.
  2. Tryck på knappen Stop till slut kristallisering experimentet. Ta försiktigt ut prov transportören som innehåller kristallisering droplet-programmet.
  3. Med hjälp av en pipett, placera en volym 2 µL alikvoter av kristallisering drop i brunnarna av Terasaki plattan.
    Obs: Genom att återvinna kristallisering droplet-programmet i en platta under olja, provet kan regelbundet kontrolleras för stabilitet och crystal tillväxt med hjälp av ett Mikroskop eller andra DLS tekniker som fungerar med standard Terasaki plattor.

Representative Results

De resultat som erhålls genom DLS mätningar under kristallisering experimentet visar en detaljerad utvecklingen av hydrodynamisk partikel radierna resulterar i två huvudsakliga partikel fördelning fraktioner, som utvecklas över tiden. I den första delen av experimentet, var provet långsamt avdunstat, för att uppnå en högre proteinkoncentration. Som visas i figur 5B, var protein nedgången koncentrerad från 14 mg/mL till 19,5 mg/mL. Under denna tid enligt den radie spridningsbild i figur 5A, proteinet visar en monomer beteende i lösning med en konstant partikelstorlek cirka 2,5 nm. Som provet är förångas ytterligare, förblir monomer protein stabil i lösning, utan några tecken på denaturering eller prov aggregering.

Tillägg av fällningsmedel lösning till protein släppa är omedelbart initieras efter provavdunstning och markeras med grå i RADIUS-distribution mönster och balans kurvorna för bättre visualisering (figur 5). Utifrån de beräkningar som härrör från provets vikt, tillskrivs de markerade partikel bråkdel inledandet av kristallkärnbildning, vilket resulterar i en radie storlek på cirka 200-400 nm. Detta fenomen (kallas kärnbildning) initieras med en fällningsmedel koncentration på 0,6 M i protein droplet-programmet, på en tidsperiod av cirka 66 min från inledandet av experiment och cirka 23 min i avseende på inledandet av fällningsmedel tillägg. Som koncentrationen av fällningsmedel ökar visar radie fördelningen en bred fördelning av partiklar i lösning. Eftersom fler kärnor bildar, ursprungliga kristallint enheter växer i storlek, att nå en radie fördelning mellan 800-1 300 nm. Det kan konstateras att i detta skede, crystal atomkärnor fortsätter att växa, och andelen protein blir gradvis sämre som den proteinmolekyler är tas upp av mikrokristaller. Som fällningsmedel koncentrationen i protein rullgardinsmenyn långsamt ökar, är bildandet av mikrokristaller lätt identifieras efter 75 min, när RADIUS-fördelningen fortsätter att utvecklas mellan 500 och 1 500 nm. Utvecklingen av RADIUS-fördelningen bekräftas också av CCD kamerabilder, där protein microcrystals syns vid en fällningsmedel koncentration på 0,7 M i lösning (figur 7). Som fällningsmedel tillägg är klar och kristallisering drop hålls konstant, visar radie fördelningen en dominerande fas mellan 1.000 och 3.000 nm, medan andelen kärnbildning händelser minskar över tid. I detta ögonblick, kristallisering drop är fullt mättad med microcrystals och inga ytterligare kärnbildning händelser finns i lösning.

Med som experimentell indata återkopplingsvärden ges av microbalance, drogs en kristallisering fasdiagram för en omfattande förståelse av taumatin kristallisation. I figur 6visar experimentell fas diagrammet tre oberoende kristallisering experiment, där produktionen av taumatin T. danielli microcrystals är märkt som THM_2 mikro-kristaller (protokoll). Två ytterligare kristallisering experiment märkta THM_1 makro-kristaller och THM_3 makro-kristaller har använts som indata för att få en korrekt kartläggning av arrangera gradvisdiagrammet olika områden (t.ex., löslighet eller instabil region). Eftersom protokollen för dessa experiment följer olika kristallisering vägar, blir identifiering av regionen kärnbildning enklare, och därmed mer exakt. För varje experiment markeras kristallisering sökvägen med siffror för att betona de olika synsätten och antalet kristallisering steg som användes för ett visst resultat, medan de grå pilarna representerar en uppskattning av det slutliga proteinet koncentration när crystal tillväxt uptakes proteinmolekyler från lösning i bildandet av väldefinierade stabil proteinkristaller.

De tre taumatin experiment presenteras i figur 6 visar olika förhållanden när du anger regionen kärnbildning och därmed olika slutliga kristallisering resultat eftersom det kan ses från bilderna nedan arrangera gradvisdiagrammet. När det gäller THM1 och THM3, protein lösningen passerar fasen kärnbildning och in metastabilt regionen, där den vilar tills kristaller form. Följaktligen, experimenten leda till stora, väl definierade formade kristaller omgivna av mor sprit. Dock för experimentet presenteras i avsnittet protokoll THM2_micro-kristaller, följer kristallisering vägen en särskild strategi. I ett tidigare avsnitt nämnde vi att för ett urval ge microcrystals, protein lösningen har placeras djupt i den kärnbildning fasen, så att händelserna kärnbildning kan bilda med en högsta hastighet. När det gäller THM2_micro-kristaller, förhållandet mellan protein fällningsmedel koncentrationen justerades på ett sådant sätt att provet inte bara träder kärnbildning regionen, men som en fällningsmedel läggs ytterligare till protein lösning och villkoren inte flyttar till en annan region i arrangera gradvisdiagrammet, men förbli i ett mycket övermättad inom regionen kärnbildning. Som ett resultat, minskar entropi lösningen drastiskt som protein droplet-programmet blir omedelbart mättad med små kristallina enheter.

Figure 1
Figur 1. Schematisk framställning av kristallisering experimentet. Ritningen visar en översikt av kristallisering experimentell kammare med alla de tekniska delarna som krävs för att genomföra automatiserade kristallisering experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: fönstret för DLS och urval parametrar som är relevanta för en kristallisering experiment. Parametrar inkluderar temperatur, relativ luftfuktighet, viskositet, etc.

Figure 3
Figur 3: programvara kontrollfönstret för mikro-dosering system involverad i kristallisering experimentet. Funktioner tillåter justering av specifika parametrar för generering av droppar eller lösning ström.

Figure 4
Figur 4: fönstret för tabellen schema som beskriver stegen kristallisering involverad i experimentet. De ursprungliga villkoren för kristallisering droplet-programmet är också integrerade fönster.

Figure 5
Figur 5. Översikt över taumatin T. daniellii microcrystals produktion. (A) radie fördelning av partikelstorleken i protein rullgardinsmenyn under hela kristallisation. (B) övervakade översikt över experimentella parametrar. Tomterna representerar utvecklingen över tid för vikten av protein droplet-programmet (svarta kurvan) tillsammans med de beräknade proteinkoncentration (röd kurva) och fällningsmedel koncentration (blå kurva). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Experimental kristallisering fasdiagram för taumatin T. danielli tillsammans med resulterande utfallen. Alla tomter är härledda från experimentella data, baserat på den Feedbackinformation som ges av microbalance. Siffrorna tillskrivs varje experiment som är synliga inom parentes representerar ordern och antalet steg som tas under en kristallisering protokoll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: inspelade fotografi för THM2_Micro-kristaller (protokoll) visar ett rikligt antal microcrystals mättad lösning. Bilden togs på 4 h (240 min) efter protein droplet-programmet i den experimentella avdelningen för kristallisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: inspelade fotografi för THM_1 makro-kristaller visar några stora taumatin kristaller stabil i lösning. Bilden togs 20 h efter protein droplet-programmet i den experimentella avdelningen för kristallisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: inspelade fotografi för THM_3 makro-kristaller visar olika storlekar av taumatin kristaller i lösningen. Bilden togs 20 h efter protein droplet-programmet i den experimentella avdelningen för kristallisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Ämne Molariteten/procent Tid (s)
vatten 0 100
vatten -25 2100
vatten 0 2100

Tabell 1: Automatisk schema ingång för provavdunstning steg i produktionen av taumatin microcrystals.

Ämne Molariteten/procent Tid (s)
vatten 0 100
prec 0,8 1800
vatten 0 18000

Tabell 2: automatiserad schema ingång för fällningsmedel tillägg steg i produktionen av taumatin microcrystals.

Discussion

Kristallisering enheten är utformad för att övervaka och manipulera avgörande parametrar under en kristallisering experiment baserat på en modifierad vapor-diffusion metod. Denna teknik tillåter övervakning och scoring ett protein kristallisering experiment på alla stadier, så att du har exakt kunskap och kontroll av protein lösningen under kristallisering arrangera gradvisdiagrammet, baserat på i situ DLS analys av provet upphängning.

Kristallisering enheten består av en experimentell kammare (figur 1) ansluten till en CCD-kamera som möjliggör realtidsövervakning av kristallisering droplet-programmet. Kameran är anpassad till Mikroskop utrustat med olika förstoring linser, som ger en maximal rumslig upplösning på cirka 2,5 µm. Kärnan i den experimentella avdelningen är en ultrasensitive microbalance för att spåra utvecklingen av provets vikt över tid. Förfarandet för kristallisering motsvarar ett sammanträde-drop vapor-diffusion experiment, där protein drop är placerad på en silikoniserad täckglas, som placeras på microbalance. Baserat på kroppsvikt och förändringar av droplet-programmet, som orsakas av fällningsmedel tillägg, vatten/additiva tillägg eller provavdunstning, ger microbalance en exakt ingång till en algoritm för omedelbar beräkning av protein och fällningsmedel koncentration över tid . Dessutom viktigt kristallisering parametrar såsom temperatur och relativ fuktighet exakt övervakas och kontrolleras.

För att utföra en kristallisering experiment, är enheten utrustad med två micro-dosering system (kontakta gratis piezoelektriska pumpar) som fungerar på en picoliter skala för fällningsmedel och vatten tillägg. Genom att arbeta med sådana små mängder av ämnet, minimeras de koncentration Övertoningarna och konvektion fenomenet inom protein droplet-programmet. Den huvudsakliga rollen av piezoelektriska pumpar är tillägget av fällningsmedel eller vatten, de senare till exempel används som ersättning för naturlig förångning av protein droplet-programmet. Micro-dosering systemen har en uppsättning funktioner som kan diktera tillägg av ett ämne. Sådana funktioner omfattar: andelen upprepning för att lägga till ett ämne, antalet droppar tillsatts per sekund, bredd och höjd av ämnet stream bana osv. Dessutom kan placera av pumparna justeras manuellt, så att du har en exakt position för tillägg av ämnen till protein droplet-programmet.

Unika feedback kontrollerade manipulering av kristallisering drop uppnås genom i situ DLS data, som kan visa möjliga ändringar i tillståndet protein Oligomera under hela experimentella förfarandet. Tekniken tillåter konstant utvärdering av partikelstorleksfördelning över tid, vilket visar okänt protein-relaterade mekanismer. DLS optik utrustningen placeras strategiskt under täckglas området, vilket gör att detektorn och laser strålen att passera genom täckglaset och vidare genom protein droplet-programmet i en i situ mode; därför registreras endast ändringar inom droplet-programmet från DLS sökvägen. För att möjliggöra enkel hantering, enheten har två öppningar: en dörr för en optimal placering av täckglaset och ett topplock som kan tas bort, så att användaren kan justera skjutställning av mikro-dosering system samt inställning med noggrannhet en ny protein dro plet på täckglaset.

Den interaktiva kristallisering metoden använder ovannämnda enheten är en tillförlitlig teknik för storlek-kontrollerade produktionen av proteinkristaller. Även om det finns för närvarande många kristallisering metoder, insiderinformation om kristallisation är mekanism själv inte enkelt kan uppnås. I allmänhet, tillåter konventionella kristallisering metoder endast begränsad kontroll av en lösning i kristallisering arrangera gradvisdiagrammet, med endast några möjligheter att ändra sin kurs när ett experiment har startat. Medan du utför en kristallisering experimentera och tillämpa sådan en automatiserad kristallisering teknik tillsammans med i situ DLS, en stor del kunskap erhålls om övergångar i arrangera gradvisdiagrammet. I allmänhet är de regionerna som resulterar i amorf fällning och induktion av homogen kärnbildning nära varandra i arrangera gradvisdiagrammet. Därför, genom att manipulera loppet av en kristallisering droplet baserat på realtidsinformation om dess fördelning, är det möjligt att undvika utfällning av ett protein genom att gradvis justera kristallisering villkoren mot kärnbildning och Crystal bildandet.

Numera omfattar många kristallisering villkor fällningsmedel lösningar där polyetylenglykol (PEG) derivat förekommer allmänt. Sådana föreningar har oftast en hög viskositet som kan ha svårigheter för pipettering eller dispensering. I förevarande fall studien gäller de mikro-dosering-system som används för fällningsmedel munstycket mycket tunna kapillärer som gör tillägg av pikoliter steg om möjligt. Följaktligen finns det vissa begränsningar i arbetar med högviskösa ämnen. Inom en rad tidigare experiment, systemet har gett positiva resultat med följande PEG derivat: PEG200 50%, PEG3000 20%, PEG6000 10%, PEG800010%. Även om hittills endast de ovannämnda lösningarna testades, innehåller mikro-dosering systemen en speciell värme mekanism som kan användas för att minska viskositeten hos en lösning. En annan faktor är saltlösningar som måste beaktas när den används som protein fällningsmedel. När du arbetar med högkoncentrerad salter, kan en liten mängd kristallisera på munstycket på mikro-dos systemet, orsakar ytliga blockering av mikro-dosering pumpen under fällningsmedel tillägg; även när en mycket hög relativ fuktighet är närvarande i experimentell kammaren. För att lösa problemet, måste experimentet parkeras så att saltet från munstycket kan tas bort. Detta kan kräva särskild hantering och kan ge fel i fasen fällningsmedel tillägg.

Baserat på den värdefulla information som kan uppnås när du utför sådana automatiserade kristallisering experiment, kan denna teknik också förlängas till studier som undersöker de fysikaliska aspekterna av protein kristallisering. Den kärnbildning och den crystal tillväxten reaktion är kinetic fenomen som kan härledas och beräknas utifrån den tidsberoende information avbildad från ett experiment som temperatur, tillväxten av partikelstorlek och protein och fällningsmedel koncentrationen.

Disclosures

Härmed försäkrar vi att författarna Arne Meyer, Karsten Dierks och Christian Betzel är aktieägare i bolaget Xtal-begrepp GmbH, producent av XtalController900 teknik.

Acknowledgments

Författarna erkänner finansiering från EU: s Horizon 2020 forsknings- och innovationsprogrammet under Marie Sklodowska-Curie Acronym ”X-Probe” Grant avtal nr 637295 och support via BMBF grant 05K16GUA, och den ”The Hamburg centrum för ultrasnabb Imaging – struktur, dynamik och kontroll av ärendet på den atomära skalan ”excellence kluster av Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii Sigma-Aldrich 1002365940 Protein for protocol
Bis-Tris 14880 Sigma-Aldrich 2302377 Buffer for protein solution
di-Sodium tartrate dihydrate AppliChem A0451,0500 Precipitant for protein solution
Silliconized coverslips Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1051203 Coverslips for crystallization
Syringe filter Starstedt 831826001 Filter pore 0.2 µm
Syringe Omnifix 4617207V Luer Lock Solo 20 mL
Paraffin oil Sigma-Aldrich 2323842 Oil for coating the plate
Standard Terakasi plate Sigma-Aldrich M5812270EA Plate for recovering the crystallization droplet
Soft wipes KIMTECH Science
XtalController900 Xtal-Concepts GmbH XTC900 Crystallization device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xtal Concepts GmbH, Germany . Patent "Vorrichtung und Verfahren zur Kontrolle der Kristallisation". EP 2 588 649 (11754824.8) and US 9,284,659 B2 (2010).
  2. Chapman, H. M., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470, (7332), 73-77 (2011).
  3. Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcuselongatus as a model system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 369, (1647), 20130316 (2014).
  4. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2, (2052-2525), 246-255 (2015).
  5. Stevenson, H. P., et al. Use of transmission electron microscopy to identify nanocrystals of challenging protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, (23), 8470-8475 (2014).
  6. Meyer, A., et al. Single-drop optimization of protein crystallization. Acta. Crystallogr. Sect. F. Biol. Cryst. Commun. 68, (Pt 8), 994-998 (2012).
  7. Ferré-D'Amaré, A. R. Crystallization of Biological Macromolecules. 5, (7), Cold Spring Harbor Laboratory Press. 847-848 (1999).
  8. Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34, (3), 266-272 (2004).
  9. Sauter, C., Lorber, B., Kern, D., Cavarelli, J., Moras, D., Giege, R. Crystallogenesis studies on yeast aspartyl-tRNAsynthetase: use of phase diagram to improve crystal quality. Acta. Cystallogr. D. Biol. Crystallogr. 55, (Pt 1), 149-156 (1999).
  10. Ewing, F., Forsythe, E., Pusey, M. Orthorhombic lysozyme solubility. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50, (Pt 4), 424-428 (1994).
  11. Saridakis, E. E. G., Steward, P. D. S., Lloyd, L. F., Blow, D. M. Phase diagram and dilution experiments in the crystallization of carboxypeptidase G2. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50, (Pt 3), 293-297 (1994).
  12. McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta. Crystallogr. F. Struct. Biol. Commun. 70, (Pt 11), 1445-1467 (2014).
  13. Sleutel, M., Van Driessche, A. E. S. Role of clusters in nanoclassical nucleation and growth of protein crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111, (5), 546-553 (2014).
  14. Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-time observation of protein dense liquid cluster evolution during nucleation in protein crystallization. Cryst. Growth Des. 17, (3), 954-958 (2017).
  15. Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2, (11), 2346-2357 (2010).
  16. Vekilov, P. G. Dense liquid precursor for the nucleation of ordered solid phases from solution. Crystal Growth & Design. 4, (4), 671-685 (2004).
  17. Dierks, K., Meyer, A., Einspahr, H., Betzel, C. Dynamic light scattering in protein crystallization droplets: adaptations for analysis and optimization of crystallization processes. Cryst. Growth Des. 8, (5), 1628-1634 (2008).
  18. Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J. Appl. Cryst. 48, 1476-1484 (2015).
  19. Brown, W. Dynamic light scattering: the method and some applications. Clarendon Press: Oxford. ISBN-13: 978-0198539421 978 (1993).
Växande proteinkristaller med olika dimensioner med automatiserad kristallisering tillsammans med <em>In Situ</em> det dynamiska ljusspridning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baitan, D., Schubert, R., Meyer, A., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering. J. Vis. Exp. (138), e57070, doi:10.3791/57070 (2018).More

Baitan, D., Schubert, R., Meyer, A., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering. J. Vis. Exp. (138), e57070, doi:10.3791/57070 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter