大規模なネイティブ蛋白質: 蛋白質および蛋白質の蛋白質組成を分析するためのプロトコルの紹介: ナタネから核酸複合体 (ナタネ)ブルーを組み合わせて 3 D ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) アプローチを使用して篩部の滲出液ネイティブ (BN) 質量分析による同定が続く変化の 2 つのページを持つ。
高等植物の篩管液をサンプリング、しばしば骨の折れると植物種に大きく依存。ただし、別の植物種の変性条件下のプロテオーム研究を達成できます。ネイティブ蛋白質: 蛋白質および蛋白質: 師部のサンプルから核酸複合体、まだやっとのことで分析されているこの特殊な区画の維持または長距離シグナル伝達で重要な役割を果たしている可能性が。大きな分子は、青ネイティブ ゲル電気泳動法 (BN] ページ) を使用して分離できます。その後ナトリウム ドデシル硫酸ページ (SDS-PAGE) による、タンパク質成分を分離できます。ただし、同じような分子量が付いている蛋白質共同移行、質量分析法によるタンパク質の同定を妨げることができるか。BN-PAGE-を組み合わせて 2 つ異なる変性ゲル電気泳動手順、すなわちトリス トリシン尿素と SDS ページの親水性/疎水性に従ってタンパク質を追加分離できます、解像度と成功を増やしますタンパク質同定。それも違いだけで、翻訳後修飾タンパク質を区別することができます。さらに、高分子複合体の RNA コンポーネントを識別するには、青いネイティブ北しみが付くことを適用できます。我々 のプロトコルが蛋白質およびネイティブ蛋白質: 蛋白質および師部のサンプルで発生するリボ核タンパク質 (RNP) 複合体の RNA 成分の解明に適していることを示します。青を組み合わせること 2 つの異なる変化ページ手順でネイティブ ページは異なった種類の大きい蛋白質の複合体を分離することができ、質量分析法による部品の高められた識別率ができます。さらに、プロトコルは同時に 1 つの蛋白質の複合体の内で潜在的にバインドされている核酸を検出する十分な堅牢です。
師部の長距離導管高等植物の有機性栄養素の配分に欠かせないが成長と発展、病原体の防御と悪影響への適応の重要な多くの異なるプロセスに関与するも環境条件。イオン、植物ホルモン、または自分自身の代謝物のような小さなエフェクタは、ほかのタンパク質と Rna のような高分子最近潜在的な信号として浮上しています。
研究は、蛋白質の師部読み込みがサイズ依存と伴細胞 (CC) の接続孔 plasmodesmal 単位のサイズ排除限界 (SEL) で制御したことを示されているふるいの要素 (SE) に 10 の範囲に通常ある、> 67 kDa の1,2,3しかし、にもかかわらずこれらのサイズ制限より大きい蛋白質および蛋白質の複合体は、サイズ排除4のアイデアに挑戦師部システム内発見されている、推奨5 、CC からタンパク質が SE にも非特異的失われて。.
物質として大きなリボ核蛋白質複合体は、生合成・ セル6の構造の整合性の維持に極めて重要な役割を再生します。4、7を師部携帯タンパク質とリボ核蛋白質複合体に存在する証拠があるが、その機能についてはほとんど知られている日付に。篩ふるいの要素: タンパク質と RNP 複合体が関与している長距離輸送および/または信号8,9。その組成変動を受ける環境を勉強して転体の機能の解明や、ストレス条件が必要です。そのためには、ネイティブ複合体を分離する必要があり、そのコンポーネントは、十分な解像度と分離しなければなりません。
師部から高分子量複合体を分離、十分な質と量の sap サンプルを取得するの先決です。師部をサンプリングするために使用できる手法は、興味の植物種に依存します。師管液を取得する 3 つの主な方法存在10: 昆虫 stylectomy11、EDTA 促進溶出12、および自発的な滲出物13。
シロイヌナズナ(a)、研究所、世界中で主要なモデル プラントからの師部のサンプルは、EDTA 促進溶出やアブラムシ stylectomy14,15でのみ取得できます。両方のメソッドは、非常に希釈師部 sap または非常に低いサンプル量に します。EDTA 促進溶出も汚染しやすい、実際師部組成16を表さないことがあります。自発師部滲出物は、植物の部分を切断は簡単に収集した13,17,18をすることができます師部樹液の自然放出につながる、ウリ、ルピナス、ユッカなど植物に限定 19。我々 は最近篩分析のための適切なモデル システムとしてナタネ (ナタネ) を設立、シロイヌナズナの近親と師管液のいくつかマイクロリットルを示されている小切開から取得できますので高純度4,8,20であります。さらに、ナタネのゲノム塩基配列は 2014年21にリリースされました。
アブラムシの stylectomy を除いて説明すべての師部コレクション方法は周囲のサンプリング、現場組織の損傷を含めるし、師管液の組成は、損傷に応答変更可能性があります。したがってサンプリング法に関係なく、師部サンプルの品質をチェックする不可欠です。例えばRNase 活動22,23Rubisco8,24プライマーと PCR または砂糖の分析による決定により収集された師部 sap の品質管理のさまざまな方法があります。組成8。
サイズ排除クロマトグラフィー、ショ糖密度遠心明確な分子量カット膜によるサンプルろ過などを分離し、タンパク質複合体を分離するさまざまな方法を適用できるトレードオフです。ただし、これらのアプローチは高解像度を許さない。最初 Schäggerらによって記述された青ネイティブ ページ (BN-PAGE) と呼ばれる手法。25日は解像度の面で優れています。それは正常に様々 な細胞小器官や細胞可溶化物の相対的な存在量26,27から大規模なネイティブ タンパク質の分子量を決定するため使用されました。
さらにタンパク質の複雑な組成の解明、複雑な部品の完全な分解につながる条件の変化の下で個々 のコンポーネントを分離する必要は。これは SDS ページ28,29またはより高い解像度を実現、等電集中 (IEF) の 2 番目の次元で続いて SDS ページ30の third dimension との識別をその後に 2 番目の次元によって達成することができます。質量分析法を用いたタンパク質。
このプロトコルでは、ナタネ植物から純粋な師部樹液の採取・ BN-PAGE-トリス-トリシン-尿素-ページおよび SDS のページを組み合わせて 3 D 電気泳動のアプローチを使用してこのような師部サンプルからタンパク質複合体の分析について説明します。複雑なコンポーネントは、質量分析法による識別されますその後分離されたタンパク質。さらに、紹介するブルー ネイティブ北しみが付くこと大きい RNP 複合体4Rna の検出を許可する方法としてアプローチの適用性を拡張します。
師部は高利のコンパートメント、深水の主要交通ルートを構成する、別の植物の部品9,20,34、間長距離シグナル伝達に必須でも 35。小さな分子に加えてタンパク質と Rna のような高分子は師部メンテナンスとシグナリング4,7,8関与しています。師部組成の分析は、ほとんど植物の師部サンプルに限られたアクセシビリティによって制限されます。昆虫スタイレット手法は広く適用が実験的に厳しいと師部サンプル11の非常に少量の結果します。師部をサンプリングするために使用される 1 つの簡単なテクニックは、EDTA 促進溶出12です。EDTA はカルシウムのような二価イオンをキレートおよび P 蛋白質およびカロースによる篩板の閉鎖を防止すること。それは使いやすいが、損傷した細胞による汚染しやすい、サンプルを希釈します。EDTA による二価イオンの破壊も、既存の複合体の破壊に 。ただし、それはモデル植物シロイヌナズナ15を含む種の広い範囲からのサンプリングができます。師部樹液の自発的な滲出物は、植物種の小さい数でのみ発生します。植物組織10の重大な傷害を伴う侵襲的な方法です。我々 は最近の長距離輸送4,8,20を研究モデル種としてナタネを設立しました。ここで、師管液楽しめます小さな切開から負傷の影響と汚染源を軽減できます。
別のサンプリング技術を使用して、別の植物種から採取された師部のプロテオームを近年7,8,17,36,37,で検討されている38,39。これらのプロテオーム研究蛋白質で抽出、条件の変化の下で沈殿蛋白質: 蛋白質および蛋白質についての結論を許可しないため、: 核酸相互作用が原産の条件の下に存在します。Co-免疫沈降 (CoIP) とオーバーレイの試金示されるカボチャ40、師部樹液の主要なリボ核蛋白質の複雑ながありますが、内のネイティブの条件の下で任意の高分子複合体が存在することを認められなかった、師部システム。
Schäggerらによって導入された、青ネイティブ ページ26日以降高解像度ゲル電気泳動手順との組み合わせでは、大規模なタンパク質複合体の個々 のコンポーネントの分離を有効にします。ネイティブナタネの 3 D ページ解析を使用して, 篩部の滲出液が最近ことを示すいくつかの高分子量蛋白質: 蛋白質と RNP 複合体師部サンプルに存在が酵素によって実行中4。サイズ排除クロマトグラフィーのような蛋白質の複合体として結合を分離する方法は存在するが、BN ページと比較した場合は解像度の面で失敗する可能性があります。さらに、複雑な分離の合理的な品質、サイズ排除列行列は調査されている全体的な複雑な分子量に応じて対応しなければなりません。異なるサイズの複合体を分析、したがって集中的なコストは、BN ページとして高い焦点を力として可能にしない列の種類を要求します。
ナタネから複合体を分析するための重要なステップは、師管液の開始材料として使用を含めます。師部サンプルの少なくとも 600 μ L 必要し、5 つ植えた植物から得られます。3 D ページおよび BN 北しみが付くことの師部サンプルの十分な量の初期の BN ゲルを開始する必要が。これを達成するには、師部サンプル集中している蛋白質の 20 に 30 μ g は、よく、少なくともそれぞれに読み込まれることができますまで並列で実行される同じサンプルのトリプリケートします。低すぎるか高すぎる濃度を減らす複合体 (図 3) の検出。師部のサンプルは、氷の上の反応管に収集する必要があります、タンパク質分解と売り上げ高を避けるために後で使用できるフリーズされて保存されるべきであります。プロテアーゼ阻害剤は、すべて師部プロテオーム解析で発見されているが、ナタネ4の師部の完全にアクティブなプロテアソームがまた記述されていた。さらに、ボリュームと師部サンプル組成依存サンプリング時点で環境条件10。したがって同じような条件の下で一日の同じ時間で収集するためには注意が必要があります。ストレス治療 (干ばつなど) は収集できる師部の量を減らすことができます。質量分析法による単一蛋白質を識別するために、すべての時間の手袋を装着して可能なケラチン汚染を制限する必須です。ケラチンは質量スペック解析時に追加の信号につながるし、タンパク質の同定を妨げません。高電圧や周囲温度で BN ページで実行すると、壊れやすい複合体の分解が生じるゲルの加熱につながります。
ここで提示されたプロトコルは蛋白質: 蛋白質複合体の解析に適しています。また、使用と並列の複合体に含まれている特定の Rna を検出できますが.これを達成するには、最近 BN 北部4しみが付くことのためのプロトコルを導入しました。Rna は、RNAse 汚染による劣化になりやすいです。このような劣化を抑える DEPC 処理水使用してください。
本手法の主な制限は、移行動作サイズ、形状とも複合体31、翻訳後修飾によって異なりますので BN-PAGE – で区切られたタンパク質の分子量の推定 41。RNP 複合体のサイズ推定は移行挙動に及ぼす核酸が原因も複雑です。それも防止できない同じサイズの複合体は共同 1 つの単一バンドに移行。これは複雑な組成の誤った予測につながることができます。例えば機能アッセイ4、したがって、相補的な手法で観測された相互作用を検証するは必要で 。蛋白質だけ弱いか一過性高分子複合体に関連付けられている使用される BN バッファー失われる可能性があります。これを避けるためには、サンプルが架橋、成果物につながることができますか、タンパク質同定を防ぐことができるまたはバッファー条件を最適化することができます。
古典的な 2 D のページとは対照的組み合わせ尿素-SDS-PAGE の疎水性と等電点 (pI) と分子量28ではなく分子量に従って分離し、蛋白質の分離は制限されません、特定の pI の範囲です。古典に類似した 2 D ページ、分離タンパク質シングル スポットとして表示されますが、対角線上線4,28 (図 5, 図 6)。ライン28下より親水性タンパク質が見つかったに対し、この対角線上のスポットで多くの疎水性タンパク質が表示されます。このプロトコルで使用されるポリアクリルアミド濃度は 25 に 80 kDa のタンパク質をよく分離されます。小さいまたは大きいタンパク質の分離、ポリアクリルアミドを許可するように濃度を変えることができるまたは勾配ゲルを 3 番目のディメンションで使用できます。3 D ページ (図 6) で区切られた複雑な IV (図 3) のコンポーネントは、トリプシン消化、および質量分析法による分析をカットされました。これは、いくつかの tRNA のリガーゼの特定につながった。他の複合体のコンポーネントをされている最近、 4を公開します。当社の 3 D ページには、異なるリガーゼ、すなわちアスパラギン酸、アスパラギン、スレオニン、リジン、グリシンのリガーゼ、同じような分子量 (表 3) との分離が有効になります。メチオニン tRNA 特定プローブを使用して、我々 は複雑な IV 内可能性がありますバインドされた tRNA を検出することができたが、フルレングス tRNA または tRNA 断片が、複雑な場合は使用プローブと差別されることはできません。プロテアーゼ消化師部 sap である核酸は本当にコンプレックス内連結および共同移行ではない場合、チェックするには、サンプルは適切なマイグレーション制御として役立つかもしれない。
それは師部篩管内でタンパク質翻訳することができます行われる師部サンプル4,7で伸長因子と同様、全体のリボソームのほとんどのコンポーネントが検出されましたので以前推測されています。TRNA と tRNA のリガーゼの私達の見つけることはこの考えを支持するようです。しかし、カボチャから篩部のサンプルで現在の tRNA 断片が翻訳42の強力な阻害剤に示されている、機能的なリボゾーム欠席4翻訳が場所を取ることができないことを示唆するように見えます。
一緒に取られて、ここで提示されたプロトコルは、高解像度の個々 のコンポーネントのネイティブ蛋白質: 蛋白質および師部のサンプルと分離からも RNP 複合体の分離と同定をことができます。このメソッドのアプリケーションは新規タンパク質と師部サンプル RNP 複合体の検出を有効し、したがってこの専門性の高い工場区画の新機能を解明することができます。
The authors have nothing to disclose.
彼らの科学的なサポート、ジェニファー フェイントをかけるとウルシュラ Zarzenska に感謝します。この仕事はキャリア統合許可 (CIG、PCIG14-ジョージア州-2013-63 0734) 第 7 フレームワーク プログラム、LFF GK06 ‘DELIGRAH’ (Landesforschungsförderung ハンブルク)、グラントと DFG グラント (DFG KE 856_6-1) 内にある欧州委員会によって財政上支えられるJK に授与。
1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm | BioRad | 1653359 | |
2-Propanol | AppliChem | 131090 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution | BioRad | 1610156 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution | BioRad | 1610158 | |
96 % Ethanol | Carl Roth | P075 | |
Acetic acid | Carl Roth | 6755 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate | AppliChem | 141101 | |
Ammonium peroxodisulfate (APS) | Carl Roth | 9592.3 | |
Bis-Tris | AppliChem | A3992 | |
Boric acid | AppliChem | A2940 | |
Bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
Centrifugal concentrators e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa) | Sartorius | VS0102 | |
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit | Thermo Fisher Scientific | 89880 | |
Chromatography papers e.g. 3 mm CHR | Whatman | 3030-153 | |
CoolBox M30 System | Biocision | BCS-133 | |
Coomassie brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | AppliChem | A0881 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
DNase I | AppliChem | A3778 | |
Ethanol abs. | AppliChem | A3693 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | AppliChem | A1103 | |
Gel Imaging system e.g. Chemidoc Touch | BioRad | 1708370 | |
GeneRuler 1kb plus | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | |
Glycerol | AppliChem | 141339 | |
Glycine | AppliChem | 131340 | |
Heating block TS1 | Biometra | 846-051-500 | |
Hybridization oven e.g. GFL Hybridization Incubator 7601 | GFL | 7601 | |
Hypodermic needle (0.8 mm) | B Braun | 4658309 | |
IPG gel comb, thickness 1 mm | BioRad | 1653367 | |
Labeling of RNA e.g.Biotin 3'end DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | 89818 | |
Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4–16% Bis-Tris protein gel | Invitrogen | BN1002BOX | |
Nylon membrane e.g. Hybond-N+ | Amersham Pharmacia | RPN203B | |
Ortho-phosphoric acid | Carl Roth | 6366.1 | |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
Power supply for Gel electrophoresis EPS | Amersham Pharmacia | 18-1130-01 | available from GE Healthcare |
RNA Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi dry Blot | Biometra | 846-015-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | AppliChem | A1149 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | AppliChem | 142363 | |
Synthesis of cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | AppliChem | A1148 | |
Tricine | AppliChem | A3954 | |
Tris | AppliChem | A1086 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | AppliChem | A3901 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer | Thermo Fisher Scientific | AM8670 | |
Urea | AppliChem | A1360 | |
UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400 | Agilent | NC0477671 | from Fisher Scientific |
Vertical electrophoresis apparatus e.g.The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System | Thermo Fisher Scientific or BioRad | EI0001 or 1658004 | |
Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 |