Aquí presentamos un protocolo para analizar la composición de proteína de proteína: proteína nativa grande y proteínas: complejos de ácido nucleico de colza (B. napus) exudado líber utilizando un enfoque 3D poliacrilamida gel electroforesis (PAGE) combinando azul nativo (BN) con dos páginas desnaturalización seguida de identificación espectrométrica de masa.
Muestreo el floema de las plantas superiores es a menudo laborioso y significativamente dependiente de las especies de plantas. Sin embargo, estudios de proteoma bajo desnaturalizar condiciones pueden lograrse en diferentes especies de plantas. Nativa: proteína y proteína: complejos de ácidos nucleicos de muestras de líber aún apenas se han analizado, aunque podría desempeñar un papel importante en el mantenimiento de este compartimiento especializado o en la señalización de larga distancia. Grandes ensamblajes moleculares pueden ser aislados mediante una electroforesis nativa azul (BN-PAGE). Sus componentes de proteínas se pueden separar por un dodecil sulfato de sodio posterior página (SDS-PAGE). Sin embargo, las proteínas con pesos moleculares similares Co migran, lo que puede dificultar la identificación de proteínas por espectrometría de masas. Combinación de BN-PAGE a dos diferentes desnaturalización gel de electroforesis, es decir, Tris-Tricina-urea y SDS-PAGE, permite la separación adicional de proteínas según su hidrofilicidad/hidrofobicidad y así aumenta la resolución y el éxito de identificación de proteínas. Incluso permite distinguir proteínas que sólo difieren en sus modificaciones postraduccionales. Además, el borrar norteño nativa azul se puede aplicar para identificar los componentes de RNA en complejos macromoleculares. Demostramos que nuestro protocolo es adecuado para desentrañar la proteína y RNA componentes de proteína: proteína nativa y complejos de ribonucleoproteína (RNP) que ocurre en las muestras de líber. Combinar un azul nativo con dos pasos diferentes de página desnaturalización puede ayudar a separar los diferentes tipos de complejos de proteínas grandes y también permite una tasa de aumento de la identificación de sus componentes por espectrometría de masas. Además, el protocolo es lo suficientemente robusto como para detectar simultáneamente potencialmente enlazados ácidos nucleicos dentro de complejos de proteína sola.
Los conductos de larga distancia del floema son esenciales para la asignación de nutrientes orgánicos en las plantas superiores, pero también están involucrados en la regulación de diferentes procesos importantes para el crecimiento y desarrollo, defensa del patógeno y la adaptación a las adversas condiciones ambientales. Además de pequeños generadores como los iones, fitohormonas o metabolitos propios, macromoléculas como las proteínas y RNAs recientemente han surgido como potenciales señales.
Los estudios han demostrado que la carga del floema de las proteínas es tamaño dependiente y controlado por el límite de exclusión de tamaño (SEL) de las unidades poro plasmodesmal conectar células acompañantes (CC) y elementos (SE) que se encuentran típicamente en el rango de 10 a del tamiz > 67 kDa1 , 2 , 3. sin embargo, a pesar de estas proteínas más grandes de la limitaciones de tamaño y de la proteína se han encontrado complejos dentro del sistema de líber desafiando la idea de exclusión de tamaño4, y aún no específica pérdida de proteínas del CC que SE ha sido sugerida5 .
Complejos de multiproteínas como grandes ribonucleoproteína juegan un papel fundamental en la biosíntesis y mantenimiento de la integridad estructural de la célula6. Hay pruebas de que complejos de proteínas y ribonucleoproteína de líber-móvil existen4,7, pero hasta la fecha se conoce poco sobre su función. En elementos de floema tamiz: proteína y RNP complejos se han implicado con transporte interurbano o señalización de8,9. Para desentrañar las funciones de los complejos translocados, estudiando su composición bajo variables ambiental o condiciones de estrés es necesarias. Para lograr esto, nativos complejos tienen que ser aislados y sus componentes deberán estar separadas con suficiente resolución.
Para aislar los complejos de alto peso molecular desde el floema, es necesario obtener muestras de sap en suficiente calidad y cantidad. La técnica que puede utilizarse para el muestreo de floema depende de las especies vegetales de interés. Tres métodos principales para obtener la savia del floema existen 10: insectos stylectomy11, exudación de EDTA facilita12y exudación espontánea13.
Muestras de líber de thaliana de Arabidopsis (dea. thaliana), la planta modelo importantes en laboratorios de todo el mundo, sólo pueden obtenerse un facilitado de EDTA exudación o pulgón stylectomy14,15. Ambos métodos conducen a la savia del floema altamente diluido o cantidades de muestra muy bajo. Exudación de EDTA facilita también es propensa a la contaminación y no pudo representar el floema real composición16. Exudación espontánea líber se limita a plantar especies como cucurbitáceas, lupino o yuca, donde cortar partes de la planta lleva a una emisión espontánea de savia del floema que puede ser fácilmente recogidos13,17,18, 19. Recientemente establecimos colza (Brassica napus) como un sistema de modelo adecuado para el análisis del floema, ya que es un pariente cercano de a. thaliana y varios microlitros de savia del floema pueden obtenerse en pequeñas incisiones que se ha demostrado que ser de alta pureza4,8,20. Además, la secuencia del genoma B. napus fue lanzada en 201421.
Excepto pulgón stylectomy, todos los métodos de colección de líber descritos incluyen daño del tejido en el sitio de muestreo, y la composición de la savia del floema puede cambiar en respuesta a la lesión. Por lo tanto, es esencial para comprobar la calidad de las muestras de líber, independientemente del método de muestreo aplicado. Existen diferentes métodos para el control de calidad de sap líber recogidos, por ejemplo, por determinación de la actividad22,23Rnasa, RT-PCR con cebadores contra Rubisco8,24o el análisis del azúcar composición8.
Pueden aplicarse diferentes métodos para aislar y separar los complejos, incluyendo la cromatografía por exclusión de tamaño, ultracentrifugación de densidad de sacarosa o filtración de la muestra a través de membranas con distinto peso molecular cortado offs. Sin embargo, estos enfoques no permiten alta resolución. La técnica denominada página nativa azul (BN-PAGE), primero descrita por Schägger et al. 25, es superior en términos de resolución. Fue utilizado con éxito para determinar los pesos moleculares de complejos de proteína nativa grande de varios organelos o Lisados celulares y su abundancia relativa26,27.
Para aclarar más lejos la composición compleja de complejos de la proteína, es necesario separar los componentes individuales bajo desnaturalizar condiciones, hacia el desmontaje de los componentes del complejo. Esto puede lograrse mediante una segunda dimensión de SDS-PAGE 28,29 o, para lograr una resolución más alta, por una segunda dimensión de la concentración isoeléctrica (IEF) seguida por un third dimension de SDS-PAGE30 y posterior identificación de las proteínas mediante espectrometría de masas.
En este protocolo, se describen el muestreo de savia pura líber de las plantas B. napus y el análisis de los complejos de la proteína de estas muestras de floema usando un acercamiento electroforético 3D combina BN-PAGE con Tris-Tricina-urea-PAGE y SDS-PAGE. Los componentes complejos de proteínas separadas se identifican posteriormente mediante espectrometría de masas. Además, presentamos el borrar norteño nativa azul como método permitiendo la detección de ARN grande de complejos RNP4, extender la aplicabilidad del enfoque.
El floema es un compartimento de gran interés, ya que constituye la ruta de transporte más importantes de fotoasimilados y es también esencial para señalización de larga distancia entre plantas diferentes partes9,20,34, 35. Además de moléculas pequeñas, macromoléculas como las proteínas y RNAs se han implicado con líber mantenimiento y señalización de4,7,8. El análisis de composición de líber está restringido por la limitada accesibilidad a muestras de floema en la mayoría de especies vegetales. La técnica del estilete insectos es ampliamente aplicable, pero experimentalmente exigente y los resultados en cantidades muy pequeñas de líber muestras11. Una técnica fácil, utilizada para el muestreo de líber es facilitado por EDTA exudación12. EDTA quelatos de iones divalentes como el calcio y así evita el cierre de las placas de tamiz por P-proteínas y Callosa. Es fácil de usar, pero es propenso a la contaminación por células dañadas y se diluyen las muestras. Agotamiento de iones divalentes con EDTA también podría llevar a una ruptura de los complejos existentes. Sin embargo, permite la toma de muestras de una gran variedad de especies incluyendo la planta modelo thaliana a.15. Exudación espontánea de savia del floema ocurre solamente en un pequeño número de especies de plantas. Es un método invasivo que consiste en lesiones importantes de tejidos de planta10. Recientemente establecimos B. napus como una especie de modelo para el estudio de transporte a larga distancia4,8,20. Aquí, savia del floema puede ser muestreado de pequeñas incisiones, que reduce la herida efectos y fuentes de contaminación.
Utilizando técnicas de muestreo diferentes, el proteoma de las muestras de líber de diferentes especies de plantas se ha investigado en los últimos años7,8,17,36,37, 38,39. Para estos estudios del proteoma, proteínas fueron extraídas y precipitadas bajo desnaturalizar condiciones y por lo tanto no permiten conclusiones sobre: proteína y proteína: interacciones de ácidos nucleicos presentan en condiciones nativas. Análisis de superposición y co-inmunoprecipitación (CoIP) indicaron que podría existir un importante complejo de ribonucleoproteína en la savia del floema de calabaza40, pero no se demostró que cualquier complejos macromoleculares existen bajo condiciones nativas dentro de la sistema de líber.
Azul página nativa, introducida por Schägger et al. 26, en combinación con pasos de electroforesis en gel de alta resolución posterior permiten la separación de los componentes de los complejos grandes. Usando análisis de la página de 3D de nativa B. napus exudado de líber, recientemente podríamos demostrar que varias proteínas: proteína de alto peso molecular y los complejos de RNP existen en muestras de líber y son enzimáticamente activa4. Métodos alternativos para aislar los complejos así como RNPs como cromatografía por exclusión de tamaño podrían existir, pero no en términos de resolución en comparación a la página de la BN. Además, una razonable calidad de separación complejo, matrices de columna de exclusión de tamaño debe ser adaptado según los pesos moleculares en general complejos siendo investigados. Análisis complejos de diferente tamaño por lo tanto exigirá diferentes tipos de columnas que es costo intensivo y no permite como enfoque de alta potencia como una página de BN.
Pasos críticos para analizar complejos de B. napus incluyen el total de la savia del floema utilizado como material de partida. Al menos 600 μl de la muestra del floema son necesarios y pueden obtenerse en cinco plantas bien irrigadas. Para 3D-PAGE y BN el borrar norteño es necesario poner el gel BN inicial con una cantidad suficiente de muestras de líber. Para ello, muestras de líber se concentran hasta 20 a 30 μg de proteína se pueden cargar en cada bien y por lo menos triplicado de la misma muestra se ejecuta en paralelo. Concentración demasiado baja o demasiado alta reduce la detección de complejos (figura 3). Líber muestras deben recogerse en tubos de reacción sobre hielo y deben almacenarse congelado para que su uso posterior evitar la rotación y la degradación de las proteínas. Inhibidores de la proteasa se han encontrado en los proteomas de líber analizados, pero también un proteasoma activo fue descrito en el floema de B. napus4. Además, volumen y composición de las muestras de líber dependen del momento de muestreo y condiciones ambientales10. Por lo tanto se debe tener cuidado para recoger al mismo tiempo del día en condiciones similares. Tratamientos de estrés (por ejemplo sequía) pueden reducir la cantidad de floema que se puede recoger. Para identificar las proteínas solo por espectrometría de masas, es obligatorio para limitar la contaminación posible de la queratina por usando guantes todo el tiempo. La queratina conduce a señales adicionales durante masa especificaciones análisis y dificulta la identificación de proteínas. Ejecutando la página BN a un voltaje mayor o a temperatura ambiente puede conducir a la calefacción del gel que pueda resultar en desmontaje de frágiles complejos.
El protocolo presentado aquí es conveniente para el análisis de complejos de proteína: proteína. También mostramos que pueden utilizarse para detectar ARN específica contenida en los complejos en paralelo. Para lograr esto, hemos introducido recientemente un protocolo para BN norte borrar4. RNAs son propensos a la degradación por contaminación de Rnasa. Para limitar esa degradación tratada con DEPC, debe utilizarse agua.
Principales limitaciones del método presentado incluyen la estimación del peso molecular de complejos de proteínas separadas por BN-PAGE, ya que el comportamiento de migración depende en el tamaño, forma e incluso modificaciones del posttranslational de los complejos31, 41. Estimación de tamaño de los complejos de RNP es aún más complicado debido a la influencia de los ácidos nucleicos en el comportamiento de la migración. Se puede también no ser prevenido que complejos del mismo tamaño migran conjuntamente en una sola banda. Esto puede conducir a la predicción errónea de composiciones complejas. Por lo tanto verificar las interacciones observadas con técnicas complementarias, por ejemplo, por análisis funcional4, puede ser necesario. También proteínas sólo débil o transitorio asociadas a un complejo macromolecular podrían ser perdidas en el búfer BN utilizado. Para evitar esto, las muestras pueden ser reticulado, lo que puede conducir también a artefactos o puede evitar la identificación de proteínas, o las condiciones de buffer pueden ser optimizadas.
En contraste con clásico 2D-PAGE, la combinación de urea y SDS-PAGE permite la separación según la hidrofobicidad y del peso molecular en vez de punto isoeléctrico (pI) y peso molecular 28y no limitar la separación de proteínas de un gama específica de pI. Similar al clásico 2D-PAGE, separadas proteínas son visibles como puntos individuales, pero en una diagonal línea 4,28 (figura 5, figura 6). Más proteínas hidrofóbicas aparecen en lugares por encima de esta diagonal, mientras más proteínas hidrofílicas se encuentran por debajo de la línea28. Las concentraciones de poliacrilamida utilizadas en este protocolo también separarán proteínas entre 25 y 80 kDa. Para permitir una separación de las proteínas más pequeñas o más grandes la poliacrilamida se puede variar la concentración o geles de gradiente se pueden utilizar en la tercera dimensión. Los componentes del complejo IV (figura 3) separados por 3D-PAGE (figura 6) fueron cortados, tripsina digiere y analizados por espectrometría de masas. Esto dio lugar a la identificación de varias ligasas de tRNA. Los componentes de los otros complejos han sido publicados recientemente 4. Nuestra página de 3D permitió la separación de ligasas diferentes, es decir, aspartato, Asparagina, treonina, ligasas lisina y glicina, con pesos moleculares similares (tabla 3). Utilizando una sonda de metionina ARNt específico, fueron capaces de detectar tRNA potencialmente consolidados dentro de complejo IV pero si tRNA completos o fragmentos de tRNA en el complejo no pueden ser discriminados con las sondas. Para comprobar si los ácidos nucleicos son realmente consolidados dentro del complejo y no Co migrar, proteasa digirió savia del floema podrían servir de muestras controles migratorios adecuados.
Se ha especulado antes que traducción de la proteína puede ocurrir dentro de tubos de tamiz del floema, ya que la casi mayoría de los componentes del ribosoma entero así como los factores de elongación se han encontrado en muestras de líber4,7. Nuestro hallazgo de tRNA y ligasas tRNA parece apoyar esta idea. Sin embargo, fragmentos de ARNt presentes en muestras de líber de calabaza han demostrado ser potentes inhibidores de la traducción en42 y los ribosomas funcionales parecen ser ausente4, lo que sugiere que la traducción no puede ocurrir.
Tomados en conjunto, el protocolo que presentamos permite la separación de proteínas: proteína nativa y hasta complejos de RNP de líber de muestras y la separación e identificación de sus componentes individuales de alta resolución. La aplicación de este método permite el descubrimiento de nuevas proteínas y complejos de RNP en muestras de floema y por lo tanto puede dilucidar nuevas funciones en este compartimiento de plantas altamente especializadas.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Jennifer Deke y Urszula Zarzenska por su apoyo científico. Este trabajo fue apoyado por una beca de integración de carrera (CIG, 0734 PCIG14-GA-2013-63) la Comisión Europea dentro del 7 º Programa marco, la concesión LFF-GK06 ‘DELIGRAH’ (Landesforschungsförderung Hamburg) y la concesión de la DFG (DFG KE 856_6-1) adjudicado a JK.
1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm | BioRad | 1653359 | |
2-Propanol | AppliChem | 131090 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution | BioRad | 1610156 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution | BioRad | 1610158 | |
96 % Ethanol | Carl Roth | P075 | |
Acetic acid | Carl Roth | 6755 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate | AppliChem | 141101 | |
Ammonium peroxodisulfate (APS) | Carl Roth | 9592.3 | |
Bis-Tris | AppliChem | A3992 | |
Boric acid | AppliChem | A2940 | |
Bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
Centrifugal concentrators e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa) | Sartorius | VS0102 | |
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit | Thermo Fisher Scientific | 89880 | |
Chromatography papers e.g. 3 mm CHR | Whatman | 3030-153 | |
CoolBox M30 System | Biocision | BCS-133 | |
Coomassie brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | AppliChem | A0881 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
DNase I | AppliChem | A3778 | |
Ethanol abs. | AppliChem | A3693 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | AppliChem | A1103 | |
Gel Imaging system e.g. Chemidoc Touch | BioRad | 1708370 | |
GeneRuler 1kb plus | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | |
Glycerol | AppliChem | 141339 | |
Glycine | AppliChem | 131340 | |
Heating block TS1 | Biometra | 846-051-500 | |
Hybridization oven e.g. GFL Hybridization Incubator 7601 | GFL | 7601 | |
Hypodermic needle (0.8 mm) | B Braun | 4658309 | |
IPG gel comb, thickness 1 mm | BioRad | 1653367 | |
Labeling of RNA e.g.Biotin 3'end DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | 89818 | |
Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4–16% Bis-Tris protein gel | Invitrogen | BN1002BOX | |
Nylon membrane e.g. Hybond-N+ | Amersham Pharmacia | RPN203B | |
Ortho-phosphoric acid | Carl Roth | 6366.1 | |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
Power supply for Gel electrophoresis EPS | Amersham Pharmacia | 18-1130-01 | available from GE Healthcare |
RNA Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi dry Blot | Biometra | 846-015-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | AppliChem | A1149 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | AppliChem | 142363 | |
Synthesis of cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | AppliChem | A1148 | |
Tricine | AppliChem | A3954 | |
Tris | AppliChem | A1086 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | AppliChem | A3901 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer | Thermo Fisher Scientific | AM8670 | |
Urea | AppliChem | A1360 | |
UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400 | Agilent | NC0477671 | from Fisher Scientific |
Vertical electrophoresis apparatus e.g.The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System | Thermo Fisher Scientific or BioRad | EI0001 or 1658004 | |
Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 |