Summary
نقدم هنا بروتوكولا لتحليل تكوين البروتين البروتين الأصلي كبير: البروتين والبروتين: مجمعات الحمض النووي من الاغتصاب البذور الزيتية (نابوس باء) لحاء نضحة باستخدام نهج 3D polyacrylamide هلام التفريد (صفحة) يجمع بين الأزرق أصلي (BN) مع صفحتين يشوه متبوعاً بالهوية الجماعية والمطيافيه.
Abstract
أخذ العينات في لحاء النباتات العليا غالباً شاقة وتعتمد إلى حد كبير على الأنواع النباتية. ومع ذلك، يمكن تحقيق دراسات البروتين تحت ظروف يشوه في الأنواع النباتية المختلفة. البروتين: البروتين الأصلي والبروتين: مجمعات الحمض النووي من عينات لحاء قد حتى الآن نادراً ما تم تحليلها، على الرغم من أنها قد تؤدي أدواراً هامة في الحفاظ على هذه المقصورة المتخصصة أو يشير إلى مسافات بعيدة. جمعيات الجزيئية كبيرة يمكن أن تكون معزولة التفريد جل أصلي أزرق (BN-الصفحة) باستخدام. يمكن فصل مكوناتها البروتين بواسطة كبريتات صوديوم لاحقة دوديسيل صفحة (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة). بيد المشترك تهاجر البروتينات مع الأوزان الجزيئية مماثلة، ما يمكن أن تعيق تحديد البروتين من الطيف الكتلي. الجمع بين BN-الصفحة مع اثنين يشوه جل التفريد خطوات مختلفة، أي تريس-تريسيني-اليوريا والحزب الديمقراطي الصربي صفحة، يمكن فصل إضافية من البروتينات وفقا لما هيدروفيليسيتي/هيدروفوبيسيتي ومما يزيد القرار ونجاح لتعريف البروتين. بل أنه يسمح تمييز البروتينات التي تختلف فقط في تلك التعديلات بوستترانسلاشونال. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيقها النشاف الأزرق الشمالي الأصلي لتحديد عناصر الجيش الملكي النيبالي في مجمعات الجزيئات. نظهر أن لدينا بروتوكول مناسبة لكشف البروتين وعناصر الجيش الملكي النيبالي من البروتين: البروتين الأصلي ومجمعات ribonucleoprotein (رنب) التي تحدث في عينات لحاء. الجمع بين زرقاء الصفحة الأصلية مع خطوتين الصفحة يشوه مختلفة يمكن أن تساعد على الفصل بين أنواع مختلفة من المجمعات الكبيرة من البروتين، وأيضا من معدل زيادة تحديد مكوناتها من الطيف الكتلي. وعلاوة على ذلك، البروتوكول متينة بما فيه الكفاية لكشف في الوقت نفسه يحتمل أن تكون منضمة الأحماض النووية داخل مجمعات البروتين وحيد.
Introduction
قنوات مسافات طويلة لحاء ضرورية لتوزيع المواد الغذائية العضوية في النباتات العليا، ولكن تشارك أيضا في تنظيم العديد من العمليات المختلفة هامة للنمو والتنمية والدفاع الممرض والتكيف مع السلبية الظروف البيئية. إلى جانب الصغيرة المستجيبة مثل أيونات أو فيتوهورمونيس أو نواتج الأيض أنفسهم، ظهرت مؤخرا الجزيئات الكبيرة مثل البروتينات والكشف كإشارات محتملة.
وقد أظهرت الدراسات أن تحميل لحاء البروتينات حجم التابعة والخاضعة للرقابة باستثناء الحد الأقصى لحجم (SEL) وحدات المسام بلاسموديسمال ربط الخلايا رفيق (CC) ومنخل العناصر (جنوب شرق) التي عادة في حدود 10-> 67 كاتشين1 , 2 , 3-بيد أن على الرغم من هذه القيود حجم البروتينات أكبر والبروتين تم العثور على مجمعات داخل منظومة لحاء تتحدى فكرة استبعاد حجم4وخسارة غير محدد حتى البروتينات من CC إلى سراج الدين قد اقترح5 .
مجمعات ريبونوكليوبروتين مولتيبروتين، فضلا عن كبيرة تلعب دور محوري في تخليق الحيوي والحفاظ على سلامة هيكل الخلية6. وهناك دليل على وجود مجمعات البروتين-بروتين و ribonucleoprotein لحاء موبايل7من4،، ولكن حتى الآن هو يعرف سوى القليل عن وظيفتها. في عناصر غربال لحاء تورطت البروتين: البروتين ومجمعات رنب مع النقل مسافات طويلة و/أو إشارات8،9. مطلوب لكشف المهام للمجمعات ذوبانها، دراسة تركيبتها تحت اختلاف البيئة أو التشديد على الظروف. ولتحقيق ذلك، مجمعات السكان الأصليين يجب أن تكون معزولة ومكوناتها يجب أن تكون مفصولة بالقرار كافية.
لعزل مجمعات عالية الوزن الجزيئي من لحاء، أنها الأولى اللازمة للحصول على عينات ساب كافية كما وكيفا. هذه التقنية التي يمكن استخدامها لأخذ العينات لحاء يعتمد على الأنواع النباتية للفائدة. توجد ثلاثة أساليب رئيسية للحصول على ساب لحاء 10: ستيليكتومي الحشرات11ويسرت يدتا نتحه12نتحه عفوية13.
يمكن الحصول على عينات لحاء من نبات التمويل (ألف-التمويل)، المصنع النموذجي الرئيسية في المختبرات في جميع أنحاء العالم، فقط بتيسير يدتا نتحه أو المن ستيليكتومي14،15. كلتا الطريقتين تؤدي إلى ساب لحاء مخففة جداً أو كميات منخفضة جداً من العينة. يسر يدتا نتحه هو أيضا عرضه للتلوث، وقد لا تمثل تركيبة لحاء الحقيقي16. نتحه لحاء عفوية يقتصر على زراعة الأنواع مثل والقرعيات وترمس أو يوكا، حيث قطع أجزاء النبات يؤدي إلى انبعاث ساب لحاء التي يمكن جمعها بسهولة13،،من1718عفوية، 19. أنشأنا مؤخرا الاغتصاب البذور الزيتية (كرنب نابوس) كنظام نموذج مناسب لتحليل لحاء، وأنه يمكن الحصول على قريب من ألف-التمويل وميكروليتيرس عدة من لحاء ساب من الشقوق الصغيرة التي قد تبين أن أن درجة نقاء عالية4،،من820. وعلاوة على ذلك، تسلسل الجينوم نابوس (ب) صدر في عام 201421.
باستثناء ستيليكتومي أولاً بأول، تشمل جميع أساليب جمع لحاء وصف الأضرار المحيطة بالانسجة في الموقع لأخذ العينات، وقد تتغير تركيبة ساب لحاء استجابة للإصابة. ولذلك من الضروري للتحقق من جودة عينات لحاء، بغض النظر عن طريقة أخذ العينات المطبقة. وهناك أساليب مختلفة لمراقبة الجودة لجمع لحاء ساب، مثلاً بتحديد نشاط22،23رناسي، الرايت-بكر مع الإشعال ضد روبيسكو8،24أو تحليل السكر تكوين8.
يمكن تطبيق أساليب مختلفة لعزل وفصل مجمعات البروتين، بما في ذلك حجم الاستبعاد اللوني أو تنبيذ فائق الكثافة السكروز أو نموذج الترشيح من خلال الأغشية مع خفض الوزن الجزيئي متميزة العرضية. ومع ذلك، لا تسمح هذه النهج عالية الدقة. تقنية تسمى الصفحة الأصلية الزرقاء (BN-صفحة)، وصف لأول مرة من Schägger وآخرون. 25، أعلى فيما يتعلق بالقرار. أنها استخدمت بنجاح لتحديد الأوزان الجزيئية للمجمعات الكبيرة من البروتين الأصلي من العضيات المختلفة أو من ليساتيس الخلوية وعلى وفرة نسبية26،27.
لتوضيح تكوين مجمع من مجمعات البروتين، من الضروري فصل المكونات الفردية تحت يشوه الشروط، مما يؤدي إلى التفكيك الكامل لمكونات معقدة. ويمكن تحقيق ذلك ببعد ثاني من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 28،29 ، أو لتحقيق دقة أعلى، ببعد ثاني isoelectric التركيز (الضمنية) تليها third dimension من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة30 وتحديد اللاحقة البروتينات باستخدام الطيف الكتلي.
في هذا البروتوكول، يصف لنا لأخذ عينات ساب لحاء نقية من النباتات نابوس (ب) وتحليل البروتين المجمعات من هذه العينات لحاء استخدام نهج الغرواني الكهربي 3D الجمع بين الجبهة الوطنية-الصفحة مع تريس-تريسيني-اليوريا-الصفحة، والحزب الديمقراطي الصربي صفحة. يتم تعريف مكونات معقدة البروتين المنفصلين عن ذويهم في وقت لاحق استخدام الطيف الكتلي. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم الأزرق الأصلي شمال النشاف كأسلوب يسمح الكشف عن الكشف في كبيرة رنب المجمعات4، توسيع نطاق تطبيق النهج.
Protocol
1-أخذ العينات ومحطات إعداد ساب لحاء من نابوس باء- 4،،من820
- لأخذ العينات ساب لحاء، استخدم الرطبة جيدا 8 أسبوع من العمر نابوس ب- النباتات المزهرة فقط الأولى أن إظهار لمنع التلوث حبوب اللقاح.
- استخدام إبرة حقن (Ø 0.8 ملم) والشروريه نورات تنبع عدة مرات. كرر في عدة أخرى ينبع نورات ومصانع أخرى للحصول على ما يكفي ساب لحاء (الشكل 2a).
ملاحظة: لتحليل معقدة، من المستحسن أن تبدأ مع مالا يقل عن 600 ميليلتر من لحاء ساب. سوف تسفر عن 4 إلى 5 محطات بين 200 و 700 ميليلتر من لحاء sap. - تمحو من أول هبوط من المواقع المتضررة مع أوراق الترشيح. أساسا هذه القطرات تحتوي على مواد ملوثة جداً من إصابة الأنسجة المحيطة وتحتاج إلى تجاهل.
- جمع قطرات التالية عن طريق بيبيتينج وتخزين الإفرازات التي تم جمعها في أنبوب رد فعل مل 1.5 مخروطية مبردة مسبقاً في-20 درجة مئوية باستخدام نظام تبريد خاليا من الجليد.
- يواصل جمع حتى يتم تشكيل قطره أخرى لا يمكن ملاحظتها، ولكن ليس أطول من ح 1. ويمكن تكرار هذا الإجراء بعد يومين من دون خسائر كبيرة في جمع لحاء sap.
ملاحظة: يمكن استخدامها على الفور ساب لحاء جمعها أو تخزينها في-80 درجة مئوية للتحليل في المستقبل. لتخزين-80 درجة مئوية، صدمة تجميد الأنبوب رد فعل في نيتروجين سائل. - تركيز العينة لحاء إلى حوالي 1/6ال من وحدة التخزين الأولية باستخدام مركزات الطرد المركزي مع وزن الجزيئي قطع (موكو) من دالتونس 10,000 (دا). الطرد المركزي عينة مركزة على 4 درجة مئوية و 20,000 ز س لمدة 15 دقيقة على الأقل لإزالة جزيئات الغبار.
ملاحظة: لا يؤدي تركيز ساب لحاء إلى خسارة كبيرة من البروتينات. - لتحليل معقدة اللاحقة، المضي في الخطوة 3، 1.
2-لحاء ساب نقاء مراقبة استخدام المنتسخة العكسية بكر (RT-PCR) 4،،من820
- عزل الحمض النووي الريبي مجموع من لحاء sap باستخدام أسلوب استخراج الحمض النووي الريبي للمواد السائلة (مثل استخراج تريزول أو الفينول كلوروفورم متبوعاً بترسيب الايزوبروبانول من المرحلة المائية والايثانول الغسيل الخطوات استناداً إلى البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة).
تنبيه: الفينول كلوروفورم السامة. تعمل تحت غطاء محرك السيارة مع معدات الحماية الشخصية الملائمة. ويمكن تخزين الحمض النووي الريبي المستخرج في الإيثانول في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر. - إزالة التلوث من الحمض النووي من الهضم مع الدناز أنا (1 يو/ميكروغرام) لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية وإلغاء تنشيط الإنزيم بإضافة أدتا إلى تركيز نهائي من 5 مم، واحتضان العينة عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- للحصول على الحمض النووي الريبي نقية وتنقية وتركيز العينة بخطوة تنقية أخرى (مثل استخدام "مجموعات تنظيف الجيش الملكي النيبالي"، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة).
- القيام عكس المنتسخة بكر (RT-PCR) لتوليف كدنا مع مجموعة توليف كدنا استخدام 150 نانوغرام من الحمض النووي الريبي نقية كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة البروتوكول.
ملاحظة: يمكن تخزين كدنا في-20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. - استخدام 5 ميليلتر من كدنا كقالب لفعل PCR قياسية كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة، إلى تضخيم النصوص مقصورة على حدة والتحقق من قبل [اغروس] هلام التفريد. تأكيد نقاء عينات لحاء بمثل استخدام كبسولة تفجير لوحدة فرعية صغيرة روبيسكو، ح ثيوريدوكسين، والبروتين معطف حبوب اللقاح (الشكل 1b، الجدول 1).
3-الأزرق الأصلي الصفحة 4،25،،من2631
- استخدام أما الهلامية المتدرجة أصلي سكب الذاتي كما هو موضح في مكان آخر27 أو التجارية مكررا-تريس الهلامية المتدرجة.
- تحميل 20 إلى 30 ميكروغرام من العينة البروتين تتركز كل بئر على الجل في تريبليكاتيس على الأقل.
- تشغيل الهلام في 4 درجة مئوية و 150 الخامس استخدام كاثود الأزرق الداكن المخزن المؤقت ب والانود المخزن المؤقت (الجدول 2) حتى تمرير العينة 1/3rd جل (ca. 20 إلى 30 دقيقة، الشكل 3 ألف).
ملاحظة: لشمال النشاف، ممر واحد جل كافية، بينما لتحليل تكوين البروتين قبل الصفحة 3D والطيف الكتلي ينصح بالجمع بين الفرقة نفسها من يصل إلى عشرة ممرات جل تركيز البروتينات أقل وفرة. - إيقاف التشغيل وتبادل كاثود الأزرق الداكن المخزن المؤقت ب مع الضوء الأزرق الكاثود المخزن المؤقت B/10 (الجدول 2)، ومواصلة التشغيل. إنهاء جل تشغيلها عند بدء تشغيل الجبهة الأزرق الوت من الهلام (ca. 120 إلى 180 دقيقة، الشكل 3 ألف).
ملاحظة: يمكن تخزين الجل الأصلي الأزرق انتهى في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد على الأقل. مخزن لفترة طويلة يمكن أن يؤدي إلى نزع فتيل العصابات وينبغي تجنبها. يمكن إعادة استخدام المخزن المؤقت الأزرق الداكن ب.
4. اختياري: الكشف عن الحمض النووي الريبي استخدام الأزرق الأصلي شمال النشاف 4
- قطع نطاقات مميزة أو استخدام لين جل كله من الجل الأصلي الأزرق ونقلها على غشاء نايلون بشبه الجاف النشاف في 3.5 mA/سم2 لمدة 60 دقيقة وعلامة الحدود العليا والسفلي جل مع قلم رصاص على الغشاء (الشكل 4 أ).
- بعد النشاف، يغسل الغشاء مع المياه المعالجة ديبك والجافة بين ورقتي عامل التصفية.
- تؤدي الأشعة فوق البنفسجية-كروسلينكينج للغشاء بلوتيد مع 120,000 µJ/سم2 (85 s إذا تستخدم في كروسلينكير في الجدول للمواد).
- قبل هجن الغشاء مع 6 مل من التهجين المخزن المؤقت (تجارية أو عصامي) لمدة 60 دقيقة في 68 درجة مئوية في فرن تهجين (الشكل 4 أ).
- إضافة 1 مل إضافية من التهجين المخزن المؤقت الذي يحتوي على 4 ميليلتر من المسابر 3 '--بيوتينيلاتيد (100 nM).
- احتضان الغشاء مع التحقيق بين عشية وضحاها، بينما يبرد الفرن من 68 درجة مئوية إلى 37 درجة مئوية.
- يغسل الغشاء مع مخزن يحتوي على 2 x SSC و 0.1 في المائة الحزب الديمقراطي الصربي، لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة المجسات ملزمة أونسبيسيفيكالي.
تنبيه: مخزونات النشر الاستراتيجي يمكن أن يسبب تهيجا. ارتداء القفازات ومعطف مختبر عند العمل مع الحزب الديمقراطي الصربي والحزب الديمقراطي الصربي الذي يحتوي على الحلول. - إجراء الكشف عن تحقيقات 3 '--بيوتينيلاتيد على الغشاء مثلاً مع ستريبتافيدين-برنامج الصحة الإنجابية-المتقارن ولومينول كركيزة الفجل البيروكسيديز (HRP)، أسفر عن رد فعل تشيميلومينيسسينت حساسة (الشكل 4 أ).
5-وثانيا البعد: الصفحة تريس-تريسيني-اليوريا 4،28
- المكوس العصابات واحدة من جل الأصلي الأزرق. ضم نطاقات من عينات تشغيل في الممرات الموازية لتحقيق تركيز مزيد من البروتينات المعقدة (الشكل 5).
ملاحظة: يمكن تخزين الأشرطة قصت في أنابيب رد فعل واحد حتى استخدامها مرة أخرى في 4 درجات مئوية. - صب جل تريس-تريسيني-يوريا 12% (سمك 1 مم، 6.8 × 8.6 سم (العرض × الطول)). إعداد 10 مل من محلول جل أ لجل فصل (الجدول 2)، صب بين اثنين من ألواح الزجاج وتراكب مع الكحول. إزالة الايزوبروبانول بعد الانتهاء من البلمرة ونقل 4 مل محلول جل ب (الجدول 2) لجل التراص على جل وإدراج 10 مشط جيدا.
تنبيه: يمكن أن تكون الاكريلاميد أونبوليميريزيد الأعصاب وتيميد الضارة إذا استنشق. دائماً ارتداء معدات الحماية الشخصية والعمل تحت غطاء محرك السيارة. - نقل النطاقات جل قصت في أنبوب رد فعل 1.5 مل وإضافة 1 مل 2 × العازلة عينة الحزب الديمقراطي الصربي للموازنة القطع هلام (الشكل 5، الجدول 2).
- احتضان هذه العينات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، قبل الغليان في كتلة تدفئة (95 درجة مئوية) أو في فرن ميكروويف، واحتضان العينات مرة أخرى في درجة حرارة الغرفة لزيادة 15 دقيقة.
- المكدس عدة قطع جل متوازن يمثل نفسه معقدة في جيب هلام مفرد واحد.
- إجراء التفريد استخدام اﻷنود والكاثود تشغيل المخازن المؤقتة في 150 الخامس لمدة 45 إلى 60 دقيقة، والمكوس لين جل كله.
- احتضان لين قطع لمدة 20 دقيقة في المخزن المؤقت الحمضية (100 مم تريس، حمض الخليك 100 ملم)، وحجته في 125 ملم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 6.8 لآخر 20 دقيقة (الشكل 5).
6-البعد الثالث: 4،الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة32
- من أجل الحزب الديمقراطي الصربي 15% من فصل جل وفقا لايملي32 (سمك: 1.5 مم، 6.8 × 8.6 سم (العرض × الطول)) (الجدول 2) وإضافة طبقة رقيقة من % 4 التراص هلام أعلاه.
تنبيه: الحزب الديمقراطي الصربي، الاكريلاميد وتيميد السامة والضارة. تعمل تحت غطاء محرك السيارة، وارتداء معدات الحماية الشخصية. - نقل لين جل متوازن على جل الحزب الديمقراطي الصربي وتغطي الجل مع [اغروس] 0.5% (w/w) في الحزب الديمقراطي الصربي 1 x تشغيل المخزن المؤقت تستكمل مع أثر بروموفينول الأزرق (الشكل 5).
- يغلي الحزب الديمقراطي الصربي تشغيل المخزن المؤقت مع [اغروس] في الميكروويف قبل تحميل إلى الهلام.
- لتشغيل علامة بروتين لتقدير الأوزان الجزيئية لمكونات واحدة، أدخل قطعة من ورق الترشيح في نهاية واحدة من الجل حتى توطد [اغروس] أو استخدام مشط خاص يستخدم عادة للهلام IPG.
- تشغيل الجل 150 الخامس 60 دقيقة ووصمة عار في تلطيخ الهلام مع أخذ الغروية، والفضة وصمة عار أو أي دولة أخرى طريقة مناسبة للتحليل الشامل والمطيافيه اللاحقة.
- تحليل البقع البروتين مرئية باستخدام النهج الشامل والمطيافيه مثل الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين وقت الطيران (استخدام-TOF) أو LC-MS/MS الكتلي.
ملاحظة: نوصي باستخدام أخذ الغروية تلطيخ كما سبق وصف33. في أيدينا، حتى أقل وفرة البروتينات يمكن أن يكون ملون بما فيه الكفاية، ويسمح بتحليل والمطيافيه جماعية مع نوعية البيانات معقولة.
Representative Results
نقدم هنا بروتوكول يسمح تحليل البروتين: البروتين فضلا عن مجمعات البروتين: الجيش الملكي النيبالي في لحاء عينات من كرنب نابوس. ويتضح سير العمل في الشكل 1. واحد الميزة الرئيسية نابوس (ب) عبر الكائنات الأخرى في النموذج هو إمكانية جمع العينات لحاء سهلة نسبيا من ثقوب صغيرة في نورات الجذعية. يسمح هذا للحصول على عينات نقية لحاء بكميات كبيرة نسبيا. عند أخذ العينات لحاء، من المستحسن دائماً للبحث عن التلوث، على سبيل المثال ب RT-PCR8. نتيجة تمثيلية التي تم الحصول عليها من عينة لحاء نقي هو مبين في الشكل 2. يجب أن تظهر العينات الملوثة بعدم لحاء فرقة مرئية ح ثيوريدوكسين، بينما يجب أن تظهر أي إشارة روبيسكو والبروتين معطف حبوب اللقاح. فرعية صغيرة روبيسكو يمكن أن تكون بمثابة عنصر تحكم في عينات من الأوراق، وينبع نورات أو حبوب اللقاح. ح ثيوريدوكسين ينبغي أن تكون قابلة للاكتشاف في جميع العينات، مرناً، قد وجد في لحاء من مختلف الأنواع، بينما نسخة البروتين معطف حبوب اللقاح يجب أن تكون مرئية في عينات برعم زهرة فقط. يمكن أن يحدث التلوث عند إجراء أخذ العينات لحاء في كامل النباتات المزهرة (حبوب اللقاح معطف البروتين)، أو عندما لا يتم تجاهل قطرات أول من لحاء أخذ العينات ثقوب بشكل صحيح (روبيسكو).
قبل صفحة الجبهة الوطنية وملزمة لتركيز ساب لحاء. استخدام 20 إلى 30 ميكروغرام من البروتين لكل بئر، أربعة على الأقل البروتين الرئيسية المعقدة العصابات تصبح مرئية بعد BN-صفحة نابوس باء- لحاء ساب، منخفضة جداً أو تركيزات عالية جداً لا تسمح بفصل واضح من المجمعات (الشكل 3). من المستحسن تحميل عدة عصابات جل تمثل نفس معقدة في جيب واحد واحد من جل البعد الثاني زيادة تركيز البروتينات من كل مجمع واحد للتجهيز النهائي وتحديد كتلة والمطيافيه اللاحقة.
تحديد المكونات الفردية لمجمعات لحاء الجزيئات، جنبا إلى جنب BN-الصفحة الأولى ذات بعد ثاني تريس-تريسيني-اليوريا، والبعد الثالث صفحة الحزب الديمقراطي الصربي لتحقيق فصل البروتينات وحيدة. هنا، يمكن ملاحظة فصل بدقة عالية بسبب السلوكيات الهجرة مختلفة من البروتين في اليوريا والمواد الهلامية الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. عادة، تكون البروتينات المنتمين إلى مجمع واحد تظهر كخط قطري عبر الهلام. وقد البروتينات أعلى هذا الخط زيادة هيدروفوبيسيتي، بينما تمثل البروتينات تحت الخط أكثر منها ماء28 (الشكل 5، 6 الشكل).
لتوصيف مجمعات رنب، استخدمنا جزء من جل BN-صفحة لأداء الجبهة الشمالية النشاف. بعد النشاف من ممر كله على غشاء النايلون، وكروسلينكينج بالأشعة فوق البنفسجية، يمكن تصور الجيش الملكي النيبالي باستخدام المجسات الخاصة بالحمض النووي الريبي كما هو موضح في الشكل 4. ويتضح هنا أن الحمض الريبي النووي النقال محددة موجودة فقط في مجمع معين واحد. مكونات البروتين هذا المجمع الحمض الريبي النووي النقال ملزمة يمكن أن يحقق زيادة استخدام هلام 3D النهج المبين أعلاه. أظهرت التحليلات والمطيافيه الجماعي أن هذا المجمع يحتوي على أساسا الحمض الريبي النووي النقال-ليجاسيس ما يؤكد النشاط ملزمة الحمض الريبي النووي النقال وجدت من قبل الجبهة الوطنية الشمالية النشاف.
رقم 1: العمل تدفق من التحليل للمجمعات ريبونوكليوبروتين في ساب لحاء الاغتصاب البذور الزيتية- وبعد أخذ العينات، وإعداد العينات لحاء، تتم BN-الصفحة لفصل مجمعات السكان الأصليين. تسمح هذه المواد الهلامية BN-الصفحة الموازية تحليل الأحماض النووية بالجبهة الشمالية النشاف وتحديد مكونات البروتين من المجمعات من الطيف الكتلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التحكم أخذ العينات والنقاء من عصارة لحاء نابوس. بعد ثقب الجذعية نورات النباتات الاغتصاب البذور الزيتية الأسبوع 8-10 القديمة مع إبرة حقن معقمة، جمعت مع ماصة الإفرازات ونقل إلى رد فعل الجليد أنبوب (أ) لتأكيد نقاء العينات لحاء تتم الرايت-بكر، وأجرى تضخيم وقائع ح ثيوريدوكسين ووحدة فرعية صغيرة روبيسكو وحبوب اللقاح معطف البروتين في عينات الأنسجة على حدة (ب) RT-PCR دون المنتسخة العكسية كعنصر تحكم (-). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: BN-الصفحة. التمثيل التخطيطي للصفحة الأصلية الزرقاء مع عينات لحاء مركزة من نابوس. (أ) بعد تحميل هلام بروتين التدرج مع 15-20 ميليلتر من لحاء تتركز ساب، تتم BN-الصفحة مع 1 x كاثود الأزرق الداكن المخزن المؤقت ب 150 الخامس لمدة 20-30 دقيقة في غرفة باردة. ثم يتم تبادل المخزن المؤقت ضد 1 x كاثود الأزرق الخفيفة العازلة B/10 والصفحة يتم الانتهاء في 150 الخامس ل 120-180 دقيقة حتى الأزرق الداكن تشغيل تشغيل الجبهة من الجل. إظهار المواد الهلامية BN-الصفحة أربعة نطاقات مميزة تمثل أربعة مجمعات عالية الوزن الجزيئي مختلفة. (ب) تحميل القليل جداً (ج) أو الكثير من البروتينات لحاء (د) يقلل من بروز مجمعات الفردية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الجبهة الوطنية الشمالية النشاف. التمثيل التخطيطي للجبهة الشمالية النشاف الأسلوب. (أ) لين BN-الصفحة منقولا على غشاء نايلون بشبه الجاف النشاف. بعد كروسلينكينج الأشعة فوق البنفسجية والتهجين قبل، هي المحتضنة الغشاء مع تحقيقات محددة الحمض النووي الريبي (هنا معين الحمض الريبي النووي النقال ميثيونين التحقيق)، وبيوتينيلاتيد بنهاية 3 '-في فرن تهجين طوال الليل. تتم إزالة المسابير مجاناً بواسطة الغسيل الخطوات ويجري الكشف عن الجيش الملكي النيبالي المتقارن streptavidin-برنامج الصحة الإنجابية ولومينول. باستخدام هذا النهج، لاحظنا أن الرابع معقدة من BN-الصفحة تحتوي على الميثيونين الحمض الريبي النووي النقال. (ب) جل أخذ الملون ووصمة عار الحمض الريبي النووي النقال يشابه حارتين جل مختلفة بالتوازي تجنب حدوث اختلافات الهجرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: 3D-صفحة- التمثيل التخطيطي للنهج 3D-صفحة. اقتطعت من جل BN-صفحة عدة فرق من المجمع نفسه، المحتضنة في تحميل المخزن المؤقت وتحويلها إلى بئر واحدة للبعد الثاني تريس-تريسيني-اليوريا-الصفحة. بعد التفريد، الممرات جل كله قطع، غسلها في المخزن المؤقت الحمضية الحمضية، اكويليبراتيد، وتوضع على جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 15%. بعد البعد الثالث صفحة، يتم فصل البروتينات أخذ الملون وتحليلها بواسطة الكتلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: الممثل النتائج بعد 3D-صفحة- داخل الجبهة الوطنية-الصفحة ظهرت عدة مجمعات والبعد الأول. يمكن فصل مكوناتها البروتين كذلك بصفحتين يشوه اللاحقة، أدى نمط تركيز قطري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| مسبار | التسلسل |
| ح ثيوريدوكسين |
إلى الأمام: كتكاجكاجككااجاتك عكس: أتجككتجاكاتكجاكتك |
| سلسلة روبيسكو الصغيرة |
إلى الأمام: تكاككجكتجاجتكاتك عكس: ككججتاكتككتكتجكات |
| حبوب اللقاح معطف البروتين BRU77666 |
إلى الأمام: تكاجاكتجاجكتكاكج عكس: تككتاتجككتكاجتج |
الجدول 1: الإشعال المستخدمة لمراقبة نقاء العينة لحاء. لتأكيد نقاوة العينة لحاء كبسولة تفجير محددة لسلسلة روبيسكو الصغيرة، ح ثيوريدوكسين وحبوب اللقاح معطف البروتين يمكن استخدامها لتضخيم كدنا.
| المخازن المؤقتة والحلول | المحتوى | التعليق | |
| كاثود الأزرق الداكن المخزن المؤقت ب | مم 15 مكررا-تريس pH 7.0 50 مم تريسيني 0.02% (w/v) G250 أخذ الأزرق |
وصفه هو مقتبس من فيالا et al. 17 ينبغي تعديل درجة الحموضة 7.0 يمكن إجراء المخزن المؤقت كمخزون 10 x |
|
| الضوء الأزرق الكاثود المخزن المؤقت B/10 | مم 15 مكررا-تريس pH 7.0 50 مم تريسيني 0.002% (w/v) G250 أخذ الأزرق |
يمكن إعداد المخزن المؤقت بتمييع الكاثود المخزن المؤقت ب مع الكاثود المخزن المؤقت دون أخذ | |
| المخزن المؤقت اﻷنود |
50 مم مكررا-تريس pH 7.0 |
يمكن إعداد المخزن المؤقت 10 × الحل الأسهم | |
| 2 × المخزن المؤقت لنموذج صحيفة بيانات السلامة |
125 ملم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 6.8 الحزب الديمقراطي الصربي 4% 20% والغليسيرول 0.2 M DTT 0.02% (w/v) بروموفينول الأزرق |
||
| نقل المخزن المؤقت 1 x TBE المخزن المؤقت |
89 مم تريس درجة الحموضة 7.6 حمض البوريك 89 مم 2 مم يدتا |
يمكن TBE العازلة وتخزينه كمخزون من 5 x أو 10 x. من المهم استخدام خالية رناسي منزوع الماء. | |
| 2 × SSC المخزن المؤقت |
300 ملم كلوريد الصوديوم 30 مم نا3سترات pH 7.0 |
||
| 3 x جل المخزن المؤقت |
تريس م 3 HCl م 1 0.3 الحزب الديمقراطي الصربي % الرقم الهيدروجيني 8.45 |
وصفه مقتبس من Schägger 19 | |
| تريس تريسيني هلام الحل A |
10 مل: 30% اكريلاميد-بيساكريلاميدي (فيها) مل 3.34 اليوريا م 6 3 x جل المخزن المؤقت مل 3.34 والغليسيرول 70% 1.4 مل إضافة ddH2س إلى 10 مل وكالة الأنباء الجزائرية 40 10% ميليلتر ميليلتر تيميد 4 |
الوزن 6 م اليوريا وإضافة 3 س جل المخزن المؤقت وحل اكريلاميد-بيساكريلاميدي جيسيرول 70%. الحرارة إلى 60 درجة مئوية في حمام مائي جعل اليوريا. إضافة ddH2س 10 مل، 10% لوكالة الأنباء الجزائرية، وأخيراً تيميد البلمرة. | |
| تريس تريسيني هلام حل ب |
لمل 6: 30% اكريلاميد-بيساكريلاميدي (فيها) 0.8 مل اليوريا م 6 3 x جل المخزن المؤقت 1.5 مل إضافة س ddH2إلى 6 مل وكالة الأنباء الجزائرية 45 10% ميليلتر ميليلتر تيميد 4.5 |
الوزن 6 م اليوريا وإضافة 3 × حل جل المخزن المؤقت ومادة اكريلاميد-بيساكريلاميدي. الحرارة إلى 60 درجة مئوية في حمام مائي جعل اليوريا. إضافة ddH2س 10 مل، 10% لوكالة الأنباء الجزائرية، وأخيراً تيميد البلمرة. | |
| 1 × تريس تريسيني تشغيل المخزن المؤقت (أنود) |
100 مم تريس 22.5 مم هيدروكلورايد 8.9 درجة الحموضة |
وصفه مقتبس من Schägger 19 | |
| 1 × تريس تريسيني تشغيل المخزن المؤقت (الكاثود) |
100 مم تريس 100 مم تريسيني الحزب الديمقراطي الصربي 1% الرقم الهيدروجيني 8.25 |
وصفه مقتبس من Schägger 19 | |
| المخزن المؤقت الحمضية |
100 مم تريس 100 ملم حمض الخليك |
||
| الحزب الديمقراطي الصربي 4 ٪ هلام التراص |
لمل 2: ddH2O 1.4 مل 30% اكريلاميد-بيساكريلاميدي (37.5:1) 0.33 مل 1 مل الأس الهيدروجيني 6.8 0.25 "م تريس" الحزب الديمقراطي الصربي 20 10% ميليلتر وكالة الأنباء الجزائرية 20 10% ميليلتر ميليلتر تيميد 2 |
||
| الحزب الديمقراطي الصربي 15% فصل هلام |
10 مل: ddH2س 2.3 مل 30% اكريلاميد-بيساكريلاميدي (37.5:1) 5 مل 1 م.5 تريس الأس الهيدروجيني 8.8 2.5 مل الحزب الديمقراطي الصربي 100 10% ميليلتر وكالة الأنباء الجزائرية 100 10% ميليلتر ميليلتر تيميد 4 |
||
| 1 × الحزب الديمقراطي الصربي تشغيل المخزن المؤقت |
25 مم تريس 192 مم جليكاين 0.1 الحزب الديمقراطي الصربي % |
||
| أخذ تلطيخ الحل |
5% (w/v) كبريتات الألومنيوم-(14-18) هيدرات 10% (v/v) الإيثانول (96%) حمض أورثوفوسفوريك 2% (v/v) (85%) 0.02% (w/v) G-250 "أخذ الزرقاء الرائعة" |
||
| المخزن المؤقت التهجين أولتراسينسيتيفي أولتراهيب | أمبيون، تكنولوجيا الحياة | ||
الجدول 2: حلول ووصفات المخزن المؤقت- قائمة بكافة المخازن المؤقتة والحلول اللازمة لتحليل 3D-صفحة.
| أي بقعة. | أمراض ميغاواط [كاتشين] | تحديد الهوية | الكائن الحي | الانضمام لا. | ميغاواط [كاتشين] | درجة التميمة | |
| CIV_1 | 130 | مقاومة المرض المفترضة البروتين At4g19050 | باء-نابوس | CDX78917 | 131.1 | 110 | |
| CIV_2 | 130 | مقاومة المرض المفترضة البروتين At4g19050 | باء-نابوس | CDX78917 | 131.1 | 89 | |
| CIV_3 | 100 | الصدمة الحرارة 70 كاتشين البروتين مثل 14 | باء-نابوس | XP_013748865 | 89.9 | 113 | |
| CIV_4 | 90 | عامل استطالة حقيقية النواة 2 التحكم في انقسام الخلية البروتين homolog 48 ألف |
باء-نابوس باء-نابوس |
CDX90241 CDY41316.1 |
89.5 89.5 |
111 197 |
|
| CIV_5 | 85 | الحرارة بروتين الصدمة 90-2-مثل | باء-رابا | XP_009132342 | 79.8 | 172 | |
| CIV_6 | 80 | ثريونين-ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال جليكاين-ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال |
باء-حمقاء باء-نابوس |
XP_013599115 CDY43195 |
81.5 80.8 |
110 88 |
|
| CIV_7 | 70 | الحرارة صدمة كاتشين البروتين 70 يسين-الحمض الريبي النووي النقال مثل ليجاسى |
باء-حمقاء باء-نابوس |
XP_013685267 XP_013747530 |
67.8 69.9 |
230 150 |
|
| CIV_8 | 65 | ميروسيناسي اسبارتاتي-الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى 2 الهليونين-ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال 1 |
باء-نابوس باء-نابوس باء-نابوس |
ABQ42337 XP_013670803 XP_013729126 |
60.6 61.6 63.5 |
183 141 153 |
|
| CIV_9 | 60 | ميروسيناسي | باء-نابوس | ABQ42337 | 60.6 | 164 | |
| CIV_10 | 55 | 2-مثل أدينوسيلهوموسيستيناسي | باء-رابا | XP_009135865 | 53.1 | 139 | |
| CIV_11 | 55 | استطالة معامل 1-ألفا 1-مثل | باء-حمقاء | XP_013586115 | 51.9 | 161 | |
| CIV_12 | 50 | لياز السيستين CORI3-مثل | باء-نابوس | XP_013653143 | 48.1 | 237 | |
| CIV_13 | 44 | لياز السيستين CORI3-مثل | باء-رابا | XP_009108611 | 48.3 | 213 | |
| CIV_14 | 38 | الدولاسي الفركتوز-بيسفوسفاتي | باء-رابا | XP_009115993 | 38.4 | 226 | |
| CIV_15 | 45 | لياز السيستين CORI3-مثل | باء-رابا | XP_009108611 | 48.3 | 219 | |
| CIV_16 | 45 | لياز السيستين CORI3 | باء-رابا | CDY69765 | 46.9 | 209 | |
| CIV_17 | 38 | الدلاس الفركتوز-بيسفوسفاتي | باء-رابا | XP_009115993 | 38.4 | 124 | |
| CIV_18 | 18 | رابطة الدول المستقلة-ترانس بروليل بيبتيديل إيزوميراز CYP18-3-مثل | باء-نابوس | XP_009101932 | 18.3 | 128 | |
| CIV_19 | 45 | لياز السيستين CORI3-مثل | باء-رابا | XP_009108611 | 48.3 | 177 | |
الجدول 3: تحديد مكونات البروتين من الرابع المعقدة. وجدت عدة ligases الحمض الريبي النووي النقال وكذلك البروتينات داخل المجمع ملزمة الحمض الريبي النووي النقال استخدام TOF استخدام الكتلة تحليل والمطيافيه بعد 3D-صفحة.
Discussion
لحاء حجرة الفوائد المرتفعة، حيث يشكل مسار النقل الرئيسية فوتواسيميلاتيس، وأيضا ضروري ليشير إلى مسافات طويلة بين مصنع مختلف أجزاء9،،من2034، 35. بالإضافة إلى جزيئات صغيرة، قد تورط الجزيئات الكبيرة مثل البروتينات والكشف مع صيانة لحاء وإرسال الإشارات4،7،8. تحليل تكوين لحاء مقيد بإمكانية وصول محدودة إلى عينات لحاء في معظم الأنواع النباتية. تقنية ستيليت الحشرات هو التطبيق على نطاق واسع، ولكن تجريبيا تطلبا وينتج كميات صغيرة جداً من لحاء عينات11. هو أسلوب سهل واحد يستخدم لأخذ العينات لحاء نتحه يدتا-ويسرت12. يدتا يخلب أيونات ديفالينت مثل الكالسيوم وهكذا يمنع إغلاق لوحات غربال فالبروتينات وكلوس. أنها سهلة الاستخدام، ولكن هو عرضه للتلوث بواسطة الخلايا التالفة وهي تضعف العينات. المستنفدة الأيونات divalent حسب يدتا يمكن أن يؤدي أيضا إلى انهيار للمجمعات القائمة. ومع ذلك، فإنه يسمح أخذ العينات من مجموعة واسعة من الأنواع بما في ذلك المصنع النموذجي التمويل (أ)15. نتحه عفوية من لحاء ساب يحدث فقط في عدد قليل من الأنواع النباتية. هو أسلوب الغازية التي تنطوي على ضرر ذي شأن من الأنسجة النباتية10. أنشأنا مؤخرا نابوس (ب) كنوع نموذج لدراسة النقل مسافات طويلة4،8،20. هنا، ساب لحاء يمكن تذوق من شقوق صغيرة، مما يقلل من آثار إصابة ومصادر التلوث.
باستخدام تقنيات أخذ العينات المختلفة، تم التحقيق في البروتين من لحاء عينات من الأنواع النباتية المختلفة في السنوات الأخيرة7،،من817،،من3637، 38،39. هذه الدراسات البروتين، استخرجت البروتينات وعجلت تحت ظروف يشوه و ولذلك لا تسمح باستنتاجات حول البروتين: البروتين والبروتين: التفاعلات الحمض النووي الحالية تحت ظروف السكان الأصليين. Co-إيمونوبريسيبيتيشن (كويب) وفحوصات تراكب أشارت إلى أن ريبونوكليوبروتين رئيسية معقدة قد تكون موجودة في لحاء sap من اليقطين40، لكنه وثبت عدم وجود أي مجمعات الجزيئات تحت ظروف أصلي داخل نظام لحاء.
الأزرق في الصفحة الأصلية، عرضته Schägger et al. 26، بالاقتران مع الخطوات اللاحقة جل الاستبانة التفريد تمكين فصل المكونات الفردية للمجمعات الكبيرة من البروتين. استخدام تحليلات 3D-الصفحة الأصلية نابوس باء- لحاء نضحة، نحن يمكن أن مؤخرا تثبت أن عدة الوزن الجزيئي عالية البروتين: البروتين ومجمعات رنب موجودة في لحاء عينات وهي نشطة انزيماتيكالي4. أساليب بديلة لعزل البروتين المجمعات فضلا عن رنبس مثل حجم الاستبعاد اللوني قد تكون موجودة، ولكن الفشل فيما يتعلق بالقرار بالمقارنة مع الجبهة الوطنية-الصفحة. علاوة على ذلك، لنوعية معقولة من الفصل المعقدة، حجم الاستبعاد العمود المصفوفات يتعين تكييف وفقا للأوزان الجزيئية المعقدة الشاملة قيد التحقيق. تحليل مجمعات مختلفة الحجم ولذلك تتطلب أنواع مختلفة من الأعمدة التي هي تكلفة مكثفة ولا يسمح كقوة تركيز عالية كصفحة الجبهة الوطنية.
وتشمل الخطوات الحاسمة لتحليل المجمعات من نابوس (ب) المبلغ الإجمالي لساب لحاء المستخدمة كابتداء من المواد. على الأقل 600 ميليلتر من عينة لحاء ضرورية، ويمكن الحصول عليها من خمس محطات الرطبة جيدا. 3D-صفحة والجبهة الشمالية النشاف من الضروري بدء هلام BN الأولية مع كمية كافية من عينات لحاء. ولتحقيق ذلك، عينات لحاء تتركز حتى يمكن تحميل 20 إلى 30 ميكروغرام من البروتين في كل منهما جيدا وعلى الأقل تريبليكاتيس من نفس العينة يتم تشغيلها في نفس الوقت. خفض تركيزات منخفضة جداً أو مرتفعة جداً في الكشف عن مجمعات (الشكل 3). عينات لحاء حاجة يمكن جمعها في أنابيب رد فعل على الجليد وينبغي تخزين المجمدة لاستخدامها لاحقاً لتجنب تدهور البروتين ودوران. مثبطات البروتياز عثر عليها في جميع بروتيوميس لحاء تحليلها، ولكن أيضا وصف بروتوزوم نشط بشكل كامل في لحاء نابوس باء-4. وعلاوة على ذلك، حجم وتكوين عينات لحاء تعتمد على الوقت-نقطة العينة، والظروف البيئية10. ولذلك يجب الحرص على جمع اليوم في ظروف مماثلة وفي الوقت نفسه. علاج الإجهاد (مثل الجفاف) يمكن أن تقلل من مقدار لحاء التي يمكن جمعها. لتحديد البروتينات وحيدة من الطيف الكتلي، وملزمة للحد من التلوث الكيراتين ممكن عن طريق ارتداء القفازات طوال الوقت. الكيراتين يؤدي إلى إشارات إضافية من خلال التحليل الشامل المواصفات ويعرقل تحديد البروتين. تشغيل BN-الصفحة في جهد العالي أو في درجة حرارة الغرفة يمكن أن تؤدي إلى تدفئة جل الذي قد يؤدي إلى تفكيك مجمعات الهشة.
البروتوكول المعروضة هنا مناسبة لتحليل البروتين: البروتين المجمعات. نعرض أيضا أنه يمكن استخدامه للكشف عن الكشف المحددة الواردة في المجمعات بالتوازي. ولتحقيق ذلك، قدمنا مؤخرا بروتوكولا للجبهة الشمالية النشاف4. الكشف معرضة للتدهور بالتلوث رناسي. للحد من هذا التدهور ديبك المعالجة، المياه ينبغي أن تستخدم.
وتشمل القيود الرئيسية أسلوب عرض تقدير الوزن الجزيئي للبروتين المجمعات مفصولة بواسطة BN-الصفحة، حيث يعتمد سلوك الهجرة في الحجم والشكل وحتى على تعديلات مجمعات31، بوسترانسلاشونال 41. تقدير حجم مجمعات رنب أكثر تعقيداً بسبب تأثير الأحماض النووية على سلوك الهجرة. فإنه يمكن أيضا عدم منع أن المجمعات من نفس حجم ترحيل شارك في الفرقة واحد واحد. وهذا يمكن أن يؤدي إلى التنبؤ الخاطئ بالتراكيب المعقدة. وللتحقق من التفاعلات الملاحظة مع تقنيات تكميلية، مثل فحوصات الفنية4، قد يكون ضروريا. أيضا قد فقدت البروتينات المرتبطة فقط ضعيف أو عابر لمجمع الجزيئات في المخزن المؤقت للجبهة الوطنية المستخدمة. لتجنب هذا الأمر، يمكن أن تكون العينات كروسلينكيد، ما يمكن أن يؤدي أيضا إلى النتائج الملموسة، أو يمكن أن يمنع تحديد البروتين، أو يمكن أن يكون الأمثل شروط المخزن المؤقت.
على النقيض من صفحة 2D الكلاسيكية، المزيج من اليوريا، والحزب الديمقراطي الصربي-صفحة يسمح الفصل وفقا هيدروفوبيسيتي والوزن الجزيئي بدلاً من نقطة isoelectric (pI) والوزن الجزيئي 28، ولا يحد من الانفصال إلى البروتينات وتتراوح بي محددة. بروتينات مماثلة إلى الكلاسيكية 2D-صفحة، مفصولة تظهر كبقع واحدة، ولكن على قطري خط 4،28 (الشكل 5، الشكل 6). البروتينات مسعور أكثر تظهر في بقع أعلاه هذا قطري، في حين تم العثور على أكثر من البروتينات ماء أسفل السطر28. تركيزات بولياكريلاميدي المستخدمة في هذا البروتوكول سيتم فصل البروتينات بين 25 إلى 80 كاتشين جيدا. للسماح بفصل البروتينات أصغر أو أكبر في بولياكريلاميدي يمكن أن تختلف تركيز أو يمكن استخدام المواد الهلامية المتدرجة في البعد الثالث. مكونات مجمع الرابع (الشكل 3) مفصولة بواسطة 3D-صفحة (الشكل 6) تم قطع، التربسين هضمها وتحليلها بواسطة الطيف الكتلي. وادي هذا إلى تحديد عدة الحمض الريبي النووي النقال ليجاسيس. مكونات المجمعات الأخرى قد نشرت مؤخرا 4. 3D-الصفحة مكن الفصل بين ليجاسيس مختلفة، هي: اسبارتاتي، أسباراجين، ثريونين، ligases يسين وجليكاين، مع الأوزان الجزيئية مماثلة (الجدول 3). استخدام تحقيق خاصة بالحمض الريبي النووي النقال ميثيونين، نحن كانت قادرة على الكشف عن منضم يحتمل أن الحمض الريبي النووي النقال داخل الرابع معقدة، ولكن لا تميز إذا كان طول كامل الحمض الريبي النووي النقال أو أجزاء الحمض الريبي النووي النقال في المجمع مع المجسات المستخدمة. قد عينات للتحقق إذا كانت الأحماض النووية ملزمة حقاً داخل المجمع وعدم ترحيل المشترك، مبطلات يهضم ساب لحاء بمثابة ضوابط الهجرة مناسبة.
كان قد تردد في وقت سابق أن ترجمة البروتين يمكن أن يحدث داخل الأنابيب غربال لحاء، حيث وجدت تقريبا معظم مكونات الريبوسوم كاملة، فضلا عن العوامل استطالة في لحاء عينات4،7. ويبدو لنا العثور على الحمض الريبي النووي النقال و ligases الحمض الريبي النووي النقال لدعم هذه الفكرة. ومع ذلك، الحمض الريبي النووي النقال الشظايا موجودة في لحاء العينات من اليقطين قد أظهرت أن تكون مثبطات قوية للترجمة42 وريبوسوم الفنية ويبدو أن غياب4، مما يوحي بأن الترجمة لا يمكن أن يحدث.
أخذت معا، يسمح البروتوكول المعروضة هنا فصل البروتين: البروتين الأصلي وحتى رنب في مجمعات من عينات لحاء وفصل وتحديد المكونات الفردية الخاصة بهم بدقة عالية. تطبيق هذا الأسلوب يتيح اكتشاف البروتين رواية ومجمعات رنب في عينات لحاء ولذلك يمكن توضيح مهام جديدة في هذه المقصورة محطة متخصصة للغاية.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر جنيفر Deke وزارزينسكا Urszula للدعم العلمي. هذا العمل كان يدعمها ماليا "منحة التكامل الوظيفي" (CIG، 0734 PCIG14-GA-2013-63) من "المفوضية الأوروبية" ضمن البرنامج الإطاري السابع ومنح لف-GK06 'ديليجرة' (Landesforschungsförderung هامبورغ)، ومنحة DFG (كه DFG 856_6-1) منحت لكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| 10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm | BioRad | 1653359 | |
| 2-Propanol | AppliChem | 131090 | |
| 30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution | BioRad | 1610156 | |
| 30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution | BioRad | 1610158 | |
| 96 % Ethanol | Carl Roth | P075 | |
| Acetic acid | Carl Roth | 6755 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate | AppliChem | 141101 | |
| Ammonium peroxodisulfate (APS) | Carl Roth | 9592.3 | |
| Bis-Tris | AppliChem | A3992 | |
| Boric acid | AppliChem | A2940 | |
| Bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
| Centrifugal concentrators e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa) | Sartorius | VS0102 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit | Thermo Fisher Scientific | 89880 | |
| Chromatography papers e.g. 3 mm CHR | Whatman | 3030-153 | |
| CoolBox M30 System | Biocision | BCS-133 | |
| Coomassie brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | AppliChem | A0881 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
| DNase I | AppliChem | A3778 | |
| Ethanol abs. | AppliChem | A3693 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | AppliChem | A1103 | |
| Gel Imaging system e.g. Chemidoc Touch | BioRad | 1708370 | |
| GeneRuler 1kb plus | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | |
| Glycerol | AppliChem | 141339 | |
| Glycine | AppliChem | 131340 | |
| Heating block TS1 | Biometra | 846-051-500 | |
| Hybridization oven e.g. GFL Hybridization Incubator 7601 | GFL | 7601 | |
| Hypodermic needle (0.8 mm) | B Braun | 4658309 | |
| IPG gel comb, thickness 1 mm | BioRad | 1653367 | |
| Labeling of RNA e.g.Biotin 3'end DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | 89818 | |
| Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4–16% Bis-Tris protein gel | Invitrogen | BN1002BOX | |
| Nylon membrane e.g. Hybond-N+ | Amersham Pharmacia | RPN203B | |
| Ortho-phosphoric acid | Carl Roth | 6366.1 | |
| PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
| Power supply for Gel electrophoresis EPS | Amersham Pharmacia | 18-1130-01 | available from GE Healthcare |
| RNA Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi dry Blot | Biometra | 846-015-100 | |
| Sodium chloride (NaCl) | AppliChem | A1149 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | AppliChem | 142363 | |
| Synthesis of cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | AppliChem | A1148 | |
| Tricine | AppliChem | A3954 | |
| Tris | AppliChem | A1086 | |
| Tri-sodium citrate dihydrate | AppliChem | A3901 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer | Thermo Fisher Scientific | AM8670 | |
| Urea | AppliChem | A1360 | |
| UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400 | Agilent | NC0477671 | from Fisher Scientific |
| Vertical electrophoresis apparatus e.g.The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System | Thermo Fisher Scientific or BioRad | EI0001 or 1658004 | |
| Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 |
References
- Kempers, R., van Bel, A. J. E. Symplasmic connections between sieve element and companion cell in the stem phloem ofVicia faba L. have a molecular exclusion limit of at least 10 kDa. Planta. 201 (2), 195-201 (1997).
- Stadler, R., et al. Expression of GFP-fusions in Arabidopsis companion cells reveals non-specific protein trafficking into sieve elements and identifies a novel post-phloem domain in roots. Plant J. 41 (2), 319-331 (2005).
- Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues. Plant Cell. 11 (3), 309-322 (1999).
- Ostendorp, A., et al. Functional analysis of Brassica napus phloem protein and ribonucleoprotein complexes. New Phytol. 214 (3), 1188-1197 (2017).
- Paultre, D. S. G., Gustin, M. -P., Molnar, A., Oparka, K. J. Lost in Transit: Long-Distance Trafficking and Phloem Unloading of Protein Signals in Arabidopsis Homografts. Plant Cell. 28 (9), 2016-2025 (2016).
- Sali, A., Glaeser, R., Earnest, T., Baumeister, W. From words to literature in structural proteomics. Nature. 422 (6928), 216-225 (2003).
- Lin, M. -K., Lee, Y. -J., Lough, T. J., Phinney, B. S., Lucas, W. J. Analysis of the Pumpkin Phloem Proteome Provides Insights into Angiosperm Sieve Tube Function. Mol. Cell. Proteomics. 8 (2), 343-356 (2008).
- Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. Towards the proteome of Brassica napus phloem sap. Proteomics. 6 (3), 896-909 (2006).
- Lucas, W. J., Yoo, B. C., Kragler, F. RNA as a long-distance information macromolecule in plants. Nat. Rev. Mol. Cell. Bio. 2 (11), 849-857 (2001).
- Dinant, S., Kehr, J. Sampling and Analysis of Phloem Sap. Plant Mineral Nutrients. 953, 185-194 (2013).
- Kennedy, J. S., Mittler, T. E. A Method of obtaining Phloem Sap via the Mouth-parts of Aphids. Nature. 171 (4351), 528 (1953).
- King, R. W., Zeevaart, J. A. Enhancement of Phloem exudation from cut petioles by chelating agents. Plant Physiol. 53 (1), 96-103 (1974).
- Alosi, M. C., Melroy, D. L., Park, R. B. The regulation of gelation of Phloem exudate from cucurbita fruit by dilution, glutathione, and glutathione reductase. Plant Physiol. 86 (4), 1089-1094 (1988).
- Dinant, S., Bonnemain, J. -L., Girousse, C., Kehr, J. Phloem sap intricacy and interplay with aphid feeding. Comptes rendus biologies. 333 (6-7), 504-515 (2010).
- Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Collection and analysis of Arabidopsis phloem exudates using the EDTA-facilitated Method. J Vis Exp. (80), e51111 (2013).
- Kovalskaya, N., Owens, R., Baker, C. J., Deahl, K., Hammond, R. W. Application of a modified EDTA-mediated exudation technique and guttation fluid analysis for Potato spindle tuber viroid RNA detection in tomato plants (Solanum lycopersicum). J. Virol. Methods. 198, 75-81 (2014).
- Rodriguez-Medina, C., Atkins, C. A., Mann, A. J., Jordan, M. E., Smith, P. M. Macromolecular composition of phloem exudate from white lupin (Lupinus albus L). BMC Plant Biol. 11 (1), 36 (2011).
- Taylor, J. S., Thompson, B., Pate, J. S., Atkins, C. A., Pharis, R. P. Cytokinins in the Phloem Sap of White Lupin (Lupinus albus L.). Plant Physiol. 94 (4), 1714-1720 (1990).
- Yoo, B., et al. A Systemic Small RNA Signaling System in Plants. Plant Cell. 16 (8), 1979-2000 (2004).
- Buhtz, A., Springer, F., Chappell, L., Baulcombe, D. C., Kehr, J. Identification and characterization of small RNAs from the phloem of Brassica napus. Plant J. 53 (5), 739-749 (2008).
- Chalhoub, B., et al. Plant genetics. Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassica napus oilseed genome. Science. 345 (6199), 950-953 (2014).
- Sasaki, T., Chino, M., Hayashi, H., Fujiwara, T. Detection of several mRNA species in rice phloem sap. Plant Cell Phys. 39 (8), 895-897 (1998).
- Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements. J Exp. Bot. 53 (369), 631-637 (2002).
- Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Cázares, B., Lucas, W. J. Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants. Dev. 126 (20), 4405-4419 (1999).
- Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), e2164 (2011).
- Rais, I., Karas, M., Schägger, H. Two-dimensional electrophoresis for the isolation of integral membrane proteins and mass spectrometric identification. Proteomics. 4 (9), 2567-2571 (2004).
- Schägger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature protocols. 1 (1), 16-22 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. -P., Schägger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Eubel, H., Braun, H. -P., Millar, A. H. Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions. Plant Methods. 1 (1), 11 (2005).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J Vis Exp. (30), (2009).
- Turnbull, C. G. N., Lopez-Cobollo, R. M. Heavy traffic in the fast lane: long-distance signalling by macromolecules. New Phytol. 198 (1), 33-51 (2013).
- Hall, S. M., Baker, D. A. The chemical composition of Ricinus phloem exudate. Planta. 106 (2), 131-140 (1972).
- Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Ashton, P., Jones, A., Pritchard, J. Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry. J. Exp. Bot. 55 (402), 1473-1481 (2004).
- Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins. Phytochemistry. 65 (12), 1795-1804 (2004).
- Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes. Plant J. 31 (2), 189-197 (2002).
- Kehr, J. Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects. J Exp. Bot. 57 (4), 767-774 (2006).
- Ham, B. -K., Brandom, J. L., Xoconostle-Cázares, B., Ringgold, V., Lough, T. J., Lucas, W. J. A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex. Plant Cell. 21 (1), 197-215 (2009).
- Schamel, W. W. Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE. J. Immunol. Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).
- Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. The phloem-delivered RNA pool contains small noncoding RNAs and interferes with translation. Plant Physiol. 150 (1), 378-387 (2009).
