Aqui nós apresentamos um protocolo para analisar a composição da proteína da proteína: proteína nativa grande e proteína: complexos de ácidos nucleicos de colza (b. napus) exsudato floema usando uma abordagem de eletroforese (página) do gel de polyacrylamide 3D combinando azul nativo (BN) com duas páginas de desnaturação, seguido pela identificação de espectrometria de massa.
O floema de plantas superiores de amostragem é muitas vezes trabalhoso e significativamente dependente das espécies vegetais. No entanto, estudos de proteoma sob condições de desnaturação poderiam ser alcançados em diferentes espécies de plantas. Proteína: proteína nativa e proteína: complexos de ácidos nucleicos de amostras de floema ainda mal foram analisados, embora eles podem desempenhar um papel importante na manutenção deste compartimento especializado ou na sinalização de longa distância. Grandes conjuntos moleculares podem ser isolados usando uma eletroforese em gel azul de nativo (BN-PAGE). Seus componentes de proteínas podem ser separadas por um sulfato dodecyl de sódio subsequentes página (SDS-PAGE). No entanto, as proteínas com peso moleculares similares co migram, o que pode dificultar a identificação de proteínas por espectrometria de massa. Combinando a BN-página com dois diferentes desnaturação gel de electroforese passos, ou seja, Tris-Tricine-ureia e SDS-PAGE, permite a separação adicional de proteínas de acordo com sua Hidrofilia/hidrofobicidade e, portanto, aumenta a resolução e o sucesso da identificação de proteínas. Ele ainda permite distinguir as proteínas que só diferem em suas modificações posttranslational. Além disso, a mancha do Norte nativo azul pode ser aplicado para identificar os componentes do RNA em complexos macromoleculares. Nós mostramos que nosso protocolo destina-se a desvendar a proteína e os componentes do RNA de proteína: proteína nativa e complexos ribonucleoprotein (RNP) ocorrem nas amostras de floema. Combinando um azul nativa página com duas diferentes etapas de página desnaturação pode ajudar a separar os diferentes tipos de grandes complexos de proteínas e também permite uma taxa de aumento da identificação de seus componentes por espectrometria de massa. Além disso, o protocolo é robusto o suficiente para detectar simultaneamente potencialmente vinculados ácidos nucleicos dentro de complexos de proteínas simples.
Os conduítes de longa distância do floema são essenciais para a atribuição de nutrientes orgânicos em plantas superiores, mas também estão envolvidos na regulação de muitos processos diferentes importantes para o crescimento e desenvolvimento, defesa do patógeno e a adaptação ao adversos condições ambientais. Além de pequenos efetores como íons, fitohormônios ou metabolitos próprios, macromoléculas como proteínas e RNAs surgiram recentemente como potenciais sinais.
Estudos têm mostrado que o carregamento do floema de proteínas é tamanho dependente e controlado pelo limite de exclusão de tamanho (SEL) das unidades do pore-plasmodesmal conectando células companheiro (CC) e peneira elementos (SE) que são tipicamente na faixa de 10 a > 67 kDa1 , 2 , 3. no entanto, apesar destes tamanho limitações maiores proteínas e proteínas complexos foram encontrados dentro do sistema de floema, desafiando a ideia de exclusão de tamanho4, e nem inespecífica perda de proteínas do CC para SE tem sido sugeridas5 .
Complexos Multiproteicos, bem como grandes ribonucleoprotein desempenham um papel crucial na biossíntese e mantendo a integridade estrutural da célula6. Há evidências de que o floema-mobile da proteína-proteína e ribonucleoprotein complexos existem4,7, mas até agora pouco sobre a sua função é conhecido. Em elementos crivados de floema proteína: proteína e RNP complexos têm sido implicados com o transporte de longa distância e / ou sinalização de8,9. Para desvendar as funções dos complexos translocados, estudando sua composição sob diferentes ambiental ou condições de estresse é necessárias. Para conseguir isso, complexos nativos precisam ser isolado e seus componentes têm de ser separados com resolução suficiente.
Para isolar complexos de alto peso molecular do floema, é primeiro necessário para obter amostras de seiva em qualidade e quantidade suficientes. A técnica que pode ser usada para amostragem de floema depende da espécie de planta de interesse. Três métodos principais para obter seiva do floema existem 10: inseto stylectomy11, exsudação de EDTA-facilitou12e exsudação espontânea13.
Amostras de floema de Arabidopsis thaliana (a. thaliana), a planta modelo grande em laboratórios em todo o mundo, só podem ser obtidas por EDTA-facilitado exsudação ou pulgão stylectomy14,15. Ambos os métodos conduzem a seiva do floema altamente diluídas ou quantidades de amostra muito baixa. Exsudação de EDTA-facilitou também é propensa a contaminação e não pode representar o floema real composição16. Exsudação de floema espontânea é limitada para plantar espécies como abóboras, tremoço ou yucca, onde cortar as partes da planta leva a uma emissão espontânea de seiva do floema que pode ser facilmente coletadas13,17,18, 19. Recentemente estabelecemos colza (Brassica napus) como um sistema de modelo apropriado para a análise do floema, uma vez que é um parente próximo da . thaliana e vários microlitros de seiva do floema podem ser obtidos de pequenas incisões que tem sido mostrado para ser de alta pureza4,8,20. Além disso, a sequência do genoma de b. napus foi lançada em 201421.
Exceto para pulgão stylectomy, todos os métodos de coleção de floema descritos incluem danos do tecido no local da amostragem, e a composição da seiva do floema pode mudar em resposta a lesões. Portanto, é essencial verificar a qualidade das amostras de floema, independentemente do método de amostragem aplicada. Existem diferentes métodos para o controle de qualidade de seiva do floema coletados, por exemplo, por determinação do RNase atividade22,23, RT-PCR com primers contra Rubisco8,24ou a análise do açúcar composição8.
Diferentes métodos para isolar e separar os complexos da proteína podem ser aplicados, incluindo cromatografia de exclusão, ultracentrifugação de densidade de sacarose ou filtração da amostra através de membranas com distintas de peso molecular de corte offs. No entanto, essas abordagens não permitem alta resolução. A técnica chamada azul nativa página (BN-), primeiramente descrita por Schägger et al. 25, é superior em termos de resolução. Foi usado com sucesso para determinar os pesos moleculares dos complexos proteína nativa grande de várias organelas ou de lisados celulares e suas abundâncias relativas de26,27.
Para elucidar ainda mais a composição complexa de complexos de proteínas, é necessário separar os componentes individuais sob condições, levando a desmontagem completa dos componentes do complexos de desnaturação. Isto pode ser conseguido por uma segunda dimensão de SDS-PAGE 28,29 , ou, para obter maior resolução, por uma segunda dimensão de focalização isoelétrica (IEF) seguida por um third dimension de SDS-PAGE30 e posterior identificação de as proteínas usando espectrometria de massa.
Neste protocolo, descrevemos a amostragem de seiva pura do floema de plantas b. napus e a análise de complexos de proteínas de tais amostras de floema usando uma abordagem eletroforética 3D combinando BN-página com Tris-Tricine-ureia-página e SDS-PAGE. Os componentes de complexos de proteínas separadas são posteriormente identificados usando espectrometria de massa. Além disso, nós introduzimos azul nativo northern blot que serve como um método que permite a detecção de RNAs em grandes complexos RNP4, estendendo-se a aplicabilidade da abordagem.
O floema é um compartimento de grande interesse, uma vez que constitui a rota de transporte principais para fotossimilados e também é essencial para a sinalização de longa distância entre plantas diferentes partes9,20,34, 35. Além de pequenas moléculas, macromoléculas como proteínas e RNAs têm sido implicadas com a manutenção do floema e sinalização4,7,8. A análise da composição do floema é restrito pela acessibilidade limitada para amostras de floema na maioria das espécies de plantas. A técnica de inseto estilete é amplamente aplicável, mas experimentalmente exigentes e resulta em muito pequenas quantidades de amostras de floema11. Uma técnica fácil, usada para amostragem de floema é exsudação EDTA-facilitou12. EDTA quelatos íons divalentes, como o cálcio e, portanto, impede o fechamento das placas de peneira por P-proteínas e callose. É fácil de usar, mas é propenso à contaminação por células danificadas e as amostras são diluídas. Empobrecimento íons divalentes por EDTA também pode levar a um colapso de complexos existentes. No entanto, ele permite a amostragem de uma grande variedade de espécies, incluindo a planta de modelo a. thaliana15. Espontânea exsudação de seiva do floema ocorre apenas em um pequeno número de espécies de plantas. É um método invasivo que envolve significativa lesão de tecidos de planta10. Recentemente estabelecemos b. napus como uma espécie de modelo para estudar o transporte de longa distância4,8,20. Aqui, seiva do floema pode ser degustada de pequenas incisões, que reduz ferindo efeitos e fontes de contaminação.
Usando técnicas de amostragem diferentes, a proteoma das amostras do floema de diferentes espécies de plantas tem sido pesquisada em anos recentes7,8,17,36,37, 38,39. Para estes estudos de proteoma, proteínas foram extraídas e precipitadas sob condições de desnaturação e, portanto, não permitem conclusões sobre proteína: proteína e proteína: interações ácido nucleico presente sob condições nativas. Co-imunoprecipitação (CoIP) e sobreposição ensaios indicaram que um grande complexo de ribonucleoprotein pode existir na seiva do floema de abóbora40, mas não foi demonstrado que qualquer complexos macromoleculares existirem sob condições nativas dentro da sistema de floema.
Azul página nativa, introduzida por Schägger et al . 26, em combinação com passos de eletroforese de gel de alta resolução subsequente permitem a separação dos componentes individuais de grandes complexos de proteínas. Usando o 3D-página análises de nativo b. napus exsudado do floema, nós recentemente pôde demonstrar que várias proteínas: proteína de alto peso molecular e complexos de RNP existem em amostras de floema e são enzimaticamente ativo4. Métodos alternativos para isolar os complexos da proteína, bem como RNPs como cromatografia de exclusão podem existir, mas falham em termos de resolução quando comparado à BN-página. Além disso, para uma razoável qualidade de separação complexa, matrizes de coluna de exclusão de tamanho devem ser adaptados de acordo com os global complexos pesos moleculares sendo investigados. Analisando a complexos de tamanho diferente, portanto, vai exigir diferentes tipos de colunas que é custo intensivo e não permitir como alta potência focagem como BN-página.
Passos críticos para analisar complexos de b. napus incluem a quantidade total de seiva do floema usada como material de partida. Pelo menos 600 µ l de amostra do floema são necessárias e podem ser obtidas de cinco plantas bem regadas. 3D-página e BN mancha do Norte é necessário iniciar o gel BN inicial com uma quantidade suficiente de amostras de floema. Para alcançar este objetivo, amostras de floema estão concentradas até 20 a 30 µ g de proteína pode ser carregado em cada bem e pelo menos que triplica da mesma amostra é executada em paralelo. Muito baixas ou muito altas concentrações reduzem a detecção dos complexos (Figura 3). Floema amostras precisam ser coletadas em tubos de reação no gelo e devem ser armazenadas congelados para uso posterior evitar a rotatividade e a degradação das proteínas. Inibidores de protease têm sido encontrados em todos os floema proteomes analisados, mas também uma Proteassoma totalmente ativa foi descrita no floema de b. napus4. Além disso, volume e composição das amostras de floema dependem do tempo-ponto de amostragem e de condições ambientais10. Portanto, deve-se ter cuidado para coletar ao mesmo tempo do dia em condições similares. Tratamentos de stress (por exemplo, seca) podem reduzir a quantidade de floema que pode ser coletada. Para identificar proteínas única por espectrometria de massa, é obrigatório para limitar as contaminações possíveis queratina por usando luvas o tempo todo. Leva a sinais adicionais durante a análise em massa e dificulta a identificação da proteína queratina. A BN-página em execução em uma tensão mais alta ou a temperatura ambiente pode causar aquecimento do gel que possa resultar na desmontagem dos complexos frágil.
O protocolo aqui apresentado é adequado para a análise de complexos de proteína: proteína. Também mostramos que ele pode ser usado para detectar RNAs específicos contidos na complexos em paralelo. Para conseguir isso, introduzimos recentemente um protocolo para BN norte da mancha a4. RNAs são propensas à degradação por contaminações de RNAse. Para limitar tal degradação DEPC tratada, água deve ser usada.
Principais limitações do método apresentado incluem a estimativa do peso molecular de complexos de proteínas separadas por BN-página, desde que o comportamento de migração depende de tamanho, forma e até mesmo modificações posttranslational de complexos31, 41. Estimativa de tamanho de complexos RNP é ainda mais complicada devido à influência dos ácidos nucleicos sobre o comportamento de migração. Ele também não pode ser evitado que os complexos do mesmo tamanho co migram em uma única banda. Isso pode levar à previsão errônea de composições complexas. Portanto, verificar as interações observadas com técnicas complementares, por exemplo, por ensaios funcionais4, pode ser necessário. Também proteínas apenas fracamente ou transitoriamente associadas a um complexo macromolecular podem ser perdidas no BN buffer usado. Para evitar isso, as amostras podem ser ligação cruzada, o que também pode levar a artefatos ou pode impedir a identificação da proteína, ou as condições de reserva podem ser otimizadas.
Em contraste com o clássico 2D-PAGE, a combinação de ureia – e SDS-PAGE permite a separação de acordo com a hidrofobicidade e peso molecular, em vez de ponto isoelétrico (pI) e peso molecular de 28e não limita a separação de proteínas de um intervalo específico de pI. Similar ao clássico 2D-PAGE, separadas de proteínas são visíveis como pontos simples, mas na diagonal, linha de 4,28 (Figura 5, Figura 6). Mais proteínas hidrofóbicas aparecem em pontos acima a diagonal, Considerando que mais hidrófilas proteínas encontram-se abaixo da linha28. As concentrações de poliacrilamida utilizadas neste protocolo vão separar proteínas entre 25 a 80 kDa bem. Para permitir uma separação de proteínas de menores ou maiores a poliacrilamida concentração pode ser variada ou géis gradientes podem ser usados na terceira dimensão. Os componentes do complexo IV (Figura 3), separados por 3D-página (Figura 6) foram cortados, tripsina digerido e analisados por espectrometria de massa. Isto resultou na identificação de vários ligases de tRNA. Os componentes dos outros complexos têm sido recentemente publicado 4. Nossa página de 3D habilitado a separação de ligases diferentes, ou seja, aspartato, asparagina, treonina, lisina e glicina ligases, com peso moleculares similares (tabela 3). Usando uma sonda de tRNA específico de metionina, foram capazes de detectar o tRNA potencialmente acoplado dentro complexo IV, mas se tRNA completos ou fragmentos de tRNA são no complexo não podem ser discriminados com as sondas utilizadas. Para verificar se os ácidos nucleicos são realmente acoplado dentro do complexo e não co migrando, protease digerido seiva do floema amostras poderá servir como controles de migração adequada.
Foi especulado anteriormente que tradução de proteína pode ocorrer dentro de tubos de peneira do floema, uma vez que quase a maioria dos componentes do Ribossoma inteira, bem como fatores de alongamento foram encontrados em amostras de floema4,7. Nosso achado de tRNA e ligases tRNA parece apoiar esta ideia. No entanto, fragmentos de tRNA presentes nas amostras de floema de abóbora foram mostrados para ser potentes inibidores da tradução42 e ribossomas funcionais parecem estar ausentes da4, sugerindo que a tradução não pode ter lugar.
Tomados em conjunto, o protocolo aqui apresentado permite a separação de proteínas: proteína nativa e até mesmo RNP complexos de amostras de floema e a separação e identificação dos seus componentes individuais com alta resolução. A aplicação deste método permite a descoberta de novas proteínas e complexos de RNP em amostras de floema e, portanto, pode elucidar novas funções neste compartimento planta altamente especializados.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Jennifer Deke e Urszula Zarzenska pelo apoio científico. Este trabalho foi apoiado financeiramente por uma concessão de integração de carreira (CIG, PCIG14-GA-2013-63 0734) pela Comissão Europeia no âmbito do 7º programa-quadro, a concessão LFF-GK06 ‘DELIGRAH’ (Landesforschungsförderung Hamburgo) e a concessão DFG (DFG KE 856_6-1) atribuído a JK.
1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm | BioRad | 1653359 | |
2-Propanol | AppliChem | 131090 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution | BioRad | 1610156 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution | BioRad | 1610158 | |
96 % Ethanol | Carl Roth | P075 | |
Acetic acid | Carl Roth | 6755 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate | AppliChem | 141101 | |
Ammonium peroxodisulfate (APS) | Carl Roth | 9592.3 | |
Bis-Tris | AppliChem | A3992 | |
Boric acid | AppliChem | A2940 | |
Bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
Centrifugal concentrators e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa) | Sartorius | VS0102 | |
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit | Thermo Fisher Scientific | 89880 | |
Chromatography papers e.g. 3 mm CHR | Whatman | 3030-153 | |
CoolBox M30 System | Biocision | BCS-133 | |
Coomassie brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | AppliChem | A0881 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
DNase I | AppliChem | A3778 | |
Ethanol abs. | AppliChem | A3693 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | AppliChem | A1103 | |
Gel Imaging system e.g. Chemidoc Touch | BioRad | 1708370 | |
GeneRuler 1kb plus | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | |
Glycerol | AppliChem | 141339 | |
Glycine | AppliChem | 131340 | |
Heating block TS1 | Biometra | 846-051-500 | |
Hybridization oven e.g. GFL Hybridization Incubator 7601 | GFL | 7601 | |
Hypodermic needle (0.8 mm) | B Braun | 4658309 | |
IPG gel comb, thickness 1 mm | BioRad | 1653367 | |
Labeling of RNA e.g.Biotin 3'end DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | 89818 | |
Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4–16% Bis-Tris protein gel | Invitrogen | BN1002BOX | |
Nylon membrane e.g. Hybond-N+ | Amersham Pharmacia | RPN203B | |
Ortho-phosphoric acid | Carl Roth | 6366.1 | |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
Power supply for Gel electrophoresis EPS | Amersham Pharmacia | 18-1130-01 | available from GE Healthcare |
RNA Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi dry Blot | Biometra | 846-015-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | AppliChem | A1149 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | AppliChem | 142363 | |
Synthesis of cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | AppliChem | A1148 | |
Tricine | AppliChem | A3954 | |
Tris | AppliChem | A1086 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | AppliChem | A3901 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer | Thermo Fisher Scientific | AM8670 | |
Urea | AppliChem | A1360 | |
UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400 | Agilent | NC0477671 | from Fisher Scientific |
Vertical electrophoresis apparatus e.g.The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System | Thermo Fisher Scientific or BioRad | EI0001 or 1658004 | |
Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 |