Qui presentiamo un protocollo per analizzare la composizione proteica della grande proteina nativa: proteina e proteina: complessi di acidi nucleici da colza (b. napus) essudato floema utilizzando un approccio di elettroforesi (pagina) del gel di poliacrilammide 3D combinando blu nativo (BN) con due pagine di denaturazione seguita dall’identificazione spettrometria di massa.
Floema delle piante superiori di campionamento è spesso laborioso e significativamente dipende la specie di pianta. Tuttavia, proteoma studi sotto condizioni di denaturazione potrebbero essere realizzati in diverse specie vegetali. Proteine: proteina nativa e proteina: complessi di acidi nucleici da campioni di floema ancora sono a malapena stati analizzati, anche se potrebbe giocano ruoli importanti nel mantenimento di questo comparto specializzato o nella segnalazione a lunga distanza. Assiemi di grandi dimensioni molecolari possono essere isolati utilizzando un’elettroforesi Natale blu del gel (BN-PAGE). Loro componenti proteici possono essere separate da un successiva sodio dodecil solfato (SDS-pagina). Tuttavia, le proteine con pesi molecolari simili co-migrano, ciò che può ostacolare la identificazione delle proteine mediante spettrometria di massa. BN-PAGE la combinazione con due differenti denaturante gel elettroforesi passi, vale a dire Tris-Tricine-urea e SDS-PAGE, consente l’ulteriore separazione delle proteine secondo loro idrofilicità/idrofobicità e così aumenta la risoluzione e il successo di identificazione della proteina. Esso consente anche di distinguere una proteina che differiscono solo nelle loro modifiche di posttranslational. Inoltre, Macchiarsi nordico nativo blu può essere applicato per identificare i componenti di RNA in complessi macromolecolari. Indichiamo che il nostro protocollo è adatto per svelare le proteine e RNA componenti di proteine: proteina nativa e complessi della ribonucleoproteina (RNP) che si verificano nei campioni del floema. Combinando un blu PAGE nativo con due diverse fasi di pagina denaturazione può aiutare a separare i diversi tipi di complessi proteici grande e consente inoltre un tasso aumentato di identificazione dei loro componenti mediante spettrometria di massa. Inoltre, il protocollo è abbastanza robusto per rilevare contemporaneamente acidi nucleici potenzialmente associati all’interno di complessi di singole proteine.
I condotti a lunga distanza del floema sono essenziali per la ripartizione dei nutrienti organici nelle piante superiori, ma sono anche coinvolti nella regolazione di molti processi differenti importanti per la crescita e lo sviluppo, difesa degli agenti patogeni e l’adattamento alle avverse condizioni ambientali. Oltre a piccoli effettori come ioni, fitormoni o metaboliti stessi, macromolecole come proteine ed RNA recentemente sono emerso come segnali di potenziali.
Gli studi hanno indicato che il caricamento del floema delle proteine è dimensione dipendente e controllato dal limite di esclusione di formato (SEL) delle unità poro-plasmodesmal collega compagno cellule (CC) ed il setaccio elementi (SE) che sono in genere nel range di 10-> 67 kDa1 , 2 , 3. Tuttavia, nonostante queste proteine più grandi limitazioni di dimensioni e proteina complessi sono stati trovati all’interno del sistema di floema sfidando l’idea di dimensione esclusione4, e anche non specifico perdita di proteine da CC a SE è stato suggerito5 .
Complessi multiproteici, nonché grandi ribonucleoproteina giocano un ruolo fondamentale nella biosintesi e mantenimento dell’integrità strutturale della cellula6. C’è evidenza che complessi proteina-proteina e ribonucleoproteina floema-mobile esistano4,7, ma fino ad oggi si sa poco sulla loro funzione. In elementi di setaccio del floema: proteina e RNP complessi sono stati implicati con trasporto su lunghe distanze e / o segnalazione8,9. Per svelare le funzioni dei complessi spostati, lo studio della loro composizione in variabili ambientali o condizioni di stress sono necessarie. Per raggiungere questo obiettivo, nativi complessi devono essere isolato e loro componenti devono essere separati con una risoluzione sufficiente.
Per isolare i complessi ad alto peso molecolare da floema, è innanzitutto necessario ottenere campioni di sap in qualità e quantità sufficiente. La tecnica che può essere utilizzata per il campionamento del floema dipende la specie vegetali di interesse. Esistono tre metodi principali per ottenere sap floema 10: insetto stylectomy11, EDTA-facilitato essudazione12ed essudazione spontanea13.
Campioni del floema da thaliana di Arabidopsis (a. thaliana), l’impianto modello principali nei laboratori in tutto il mondo, può di EDTA-facilitato essudazione o afide stylectomy14,15. Entrambi i metodi portano a sap floema altamente diluite o importi molto basso del campione. EDTA-facilitato essudazione è anche soggetto a contaminazione e potrebbe non rappresentare il floema reale composizione16. Essudazione spontanea del floema è limitato a piantare specie come cucurbitacee, lupino o yucca, dove tagliare le parti della pianta porta a un’emissione spontanea di sap floema che possono essere facilmente raccolti13,17,18, 19. Abbiamo recentemente stabilito colza (Brassica napus) come un sistema di modello adatto per l’analisi del floema, poiché è un parente stretto di a. thaliana e diversi microlitri di sap floema possono essere ottenuti da piccole incisioni che ha dimostrato di essere di elevata purezza4,8,20. Inoltre, la sequenza del genoma di b. napus è stata rilasciata nel 201421.
Ad eccezione di afide stylectomy, tutti i metodi di raccolta del floema descritti includono il danneggiamento del tessuto presso il sito di campionamento circostante e la composizione della linfa del floema può cambiare in risposta alla lesione. Pertanto è indispensabile controllare la qualità dei campioni del floema, indipendentemente dal metodo di campionamento applicato. Ci sono diversi metodi per il controllo di qualità di sap floema raccolti, ad esempio tramite determinazione di RNAsi attività22,23, RT-PCR con primer contro Rubisco8,24o l’analisi dello zucchero composizione8.
Diversi metodi per isolare e separare i complessi della proteina possono essere applicati, tra cui la cromatografia di esclusione di formato, saccarosio densità ultracentrifugazione o filtrazione del campione attraverso membrane con peso molecolare distinti taglio off. Tuttavia, questi approcci non consentono ad alta risoluzione. La tecnica chiamata PAGE nativo blu (BN-PAGE), in primo luogo descritta da Schägger et al. 25, è superiore in termini di risoluzione. È stato usato con successo per determinare i pesi molecolari dei complessi della proteina nativa grande da vari organelli o da lisati cellulari e loro abbondanze relative26,27.
Per più ulteriormente delucidare la complessa composizione dei complessi della proteina, è necessario separare i singoli componenti sotto denaturare le condizioni, che portano al completo smontaggio di componenti complessi. Ciò può essere ottenuto da una seconda dimensione di SDS-PAGE 28,29 o, per raggiungere la più alta risoluzione, da una seconda dimensione di isoelettrofocalizzazione (IEF) seguita da un third dimension di SDS-PAGE30 e la successiva identificazione di le proteine mediante spettrometria di massa.
In questo protocollo, descriviamo il campionamento di sap floema puro da b. napus piante e l’analisi dei complessi della proteina da tali esempi di floema utilizzando un approccio elettroforetico 3D combinando BN-PAGE con Tris-Tricine-urea-PAGE e SDS-PAGE. Le proteine separate componenti complessi vengono successivamente identificati mediante spettrometria di massa. Inoltre, introduciamo Macchiarsi nordico nativo blu come un metodo che permette la rilevazione di RNA in grande RNP complessi4, estendere l’applicabilità dell’approccio.
Il floema è un comparto di grande interesse, poiché costituisce la via di trasporto principali per fotoassimilati ed è anche essenziale per la segnalazione a lunga distanza tra piante diverse parti9,20,34, 35. Oltre a piccole molecole, macromolecole come proteine ed RNA sono stati implicati con manutenzione del floema e segnalazione4,7,8. L’analisi della composizione del floema è limitato dall’accessibilità limitata ai campioni del floema nella maggior parte delle specie di piante. La tecnica del mandrino dell’insetto è ampiamente applicabile, ma sperimentalmente esigenti e si traduce in quantità molto piccole di floema campioni11. Una tecnica facile utilizzata per il campionamento del floema è EDTA-facilitato essudazione12. EDTA chelata ioni bivalenti come calcio e quindi impedisce la chiusura del setaccio piastre di P-proteine e callosio. È facile da usare, ma è soggetto a contaminazione da parte di cellule danneggiate e campioni vengono diluiti. Che riducono gli ioni bivalenti con EDTA potrebbe anche portare ad una rottura dei complessi esistenti. Tuttavia, esso consente il campionamento da una vasta gamma di specie tra cui l’impianto di modello di a. thaliana15. Essudazione spontanea di sap floema si verifica solo in un piccolo numero di specie di piante. È un metodo invasivo che coinvolge la ferita significativa di pianta tessuti10. Recentemente abbiamo stabilito b. napus come una specie di modello per studiare il trasporto a lunga percorrenza4,8,20. Qui, sap floema possono essere campionati da piccole incisioni, che riduce gli effetti pungenti e fonti di contaminazione.
Utilizzando tecniche di campionamento diverso, il proteoma dei campioni del floema da diverse specie vegetali è stato studiato in anni recenti7,8,17,36,37, 38,39. Per questi studi di proteomica, proteine sono state estratte e precipitate sotto condizioni di denaturazione e pertanto non consentono conclusioni sulla proteina/proteina e proteina: interazioni acido nucleico presentano in condizioni native. Sovrapposizione dosaggi e co-immunoprecipitazione (CoIP) hanno indicato che una ribonucleoproteina principale complessa potrebbe esistere in sap floema da zucca40, ma non è stato dimostrato che qualsiasi complessi macromolecolari esistono condizioni nativo all’interno del sistema del floema.
Blu PAGE nativo, introdotta da Schägger et al. 26, in combinazione con passaggi di elettroforesi su gel ad alta risoluzione successiva attivare la separazione dei singoli componenti dei complessi della proteina grande. Usando le analisi 3D-pagina di nativo b. napus essudato del floema, recentemente potremmo dimostrare che parecchi RNP complessi e ad alto peso molecolare della proteina: esistono nei campioni del floema e sono enzimaticamente attivo4. Metodi alternativi per isolare i complessi della proteina come pure RNP come cromatografia di esclusione di formato potrebbero esistere, ma non in termini di risoluzione rispetto ai BN-PAGE. Inoltre, per una ragionevole qualità della separazione complessi, matrici di dimensione esclusione colonna devono essere adattato secondo i pesi molecolari nel complesso complessi indagati. L’analisi di complessi di diverse dimensioni richiederà pertanto diversi tipi di colonne che è costosa e non è consentito come messa a fuoco ad alta potenza come una BN-PAGE.
Passaggi critici per analizzare complessi da b. napus comprendono la quantità totale di floema sap utilizzato come materiale di partenza. Almeno 600 µ l di campione del floema sono necessari e possono essere ottenuti da cinque piante ben irrigate. Per 3D-pagina e BN Macchiarsi nordico è necessario avviare il gel BN iniziale con una quantità sufficiente di campioni del floema. Per raggiungere questo obiettivo, i campioni del floema sono concentrati fino a 20 a 30 µ g di proteina possono essere caricati in ogni bene e almeno triplici copie dello stesso campione vengono eseguiti in parallelo. Concentrazioni troppo basse o troppo alte riducono la rilevazione dei complessi (Figura 3). Floema campioni devono essere raccolti in provette di reazione sul ghiaccio e devono essere conservati congelati per un uso successivo evitare fatturato e degradazione delle proteine. Inibitori della proteasi sono stati trovati in tutti i proteomi di floema analizzati, ma anche un proteasoma pienamente attiva è stata descritta nel floema delle b. napus4. Inoltre, volume e composizione dei campioni di floema dipendono il tempo-punto di campionamento e condizioni ambientali10. Pertanto si deve prestare attenzione a raccogliere allo stesso tempo del giorno in condizioni simili. Trattamenti (ad es. la siccità) possono ridurre la quantità di floema che possa essere raccolti. Per identificare singole proteine tramite spettrometria di massa, è obbligatorio limitare contaminazioni possibili cheratina di guanti da portare tutto il tempo. Cheratina porta a segnali addizionali durante l’analisi di massa spec e ostacola l’identificazione della proteina. Esecuzione della BN-pagina ad una tensione superiore o a temperatura ambiente può portare a riscaldamento del gel che potrebbero tradursi in smontaggio dei complessi fragile.
Il protocollo qui presentato è adatto per l’analisi dei complessi proteina/proteina. Mostriamo anche che può essere utilizzato per rilevare specifici RNA contenuto nei complessi in parallelo. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo recentemente introdotto un protocollo per i BN northern blotting4. RNAs sono inclini alla degradazione da contaminazioni di RNAsi. Per limitare tale degradazione DEPC-trattati, acqua deve essere utilizzato.
Principali limitazioni del metodo presentato includono la stima del peso molecolare di complessi proteici separati da BN-PAGE, poiché il comportamento di migrazione dipende dalle dimensioni, forma e anche su modifiche di posttranslational dei complessi31, 41. Stima delle dimensioni dei complessi RNP è ancora più complicata a causa dell’influenza degli acidi nucleici sul comportamento di migrazione. Può anche non essere prevenuta che complessi della stessa dimensione co-migrano in una singola banda. Questo può portare alla previsione errata delle composizioni complesse. Pertanto verificare le interazioni osservate con tecniche complementari, ad esempio da saggi funzionali4, potrebbe essere necessario. Anche proteine solo debolmente o transitoriamente associate ad un complesso macromolecolare potrebbero essere perso in BN buffer utilizzato. Per evitare questo, campioni potrebbero essere reticolati, ciò che può anche portare a manufatti o può impedire l’identificazione della proteina, o le condizioni di buffer possono essere ottimizzate.
In contrasto con il classico 2D-PAGE, la combinazione di urea e di SDS-PAGE permette la separazione secondo idrofobicità e peso molecolare invece di punto isoelettrico (pI) e peso molecolare 28e non limita la separazione di proteine di un spettro specifico pI. Proteine simili alla classica 2D-PAGE, separate sono visibili come punti singoli, ma su una diagonale linea 4,28 (Figura 5, , Figura 6). Altre proteine idrofobiche compaiono nei punti sopra la diagonale, mentre più proteine idrofiliche si trovano sotto la linea28. Le concentrazioni di poliacrilammide utilizzate nel presente protocollo saranno ben separare le proteine tra 25 a 80 kDa. Per consentire la separazione delle proteine più piccole o più grandi il poliacrilammide concentrazione può essere variata o gel gradiente può essere utilizzato nella terza dimensione. I componenti del complesso IV (Figura 3) separati da 3D-pagina (Figura 6) sono stati tagliati fuori, tripsina digerito ed analizzati mediante spettrometria di massa. Ciò ha provocato l’identificazione di diverse ligasi di tRNA. I componenti dei altri complessi sono stati recentemente pubblicati 4. Il nostro 3D-pagina abilitata la separazione delle diverse ligasi, vale a dire aspartato, asparagina, treonina, lisina e glicina ligasi, con pesi molecolari simili (tabella 3). Utilizzando una sonda di tRNA-specific di metionina, siamo stati in grado di rilevare il tRNA potenzialmente associati all’interno del complesso IV, ma se full-length tRNA o frammenti di tRNA sono nel complesso non possono essere discriminati con le sonde utilizzate. Per verificare se gli acidi nucleici sono davvero legato all’interno del complesso e non co-migrazione, proteasi digerito sap floema campioni potrebbero servire come controlli di migrazione adatto.
Si è ipotizzato, all’inizio, che la traduzione della proteina può verificarsi all’interno di tubi cribrosi del floema, poiché quasi la maggior parte dei componenti del ribosoma intero così come i fattori di allungamento sono stati trovati nel floema campioni4,7. La nostra individuazione del tRNA e ligasi tRNA sembra supportare questa idea. Tuttavia, frammenti di tRNA presenti nei campioni del floema di zucca sono stati indicati per essere inibitori potenti di traduzione42 e ribosomi funzionali sembrano essere assenti4, suggerendo che la traduzione non può avvenire.
Presi insieme, il protocollo presentato qui consente la separazione di proteine: proteina nativa e persino RNP complessi da campioni del floema e la separazione e l’identificazione dei loro singoli componenti con alta risoluzione. L’applicazione di questo metodo consente la scoperta di nuova proteina e RNP complessi nei campioni del floema e pertanto può delucidare nuove funzioni in questo compartimento pianta altamente specializzati.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Jennifer Deke e Urszula Zarzenska per il loro sostegno scientifico. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da una sovvenzione di integrazione di carriera (CIG, 0734 PCIG14-GA-2013-63) dalla Commissione europea nell’ambito del 7 ° programma quadro, la sovvenzione LFF-GK06 ‘DELIGRAH’ (Landesforschungsförderung Hamburg) e della concessione di DFG (DFG KE 856_6-1) assegnato a JK.
1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm | BioRad | 1653359 | |
2-Propanol | AppliChem | 131090 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution | BioRad | 1610156 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution | BioRad | 1610158 | |
96 % Ethanol | Carl Roth | P075 | |
Acetic acid | Carl Roth | 6755 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate | AppliChem | 141101 | |
Ammonium peroxodisulfate (APS) | Carl Roth | 9592.3 | |
Bis-Tris | AppliChem | A3992 | |
Boric acid | AppliChem | A2940 | |
Bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
Centrifugal concentrators e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa) | Sartorius | VS0102 | |
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit | Thermo Fisher Scientific | 89880 | |
Chromatography papers e.g. 3 mm CHR | Whatman | 3030-153 | |
CoolBox M30 System | Biocision | BCS-133 | |
Coomassie brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | AppliChem | A0881 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
DNase I | AppliChem | A3778 | |
Ethanol abs. | AppliChem | A3693 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | AppliChem | A1103 | |
Gel Imaging system e.g. Chemidoc Touch | BioRad | 1708370 | |
GeneRuler 1kb plus | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | |
Glycerol | AppliChem | 141339 | |
Glycine | AppliChem | 131340 | |
Heating block TS1 | Biometra | 846-051-500 | |
Hybridization oven e.g. GFL Hybridization Incubator 7601 | GFL | 7601 | |
Hypodermic needle (0.8 mm) | B Braun | 4658309 | |
IPG gel comb, thickness 1 mm | BioRad | 1653367 | |
Labeling of RNA e.g.Biotin 3'end DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | 89818 | |
Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4–16% Bis-Tris protein gel | Invitrogen | BN1002BOX | |
Nylon membrane e.g. Hybond-N+ | Amersham Pharmacia | RPN203B | |
Ortho-phosphoric acid | Carl Roth | 6366.1 | |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
Power supply for Gel electrophoresis EPS | Amersham Pharmacia | 18-1130-01 | available from GE Healthcare |
RNA Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi dry Blot | Biometra | 846-015-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | AppliChem | A1149 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | AppliChem | 142363 | |
Synthesis of cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | AppliChem | A1148 | |
Tricine | AppliChem | A3954 | |
Tris | AppliChem | A1086 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | AppliChem | A3901 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer | Thermo Fisher Scientific | AM8670 | |
Urea | AppliChem | A1360 | |
UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400 | Agilent | NC0477671 | from Fisher Scientific |
Vertical electrophoresis apparatus e.g.The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System | Thermo Fisher Scientific or BioRad | EI0001 or 1658004 | |
Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 |