Her præsenterer vi en protokol til at analysere store nativt protein: protein og protein protein sammensætning: nukleinsyre komplekser fra raps (B. napus) phloem ekssudat ved hjælp af en 3D polyacrylamid gel elektroforese (side) tilgang ved at kombinere blå Native (BN) med to denaturering sider efterfulgt af massespektrometriske identifikation.
Prøveudtagning phloem af højere planter er ofte besværlig og betydeligt afhængig af plantearter. Dog kan proteomet studier under denatureringen betingelser opnås i forskellige plantearter. Nativt protein: protein og protein: nukleinsyre komplekser fra phloem prøver har endnu næppe blevet analyseret, selv om de kunne spille en vigtig rolle i opretholdelsen af denne specialiserede rum eller i langdistance signalering. Store Molekylær forsamlinger kan isoleres ved hjælp af en blå indfødte gelelektroforese (BN-side). Deres proteinkomponenter kan være adskilt af en efterfølgende dodecyl natriumsulfat (SDS-side). Dog overføre proteiner med lignende molekylære vægte Co, hvad kan hindre protein identifikation af massespektrometri. Kombinere BN-side med to forskellige denaturering gel elektroforese trin, nemlig Tris-Tricine-urea og SDS-PAGE, giver mulighed for en yderligere adskillelse af proteiner efter deres hydrofiliciteten/hydrophobicity og dermed øger opløsning og succes af protein identifikation. Det tillader selv adskille proteiner, der kun afviger i deres posttranslationelle modifikationer. Derudover kan blå indfødte nordlige blotting anvendes til at identificere RNA komponenterne i makromolekylære komplekser. Vi viser at vores protokol er egnet til at optrævle proteiner og RNA komponenter af nativt protein: protein og ribonucleoprotein (RNP) komplekser forekommer i phloem prøver. Kombinere en blå indfødte side med to forskellige denaturering side trin kan bidrage til at adskille forskellige slags store proteinkomplekser, og også giver mulighed for en øget identifikation sats af deres komponenter af massespektrometri. Derudover er protokollen robust nok til samtidig registrerer potentielt bundne nukleinsyrer inden for enkelt proteinkomplekser.
De lange afstande ledningsanlæg af phloem er afgørende for tildelingen af organiske næringsstoffer i højere planter, men er også involveret i reguleringen af mange forskellige processer vigtigt for vækst og udvikling, patogen forsvar og tilpasning til den negative miljøforhold. Udover lille effektorer som ioner, Phytohormoner eller metabolitter, selv, er makromolekyler såsom proteiner og RNA’er for nylig dukket op som potentielle signaler.
Undersøgelser har vist at phloem lastning af proteiner er størrelse afhængige og kontrolleret af den udelukkelse størrelsesgrænsen (SEL) af de pore-plasmodesmal enheder, der forbinder følgesvend celler (CC) og sigten elementer (SE), som er typisk i rækken af 10 til > 67 kDa1 , 2 , 3. dog trods disse størrelse begrænsninger større proteiner og protein komplekser er blevet fundet i phloem systemet udfordrende idé om størrelse udstødelse4, og selv uspecifik tab af proteiner fra CC til SE har været foreslået5 .
Multiprotein samt store ribonucleoprotein komplekser spille centrale roller i biosyntese og opretholde den strukturelle integritet af celle6. Der er beviser for at phloem-mobile protein-protein og ribonucleoprotein komplekser eksisterer4,7, men hidtil vides lidt om deres funktion. I phloem si elementer har været impliceret protein: protein og RNP komplekser med transport over lange afstande og / eller signaling8,9. Der kræves for at optrævle de omplantede komplekser, at studere sammensætning under forskellige miljømæssige funktioner eller stress betingelser. For at opnå dette, indfødte komplekser skal isoleres, og deres komponenter skal være adskilt med tilstrækkelig opløsning.
For at isolere høj molekylvægt komplekser fra i phloem, er det nødvendigt først at få sap prøver i tilstrækkelig kvalitet og mængde. Den teknik, der kan bruges til phloem prøveudtagning afhænger af plantearter af interesse. Tre vigtigste metoder til at opnå phloem sap findes 10: insekt stylectomy11, EDTA-faciliteret udsondring12og spontane udsondring13.
Phloem prøver fra Arabidopsis thaliana (A. thaliana), den store model plante i laboratorier verden over, kan kun opnås af EDTA-faciliteret udsondring eller bladlus stylectomy14,15. Begge metoder fører til enten stærkt fortyndede phloem sap eller meget lav prøve beløb. EDTA-faciliteret udsondring er også udsat for forurening og kan ikke repræsentere virkelige phloem sammensætning16. Spontan phloem udsondring er begrænset til at plante arter som Cucurbitæ, Lupin eller yucca, hvor afskære plantedele fører til en spontan emission af phloem sap, der kan være let indsamlet13,17,18, 19. Vi for nylig har etableret raps (Brassica napus) som en passende modelsystem for phloem analyse, da det er en nær slægtning af A. thaliana og flere microliters af phloem sap kan fås fra små indsnit, der har vist sig at være af høj renhed4,8,20. Derudover blev B. napus genomet sekvens udgivet i 201421.
Bortset fra bladlus stylectomy, alle phloem samling metoder beskrevet omfatter skader på omkringliggende væv i stedet for prøveudtagning og sammensætningen af phloem sap kan ændre som reaktion på skade. Derfor er det absolut nødvendigt at kontrollere kvaliteten af phloem prøver, uanset den prøveudtagningsmetode anvendes. Der findes forskellige metoder til kontrol med kvaliteten af indsamlede phloem sap, f.eks. ved bestemmelse af RNase aktivitet22,23, RT-PCR med primere mod Rubisco8,24eller analyse af sukker sammensætning8.
Forskellige metoder til at isolere og adskille proteinkomplekser kan anvendes, herunder størrelse udstødelse kromatografi, saccharose tæthed ultracentrifugering eller prøve filtrering gennem membraner med særskilte molekylvægt cut offs. Men disse metoder ikke tillader høj opløsning. Teknik kaldet blå indfødte side (BN-side), første gang beskrevet af Schägger al.. 25, er overlegen i forhold til opløsning. Det blev med held bruges til at bestemme Molekylær vægten af store nativt proteinkomplekser fra forskellige organeller eller cellulære lysates og deres relative mængder26,27.
Du kan yderligere belyse den komplekse sammensætning af proteinkomplekser, er det nødvendigt at adskille de enkelte komponenter under denatureringen betingelser, fører til komplet demontering af de komplekse komponenter. Dette kan opnås ved en anden dimension af SDS-PAGE 28,29 , eller for at opnå højere opløsning, af en anden dimension af isoelektrisk fokusering (IEF) efterfulgt af en third dimension af SDS-PAGE30 og efterfølgende identifikation af proteiner ved hjælp af massespektrometri.
I denne protokol beskriver vi prøveudtagning af ren phloem sap fra B. napus planter og analyse af proteinkomplekser fra sådanne phloem prøver ved hjælp af en 3D elektroforese tilgang kombinerer BN-side med Tris-Tricine-urea-side og SDS-PAGE. Adskilte protein komplekse komponenter er efterfølgende identificeret ved hjælp af massespektrometri. Derudover indføre vi blå indfødte nordlige blotting som metode giver mulighed for påvisning af RNA’er i store RNP komplekser4, udvide anvendeligheden af tilgangen.
Phloem er et rum af stor interesse, eftersom det udgør den store transportrute for photoassimilates, og er også afgørende for langdistance signalering mellem forskellige plante dele9,20,34, 35. Ud over små molekyler, har makromolekyler såsom proteiner og RNA’er været impliceret med phloem vedligeholdelse og signalering4,7,8. Analyse af phloem sammensætning er begrænset af begrænset tilgængelighed til phloem prøver i de fleste plantearter. Insekt stylet teknik er almindeligt gældende, men eksperimentelt krævende og resulterer i meget små mængder af phloem prøver11. En nem teknik, der anvendes til phloem prøveudtagning er EDTA-faciliteret udsondring12. EDTA chelaterer divalent ioner som Calcium og dermed forhindrer lukning af sien plader af P-proteiner og callose. Det er let at bruge, men er udsat for forurening af beskadigede celler og prøverne fortyndes. Nedbryder divalent ioner af EDTA kan også føre til en opdeling af eksisterende komplekser. Det giver imidlertid mulighed for prøvetagning fra en bred vifte af arter, herunder model plante A. thaliana15. Spontan udsondring af phloem sap kun opstår i et lille antal plantearter. Det er en invasiv metode, der involverer betydelig skade plante væv10. Vi har for nylig etableret B. napus som en model art for at studere fjerntransport4,8,20. Her, kan phloem sap udtages fra små indsnit, hvilket reducerer såret effekter og kilder til forurening.
Bruger forskellige stikprøver, proteomet phloem prøver fra forskellige plantearter er blevet undersøgt i de seneste år7,8,17,36,37, 38,39. For undersøgelserne proteomet proteiner blev udvundet og udfældet under denatureringen betingelser og derfor ikke tillader konklusioner om protein: protein og protein: nukleinsyre interaktioner præsentere indfødte betingelser. Co-immunoprecipitation (CoIP) og overlay assays er angivet, et stort ribonucleoprotein kompleks kan findes i phloem sap fra græskar40, men det blev ikke påvist, at enhver makromolekylære komplekser eksisterer indfødte betingelser inden for de Phloem system.
Blå indfødte side, indført af Schägger et al. 26, i kombination med efterfølgende høj opløsning gel elektroforese trin aktiverer adskillelse af de enkelte komponenter i store proteinkomplekser. Ved hjælp af 3D-side analyser af indfødte B. napus phloem ekssudat, vi kunne for nylig viser, at flere høj molekylvægt protein: protein og RNP komplekser eksisterer i phloem prøver og er enzymatisk aktive4. Alternative metoder til at isolere proteinkomplekser samt RNPs som størrelse udstødelse kromatografi kan findes, men ikke i form af opløsning i forhold til mia-side. Desuden for en rimelig kvalitet af komplekse adskillelse skulle størrelse udstødelse kolonne matricer tilpasses efter de samlede komplekse Molekylær vægte undersøges. Analysere komplekser af forskellige størrelse vil derfor kræve forskellige typer af kolonner, der er omkostningseffektiv intensiv og tillader ikke som høj fokus magt som en BN-side.
Kritiske trin til at analysere komplekser fra B. napus omfatter det samlede beløb af phloem sap anvendes som materiale. Mindst 600 µL af phloem prøve er nødvendig og kan fås fra fem godt vandes planter. For 3D-side og BN nordlige blotting er det nødvendigt at starte den første mia gel med en tilstrækkelig mængde af phloem prøver. For at opnå dette, er phloem prøver koncentreret indtil 20-30 µg protein kan indlæses i hver godt og mindst tre af samme prøve køres parallelt. For lavt eller for højt koncentrationer reducere afsløring for komplekser (figur 3). Phloem prøver skal indsamles i reaktion rør på is og bør opbevares til senere brug til at undgå protein nedbrydning og omsætning i frossen stand. Proteasehæmmere er blevet fundet i alle phloem proteomes analyseret, men også en fuldt aktiv proteasom blev beskrevet i phloem B. napus4. Desuden, mængde og sammensætning af phloem prøver afhænger indsamlingspunkt tid og miljøforhold10. Derfor skal sikres at samle på det samme tidspunkt på dagen under lignende forhold. Stressbehandlinger (fx tørke) kan reducere mængden af phloem, som kan blive indsamlet. For at identificere enkelt proteiner ved massespektrometri, er det obligatorisk at begrænse mulige keratin forureninger af iført handsker hele tiden. Keratin fører til yderligere signaler under masse spec analyse og hæmmer protein identifikation. Kører BN-side til en højere spænding eller ved stuetemperatur kan føre til opvarmning af gel, som kan resultere i demontering af skrøbelige komplekser.
Protokollen præsenteres her er velegnet til analyse af protein: protein komplekser. Vi viser også, at det kan bruges til at registrere specifikke RNA’er indeholdt i komplekser parallelt. For at opnå dette, indført vi for nylig en protokol for BN nordlige blotting4. RNA’er er udsat for nedbrydning af RNAse forureninger. For at begrænse sådanne nedbrydning DEPC-behandlet, vand skal bruges.
Vigtigste begrænsninger af metoden præsenteres omfatter vurdering af proteinkomplekser adskilt af BN-side, da migration adfærd afhænger af størrelse, form og endda posttranslationelle modifikationer af komplekser31, molekylvægt 41. Størrelse estimering af RNP komplekser er endnu mere kompliceret på grund af påvirkning af nukleinsyrer migration adfærd. Det kan også ikke undgås at komplekser af samme størrelse Co vandrer i én enkelt band. Dette kan føre til fejlagtige forudsigelse af komplekse kompositioner. Derfor kontrollere observerede samspillet med supplerende teknikker, kan fx af funktionelle assays4, være nødvendig. Også kan proteiner kun svagt eller forbigående tilknyttet et makromolekylære kompleks gå tabt i den BN buffer, der bruges. For at undgå dette, prøver kunne være crosslinked, hvad kan også føre til artefakter eller kan forhindre protein identifikation, eller buffer betingelser kan optimeres.
I modsætning til klassisk 2D-side, kombinationen af urinstof – og SDS-PAGE giver mulighed for adskillelse efter hydrophobicity og Molekylær vægt i stedet for isoelektriske punkt (pI) og molekylvægt 28, og begrænser ikke adskillelse til proteiner af en specifikke pI rækkevidde. Svarer til klassisk 2D-PAGE, adskilt proteiner er synlig som indre steder, men på en diagonal linje 4,28 (figur 5, figur 6). Flere hydrofobe proteiner vises i steder over denne diagonal, mens mere hydrofile proteiner findes under linje28. Polyacrylamid koncentrationerne anvendes i denne protokol vil adskille proteiner mellem 25-80 kDa godt. For at tillade en adskillelse af mindre eller større proteiner polyacrylamid koncentration kan varieres eller gradient gel kan bruges i den tredje dimension. Komponenter af komplekse IV (figur 3) adskilt af 3D-side (figur 6) var skåret ud, trypsin fordøjes, og analyseret af massespektrometri. Dette resulterede i identifikation af flere tRNA ligases. Komponenterne i de andre komplekser er blevet offentliggjort for nylig 4. Vores 3D-side aktiveret adskillelse af forskellige ligases, nemlig aspartat, asparagin, threonin, lysin og glycin ligases, med lignende molekylære vægte (tabel 3). Bruger en methionin tRNA-specifikke sonde, vi var i stand til at opdage potentielt bundne tRNA inden for komplekse IV, men hvis fuld længde tRNA eller tRNA fragmenter er i komplekset kan ikke blive diskrimineret med sonder anvendes. For at kontrollere, hvis nukleinsyrer er virkelig bundet i komplekset og ikke Co migrerer, protease fordøjet phloem sap kan prøver tjene som passende migration kontrolelementer.
Det er blevet spekuleret tidligere, at protein oversættelse kan forekomme inden for phloem si rør, da næsten de fleste komponenter af hele ribosomet samt brudforlængelse faktorer er blevet fundet i phloem prøver4,7. Vores konklusion af tRNA og tRNA ligases synes at støtte denne idé. Men tRNA fragmenter findes i phloem prøver fra græskar har vist sig at være potente hæmmere af oversættelse42 og funktionelle ribosomer synes at være fraværende4, tyder på, at oversættelsen ikke kan finde sted.
Tilsammen, tillader protokollen præsenteres her magtens nativt protein: protein og endda RNP komplekser fra phloem prøver og adskillelse og identifikation af deres individuelle komponenter med høj opløsning. Anvendelsen af denne metode gør det muligt for opdagelsen af roman protein og RNP komplekser i phloem prøver og kan derfor belyse nye funktioner i denne højt specialiserede anlæg rum.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jennifer Deke og Urszula Zarzenska for deres videnskabelig støtte. Dette arbejde blev støttet økonomisk af en karriere Integration Grant (CIG, PCIG14-GA-2013-63 0734) ved Europa-Kommissionen inden for programmet 7. rammer, grant LFF-GK06 ‘DELIGRAH’ (Landesforschungsförderung Hamborg) og DFG grant (DFG KE 856_6-1) tildeles JK.
1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm | BioRad | 1653359 | |
2-Propanol | AppliChem | 131090 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution | BioRad | 1610156 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution | BioRad | 1610158 | |
96 % Ethanol | Carl Roth | P075 | |
Acetic acid | Carl Roth | 6755 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate | AppliChem | 141101 | |
Ammonium peroxodisulfate (APS) | Carl Roth | 9592.3 | |
Bis-Tris | AppliChem | A3992 | |
Boric acid | AppliChem | A2940 | |
Bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
Centrifugal concentrators e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa) | Sartorius | VS0102 | |
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit | Thermo Fisher Scientific | 89880 | |
Chromatography papers e.g. 3 mm CHR | Whatman | 3030-153 | |
CoolBox M30 System | Biocision | BCS-133 | |
Coomassie brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | AppliChem | A0881 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
DNase I | AppliChem | A3778 | |
Ethanol abs. | AppliChem | A3693 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | AppliChem | A1103 | |
Gel Imaging system e.g. Chemidoc Touch | BioRad | 1708370 | |
GeneRuler 1kb plus | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | |
Glycerol | AppliChem | 141339 | |
Glycine | AppliChem | 131340 | |
Heating block TS1 | Biometra | 846-051-500 | |
Hybridization oven e.g. GFL Hybridization Incubator 7601 | GFL | 7601 | |
Hypodermic needle (0.8 mm) | B Braun | 4658309 | |
IPG gel comb, thickness 1 mm | BioRad | 1653367 | |
Labeling of RNA e.g.Biotin 3'end DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | 89818 | |
Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4–16% Bis-Tris protein gel | Invitrogen | BN1002BOX | |
Nylon membrane e.g. Hybond-N+ | Amersham Pharmacia | RPN203B | |
Ortho-phosphoric acid | Carl Roth | 6366.1 | |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
Power supply for Gel electrophoresis EPS | Amersham Pharmacia | 18-1130-01 | available from GE Healthcare |
RNA Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi dry Blot | Biometra | 846-015-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | AppliChem | A1149 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | AppliChem | 142363 | |
Synthesis of cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | AppliChem | A1148 | |
Tricine | AppliChem | A3954 | |
Tris | AppliChem | A1086 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | AppliChem | A3901 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer | Thermo Fisher Scientific | AM8670 | |
Urea | AppliChem | A1360 | |
UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400 | Agilent | NC0477671 | from Fisher Scientific |
Vertical electrophoresis apparatus e.g.The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System | Thermo Fisher Scientific or BioRad | EI0001 or 1658004 | |
Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 |