Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Proteinzusammensetzung von großen native Protein: Protein und Protein zu analysieren: Nukleinsäure-komplexe aus Raps (B. Napus) Phloem Exsudat mit einem 3D Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) Ansatz kombiniert blau Native (BN) mit zwei denaturierenden Seiten gefolgt von massenspektrometrische Identifizierung.
Probenahme das Phloem der höheren Pflanzen ist oft mühsam und wesentlich abhängig von der Pflanzenart. Proteom-Studien unter denaturierenden Bedingungen konnte jedoch in verschiedenen Pflanzenarten erreicht werden. Nativen Protein: Protein und Eiweiß: Nukleinsäure-komplexe aus Bast Proben noch kaum analysiert wurden, obwohl sie eine wichtige Rolle in der Wartung von diesem spezialisierten Fach oder im Fernverkehr Signalisierung spielen könnte. Große molekularen Baugruppen können isoliert mit einer blauen gebürtige Gelelektrophorese (BN-Seite) werden. Ihre Proteinkomponenten können durch eine anschließende Natriumsulfat der Dodecyl Seite (SDS-PAGE) getrennt werden. Allerdings migrieren Co Proteine mit ähnlichen Molekulargewichten, was kann Proteinidentifikation durch Massenspektrometrie behindern. Kombination von BN-Seite mit zwei verschiedenen Geruchsstoffen Gel-Elektrophorese Schritten, nämlich Tris-Tricine-Harnstoff und SDS-PAGE, ermöglicht die weitere Trennung der Proteine nach ihrer Hydrophilie/Hydrophobie und erhöht somit Auflösung und den Erfolg der Proteinidentifizierung. Es erlaubt sogar die Proteine, die unterscheiden sich nur in ihrer posttranslationale Modifikationen zu unterscheiden. Darüber hinaus kann blau native Nordbeflecken angewendet werden, um die RNA-Komponenten in makromolekulare komplexe zu identifizieren. Wir zeigen, dass unser Protokoll geeignet, das Protein und die RNA-Komponenten von nativen Protein: Protein und Ribonucleoprotein (RNP) komplexe im Phloem Proben zu entwirren. Kombination von einem blauen native Seite mit zwei verschiedenen Geruchsstoffen Seite Schritte kann dazu beitragen, um verschiedene Arten von großer Proteinkomplexe zu trennen und ermöglicht auch eine höhere Erkennungsrate von deren Komponenten durch Massenspektrometrie. Darüber hinaus ist das Protokoll robust genug, um gleichzeitig potenziell gebundenen Nukleinsäuren in einzelne Protein-komplexe erkennen.
Die Langstrecken das Phloem-Conduits sind essentiell für die Verteilung von Nährstoffen in höheren Pflanzen, sondern sind auch beteiligt bei der Regulierung der vielen verschiedener Prozessen wichtig für Wachstum und Entwicklung, Erreger Verteidigung und die Anpassung an den negativen Umweltbedingungen. Neben kleinen Effektoren wie Ionen, Phytohormonen oder Metaboliten selbst sind Makromoleküle wie Proteine und RNA als potentielle Signale vor kurzem entstanden.
Studien haben gezeigt, dass Phloem Laden von Proteinen Größe abhängig und kontrollierten durch Ausgrenzung Größenbeschränkung (SEL) der Pore-plasmodesmal Einheiten verbinden Begleiter Zellen (CC) und sieben Elemente (SE), die typischerweise im Bereich von 10 bis > 67 kDa1 , 2 , 3. jedoch trotz dieser Größe Beschränkungen größere Proteine und Protein komplexe innerhalb des Systems der Phloem herausfordernde Idee der Größe Ausgrenzung4gefunden wurden, und auch unspezifische Verlust von Proteinen aus CC SE wurde vorgeschlagen5 .
Multi sowie große Ribonucleoprotein komplexe spielen entscheidende Rolle bei der Biosynthese und Aufrechterhaltung der strukturellen Integritätdes der Zelle6. Es gibt Hinweise darauf, dass Protein-Protein und Ribonucleoprotein komplexe Phloem-Mobile gibt es4,7, aber bisher ist wenig über ihre Funktion bekannt. Im Phloem Siebelemente Protein: Protein und RNP-komplexe mit Fernverkehr und / oder Signalisierung8,9verwickelt. Um die Funktionen der translozierten komplexe, studieren ihre Zusammensetzung unter verschiedenen ökologischen zu entwirren oder stress Bedingungen ist erforderlich. Um dies zu erreichen, haben einheimische komplexe isoliert werden und ihre Komponenten mit ausreichender Auflösung getrennt werden.
Um hohen Molekulargewicht komplexe aus dem Phloem zu isolieren, ist es zunächst notwendig zu SAP-Proben in ausreichender Qualität und Menge zu erhalten. Die Technik, die für Phloem Probenahme verwendet werden kann hängt von der Pflanzenart von Interesse. Drei Hauptmethoden, Phloem Sap zu erhalten gibt es 10: Insekt Stylectomy11, EDTA erleichtert Exsudation12und spontane Exsudation13.
Phloem Proben von Arabidopsis Thaliana (A. Thaliana), der wichtigsten Modellpflanze in Laboren weltweit, erhalten Sie nur durch EDTA erleichtert Exsudation oder Blattlaus Stylectomy14,15. Beide Methoden führen zu stark verdünnte Phloem Sap oder sehr niedrigen Probe Beträge. EDTA-erleichtert Exsudation ist auch anfällig für Verschmutzung und kann nicht die reale Phloem Zusammensetzung16darstellen. Spontane Phloem Exsudation beschränkt sich auf Pflanzenarten wie Kürbisgewächse, Lupine oder Yucca, wohin führt Pflanzenteile abschneiden, eine spontane Emission von Phloem Sap, die leicht erhobenen13,17,18werden können, 19. Wir vor kurzem errichtet Raps (Brassica Napus) als Modellsystem für Phloem Analyse geeignet, denn es ist ein naher Verwandter von A. Thaliana und mehrere Mikroliter der Phloem Sap kann erfragt werden kleine Einschnitte, die gezeigt wurden sein hoher Reinheit4,8,20. Darüber hinaus wurde die Genomsequenz B. Napus 201421veröffentlicht.
Mit Ausnahme der Blattlaus Stylectomy alle Phloem Erhebungsmethoden beschrieben gehören Beschädigung des umgebenden Gewebes am Ort der Probenahme und die Zusammensetzung der Phloem Sap variieren in Reaktion auf eine Verletzung. Daher ist es unerlässlich, um die Qualität von Phloem Proben, unabhängig von der Sampling-Methode angewendet. Es gibt verschiedene Methoden zur Qualitätskontrolle von gesammelten Phloem Sap, z.B. durch Bestimmung der RNase Aktivität22,23, RT-PCR mit Primer gegen Rubisco8,24, oder die Analyse des Zuckers Zusammensetzung-8.
Verschiedene Methoden zu isolieren und zu trennen Proteinkomplexe aufgebracht werden können, einschließlich Größe Ausgrenzung Chromatographie, Saccharose Dichte Ultrazentrifugation oder Probenfiltration durch Membranen mit unterschiedlichen Molekulargewicht Cut Offs. Allerdings erlauben diese Ansätze keine hohen Auflösung. Die Technik namens blau native Seite (BN-Seite), erstmals von Schägger Et al.beschrieben. 25, ist überlegen in Bezug auf Auflösung. Es wurde erfolgreich verwendet, um festzustellen, die Molmassen von großen systemeigene Proteinkomplexen aus verschiedenen Organellen oder zellulären Lysates und ihre relativen Häufigkeiten26,27.
Um die komplexe Zusammensetzung von Proteinkomplexen weiter zu erhellen, ist es notwendig, die einzelnen Komponenten unter denaturierenden Bedingungen führt zu komplette Demontage komplexer Bauteile zu trennen. Dies kann durch eine zweite Dimension der SDS-PAGE 28,29 oder höheren Auflösung, durch eine zweite Dimension der isoelektrischen Fokussierung (IEF) gefolgt von einer Third dimension von SDS-PAGE30 und spätere Identifikation der zu erreichen die Proteine mittels Massenspektrometrie.
In diesem Protokoll beschreiben wir Probenahme von reinen Phloem-Saft von B. Napus Pflanzen und die Analyse von Proteinkomplexen aus solchen Phloem Proben mit einem 3D elektrophoretischen Ansatz BN-Seite mit Tris-Tricine-Harnstoff-PAGE und SDS-PAGE zu verbinden. Die getrennten Protein komplexen Bauteile werden anschließend durch Massenspektrometrie identifiziert. Darüber hinaus führen wir als eine Methode, die Erkennung von RNAs in großen RNP-komplexe4blau native Nordbeflecken erweitert die Anwendbarkeit des Ansatzes.
Das Phloem ist ein Fach von großem Interesse, da es den wichtigsten Transportweg für Photoassimilates bildet, und auch ist für Langstrecken Signalisierung zwischen verschiedenen pflanzlichen Teile9,20,34, 35. Neben kleinen Molekülen haben Makromoleküle wie Proteine und RNA mit Phloem Wartung und Signalisierung4,7,8verwickelt. Die Analyse der Zusammensetzung der Phloem ist durch die eingeschränkte Erreichbarkeit auf Phloem Proben in den meisten Pflanzenarten beschränkt. Die Insekten Mandrin Technik ist vielseitig einsetzbar, sondern experimentell anspruchsvoll und resultiert in sehr geringen Mengen von Phloem Proben11. Eine einfache Technik zum Phloem Probenahme ist EDTA erleichtert Exsudation12. EDTA bilden zweiwertige Ionen wie Calcium und verhindert somit Schließung der Sieb Platten von P-Proteine und Zellstress. Es ist einfach zu bedienen, aber ist anfällig für Verunreinigungen durch beschädigte Zellen und Proben verdünnt. Abbauende zweiwertige Ionen durch EDTA könnte auch zu einem Zusammenbruch der bestehenden Anlagen führen. Allerdings ermöglicht es Probenahme aus einer Vielzahl von Arten, einschließlich der Modellpflanze A. Thaliana15. Spontane Exsudation von Phloem Sap tritt nur in einer kleinen Anzahl von Pflanzenarten. Es ist eine invasive Methode, die erheblichen Verletzungen der Pflanze Gewebe10beinhaltet. Vor kurzem haben wir als eine Art Modell für das Studium Fernverkehr4,8,20 B. Napus etabliert. Hier können Sie Phloem Sap von kleinen Einschnitten, probieren die Verwundung Effekte und Kontaminationsquellen reduziert.
Verwenden verschiedene Stichprobenverfahren, das Proteom von Phloem Proben aus verschiedenen Pflanzenarten wurde untersucht in den letzten Jahren7,8,17,36,37, 38,39. Für diese Studien Proteom Proteine wurden extrahiert und unter denaturierenden Bedingungen ausgefällt und erlauben daher keinerlei Rückschlüsse auf Protein: Protein und Protein: Nukleinsäure-Interaktionen unter heimischen Bedingungen zu präsentieren. Co-Immunopräzipitation (CoIP) und Overlay-Assays zeigten, dass eine große Ribonucleoprotein komplexe könnte im Phloem-Saft von Kürbis40vorhanden, aber es nicht nachgewiesen wurde, dass makromolekulare komplexe unter heimischen Bedingungen innerhalb existieren der Phloem-System.
Blaue native Seite, eingeführt durch Schägger Et al. 26, in Kombination mit weiteren hochauflösenden Gel-Elektrophorese Schritte ermöglichen die Trennung der einzelnen Komponenten der große Proteinkomplexe. Mit 3D-Seite Analysen der native B. Napus Phloem Exsudat, konnten wir kürzlich zeigen, dass mehrere im Phloem Proben existieren hohen Molekulargewicht Protein: Protein und RNP-komplexe enzymatisch aktive4 sind. Alternative Methoden um Proteinkomplexe sowie RNPs zu isolieren, wie Größe Ausgrenzung Chromatographie existieren könnte, aber nicht in Bezug auf Auflösung im Vergleich zu BN-Seite. Darüber hinaus für eine angemessene Qualität der komplexen Trennung müssen Größe Ausgrenzung Spalte Matrizen die insgesamt komplexer Molekulargewichte untersucht angepasst werden. Analysieren komplexe unterschiedlicher Größe werden daher fordern verschiedene Typen von Spalten ist kostenintensiv und lässt sich nicht als hohe Fokussierung macht als BN-Seite.
Wichtige Schritte um komplexe aus B. Napus zu analysieren sind den Gesamtbetrag der Phloem Sap als Ausgangsmaterial verwendet. Mindestens 600 µL Phloem Probe sind notwendig und können aus fünf gut-gewässerten Pflanzen gewonnen werden. Für 3D-Seite und BN Nordbeflecken ist es notwendig, das erste BN-Gel mit einer ausreichenden Menge von Phloem Proben beginnen. Um dies zu erreichen, sind Phloem Proben konzentriert, bis gut und mindestens 20 bis 30 µg Protein in jeder geladen werden kann, dass Triplicates der gleichen Probe parallel ausgeführt werden. Zu niedrige oder zu hohe Konzentrationen reduzieren die Erkennung von komplexen (Abbildung 3). Phloem Proben müssen in Reaktionsgefäßen auf Eis gesammelt und eingefroren für die spätere Verwendung zur Vermeidung von Proteinabbau und Umsatz gespeichert werden soll. Protease-Inhibitoren sind in allen Phloem Proteome analysiert gefunden worden, aber auch ein vollaktives Proteasom in das Phloem von B. Napus4beschrieben wurde. Darüber hinaus abhängig von Volumen und Zusammensetzung Phloem Proben die Sampling-Zeit-Punkt und Umweltbedingungen10. Daher muss darauf geachtet werden, zur gleichen Zeit des Tages unter ähnlichen Bedingungen zu sammeln. Stress-Behandlungen (z.B. Trockenheit) reduzieren die Menge der Bast, die gesammelt werden können. Um einzelne Proteine durch Massenspektrometrie zu identifizieren, ist es zwingend erforderlich, um mögliche Keratin Verunreinigungen durch tragen von Handschuhen die Zeit zu begrenzen. Keratin führt zu zusätzlichen Signale während der Masse Spec Analyse und Proteinidentifikation behindert. Ausführen der BN-Seite an eine höhere Spannung oder bei Raumtemperatur führen zur Erwärmung des Gels, die Demontage der fragilen komplexe führen können.
Die hier vorgestellten Protokoll eignet sich für die Analyse von Protein: Protein-komplexe. Wir zeigen auch, dass es verwendet werden kann, um bestimmte RNAs enthalten in den komplexen parallel zu erkennen. Um dies zu erreichen, haben wir vor kurzem ein Protokoll für northern Blot-4BN eingeführt. RNAs sind anfällig für Abbau durch RNAse Verunreinigungen. Um diesen Abbau zu begrenzen sollte DEPC-behandelte Wasser verwendet werden.
Wichtigste Einschränkungen der vorgestellten Methode gehören die Schätzung des Molekulargewichtes von Proteinkomplexen getrennt von BN-Seite, da Migrationsverhalten auf Größe, Form und auch posttranslationale Modifikationen der komplexe31abhängt, 41. Abschätzung der Größe der RNP-komplexe ist noch komplizierter durch den Einfluss von Nukleinsäuren auf das Migrationsverhalten. Es kann auch nicht verhindert werden, dass komplexe gleicher Größe in einem einzigen Band Co migrieren. Dies führt zu der falschen Vorhersage von komplexen Kompositionen. Überprüfen daher die beobachteten Interaktionen mit komplementären Techniken, kann z. B. durch funktionelle Assays4, erforderlich sein. Auch verloren nur schwach oder vorübergehend zu einem makromolekulare Komplex verbundenen Proteine in der BN-Puffer verwendet. Um dies zu vermeiden, könnte Proben vernetzt, was auch zu Artefakten führen können oder nicht Proteinidentifikation, oder der Pufferbedingungen optimiert werden.
Im Gegensatz zu klassischen 2D-Seite, die Kombination von Harnstoff und SDS-PAGE ermöglicht die Trennung nach Hydrophobie und Molekulargewicht statt isoelektrischen Punkt (pI) und Molekulargewicht 28, und schränkt nicht die Trennung an Proteine von einem spezifische pI reichen. Ähnlich wie bei klassischen 2D-Seite, getrennten Proteine sind als einzelne Flecken sichtbar, aber auf einer diagonalen Linie 4,28 (Abbildung 5, Abbildung 6). Weitere hydrophobe Proteine erscheinen in Flecken über diese Diagonal, während mehr hydrophile Proteine sich unterhalb der Linie28 befinden. In diesem Protokoll verwendeten Polyacrylamid-Konzentrationen werden Proteine zwischen 25 bis 80 kDa gut zu trennen. Ermöglicht einer Trennung von kleineren oder größeren Proteinen die Polyacrylamid Konzentration variiert werden oder Farbverlauf Gele eingesetzt werden, in der dritten Dimension. Die Komponenten des komplexen IV (Abbildung 3) getrennt durch 3D-Seite (Abbildung 6) wurden ausgeschnitten, Trypsin verdaut und durch Massenspektrometrie analysiert. Dies führte bei der Identifizierung von mehreren tRNA Ligases. Die Komponenten der anderen Anlagen wurden vor kurzem veröffentlicht 4. Unsere 3D-Seite aktiviert die Trennung der verschiedenen Ligases, nämlich Aspartat-, Asparagin, Threonin, Lysin und Glycin Ligases mit ähnlichen Molekulargewichten (Tabelle 3). Mit einer Methionin-tRNA-spezifische-Sonde, wir konnten potenziell gebundene tRNA innerhalb komplexer IV erkennen, aber wenn in voller Länge tRNA oder tRNA Fragmente in der Anlage sind kann nicht mit den Sonden verwendet diskriminiert werden. Um zu überprüfen, wenn die Nukleinsäuren wirklich gefesselt innerhalb des Komplexes und Co nicht migrieren sind, Protease Phloem Sap verdaut können Proben als geeignete Migration Kontrollen dienen.
Es wurde bereits spekuliert, dass Protein Übersetzung im Phloem Sieb Röhren, auftreten kann, da fast die meisten Komponenten der gesamten Ribosom sowie Dehnung Faktoren im Phloem Proben4,7gefunden worden sind. Unsere Feststellung der tRNA und tRNA Ligases scheint diese Idee zu unterstützen. Allerdings tRNA Fragmente vorhanden im Phloem Proben aus Kürbis haben gezeigt, dass potente Inhibitoren der Übersetzung42 werden und funktionelle Ribosomen scheinen zu fehlen4, was darauf hindeutet, dass die Übersetzung nicht stattfinden kann.
Zusammengenommen kann das Protokoll hier präsentierten die Trennung von nativen Protein: Protein und sogar RNP komplexe aus Bast Proben und die Trennung und Identifizierung ihrer einzelnen Komponenten mit hoher Auflösung. Die Anwendung dieser Methode ermöglicht die Entdeckung neuartiger Protein und RNP-komplexe im Phloem Proben und kann daher neue Funktionen in diesem hoch spezialisierten Werk Fach aufzuklären.
The authors have nothing to disclose.
Jennifer Deke und Urszula Zarzenska danken wir für ihre wissenschaftliche Unterstützung. Diese Arbeit wurde von einem Career Integration Grant (CIG, PCIG14-GA-2013-63 0734) von der Europäischen Kommission im Rahmen des 7. Rahmenprogramms, Grant LFF-GK06 ‘DELIGRAH’ (Landesforschungsförderung Hamburg) und das DFG-Stipendium (DFG-KE 856_6-1) finanziell unterstützt. verliehen an JK.
1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm | BioRad | 1653359 | |
2-Propanol | AppliChem | 131090 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution | BioRad | 1610156 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution | BioRad | 1610158 | |
96 % Ethanol | Carl Roth | P075 | |
Acetic acid | Carl Roth | 6755 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate | AppliChem | 141101 | |
Ammonium peroxodisulfate (APS) | Carl Roth | 9592.3 | |
Bis-Tris | AppliChem | A3992 | |
Boric acid | AppliChem | A2940 | |
Bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
Centrifugal concentrators e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa) | Sartorius | VS0102 | |
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit | Thermo Fisher Scientific | 89880 | |
Chromatography papers e.g. 3 mm CHR | Whatman | 3030-153 | |
CoolBox M30 System | Biocision | BCS-133 | |
Coomassie brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | AppliChem | A0881 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
DNase I | AppliChem | A3778 | |
Ethanol abs. | AppliChem | A3693 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | AppliChem | A1103 | |
Gel Imaging system e.g. Chemidoc Touch | BioRad | 1708370 | |
GeneRuler 1kb plus | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | |
Glycerol | AppliChem | 141339 | |
Glycine | AppliChem | 131340 | |
Heating block TS1 | Biometra | 846-051-500 | |
Hybridization oven e.g. GFL Hybridization Incubator 7601 | GFL | 7601 | |
Hypodermic needle (0.8 mm) | B Braun | 4658309 | |
IPG gel comb, thickness 1 mm | BioRad | 1653367 | |
Labeling of RNA e.g.Biotin 3'end DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | 89818 | |
Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4–16% Bis-Tris protein gel | Invitrogen | BN1002BOX | |
Nylon membrane e.g. Hybond-N+ | Amersham Pharmacia | RPN203B | |
Ortho-phosphoric acid | Carl Roth | 6366.1 | |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
Power supply for Gel electrophoresis EPS | Amersham Pharmacia | 18-1130-01 | available from GE Healthcare |
RNA Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi dry Blot | Biometra | 846-015-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | AppliChem | A1149 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | AppliChem | 142363 | |
Synthesis of cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | AppliChem | A1148 | |
Tricine | AppliChem | A3954 | |
Tris | AppliChem | A1086 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | AppliChem | A3901 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer | Thermo Fisher Scientific | AM8670 | |
Urea | AppliChem | A1360 | |
UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400 | Agilent | NC0477671 | from Fisher Scientific |
Vertical electrophoresis apparatus e.g.The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System | Thermo Fisher Scientific or BioRad | EI0001 or 1658004 | |
Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 |