여기에 우리가 큰 네이티브 단백질: 단백질 및 단백질의 단백질 구성을 분석 하는 프로토콜을 제시: oilseed 강간에서 핵 산 복합물 (B. napus) 체 관 부 exudate 블루 결합 3D polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지) 방식을 사용 하 여 네이티브 대량 spectrometric 식별 뒤의 변성 페이지 두 개 (10 억).
더 높은 식물의 체 관 부를 샘플링은 종종 힘들고 식물 종에 크게 의존입니다. 그러나, 변성 시키기 조건에서 프로테옴 연구 다른 식물 종에 달성 될 수 있었다. 네이티브 단백질: 단백질과 단백질: 체 관 부 샘플에서 핵 산 단지 아직 부족 하 게 분석 된, 하지만 그들은 수도 있습니다 중요 한 역할을이 전문된 구획의 유지 보수 또는 장거리 신호. 큰 분자 어셈블리 블루 기본 젤 전기 이동 법 (BN-페이지)를 사용 하 여 격리 된 수 있습니다. 후속 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS-페이지)에 의해 그들의 단백질 구성 요소를 분리할 수 있습니다. 그러나, 유사한 분자 무게 단백질 공동 마이그레이션, 무슨 질량 분석에 의해 단백질 식별을 방해 수 있습니다. 두 개의 다른 변성 젤 전기 이동 법 단계, 즉 트리 스-Tricine-요소 및 SDS 페이지 BN-페이지 조합 그들의 화란/hydrophobicity에 따라 단백질의 추가 분리를 가능 하 게 하 고 따라서 해상도 성공 증가 단백질 식별. 그것은 심지어 posttranslational 수정만 다른 단백질을 구별 수 있습니다. 또한, 블루 네이티브 북부 blotting 고분자 복합물의 RNA 구성 요소를 식별 하기 위해 적용할 수 있습니다. 우리는 우리의 프로토콜 단백질 및 RNA 구성 요소 네이티브 단백질: 단백질 및 체 관 부 샘플에서 발생 하는 ribonucleoprotein (RNP) 단지의 해명 하기 적합 하다는 것을 보여줍니다. 파란색을 결합 하 여 두 개의 다른 변성 페이지 단계 기본 페이지 큰 단백질 복합물의 다른 종류를 구분 하는 데 도움이 수 있습니다 그리고 또한 질량 분석에 의해 그들의 구성 요소 식별 증가 속도 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 동시에 단일 단백질 복합물 내의 잠재적으로 바인딩된 핵 산을 검출 하기 위하여 충분히 강력한입니다.
체 관 부의 장거리 도관 더 높은 식물에 있는 유기 양분의 할당에 대 한 필수적입니다만 또한 성장 및 개발, 병원 체 방어 및 불리 한에 적응에 대 한 중요 한 많은 다른 프로세스를 규제에 참여 환경 조건입니다. 이온, phytohormones, 또는 스스로 대사 산물과 같은 작은 이펙터, 게다가 RNAs 단백질 같은 고분자는 잠재적인 신호도 최근 등장 했습니다.
연구는 단백질의 체 관 부 로드 크기 및 동반자 셀 (CC) 연결 기 공 plasmodesmal 단위의 크기 제외 제한 (SEL)에 의해 제어 요소 (SE)에 10의 범위에 일반적으로 있는 체 하 고 > 67 kDa1 , 2 , 그러나 3., 이러한 크기 제한이 더 큰 단백질 및 단백질에도 불구 하 고 단지 크기 제외4의 아이디어에 도전 하는 체 관 부 시스템 내에서 발견 되었습니다 그리고 se CC에서 단백질도 일반적인 손실 되었습니다 제안된5 .
큰 뿐 아니라 multiprotein ribonucleoprotein 단지6셀 구조적 무결성을 유지 하 고 생 합성에 중추적인 역할을 한다. 체 관 부-모바일 단백질-단백질 및 ribonucleoprotein 단지4,7, 존재 증거가 있다 하지만 날짜 그들의 기능에 대 한 약간은 알려진 다. 체 관 부 체 요소에서 단백질: 단백질과 RNP 단지 장거리 전송 및/또는 신호8,9연루 되었습니다. 환경 변화에서 그들의 구성 공부 translocated 단지의 기능을 해명 하거나 스트레스 조건이 필요 합니다. 이 위해 네이티브 단지 고립 되 고 그들의 구성 요소는 충분 한 해상도로 분리 될 필요가.
높은 분자 무게 단지는 체 관 부를 분리, 그것은 충분 한 품질 및 수량에 sap 샘플을 얻기 위해 첫 번째 필요. 체 관 부 샘플링에 사용할 수 있는 기술 관심의 식물 종에 따라 달라 집니다. 체 관 부 수액을 얻기 위해 세 가지 주요 방법 존재 10: 곤충 stylectomy11, EDTA 촉진 나옴12, 그리고 자발적인 있고13.
애기 thaliana (A. thaliana), 실험실, 전세계의 주요 모델 공장에서에서 체 관 부 샘플만 EDTA 용이 있고 또는 진딧물 stylectomy,1415에 의해 얻어질 수 있다. 두 방법 모두 매우 희석된 체 관 부 수액 또는 매우 낮은 샘플 금액으로 이어질. EDTA 용이 있고 또한 오염 하는 경향이 하 고 실제 체 관 부 구성16를 나타내지 않을 수 있습니다. 자연 체 관 부 나옴 어디 공장 부품을 잘라 쉽게 수집된13,,1718수 있는 체 관 부 수액의 자발적 방출에 리드, cucurbits, 르 피나 스 또는 유카, 같은 종 식물로 제한 됩니다. 19. 우리는 최근 체 관 부 분석을 위한 적합 한 모델 시스템으로 oilseed 강간 (브라 시카 napus)를 설립, 이후 A. thaliana 의 가까운 친척 및 체 관 부 수액의 여러 microliters 표시 되어 작은 절 개에서 얻을 수 있습니다. 고 순도4,,820의 수 있습니다. 또한, B. napus 게놈 시퀀스 201421에 릴리스 되었습니다.
진딧물 stylectomy 제외한 모든 체 관 부 수집 방법 설명 샘플링, 사이트에서 조직 주변의 손상 포함 하 고 체 관 부 수액의 구성은 부상에 대 한 응답에서 변경 될 수 있습니다. 따라서 샘플링 방법 적용에 체 관 부 샘플의 품질을 확인 하려면 필수적입니다. 예: RNase 활동22,23, Rubisco8,24에 대 한 뇌관으로 RT-PCR 또는 설탕의 분석의 결정에 의해 수집 된 체 관 부 수액의 품질 관리를 위한 다른 방법이 있다 컴포지션8.
크기 배제 크로마토그래피, 자당 밀도 ultracentrifugation, 또는 명백한 분자량 커트로 세포 막을 통해 여과 샘플을 포함 하 여 격리 하 고 분리 단백질 단지 다른 방법을 적용할 수 있습니다 오프. 그러나, 이러한 접근은 높은 해상도 허용 하지 않습니다. 라는 블루 기본 페이지 (비-), Schägger 외에의해 처음으로 설명 하는 기법. 25, 해상도 측면에서 우량 하다. 그것은 성공적으로 다양 한 세포 또는 세포 lysates 및 그들의 상대 나타났는데26,27큰 네이티브 단백질 복합물의 분자 무게를 결정 하기 위해 사용 되었다.
더 명료 단백질 복합물의 복잡 한 구성, 그것은 복잡 한 부품의 완전 한 해체로 이어지는 조건을 변성 시키기에서 개별 구성 요소를 분리 하는 데 필요한. 이 더 높은 해상도, 전자 초점 (IEF)의 두 번째 차원으로 SDS 페이지30 의 third dimension와의 후속 식별을 달성 하기 위해, 또는 SDS 페이지 28,29 의 두 번째 차원에 의해 달성 될 수 있다 단백질 질량 분석을 사용 하 여입니다.
이 프로토콜에서 순수 체 관 부 수액 B. napus 식물에서의 샘플링 및 트리 스-Tricine-우 레 아-페이지와 SDS 페이지 BN-페이지를 결합 하는 3D 전기 이동 방식을 사용 하 여 이러한 체 관 부 샘플에서 단백질 복합물의 분석을 설명 합니다. 분리 된 단백질 복잡 한 구성 요소는 이후 질량 분석을 사용 하 여 식별 됩니다. 또한, 소개 블루 네이티브 북부 blotting 큰 RNP 단지4, RNAs의 탐지를 허용 하는 방법으로는 접근의 적용을 확장 합니다.
체 관 부는 높은 관심의 구획 때문에 photoassimilates에 대 한 주요 수송 경로 구성 하 고 또한 다른 식물 부속9,20,34, 사이 장거리 신호를 위해 근본적 이다 35. 작은 분자 뿐만 아니라 RNAs 단백질 같은 고분자와 체 관 부 유지 보수 신호4,7,8연루 되었습니다. 체 관 부 구성의 분석 대부분의 식물 종에서 체 관 부 샘플에 제한 접근에 의해 제한 됩니다. 곤충 stylet 기술을 광범위 하 게 적용 하지만 실험적 요구 이며 체 관 부 샘플11의 매우 작은 양의 결과. 1 개의 쉬운 기술은 체 관 부 샘플링에 사용 되는 EDTA 촉진 나옴12입니다. EDTA 칼슘 같은 divalent 이온 chelates을 따라서 P 단백질 및 callose로 체 번호판의 폐쇄. 그것은 사용 하기 쉬운, 그러나 손상 된 세포에 의해 오염 하는 경향이 고 샘플 희석. EDTA에 의해 divalent 이온을 없애고 기존 단지의 분석 또한 발생할 수 있습니다. 그러나, 그것은 다양 한 모델 공장 A. thaliana15를 포함 하 여 종에서에서 샘플링이 있습니다. 체 관 부 수액의 자발적인 나옴만 종의 식물의 작은 수에서 발생합니다. 식물 조직10의 중요 한 상해를 포함 하는 침략 적 방법입니다. 우리는 최근 장거리 전송4,8,20공부 모델 종족으로 B. napus 를 설립. 여기, 체 관 부 수액 샘플링할 수 있다 수 작은 절 개에서 부상 효과 오염의 소스를 감소 시키는.
다른 샘플링 기법을 사용 하 여, 다양 한 식물 종에서 체 관 부 샘플의 프로테옴에 최근 몇 년 동안7,8,17,,3637, 조사는 38,39. 이러한 프로테옴 연구에 대 한 단백질 추출 되었고 조건을 변성 시키기에서 시 켰 던 따라서 단백질: 단백질 및 단백질에 대 한 결론을 허용 하지 않습니다: 핵 산 상호 작용 기본 조건 제시. 공동-immunoprecipitation (CoIP) 및 오버레이 분석 표시 주요 ribonucleoprotein 복잡 한 호박40, 체 관 부 수액에 있을 수 있지만 어떤 고분자 복합물 내의 기본 조건에서 존재 증명 되지 이었다는 체 관 부 시스템입니다.
Schägger 그 외 여러분 에 의해 도입 된 블루 기본 페이지 26, 후속 고해상도 젤 전기 이동 법 단계와 함께에서 큰 단백질 복합물의 개별 구성 요소 분리 가능 네이티브 B. napus 의 3D 페이지 분석을 사용 하 여 체 관 부 exudate, 우리 수 최근 보여 여러 높은 분자 무게 단백질: 단백질과 RNP 단지 체 관 부 샘플에 존재 하며 효소 활성화4. 크기 배제 크로마토그래피 같은 단백질 복합물 뿐만 아니라 RNPs를 분리 하는 다른 방법 존재, 하지만 억 페이지에 비해 해상도 관점에서 실패 수 있습니다. 또한, 복잡 한 분리의 합리적인 품질, 크기 배제 열 매트릭스 조사 되 고 전반적으로 복잡 한 분자 무게에 따라 적용할 수 있다. 다른 크기의 단지 분석 따라서 다른 유형의 비용을 집중 하 고 억 페이지로 초점 고성능으로 허용 하지 않는 열을 요구할 것 이다.
B. napus 에서 단지 분석 하 중요 한 단계는 시작 물자로 사용 하는 체 관 부 sap의 총 금액을 포함 합니다. 체 관 부 샘플의 적어도 600 µ L 필요 하 고 5 개의 잘 물결 무늬가 있는 식물에서 얻을 수 있습니다. 3D 페이지 및 BN 북부 blotting에 대 한 체 관 부 샘플의 충분 한 양의 초기 비 엔 젤을 시작할 필요가 있다. 이를 위해, 체 관 부 샘플은 집중 잘하고 적어도 20 ~ 30 µ g 단백질의 각에 로드할 수 있습니다 때까지 동일한 샘플의 triplicates을 동시에 실행 됩니다. 너무 낮거나 너무 높은 농도 단지 (그림 3)의 탐지를 줄일 수 있습니다. 체 관 부 샘플 필요 얼음에 반응 튜브에 수집 되며 단백질 저하와 회전율을 피하기 위해 나중에 사용 하기 위해 냉동 저장 한다. 프로 테아 제 저 해제 분석 하 고, 모든 체 관 부 proteomes에서 발견 되었습니다 하지만 또한 완전히 활성 프로테아좀 B. napus4의 체 관 부에 설명 했다. 또한, 볼륨 및 체 관 부 샘플의 구성 샘플링 시간-포인트와10환경 조건 따라 다릅니다. 따라서 유사한 조건 하에서 하루 중 같은 시간에 수집을 배려를가지고 한다. 스트레스 치료 (예: 가뭄) 수집 수 체 관 부의 양을 줄일 수 있습니다. 식별 하려면 단일 단백질 질량 분석에 의해, 제한 가능한 각 질 오염 입고 장갑 항상 필수입니다. 각 질과 질량 spec 분석 중 추가 신호 리드 저해 단백질 식별. 더 높은 전압 또는 온도에 10 억 페이지를 실행 깨지기 쉬운 단지의 분해 될 수 있는 젤의 열 발생할 수 있습니다.
여기에 제시 된 프로토콜은 단백질: 단백질 복합물의 분석에 적합 합니다. 우리는 또한 동시에 단지에 포함 된 특정 RNAs를 감지 하 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 이를 위해, 우리는 최근 북부 blotting410 억에 대 한 프로토콜 도입. RNAs는 RNAse 오염에 의해 저하 하는 경향이 있다. 이러한 성능 저하를 제한 하려면 DEPC 처리, 물 사용 되어야 한다.
제시 방법의 주요 제한 포함 마이그레이션 동작 따라 크기, 모양에 그리고도 단지31의 posttranslational 수정 이후 억 페이지를 구분 하는 단백질 복합물의 분자량의 추정 41. RNP 복합물의 크기 추정은 마이그레이션 동작에 핵 산의 영향으로 훨씬 더 복잡 합니다. 그것은 또한 하지 막을 수 있습니다 단지 같은 크기의 공동 한 하나의 밴드에서 마이그레이션할. 이 복잡 한 구성의 잘못 된 예측 발생할 수 있습니다. 따라서 상호 보완적인 기술로 관찰 된 상호 작용을 확인, 예를 들어 기능 분석 실험4, 필요할 수 있습니다. 또한 단백질만 약하게 또는 뚜렷이 고분자 복합체에 관련 된 사용 BN 버퍼에서 손실 될 수 있습니다. 이 방지 하려면 샘플 가교 화, 부작용으로 이어질 수 있습니다 무엇 또는 단백질 식별을 방지할 수 있습니다 또는 버퍼 상태를 최적화할 수 있습니다.
클래식 2D-페이지, 달리의 요소 및 SDS 페이지 hydrophobicity 및 전자 점 (pI) 및 분자량 28, 대신 분자량에 따라 분리 수 있습니다 조합과 단백질의 분리를 제한 하지 않는 한 특정 pI 범위입니다. 클래식 비슷한 2D 페이지, 분리 단백질 단일 관광 명소를 볼 수 있지만 대각선에 선 4,28 (, 그림 5 그림 6). 반면에 친수성 단백질 더 선28아래 찾을 수 있습니다 더 많은 소수 성 단백질이이 대각선 위의 관광 명소에 나타납니다. 이 프로토콜에 사용 된 polyacrylamide 농도 사이 25 ~ 80 kDa 단백질 잘 별도 것입니다. 작은 또는 큰 단백질의 분리는 polyacrylamide 있도록 농도 변화 될 수 있다 또는 그라데이션 젤 3 차원에서 사용할 수 있습니다. 3D-페이지 (그림 6)으로 구분 된 복잡 한 IV (그림 3)의 구성 요소, 트립 신, 소화 및 질량 분석에 의해 분석 밖으로 절단. 이 결과 여러 tRNA ligases의 식별. 다른 단지의 구성 요소 되었습니다 4최근 출판. 우리의 3D 페이지는 다른 ligases, 즉 aspartate, 아스파라긴, 트레오닌, 라이 신, 글리신 ligases, 유사한 분자 무게 (표 3)와 분리를 사용할 수 있습니다. 우리 복잡 한 4 내에서 잠재적으로 바인딩된 tRNA를 감지할 수 메티오닌 tRNA 전용 프로브를 사용 하 여, 하지만 전체 길이 tRNA 또는 tRNA 조각 복잡 한에 있는 경우 사용 하는 프로브와 차별 수 없습니다. 핵 산 단지 내에 정말 바인딩된와 공동 마이그레이션 있다면, 프로 테아 제 소화 체 관 부 수액 확인을 샘플 수 있습니다 적합 한 마이그레이션 컨트롤 역할을 합니다.
그것은 거의 대부분의 구성 요소는 전체 리보솜으로 신장 요인의 체 관 부 샘플4,7에서 발견 되었습니다 이후 단백질 번역 체 관 부 체 튜브 내에서 발생할 수 있습니다 이전 추측 하고있다. TRNA와 tRNA ligases의 우리의 발견이이 아이디어를 지 원하는 것으로 보인다. 그러나, tRNA 조각 호박에서 체 관 부 샘플에 존재는 번역42 의 강력한 억제제로 표시 되었습니다 그리고 기능적인 리보솜4, 번역 자리를 차지할 수 없는 제안에 결 석 것 같다.
함께 찍은, 여기에 제시 된 프로토콜 기본 단백질: 단백질 및 체 관 부 샘플 및 분리에서 심지어 RNP 복합물의 분리 및 높은 해상도 가진 그들의 개별 부품의 식별 수 있습니다. 이 방법의 응용 프로그램 소설 단백질 및 체 관 부 샘플에서 RNP 단지 검색 하 고 따라서이 고도로 전문화 된 공장에 새로운 기능을 명료 하 게 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리가 그들의 과학적 지원을 위해 제니퍼 딕 및 Urszula Zarzenska 감사합니다. 이 작품 경력 통합 교부 금에 의해 (CIG, PCIG14-가-2013-63 0734) 7 프레임 워크 프로그램, 그랜트 LFF-GK06 ‘DELIGRAH’ (Landesforschungsförderung 함부르크), DFG 그랜트 (DFG 애 856_6-1) 내에서 유럽 위원회에 의해 재정적으로 지원 되었다 JK에 게 수 여.
1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm | BioRad | 1653359 | |
2-Propanol | AppliChem | 131090 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution | BioRad | 1610156 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution | BioRad | 1610158 | |
96 % Ethanol | Carl Roth | P075 | |
Acetic acid | Carl Roth | 6755 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate | AppliChem | 141101 | |
Ammonium peroxodisulfate (APS) | Carl Roth | 9592.3 | |
Bis-Tris | AppliChem | A3992 | |
Boric acid | AppliChem | A2940 | |
Bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
Centrifugal concentrators e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa) | Sartorius | VS0102 | |
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit | Thermo Fisher Scientific | 89880 | |
Chromatography papers e.g. 3 mm CHR | Whatman | 3030-153 | |
CoolBox M30 System | Biocision | BCS-133 | |
Coomassie brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | AppliChem | A0881 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
DNase I | AppliChem | A3778 | |
Ethanol abs. | AppliChem | A3693 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | AppliChem | A1103 | |
Gel Imaging system e.g. Chemidoc Touch | BioRad | 1708370 | |
GeneRuler 1kb plus | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | |
Glycerol | AppliChem | 141339 | |
Glycine | AppliChem | 131340 | |
Heating block TS1 | Biometra | 846-051-500 | |
Hybridization oven e.g. GFL Hybridization Incubator 7601 | GFL | 7601 | |
Hypodermic needle (0.8 mm) | B Braun | 4658309 | |
IPG gel comb, thickness 1 mm | BioRad | 1653367 | |
Labeling of RNA e.g.Biotin 3'end DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | 89818 | |
Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4–16% Bis-Tris protein gel | Invitrogen | BN1002BOX | |
Nylon membrane e.g. Hybond-N+ | Amersham Pharmacia | RPN203B | |
Ortho-phosphoric acid | Carl Roth | 6366.1 | |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
Power supply for Gel electrophoresis EPS | Amersham Pharmacia | 18-1130-01 | available from GE Healthcare |
RNA Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi dry Blot | Biometra | 846-015-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | AppliChem | A1149 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | AppliChem | 142363 | |
Synthesis of cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | AppliChem | A1148 | |
Tricine | AppliChem | A3954 | |
Tris | AppliChem | A1086 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | AppliChem | A3901 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer | Thermo Fisher Scientific | AM8670 | |
Urea | AppliChem | A1360 | |
UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400 | Agilent | NC0477671 | from Fisher Scientific |
Vertical electrophoresis apparatus e.g.The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System | Thermo Fisher Scientific or BioRad | EI0001 or 1658004 | |
Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 |