Her presenterer vi en protokoll for å analysere protein sammensetningen av store innfødt protein: protein og protein: nukleinsyre komplekser fra oljevekster voldtekt (B. napus) phloem sårvæske ved hjelp av en 3D polyakrylamid gel geleelektroforese (side) tilnærming kombinere blå Opprinnelig (BN) med to denaturing sider etterfulgt av masse spectrometric identifikasjon.
Prøvetaking av phloem for høyere planter er ofte arbeidskrevende og betydelig avhengig av plantearter. Imidlertid kan proteom studier under denaturing forhold oppnås i forskjellige plantearter. Native protein: protein og protein: nukleinsyre komplekser fra phloem prøver ennå knapt er analysert, selv om de kan spille en viktig rolle i opprettholdelsen av denne spesialiserte kupé eller langdistanse signalering. Store molekylær samlinger kan isoleres ved hjelp av en blå innfødt gel geleelektroforese (BN-side). Deres protein komponenter kan skilles med en påfølgende natrium dodecyl sulfate (SDS-side). Imidlertid overføre proteiner med lignende molekylvekt co, hva kan hindre protein identifikasjon av massespektrometri. Kombinere BN-side med to forskjellige denaturing gel geleelektroforese trinn, nemlig Tris-Tricine-urea og SDS-side, muliggjør ytterligere separasjon av proteiner i henhold til deres hydrophilicity/hydrophobicity og dermed øker oppløsning og suksess protein identifikasjon. Det kan skille proteiner som bare avviker i deres posttranslational modifikasjoner. I tillegg kan blå innfødt Nord blotting brukes for å identifisere RNA komponenter i macromolecular komplekser. Vi viser at våre protokollen er egnet til å rakne protein og RNA komponenter av innfødte protein: protein og ribonucleoprotein (RNP) komplekser forekommer i phloem prøver. Kombinere en blå Opprinnelig side med to forskjellige denaturing siden trinn kan hjelpe skille ulike typer store protein komplekser, og kan også en økt identifisering rente for sine komponenter av massespektrometri. Videre er protokollen robuste nok til å samtidig oppdage potensielt bundet nukleinsyrer innen enkelt protein komplekser.
The langdistanse rør av phloem er avgjørende for tildeling av organisk næringsstoffer i høyere planter, men er også involvert i å regulere forskjellige prosessene viktig for vekst og utvikling, patogen defense og tilpasningen til uønskede miljøforhold. Foruten liten effektor som ioner, phyto-hormoner eller metabolitter seg, makromolekyler som proteiner og RNAs har nylig dukket opp som potensielle signaler.
Studier har vist at phloem lasting av proteiner er avhengige og kontrollert av exclusion størrelsesgrensen (SEL) av pore-plasmodesmal koble følgesvenn celler (CC) og sil elementer (SE) som er vanligvis mellom 10 til > 67 kDa1 , 2 , 3. men til tross for disse størrelse begrensninger større proteiner og protein komplekser er funnet innenfor phloem systemet utfordrende ideen om størrelse utelukkelse4, og selv uspesifikke tap av proteiner fra kopi se har vært foreslått5 .
Multiprotein samt store ribonucleoprotein komplekser spille viktige roller i biosyntesen og opprettholde den strukturelle integriteten av cellen6. Det er bevis for at phloem-mobile protein-protein og ribonucleoprotein komplekser finnes4,7, hittil lite om deres funksjon er kjent. Phloem sil elementer har protein: protein og RNP komplekser vært innblandet med langdistanse transport og / eller signalnettverk8,9. Er nødvendig for å rakne funksjoner translocated komplekser, studere deres sammensetning under varierende miljømessige eller stress forhold. For å oppnå dette, innfødt komplekser må isoleres og deres komponenter må skilles med høy nok oppløsning.
For å isolere høy-molekylvekt komplekser fra phloem, er det først nødvendig for å få sap eksempler i tilstrekkelig kvalitet og kvantitet. Teknikken som benyttes for phloem prøvetaking avhenger av plantearter rundt. Tre hovedmetoder for å få phloem sap finnes 10: insekt stylectomy11, EDTA-tilrettelagt exudation12og spontan exudation13.
Phloem prøver fra Arabidopsis thaliana (A. thaliana), store modellen anlegget i laboratorier over hele verden, kan bare hentes av EDTA-tilrettelagt exudation eller bladlus stylectomy14,15. Begge metodene føre til svært fortynnede phloem sap eller svært lav eksempel beløp. EDTA-tilrettelagt exudation er også utsatt for forurensning og kanskje ikke representerer virkelige phloem sammensetning16. Spontan phloem exudation er begrenset til plantearter som cucurbits, lupine eller yucca, der kutte av plantedeler fører til en spontan utslipp av phloem sap som kan enkelt samlet13,17,18, 19. Vi har nylig etablert oljevekster voldtekt (Brassica napus) som en egnet modellsystem for phloem analyse, siden det er en nær slektning av A. thaliana og flere microliters av phloem sap kan fås fra små incisions som har vist seg å være høy renhetsgrad4,8,20. Videre ble B. napus Genova orden utgitt i 201421.
Bortsett fra bladlus stylectomy, alle phloem samling metoder beskrevet inkluderer skade av omkringliggende vev på stedet av prøvetaking og sammensetningen av phloem sap kan endre svar på skader. Derfor er det viktig å sjekke kvaliteten på phloem prøver, uavhengig av sampling metoden brukes. Det finnes ulike metoder for kvalitetskontroll av samlet phloem sap, f.eks ved fastsettelse av RNase aktivitet22,23, RT PCR med primere mot Rubisco8,24eller analyse av sukker sammensetning8.
Forskjellige metoder for å isolere og separate protein komplekser kan brukes, inkludert størrelse utelukkelse Ture, sukrose tetthet ultracentrifugation eller prøve filtrering gjennom membraner med forskjellige molekylvekt kuttet offs. Disse metodene tillater imidlertid ikke høy oppløsning. Teknikken kalles blå Opprinnelig side (BN-side), først beskrevet av Schägger et al. 25, er overordnet i oppløsning. Det ble brukt til å bestemme molekylvekt av store innfødt protein komplekser fra ulike organeller eller cellular lysates og deres relative antall26,27.
For å ytterligere belyse komplekse sammensetningen av protein komplekser, er det nødvendig å skille de enkelte komponentene under denaturing forhold, fører til fullstendig demontering av komplekse komponenter. Dette kan oppnås ved en andre dimensjonen SDS side 28,29 eller for å oppnå høyere oppløsning, med en andre dimensjon av isoelectric fokus (IEF) etterfulgt av en third dimension av SDS side30 og påfølgende identifikasjon av proteiner med massespektrometri.
I denne protokollen beskriver vi prøvetaking av ren phloem sap fra B. napus planter og analyse av protein komplekser fra slike phloem prøver med en 3D electrophoretic tilnærming kombinere BN-side med Tris-Tricine-urea-side og SDS-side. Atskilt protein komplekse komponenter identifiseres senere av massespektrometri. Dessuten, introdusere vi blå innfødt Nord blotting som tillater påvisning av RNAs i store RNP komplekser4, utvide anvendelsesområdene av tilnærming.
Phloem er en kupé av høy rente, siden det utgjør den viktigste ruten for photoassimilates, og er også avgjørende for langdistanse signalering mellom ulike anlegg deler9,20,34, 35. I tillegg til små molekyler, har makromolekyler som proteiner og RNAs vært innblandet med phloem vedlikehold og signalnettverk4,7,8. Analyse av phloem sammensetning er begrenset av begrenset tilgjengelighet til phloem prøver i de fleste plantearter. Insekt stylet teknikken er allment gjeldende, men eksperimentelt krevende og resulterer i svært små mengder phloem prøver11. En enkel teknikk som brukes for phloem prøvetaking er EDTA-tilrettelagt exudation12. EDTA chelates divalent ioner som kalsium og dermed hindrer lukking av sil plater av P-proteiner og callose. Det er enkelt å bruke, men er utsatt for forurensning av skadede celler og prøver er utvannet. Tappe divalent ioner av EDTA kan også føre til en oversikt over eksisterende komplekser. Det kan imidlertid utvalg fra en rekke arter inkludert modell anlegget A. thaliana15. Spontan exudation av phloem sap bare oppstår i et lite antall plantearter. Det er en invasiv metode som involverer betydelig skade på plante vev10. Vi har nylig etablert B. napus som modell Art for å studere langdistanse transport4,8,20. Her kan phloem sap prøves fra små incisions, noe som reduserer såret effekter og beskyttet mot kontaminering.
Bruke ulike prøvetaking teknikker, proteom av phloem prøver fra forskjellige plantearter har blitt undersøkt i årene7,8,17,36,37, 38,39. For disse proteom studier, proteiner ble pakket ut og igangsatte under denaturing forhold og derfor tillater ikke konklusjoner om protein: protein og protein: nukleinsyre interaksjoner presentere under innfødt forhold. Co-immunoprecipitation (CoIP) og overlegg analyser indikerte at en stor ribonucleoprotein kompleks kan finnes i phloem sap gresskar40, men det var ikke vist at noen macromolecular komplekser finnes under innfødt forhold i den phloem system.
Blå Opprinnelig side, introdusert av Schägger et al. 26, i kombinasjon med påfølgende oppløsning gel geleelektroforese trinn aktiverer separasjon av de enkelte komponentene i store protein komplekser. Bruke 3D-side analyser av innfødte B. napus phloem sårvæske, kunne vi nylig viser at flere høy molekyl vekt protein: protein og RNP komplekser finnes i phloem prøver og er enzymatisk aktive4. Alternative metoder for å isolere protein komplekser samt RNPs som størrelse utelukkelse kromatografi kan finnes, men mislykkes i oppløsning sammenlignet med BN-side. Videre for en rimelig kvalitet komplekse separasjon må størrelse utelukkelse kolonnen matriser tilpasses etter de generelle komplekse molekylvekt etterforsket. Analysere komplekser forskjellige vil derfor kreve ulike kolonner som er kostnadskrevende og tillater ikke som høy fokus makt som en BN-side.
Avgjørende skritt å analysere komplekser fra B. napus omfatter den totale mengden phloem sap som starter materiale. Minst 600 µL av phloem prøve er nødvendig og kan fås fra fem fuktig planter. For 3D-side og BN Nord blotting er det nødvendig å starte første BN gel med en tilstrekkelig mengde phloem prøver. For å oppnå dette, phloem prøvene er konsentrert til 20-30 µg protein kan lastes inn i hver godt og minst triplicates på samme utvalget kjøres parallelt. For lav eller for høy konsentrasjoner reduserer påvisning av komplekser (Figur 3). Phloem prøver må samles inn reaksjon rørene på is og bør lagres fryses for senere bruk å unngå protein fornedrelse og omsetning. Proteasehemmere har blitt funnet i alle phloem proteomes analysert, men også en fullt aktive proteasome ble beskrevet i phloem B. napus4. Videre avhenger volum og sammensetningen av phloem prøver av tidspunkt for prøvetaking og miljøforhold10. Derfor må utvises å samle på samme tid av dagen under like forhold. Stress behandlinger (f.eks tørke) kan redusere mengden av phloem som kan bli samlet. For å identifisere enkelt proteiner av massespektrometri, er det obligatorisk å begrense mulige keratin forurensing av seg hansker hele tiden. Keratin fører til flere signaler under masse spec analyse og vanskeliggjør protein identifikasjon. Kjører BN-siden på et høyere spenning eller ved omgivelsestemperatur kan føre til oppvarming av gel det demontering av skjøre komplekser.
Protokollen presenteres her er egnet for analyse av protein: protein komplekser. Vi viser også at den kan brukes til å oppdage bestemte RNAs i komplekser parallelt. For å oppnå dette, introdusert vi nylig en protokoll for BN Nord blotting4. RNAs er utsatt for degradering av RNAse forurensing. Hvis du vil begrense slike fornedrelse DEPC-behandlet, vannet skal brukes.
Viktigste begrensninger av presentert metoden omfatter estimering av molekylvekt av protein komplekser med BN-side, siden overføring virkemåten avhenger av størrelse, form og selv posttranslational modifikasjoner av komplekser31, 41. Størrelse estimering av RNP komplekser er enda mer komplisert på grunn av påvirkning av nukleinsyrer på migrasjon virkemåten. Det kan ikke være forhindret også at komplekser av samme størrelse co migrere i ett enkelt band. Dette kan føre til feilaktige prediksjon av komplekse komposisjoner. Derfor bekrefte observert samhandlingene med komplementære teknikker, kan f.eks av funksjonelle analyser4, være nødvendig. Også kan proteiner bare svakt eller transiently knyttet til en macromolecular gå tapt i BN bufferen. For å unngå dette, prøver kan være krysskoblet, hva kan også føre til gjenstander eller kan hindre protein identifikasjon, eller bufferen betingelsene kan optimaliseres.
I motsetning til klassisk 2D-side, kombinasjonen av urea – og SDS-side for separasjon hydrophobicity og molekylvekt i stedet for isoelectric punkt (pI) og molekylvekt 28, og begrenser ikke separasjon proteiner fra en bestemt pI utvalg. Ligner på klassiske 2D-side, atskilt proteiner er synlig som enkelt flekker, men på en diagonal linje 4,28 (figur 5, figur 6). Mer hydrofobe proteiner vises i flekker over denne diagonal, mens mer hydrofile proteiner finnes under linje28. Polyakrylamid konsentrasjonen i denne protokollen vil skille proteiner mellom 25 til 80 kDa godt. For å tillate en separasjon av mindre eller større proteiner i polyakrylamid konsentrasjon kan varieres eller gradient gels kan brukes i den tredje dimensjonen. Komponentene i komplekse IV (Figur 3) med 3D-siden (figur 6) ble skåret ut, trypsin fordøyd og analyseres av massespektrometri. Dette resulterte i identifikasjon av flere tRNA ligases. Komponentene i andre komplekser har vært publisert nylig 4. Vår 3D-side aktivert separasjon av forskjellige ligases, nemlig aspartate, asparagine, threonin, lysin og glysin ligases, med lignende molekylvekt (tabell 3). Bruker en metionin tRNA-spesifikke sonde, vi kunne oppdage potensielt bundet tRNA i komplekse IV, men hvis full lengde tRNA eller tRNA fragmenter i komplekset kan ikke bli diskriminert med sonder brukes. For å sjekk hvis nucleic syrer virkelig bundet innenfor komplekset og ikke co migrering, protease fordøyd phloem sap kan eksempler tjene som passer migrasjon kontroller.
Det har vært spekulert tidligere at protein oversettelsen kan oppstå i phloem sil rør, siden nesten de fleste komponentene i det hele ribosom samt forlengelse faktorer har blitt funnet i phloem prøver4,7. Våre funn av tRNA og tRNA ligases synes å støtte denne ideen. Men tRNA fragmenter tilstede i phloem prøver fra gresskar har vist seg å være potent hemmere av oversettelse42 og funksjonelle ribosomer synes å være fraværende4, antyder at oversettelsen ikke skje.
Samlet kan protokollen presenteres her separasjon av innfødte protein: protein og selv RNP komplekser fra phloem prøver og separasjon og identifikasjon av sine enkelte komponenter med høy oppløsning. Anvendelsen av denne metoden kan roman protein og RNP blant phloem prøver og kan derfor belyse nye funksjoner i denne svært spesialisert fabrikk kupé.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jennifer Deke og Urszula Zarzenska for vitenskapelig støtte. Dette arbeidet ble økonomisk støttet av en karriere integrering Grant (CIG, PCIG14-GA-2013-63 0734) av Europakommisjonen 7th framework programmet, grant LFF-GK06 ‘DELIGRAH’ (Landesforschungsförderung Hamburg) og DFG tilskudd (DFG KE 856_6-1) tildelt JK.
1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120086 | |
10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm | BioRad | 1653359 | |
2-Propanol | AppliChem | 131090 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution | BioRad | 1610156 | |
30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution | BioRad | 1610158 | |
96 % Ethanol | Carl Roth | P075 | |
Acetic acid | Carl Roth | 6755 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate | AppliChem | 141101 | |
Ammonium peroxodisulfate (APS) | Carl Roth | 9592.3 | |
Bis-Tris | AppliChem | A3992 | |
Boric acid | AppliChem | A2940 | |
Bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
Centrifugal concentrators e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa) | Sartorius | VS0102 | |
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit | Thermo Fisher Scientific | 89880 | |
Chromatography papers e.g. 3 mm CHR | Whatman | 3030-153 | |
CoolBox M30 System | Biocision | BCS-133 | |
Coomassie brilliant Blue G-250 | AppliChem | A3480 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | AppliChem | A0881 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
DNase I | AppliChem | A3778 | |
Ethanol abs. | AppliChem | A3693 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | AppliChem | A1103 | |
Gel Imaging system e.g. Chemidoc Touch | BioRad | 1708370 | |
GeneRuler 1kb plus | Thermo Fisher Scientific | SM1331 | |
Glycerol | AppliChem | 141339 | |
Glycine | AppliChem | 131340 | |
Heating block TS1 | Biometra | 846-051-500 | |
Hybridization oven e.g. GFL Hybridization Incubator 7601 | GFL | 7601 | |
Hypodermic needle (0.8 mm) | B Braun | 4658309 | |
IPG gel comb, thickness 1 mm | BioRad | 1653367 | |
Labeling of RNA e.g.Biotin 3'end DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | 89818 | |
Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4–16% Bis-Tris protein gel | Invitrogen | BN1002BOX | |
Nylon membrane e.g. Hybond-N+ | Amersham Pharmacia | RPN203B | |
Ortho-phosphoric acid | Carl Roth | 6366.1 | |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
Power supply for Gel electrophoresis EPS | Amersham Pharmacia | 18-1130-01 | available from GE Healthcare |
RNA Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi dry Blot | Biometra | 846-015-100 | |
Sodium chloride (NaCl) | AppliChem | A1149 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | AppliChem | 142363 | |
Synthesis of cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | AppliChem | A1148 | |
Tricine | AppliChem | A3954 | |
Tris | AppliChem | A1086 | |
Tri-sodium citrate dihydrate | AppliChem | A3901 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer | Thermo Fisher Scientific | AM8670 | |
Urea | AppliChem | A1360 | |
UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400 | Agilent | NC0477671 | from Fisher Scientific |
Vertical electrophoresis apparatus e.g.The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System | Thermo Fisher Scientific or BioRad | EI0001 or 1658004 | |
Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 |